CN110172433B - 一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为出发菌株，通过同源重组敲除淀粉酶基因amy‑E并引入猪来源的表皮生长因子EGF，构建稳定且高分泌型工程菌，实现了猪表皮生长因子的高效分泌表达。动物实验表明该菌株对受损肠道具有较好的修复作用，同时能够降低IFN‑γ、IL‑1β、TNF‑α等炎症因子的分泌，促进肠绒毛生长，提高动物生长性能。为实现猪来源的表皮生长因子的工业化制备生产奠定了基础，为饲添抗生素的替代及畜牧业的健康、可持续发展提供技术支撑。

Description

一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

表皮生长因子是1962年Cohen用梭甲基纤维素柱从小鼠颇下腺分离纯化神经生长因子(NGF)时发现的一种活性物质，当时根据它促进新生小鼠门齿的萌出及眼睑睁开的功能，将它命名为“齿睑因子(Tooth-Lid Factor)”，随后发现这种多肽能够促进表皮生长，于是改称为“表皮生长因子(m EGF)”。表皮生长因子主要由唾液腺、胆汁、Paneth细胞、十二指肠的Brunner’s腺和胰腺等分泌至胃肠道，发育中的幼龄动物EGF主要来源于母乳和唾液。EGF对酸和热比较稳定，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化作用，这对其维持结构的稳定和发挥生物学作用具有重要的意义。

猪表皮生长因子(Epidermal growth factor，简称pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿，其功能和结构与人、小鼠、大鼠等动物的EGF类似。EGF是一种强有力的细胞分裂促进因子，它不仅在上皮细胞，而且在间皮和内皮细胞发挥其生物效应。EGF在机体发育中起作用，影响其生长和分化。EGF对生物体的作用表现得极为广泛，主要体现在:(1)在体内刺激皮肤组织、角膜、肺、气管上皮组织的生长繁殖；(2)诱导新生眼睑的打开；(3)加速胃溃疡的治疗和抑制胃酸的分泌；(4)增强表皮细胞的蛋白质、RNA的合成和细胞代谢；(5)加速角膜、肠道等创伤的修复；(6)对某些癌症的治疗有一定的疗效等。因此，猪表皮生长因子被广泛作为药物和饲料营养添加剂来提高动物肠道健康，促进营养物质消化吸收。此外表皮生长因子在化妆品和制药领域也具有诸多应用。

猪的血液、乳汁及胃液等含有的内源性pEGF很少，并且处于与受体结合的生理状态，从生物来源中提取pEGF比较困难且成本较高，难以实现。目前生产hEGF主要有2种途径：一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达pEGF。基因重组pEGF的基本策略首先构建出含pEGF目的基因的整合表达载体，再将该表达载体转化至枯草芽孢杆菌，使pEGF整合到枯草芽孢杆菌基因组中，最后对该重组枯草芽孢杆菌进行发酵，获得具有生物学活性的重组pEGF。

在现代集约化养殖生产体系下，为了获得最大的经济效益，仔猪的中、早期断奶被广泛采用。然而仔猪早期断奶不可避免地引起了断奶应激的发生，随断奶日龄的提前，断奶应激更加强烈，应激损伤更为严重。断奶应激引起仔猪肠道微生态环境失衡、功能紊乱、肠道发育受阻，而影响营养物质的消化、吸收，导致其生产性能下降，对病原微生物易感。生产上为了降低早期断奶应激对仔猪生产性能的影响，减少养殖业经济损失，通常采用在饲料中长期添加抗生素，由于抗生素的滥用，致使微生物产生耐药性，造成动物内源性感染和二重感染，易在畜产品和环境中造成残留等问题引起了人们的广泛关注。目前国内外推行健康养殖，生产绿色食品，允许作饲料添加剂的抗生素已寥寥无几。因此，开发或寻找替代抗生素的产品已经成为当今医药业和畜牧业开发的热点。

