CN110373369B - 一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，尤其涉及一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用。以枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过同源重组敲除淀粉酶基因amy‑E并引入猪来源的谷氨酰胺合成酶(GS)，构建稳定且高分泌型工程菌，实现了猪谷氨酰胺合成酶的高效分泌表达。动物实验表明该菌株能够预防和治疗动物腹泻的发生，提高抑炎因子IL‑10的分泌，同时降低炎症因子IFN‑γ、IL‑1β、TNF‑α等的分泌；修复受损肠道，促进肠绒毛生长，最终提高动物生产性能。为实现猪来源的谷氨酰胺合成酶的工业化制备生产奠定了基础，为饲添抗生素的替代及畜牧业的健康、可持续发展提供技术支撑。

Description

一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建 方法及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，尤其涉及一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用。

背景技术

在现代集约化养殖生产体系下，为了获得最大的经济效益，仔猪的中、早期断奶被广泛采用。断奶是仔猪出生后面临的最大的应激，由于断奶时仔猪，身体机能不完善、短期内采食量的下降加之受外界不良环境的影响，极易引起仔猪肠道微生态环境失衡、功能紊乱、肠道发育受阻，导致其生产性能下降，生长发育停滞，对病原微生物易感。随断奶日龄的提前，这种断奶应激现象更加强烈，应激损伤更为严重。生产上为了降低早期断奶应激对仔猪生产性能的影响，减少养殖业的经济损失，通常采用在饲料中长期添加抗生素，然而，近年来抗生素产生的耐药性以及残留问题越来越受到社会的重视，寻找合适的抗生素替代品是畜牧业发展急需解决的问题。目前，国内外学者在早期断奶仔猪抗应激方面已做了大量的研究工作。现已普遍认为，谷氨酰胺是仔猪在受到断奶、受伤等应激下的条件性必需氨基酸，日粮中添加一定量的谷氨酰胺可增加早期断奶仔猪的采食量，从而减少了应激的发生，同时提高了早期断奶仔猪的免疫和生产性能。

谷氨酰胺(Gln)是哺乳动物血浆和乳汁中含量最丰富的游离氨基酸，在断奶、受伤、感染和疾病等应激条件下被认为是一种条件性必需氨基酸，是肠道上皮细胞和免疫细胞如浆细胞、T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的主要能源物质。谷氨酰胺作为肠粘膜细胞提供能量的底物，能够提高丝状肌动蛋白与球状肌动蛋白的比率，降低肠粘膜渗透性。此外，谷氨酰胺是合成维持胃肠道完整性生物活性分子的重要组分，在肠道细胞中起着信号分子的作用，从而在基因和蛋白质水平上调控生理和营养代谢。近年来，随着谷氨酰胺在动物营养学、生理学、免疫学等方面独特而复杂的生理功能而成为近期研究的热点。

益生菌作为饲添抗生素最佳替代品之一已备受关注。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded safe”(GRAS)安全级别。作为食品安全级别的原核表达宿主，枯草芽孢杆菌具备大肠杆菌(E.coli)没有的一些优良特性，如非致病性，绝大多数对人畜无害，不产生内毒素和致热敏蛋白质；其分泌信号肽及分子伴侣系统非常高效，从而具有很强的分泌蛋白能力，有助于重组蛋白质保持其天然构象和生物活性。枯草芽孢杆菌有悠久广泛的应用历史，生长迅速、培养条件简单、遗传背景较清晰，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度，具备良好的发酵生产基础。近年来，枯草杆菌表达系统不断发展和完善,许多外源蛋白获得了高效表达，但同时也存在一些问题。蛋白酶的分泌是枯草杆菌作为表达宿主的限制因素之一，这些蛋白酶没有底物专一性；当外源蛋白分泌表达后，容易被这些蛋白酶降解，从而大大降低产量。而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800缺失了8种胞外蛋白酶，减少外源蛋白被降解的风险以提高蛋白表达量。由于谷氨酰胺溶解度较低，在水中很不稳定，易分解等特性，以及昂贵的国际市场价格等，限制了它在畜牧业上的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用，用于缓解仔猪断奶应激，改善断奶仔猪肠道健康，提高生产性能，减少养殖业由于仔猪应激造成的经济损失。