益生菌作为饲添抗生素最佳替代品之一已备受关注。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded safe”(GRAS)安全级别。作为食品安全级别的原核表达宿主，枯草芽孢杆菌具备大肠杆菌(E.coli)没有的一些优良特性，如非致病性，绝大多数对人畜无害，不产生内毒素和致热敏蛋白质；其分泌信号肽及分子伴侣系统非常高效，从而具有很强的分泌蛋白能力，有助于重组蛋白质保持其天然构象和生物活性。枯草芽孢杆菌有悠久广泛的应用历史，生长迅速、培养条件简单、遗传背景较清晰，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度，具备良好的发酵生产基础。近年来，枯草杆菌表达系统不断发展和完善,许多外源蛋白获得了高效表达，但同时也存在一些问题。蛋白酶的分泌是枯草杆菌作为表达宿主的限制因素之一，这些蛋白酶没有底物专一性；当外源蛋白分泌表达后，容易被这些蛋白酶降解，从而大大降低产量。而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800缺失了8种胞外蛋白酶，减少外源蛋白被降解的风险以提高蛋白表达量。因此，运用基因工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级猪表皮生长因子的有效途径，打破了猪表皮生长因子提取纯化困难的瓶颈，为实现猪表皮生长因子的工业化生产奠定了坚实的基础。本发明通过基因工程技术构建高效表达pEGF的枯草芽孢杆菌工程菌，改善动物肠道健康，以达到抗病、促生长的综合效果。为饲料添加剂抗生素的替代和畜牧业的健康、可持续发展提供了技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。本发明包括一种高效、稳定的表达猪表皮生长因子枯草芽孢杆菌工程菌的构建、筛选,以及初步应用，用于缓解仔猪断奶应激，改善断奶仔猪肠道健康，提高生产性能，减少养殖业由于仔猪应激造成的经济损失。

本发明技术方案如下所述：

申请人通过基因工程方法筛选得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌RBs-EGF，Bacillus subtilis RBs-EGF，于2019年3月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019175。

在本发明的实施方式中，本发明的猪表皮生长因子(基因登陆号为NCBI-Gene ID:X595 16.1)的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示(序列长度为1-159bp)。

在本发明的实施方式中，申请人以载体PDG1730为出发载体(基因登陆号为NCBI-Gene ID:U46199.1)，以来源于枯草芽孢杆菌的组成型启动子p43基因(基因登陆号为NCBI-Gene ID:EF473728.1)，该启动子基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示(序列长度为1-33 7bp)。信号肽SacB基因(基因登陆号为NCBI-Gene ID:MH614588.1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示(序列长度为1-84bp)，构建并重组表达载体转化野生型枯草芽孢杆菌WB800，利用酵母浸出物为碳源的无机盐培养基为发酵培养基发酵生产猪表皮生长因子，得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019175。

申请人提供了一种表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF的制备方法，所述的方法为：将枯草芽孢杆菌组成型启动子P43，信号肽SacB基因及猪表皮生长因子连接，以载体PDG1730为出发载体，构建得到重组表达载体PDG-P43-SacB-pEGF，用所得的重组表达载体转化枯草芽孢杆菌WB800，得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019175，利用酵母浸出物为碳源的无机盐培养基为发酵培养基大量增殖枯草芽孢杆菌RBs-EGF，生产猪表皮生长因子，

其中：

所述的猪表皮生长因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的枯草芽孢杆菌组成型启动子p43基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的信号肽SacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在上述制备方法中，所述的无机盐发酵培养基按照如下配方制备：酵母浸出物4～6g/L,胰蛋白胨8～12g/L和氯化钠8～12g/L。

在本发明的一种实施方式中，将种子(野生型枯草芽孢杆菌WB800)培养液按10％(v/v)的接种量接种到上步制备的发酵培养基中，培养温度为35-37℃，pH为6.0-7.0，培养时间为12-24h。

本发明得到一种表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，Bacillussubtilis RBs-EGF，于2019年3月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019175。

本发明的表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF可在制备饲用微生物制剂中应用。

与现有技术相比，本发明的重组枯草芽孢杆菌菌株具有如下优点：

(1)本发明采用原核表达系统成功实现真核动物来源的表皮生长因子异源高效活性表达，表皮生长因子通过发酵方式直接分泌到发酵上清中。

(2)本发明构建的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF菌株产生表皮生长因子的含量为0.3μg/L，而出发菌株生产的表皮生长因子含量仅为0.001μg/L，本发明的重组枯草芽孢杆菌菌株产生表皮生长因子含量较出发菌株提高了292倍。

(3)本发明构建的重组枯草芽孢杆菌菌株，是将表达猪表皮生长因子的基因直接整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，从而实现了蛋白的稳定表达，不会出现质粒随着菌株的传代次数增加而丢失。

(4)本发明的重组枯草芽孢杆菌菌株为“食品级”工业菌株，其培养方式简单，发酵时间短，生产效率高，为实现猪表皮生长因子的工业化生产奠定了坚实的基础。

(5)本发明的重组枯草芽孢杆菌可用于制备微生物制剂，该微生物制剂能显著修复断奶仔鼠的肠道损伤，有效缓解仔鼠的应激。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容

附图说明

图1：本发明构建的PDG-P43-SacB整合载体示意图。

图2：本发明从合成的P43载体上获得的P43片段的电泳图。附图标记说明：泳道M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：P43；泳道2：阴性对照。

图3：本发明从枯草芽孢杆菌中获得的信号肽SacB片段的电泳图。附图标记说明：泳道M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：SacB；泳道2：阴性对照。

图4：本发明利用重叠PCR方法获得的P43+SacB片段的电泳图。附图标记说明：泳道1为阴性对照；泳道2：P43+SacB

图5：本发明构建的重组表达载体PDG-P43-SacB-pEGF的图谱。

图6：本发明从猪肾细胞PK15获取pEGF基因PCR扩增检测结果的电泳图。附图标记说明：泳道M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1-4：表皮生长因子基因；泳道5：阴性对照。

图7：本发明构建的EGF双交换枯草芽孢杆菌中壮观基因(spc，NCBI-Gene ID:MF927932.1)、淀粉酶基因(amy-E，NCBI-Gene ID:MG264159.1)、pEGF基因(SEQ ID NO:1)的电泳图。附图标记说明：泳道M:DL 2000DNA分子量标准；泳道1-3：SPC基因、spc+、spc-；泳道4-6：Amy-E、Amy-E+、Amy-E-；7-9:EGF、EGF+、EGF-。

图8：利用淀粉平板通过碘液染色法验证重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF淀粉酶基因缺失的电泳图。附图标记说明：泳道1：野生型枯草芽孢杆菌菌株WB800；2：本发明构建的枯草芽孢杆菌菌株RBs-EGF。

图9：利用pEGF的Elisa试剂盒检测本发明构建的重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中pEGF的含量。

图10：小鼠十二指肠石蜡切片图。附图标记说明：图10中的A图为小鼠灌胃11d后，各组小鼠十二指肠绒毛的结构形态；图10中的B图为小鼠灌胃15d后，各组小鼠十二指肠绒毛的结构形态。

图11：小鼠十二指肠绒毛高度对比图。附图标记说明：图11中的A图为小鼠灌胃11d后，各组小鼠十二指肠绒毛高度结果分析；图11中的B图为小鼠灌胃15d后，各组小鼠十二指肠绒毛高度结果分析。

图12：小鼠空肠绒毛高度对比图。。附图标记说明：图12中的A图为小鼠灌胃11d后，各组小鼠空肠绒毛高度结果分析；图12中的B图为小鼠灌胃15d后，各组小鼠空肠绒毛高度结果分析。

具体实施方式

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是猪表皮生长因子基因(pEGF)的核苷酸序列。序列长度为1-159bp。

SEQ ID NO:2是启动子p43基因的核苷酸序列。序列长度为1-337bp。

SEQ ID NO:2是信号肽SacB基因的核苷酸序列。序列长度为1-84Bp。

实施例1中间质粒PDG-P43-SacB的构建：

1、引物的设计：

正向引物P43-F:CGggatccgagctcagctttattgagtgg，

反向引物P43-R:GCAAACTTTTTGATGTTCATgtgtacattcctctcttacc；

正向引物SacB-F:ggtaagagaggaatgtacacATGAACATCAAAAAGTTTGC，

反向引物SacB-R:aacccaagcttCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCT；

使用常用重叠PCR方法(陈国梁等，重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建，2010)将P43基因(启动子)片段(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与信号肽SacB基因片段(登陆号NCBI-Gene ID:MH614588.1)相连，然后将PDG1730(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与P43+SacB经BamHI和HindIII酶切后连接，构建得到整合载体PDG-P43-SacB(见图1)。

本实施例中，起始质粒PDG1730和野生型枯草芽孢杆菌WB800，由华中农业大学生命科技学院孙明教授惠赠，大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

3、试剂

限制性内切酶BamHI、HindIII以及2×PrimeSTAR Max Premix购自宝生物工程大连有限公司，壮观基因购自sigma公司。

3、基因片段来源

P43基因片段(登录号NCBI-Gene ID:EF473728.1)由天一辉远生物科技有限公司合成，克隆在PJET1.2载体上。

P43启动子基因片段的制备：用正向引物P43-F和反向引物P43-R，从含有P43基因片段的载体PJET1.2中扩得。采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F/P43-R引物各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃ 2min预变性；98℃ 10s,，60℃ 5s，72℃ 10s，32个循环后72℃延伸至7min。将所得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳,所得的片段大小与预期相符，为337个碱基对(见图2)，该片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:2所述。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