本发明是这样实现的，一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO:M2019176。

一种如权利要求1所述的产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：

S1：分别针对P43基因和SacB基因设计引物，并扩增获得相应基因片段；

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接；

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建；

S4：针对谷氨酰胺合成酶基因设计引物，并扩增获得目标片段；

S5：构建PDG-P43-SacB-GS重组表达载体；

S6：将步骤S5中获得的重组质粒转化至宿主菌。

进一步，步骤S1中针对P43基因设计的引物序列见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

进一步，步骤S1中针对SacB基因设计的引物序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

进一步，步骤S3中所用质粒为PDG1730。

进一步，步骤S4中针对谷氨酰胺合成酶基因设计引物序列见SEQ ID NO:8和SEQIDNO:9。

进一步，步骤S5中通过一步克隆法构建PDG-P43-SacB-pGS表达载体。

进一步，步骤S6中宿主菌为野生型枯草芽孢杆菌WB800。

如上述的产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在生产谷氨酰胺中的应用。

如上述的产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在益生菌制剂或动物饲料制备中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)本发明采用原核表达系统成功实现猪来源的谷氨酰胺合成酶异源高效表达，谷氨酰胺合成酶通过发酵的方式直接分泌到发酵上清中。

(2)本发明构建的重组枯草芽孢杆菌RBs-GS菌株产生谷氨酰胺合成酶的含量可达1.2μg/L，而出发菌株谷氨酰胺合成酶含量仅为0.001μg/L，重组枯草芽孢杆菌菌株产谷氨酰胺合成酶的含量较出发菌株提高了1200倍。

(3)本发明构建的重组枯草芽孢杆菌菌株，是将表达猪谷氨酰胺合成酶的基因直接整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，实现蛋白的稳定表达，不会出现质粒随着菌株的传代次数增加而丢失。

(4)本发明的重组枯草芽孢杆菌菌株为“食品级”工业菌株，培养方式简单，发酵时间短，生产强度大，为实现猪谷氨酰胺合成酶的工业化生产奠定了坚实的基础。

(5)本发明的重组枯草芽孢杆菌可用于制备微生物菌剂，能显著修复断奶仔鼠的肠道损伤，有效缓解仔鼠的应激。

本发明运用基因工程手段构建高效表达猪谷氨酰胺合成酶(pGS)的枯草芽孢杆菌是生产食品安全级猪谷氨酰胺的有效途径，产生的谷氨酰胺合成酶(GS)在猪体内利用ATP催化谷氨酸和氨形成谷氨酰胺，打破了谷氨酰胺在畜牧业上的应用困难的瓶颈。本发明通过基因工程技术构建高效表达猪谷氨酰胺合成酶(pGS)的枯草芽孢杆菌工程菌，改善动物肠道健康，以达到抗病、促生长的综合效果，为饲料添加剂抗生素的替代和畜牧业的健康、可持续发展提供了技术支撑。

附图说明

图1是本发明从合成的P43载体上获得的P43片段的电泳图，泳道M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：P43；泳道2：阴性对照；

图2是本发明从枯草芽孢杆菌中获得的信号肽SacB片段的电泳图，泳道M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：SacB；泳道2：阴性对照；

图3是本发明构建PDG-P43-SacB整合载体示意图；

图4是本发明利用重叠PCR方法获得的P43+SacB片段的电泳图，泳道1为阴性对照；泳道2：P43+SacB；

图5是本发明从猪肾细胞PK15获取pGS基因PCR扩增检测结果的电泳图，泳道M:DL2000 DNA分子量标准，泳道1：猪谷氨酰胺合成酶基因；泳道2：阴性对照；

图6是本发明构建重组表达载体PDG-P43-SacB-pGS的图谱；

图7是本发明构建的GS双交换枯草芽孢杆菌中壮观基因(spec，NCBI-Gene ID:MF927932.1)、淀粉酶基因(amy-E，NCBI-Gene ID:MG264159.1)、pGS基因的电泳图，泳道M:DL 2000DNA分子量标准；泳道1-3：spec基因、spec+、spec-；泳道4-6：Amy-E、Amy-E+、Amy-E-；7-9:GS、GS+、GS-；

图8是利用淀粉平板通过碘液染色法验证重组枯草芽孢杆菌RBs-GS淀粉酶基因缺失的电泳图，泳道1：野生型枯草芽孢杆菌菌株WB800；2：本发明构建的枯草芽孢杆菌菌株RBs-GS；

图9是利用pGS的Elisa试剂盒检测本发明构建的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中pGS的含量；

图10是利用pGS的Elisa试剂盒检测本发明构建的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中pGS的酶活力；

图11是小鼠十二指肠石蜡切片图，小鼠灌胃11d后，各组小鼠十二指肠绒毛的结构形态；

图12是小鼠十二指肠石蜡切片图，小鼠灌胃15d后，各组小鼠十二指肠绒毛的结构形态；

图13是小鼠十二指肠绒毛高度对比图，小鼠灌胃11d后，各组小鼠十二指肠绒毛高度结果分析；

图14是小鼠十二指肠绒毛高度对比图，小鼠灌胃15d后，各组小鼠十二指肠绒毛高度结果分析；

图15是小鼠空肠绒毛高度对比图，小鼠灌胃11d后，各组小鼠空肠绒毛高度结果分析；

图16是小鼠空肠绒毛高度对比图，小鼠灌胃15d后，各组小鼠空肠绒毛高度结果分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用，具体如下各实施例所示。本发明的一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌RBs-GS，建议分类名为枯草芽孢杆菌RBs-GS(Bacillus subtilis RBs-GS)，已于2019年3月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，并存活，保藏编号为CCTCC NO:M2019176。

实施例1产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌的构建

本实施例中，起始质粒PDG1730和野生型枯草芽孢杆菌WB800，由华中农业大学生命科技学院孙明教授惠赠，大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

S1：分别针对P43基因和SacB基因设计引物，并扩增获得相应基因片段。

根据NCBI中P43基因(启动子)片段序列(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与信号肽SacB基因片段序列(登陆号NCBI-Gene ID:MH614588.1)，设计引物如下：

正向引物P43-F:CGggatccgagctcagctttattgagtgg，见SEQ ID NO:1；

反向引物P43-R:GCAAACTTTTTGATGTTCATgtgtacattcctctcttacc，见SEQ ID NO:2；

正向引物SacB-F:ggtaagagaggaatgtacacATGAACATCAAAAAGTTTGC，见SEQ ID NO:3；

反向引物SacB-R:aacccaagcttCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCT，见SEQ ID NO:4。

P43基因片段由天一辉远生物科技有限公司合成，并克隆在PJET1.2载体(公知公用)上。

P43基因片段的制备：用正向引物P43-F和反向引物P43-R，从含有P43基因片段的载体PJET1.2中扩得。采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F/P43-R引物各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃2min预变性；98℃10s,，60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸至7min。将所得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，所得的片段大小与预期相符，为337个碱基对，见图1，该片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:5。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

信号肽SacB基因片段制备：用正向引物SacB-F和反向引物SacB-R，从野生型枯草芽孢杆菌WB800基因组中扩得。反应程序：采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入正向引物SacB-F/反向引物SacB-R各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃2min预变性，98℃10s，60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸7min。将PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳,所得的片段大小与预期相符，为87个碱基对，见图2，该片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:6。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接。

使用常用重叠PCR方法(陈国梁等，重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建，2010)将P43基因(启动子)片段与信号肽SacB基因片段相连，然后将PDG1730(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与P43+SacB经BamHI和HindIII酶切后连接，构建得到整合载体PDG-P43-SacB，见图3。

P43+SacB基因片段的制备：用上述纯化后的P43和SacB基因片段为模板，采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F和SacB-R引物各1.5μL，基因模板P43和SacB各1μL，去离子水20μL，混匀后置于PCR仪，按如下程序运行：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸7min。将产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，片段大小与预期相符，为424个碱基对，见图4。剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建

(1)质粒PDG1730的酶切

向1μg的质粒PDG1730中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(2)P43+SacB基因片段的酶切

向1μg的P43+SacB基因片段中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg基因片段。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(3)PDG-P43-SacB重组质粒的构建

将步骤(1)和(2)中保存的片段按以下配比加连接酶进行连接处理：PDG1730 1μL，P43+SacB基因片段5μL，T4DNA连接酶1μL，Buffer 2μL，去离子水11μL。22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，用含壮观霉素(100μg/mL)的抗性平板筛选，挑取单菌落进行新的PCR验证，反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，P43-F和SacB-R各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃30s，32个循环后72℃延伸7min。对获得的阳性重组质粒PDG-P43-SacB进行测序，从测序结果正确的菌落中提取质粒，用于下一步试验。