信号肽SacB基因片段制备：用正向引物SacB-F和反向引物SacB-R，从野生型枯草芽孢杆菌WB800基因组中扩得。反应程序：采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入正向引物SacB-F/反向引物SacB-R各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃ 2min预变性，98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 10s，32个循环后72℃延伸7min。将PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳,所得的片段大小与预期相符，为87个碱基对(见图3)，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

P43+SacB基因片段的制备：用以上述纯化后的P43和SacB基因片段为模板，采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F和SacB-R引物各1.5μL，基因模板P43和SacB各1μL，去离子水20μL，混匀后置于PCR仪，按如下程序运行：94℃ 2min预变性；98℃ 10s,60℃5s，72℃ 10s，32个循环后72℃延伸7min。将产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，片段大小与预期相符，为424个碱基对(见图4)。剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

2、质粒和菌株的制备

(1)质粒PDG1730的酶切

向1μg的质粒PDG1730中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(2)P43+SacB基因片段的酶切

向1μg的P43+SacB基因片段中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg基因片段。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(3)PDG-P43-SacB重组质粒的构建

将步骤(1)和步骤(2)中保存的片段按以下配比加连接酶进行连接处理：PDG17301μL，P43+SacB基因片段5μL，T4DNA连接酶1μL，Buffer 2μL，去离子水11μL。22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，用含壮观霉素(100μg/mL)的抗性平板筛选，挑取单菌落进行新的PCR验证，对获得的阳性重组质粒PDG-P43-SacB进行测序，从测序结果正确的菌落中提取质粒，用于进一步试验。

实施例2重组表达质粒PDG-P43-SacB-pEGF的构建

1、试验材料与方法

(1)引物设计：

正向引物pEGF-F:CCCAAGCTTATGAATAGTTACTCTGAATGCCC，

反向引物pEGF-R:GGAATTCTTAGCGCAGCTCCCACCATTTCAA；

构建重组PDG-P43-SacB-pEGF表达载体(图谱见图5)，将基因片段pEGF和质粒PDG-P43-SacB分别经HindIII和EcoRI处理后，用T4连接酶连接，以PDG1730以淀粉酶基因为整合位点，将片段P43-SacB-pEGF整合至基因组中。

(2)质粒和菌株筛选材料的来源

野生型枯草芽孢杆菌WB800，为华中农业大学生命科技学院孙明教授惠赠,质粒PDG-P43-SacB的构建参见本实施例的前述部分。

(3)相关试剂准备

试验用的限制性内切酶HindIII、EcoRI以及2×PrimeSTAR Max Premix购自宝生物工程大连有限公司，壮观霉素购自sigma公司。

(4)基因片段的制备：

猪表皮生长因子(pEGF)从PK15细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)提取RNA，经反转录后，用正向引物pEGF-F和反向引物pEGF-R从cDNA中扩得。采用2×PrimeSTARMax Premix 25μL，加入正向引物pEGF-F/R反向引物各1.5μL，基因模板cDNA2μL，去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序：94℃ 5min预变性，94℃ 30s，60℃ 30s,，72℃10s，32个循环后72℃延伸至7min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，所得片段大小与预期相符，为165个碱基对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，见图6。

(5)质粒PDG-P43-SacB的酶切

向1μg的PDG-P43-SacB质粒中分别加入1.5μL限制性内切酶HindIII和EcoRI，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(6)pEGF基因片段的酶切

向1μg的pEGF基因片段中分别加入1.5μL限制性内切酶HindIII和EcoRI，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg的pEGF基因片段。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(7)PDG-P43-SacB-pEGF重组表达载体的构建

将步骤(1)和步骤(2)中保存的片段按照以下配比加连接酶进行连接处理：PDG-P43-SacB1μL，pEGF基因片段5μL，T4DNA连接酶1μL，Buffer 2μL，去离子水11μL。22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，用壮观霉素(100μg/mL)进行抗性筛选，挑取单菌落进行PCR验证，将所得的阳性重组质粒PDG-P43-SacB-pEGF进行测序，挑选测序结果正确的菌落中提取质粒，用于下一步试验。