S4：针对谷氨酰胺合成酶基因设计引物，并扩增获得目标片段。

本实施例中涉及到的猪谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，针对谷氨酰胺合成酶(pGS)基因设计引物如下：

正向引物pGS-F:gtaagagaggaatgtacacaagcttATGGCCACCTCAGCGAGCTCC，见SEQIDNO:8；

反向引物pGS-R:tcgccagggctgcaggaattcTTAGTTTTTGTACTGGAAGG，见SEQ ID NO:9；

pGS基因片段的制备：pGS从PK15细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)提取RNA，反转录成cDNA后，用正向引物pGS-F和反向引物pGS-R从cDNA中扩得。采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入正向引物pGS-F/R反向引物各1.5μL，基因模板cDNA2μL，去离子水20μL，混匀后置于PCR仪中，按如下程序：94℃2min预变性，98℃10s，60℃5s,，72℃15s，32个循环后72℃延伸至7min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，所得片段大小与预期相符，约为1170个碱基对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，见图5。

S5：PDG-P43-SacB-pGS重组表达载体的构建。

通过一步克隆法构建PDG-P43-SacB-pGS表达载体，图谱见图6，将质粒PDG-P43-SacB经HindIII和EcoRI处理后，按照II One Step Cloning Kit(南京诺维赞生物科技有限公司)说明书的方法，将片段pGS克隆到质粒PDG-P43-SacB上构建PDG-P43-SacB-pGS重组表达载体，具体过程如下：

(1)质粒PDG-P43-SacB的酶切

向1μg的PDG-P43-SacB质粒中分别加入1.5μL限制性内切酶HindIII和EcoRI，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(2)PDG-P43-SacB-pGS重组表达载体的构建

将pGS和步骤(1)中保存的片段按照一步克隆法进行操作：PDG-P43-SacB片段浓度在50～200ng之间，pGS片段浓度在50～200ng之间，II2μL，5×CE II Buffer 4μL，加去离子水补齐到20μL。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。将反应产物转化DH5α感受态细胞，用壮观基因(100μg/mL)进行抗性筛选，挑取单菌落进行PCR验证，将所得的阳性重组质粒PDG-P43-SacB-pGS进行测序，挑选测序结果正确的菌落提取质粒，用于下一步试验。

S6：将步骤S5中获得的重组质粒转化至宿主菌。

该重组表达载体PDG-P43-SacB-pGS以枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因作为同源臂，将片段P43-SacB-pGS整合至枯草芽孢杆菌基因组中。

将上述重组质粒PDG-P43-SacB-pGS转化至野生型枯草芽孢杆菌WB800中，枯草芽孢杆菌感受态细胞制备遵循Anagnostopoulos和Spizizen在1961描述的经典营养降档法进行(Anagnostopoulos C.,et al.,1961，Requirements for transformation inBacillussubtilis)。重组克隆子RBs-GS经壮观基因(反应体系：2×PrimeSTAR MaxPremix 10μL，Spec-F:gaacaaggatacattcctcagaag，见SEQ ID NO:10和Spec-R:tggtatgattttacccgtgtcc，见SEQ ID NO:11各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃20s，32个循环后72℃延伸7min)、缺失的淀粉酶基因(反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，AmyE-F:ggttcttagacagggcattgaatga，见SEQ ID NO:12和AmyE-R:acatcagatgcatagtgggagata，见SEQ ID NO:13各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃20s，32个循环后72℃延伸7min)以及谷氨酰胺合成酶基因(反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，pGS-F/R各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃1min，32个循环后72℃延伸7min)PCR验证，电泳结果如图7所示。用淀粉平板通过碘液染色法验证阳性克隆子RBs-GS的淀粉酶基因缺失，结果如图8所示。

实施例2利用基因重组枯草芽孢杆菌分泌、表达pGS

将验证正确的重组枯草芽孢杆菌菌株RBs-GS进行发酵。

具体步骤为：挑取单克隆接种于5ml的LB培养基中，于37℃，200r/min下活化12-24h；取活化后的菌液按10％(v/v)的接种量接种在50mL的LB培养基中，于37℃，200r/min下培养2-14h，取重组菌的发酵菌悬液与对照菌(即野生型枯草芽孢杆菌WB800)的发酵菌悬液，用上海酶联生物科技有限公司生产的GSElisa测定试剂盒，根据试剂盒操作说明书对发酵菌悬液(即所得的pGS)的含量和活性进行检测，得到如图9和图10所示的结果。

实施例3重组枯草芽孢杆菌RBs-GS对仔鼠肠道的保护作用

将本发明重组的枯草芽孢杆菌株RBs-GS作为益生菌制剂，制备方法为:RBs-GS在摇床中以37℃，200r/min培养6h的发酵菌悬液即益生菌制剂。饲喂肠道受损的断奶仔鼠，目的是在动物水平上验证本发明的重组的枯草芽孢杆菌RBs-GS对断奶仔鼠受损肠道的修复能力。

试验分组情况

动物试验选取200只19-21d日龄体重相近的断奶仔鼠，分为成10个组别，每组3个重复，试验期为15d，其中基础日粮为华中农业大学动物实验中心提供为常规断奶仔鼠的基础日粮(也可购自商业饲料公司，为通用型实验动物饲料)。具体试验分组见表1。(在表1中：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌，K88为产肠毒素性大肠杆菌)。

表1断奶仔鼠饲喂试验分组处理

1.试验过程

将所有断奶仔鼠圈养在温度受控的环境中，具有12小时光照和12小时黑暗循环并且自由饮水和自由采食。试验开始前，先让断奶仔鼠适应3天。每组断奶仔鼠每天上午9：00通过无菌灌胃针进行灌胃一次，按照表1分别接受300μL的菌悬液(野生型枯草芽孢杆菌WB800和RBs-GS约为8×10 8CFU/mL；K88约为5×10 9CFU/mL)或者LB液体培养基。在整个实验过程中监测仔鼠的腹泻，行为异常或死亡现象。

2.测定指标

(1)试验小鼠一般体态特征观察

试验期间1-7d各组小鼠呼吸平稳，其它体征如行为、精神状态、皮毛光泽等没有异常，未出现中毒和死亡现象。第8天用产肠毒素性大肠杆菌K88(武汉华大瑞尔科技有限公司赠予)进行灌胃，致小鼠腹泻率达到75％，但未出现中毒和死亡现象。

(2)血清指标的测定

血清指标包括促炎症因子IL-1、IL-12p70、IL-1β、IFN-γ、抗炎症因子IL-10。试验第11天和15天时，各组随机抽取9只小鼠，进行眼眶采血。将采取的血液迅速装于真空促凝管中，倾斜静置于37℃恒温箱中，1h后，于4℃放置2h，4℃，3000r/min离心15min；吸取上清液，置于-20℃保存，用相应超敏电化学发光试剂盒(MESO SCALE DISCOVERY，上海优宁维生物科技有限公司)按照说明书操作对多个细孢因子指标进行测定。

结果见表2和表3：与野生型枯草芽孢杆菌WB800预防组、治疗组、预防+治疗组相比，本发明的重组GS预防组、治疗组、预防+治疗组在第9天时，提高IL-10抗炎症因子水平且降低IL-1、IL-1β、IFN-γ促炎症因子水平。在第15天时，由于小鼠的自我修复作用，炎症因子差异不明显。IL-12p70在血清中含量较低未被检测出。说明本发明的枯草芽孢杆菌RBs-GS对肠道损伤引发的炎症因子升高具有较好的抑制作用。

表2各组断奶仔鼠第11天血清炎症因子水平

表2的说明：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌。

表3各组断奶仔鼠第15天血清炎症因子水平

表3的说明：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌WB800。

(3)十二肠绒毛形态学观察

试验第11、15天时，将采血后的小鼠解剖，快速剪下每组断奶仔鼠的十二指肠、空肠、回肠组织约2cm直接放入固定液(4％甲醛溶液)，经过过夜→取材→水洗30min→脱水(70％乙醇3h、80％过夜、90％乙醇2h、95％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h)→水杨酸甲酯透明过夜→透蜡→包埋→制作蜡块。用于HE染色，肠道结构形态见图11和图12。对每组小鼠肠绒毛至少选择10个典型视野，统计分析绒毛高度。

由图13至图16结果显示：与野生型枯草芽孢杆菌WB800预防组、治疗组、预防+治疗组相比，本发明的重组GS预防组、治疗组、预防+治疗组在第9天、15天，十二指肠、空肠肠绒毛高度和宽度明显优于对照组(P<0.05)。因此本发明重组枯草芽孢杆菌RBs-GS能够预防和治疗炎症对肠绒毛的损伤，促进肠绒毛发育。

将本发明产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草孢杆菌灌胃小鼠，通过仔鼠的肠道结构形态、绒毛高度、血清指标等综合分析，验证了本发明菌株具有较好的预防和修复肠绒毛损伤作用。所以本发明的菌株有望作为一种新型饲料添加剂，为绿色养殖的推广打下坚实的基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌、构建方法及其应用

<140> 2019105547493

<141> 2019-06-25

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(P43-F)

<400> 1

cgggatccga gctcagcttt attgagtgg 29

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(P43-R)

<400> 2

gcaaactttt tgatgttcat gtgtacattc ctctcttacc 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(SacB-F)

<400> 3

ggtaagagag gaatgtacac atgaacatca aaaagtttgc 40

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(SacB-R)

<400> 4

aacccaagct tcgcaaacgc ttgagttgcg cct 33

<210> 5

<211> 337

<212> DNA

<213> P43(P43)

<400> 5

gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat gttttcgctt 60

gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 120

cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttac cgtgatttcg 180

tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 240

attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 300

atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacac 337

<210> 6

<211> 87

<212> DNA

<213> SacB(SacB)

<400> 6

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc gtttgcg 87

<210> 7

<211> 1122

<212> DNA

<213> pGS(pGS)

<400> 7

atggccacct cagcgagctc ccacttgaac aaaggcatca agcaggtgta catgtccctg 60

ccccagggcg agaaagtcca agctatgtac atctggattg acggtacggg agagggactg 120

cgctgcaaga cccggaccct ggattctgag cccaagtgta tagaagagtt gcccgagtgg 180

aatttcgatg gctctagtac ttttcagtct gaaggctcca acagtgacat gtatcttgtc 240

cctgctgcca tgtttcggga ccctttccgc aaggacccca acaagctggt gttctgtgag 300

gtcttcaagt acaaccgaaa gcctgcagag accaacttaa ggcacacctg taaacggata 360

atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg agcaggaata tactctcatg 420

ggcacagatg gacacccctt tggttggcct tccaatggct tccctgggcc ccaaggtccg 480

tactattgtg gtgttggagc agacaaagcc tatggcaggg acattgtgga ggctcactac 540

cgggcctgct tgtatgccgg catcaagatt gggggcacca atgccgaggt catgcccgcc 600

cagtgggaat tccagatcgg accctgtgaa ggaatcgaca tgggagatca cctctgggtg 660

gcccgattca tcttgcatcg tgtgtgcgaa gacttcggag tgatcgccac ctttgatcct 720

aagcccattc ctgggaactg gaatggtgcc ggctgccaca ccaactttag caccaaggcc 780

atgcgagagg agaatggtct gaagtacatc gaggaggcca tcgagaagct aagcaagcgg 840

caccagtacc acatccgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaacgc ccggcgccta 900

actggattcc atgaaacctc caacatcaac gacttttctg ccggcgtggc caaccgtggc 960

gctagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga agggttactt cgaagaccgt 1020

cgcccttctg ccaactgtga cccctttgcg gtgacagaag ctctcatccg cacgtgtctc 1080

ctcaacgaaa ctggcgacga gcccttccag tacaaaaact aa 1122

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(pGS-F)

<400> 8

gtaagagagg aatgtacaca agcttatggc cacctcagcg agctcc 46

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(pGS-R)

<400> 9

tcgccagggc tgcaggaatt cttagttttt gtactggaag g 41

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Spec-F)

<400> 10

gaacaaggat acattcctca gaag 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Spec-R)

<400> 11

tggtatgatt ttacccgtgt cc 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(AmyE-F)

<400> 12

ggttcttaga cagggcattg aatga 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(AmyE-R)

<400> 13

acatcagatg catagtggga gata 24

Claims (3)

1.一种产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO:M2019176；

所述产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

S1：分别针对P43基因和SacB基因设计引物，并扩增获得相应基因片段；

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接；

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建；

S4：针对谷氨酰胺合成酶基因设计引物，并扩增获得目标片段；所述谷氨酰胺合成酶为猪来源的谷氨酰胺合成酶，猪谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

S5：构建PDG-P43-SacB-pGS重组表达载体；

S6：将步骤S5中获得的重组质粒转化至宿主菌。

2.如权利要求1所述的产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在生产谷氨酰胺中的应用。

3.如权利要求1所述的产猪谷氨酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在益生菌制剂或动物饲料制备中的应用。

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