将上述重组质(或称为载体)粒PDG-P43-SacB-pEGF转化野生型枯草芽孢杆菌WB800基因组，枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备遵循Anagnostopoulos和Spizizen在1961描述的经典营养降档方(Anagnostopoulos C.,et al.,1961，Requirements fortransformation in Bacillus subtilis)进行。重组克隆子经PCR验证，电泳鉴定，结果如图7所示。用淀粉平板通过碘液染色法验证阳性克隆子的淀粉酶基因缺失，结果如图8所示。

实施例3利用基因重组的枯草芽孢杆菌分泌、表达猪表皮生长因子(pEGF)

将验证正确的重组枯草芽孢杆菌菌株RBs-EGF进行发酵。具体步骤为：挑取单克隆接种于5ml的LB培养基中，于37℃，200r/min下活化14h；取活化后的菌液按10％(v/v)的接种量接种在50mL的LB培养基中，于37℃，200r/min下培养2-14h，取重组枯草芽孢杆菌菌株的发酵菌悬液与对照菌(即野生型枯草芽孢杆菌WB800)的发酵菌悬液，用上海酶联生物科技有限公司生产的EGF Elisa测定试剂盒，根据试剂盒操作说明书对发酵菌悬液(即所得的pEGF)的含量进行检测，得到如图9所示的结果。

实施例4利用重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF对断奶仔鼠的肠道进行保护验证

将本发明重组的枯草芽孢杆菌株RBs-EGF作为益生菌制剂(益生菌制剂的制备方法为常规方法，实施本发明是直接利用枯草芽孢杆菌株RBs-EGF作为益生菌制剂，即直接为枯草芽孢杆菌株RBs-EGF菌体和培养基中残存的菌丝，未经过纯化)饲喂肠道受损的断奶仔鼠，目的是在动物水平上验证本发明的重组的枯草芽孢杆菌对断奶仔鼠受损肠道的修复能力。

1.试验分组情况

动物试验选取200只19-21d日龄体重相近的断奶仔鼠，分为成10个组别，每组3个重复，试验期为15d，其中基础日粮为华中农业大学动物实验中心提供为常规断奶仔鼠的基础日粮(也可购自商业饲料公司，为通用型实验动物饲料)。具体试验分组见表1。(在表1中：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌，K88为产肠毒素性大肠杆菌)。试验分组设计见表1。

表1断奶仔鼠饲喂试验分组处理

对表2中生物材料的说明：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌。

1.试验过程

将所有断奶仔鼠圈养在温度受控的环境中，具有12小时光照和12小时黑暗循环并且自由饮水和自由采食。试验开始前，先让断奶仔鼠适应3天。每组断奶仔鼠每天上午9：00通过无菌灌胃针进行灌胃一次。每组幼鼠每天按照表1分别接受300μL的菌悬液(野生型枯草芽孢杆菌WB800WB800和RBs-EGF为8×10⁸CFU/mL；K88为5×10⁹CFU/mL)或者LB液体培养基。在整个实验过程中监测仔鼠的腹泻，行为异常或死亡现象。

2.测定指标

(1)试验小鼠一般体态特征观察

试验期间1-7d各组小鼠呼吸平稳，其它体征如行为、精神状态、皮毛光泽等没有异常，未出现中毒和死亡现象。第8天用产肠毒素性大肠杆菌K88(武汉华大瑞尔科技有限公司赠予)进行灌胃，致小鼠腹泻率达到75％，但未出现中毒和死亡现象。

(2)血清指标的测定

血清指标包括促炎症因子IL-1、IL-12p70、IL-1β、IFN-γ、抗炎症因子IL-10。试验第11天和15天时，各组随机抽取9只小鼠，进行眼眶采血。将采取的血液迅速装于真空促凝管中，倾斜静置于37℃恒温箱中，1h后，于4℃放置2h，4℃，3000r/min离心15min；吸取上清液，置于-20℃保存，用相应超敏电化学发光试剂盒(MESO SCALE DISCOVERY，上海优宁维生物科技有限公司)按照说明书操作对多个细胞因子指标进行测定。

结果显示(见表2和表3)：与野生型枯草芽孢杆菌WB800预防组、治疗组、预防+治疗组相比，本发明的重组EGF预防组、治疗组、预防+治疗组在第9天时，提高IL-10抗炎症因子水平且降低IL-1、IL-1β、IFN-γ促炎症因子水平。在第15天时，由于小鼠的自我修复作用，炎症因子差异不明显。IL-12p70在血清中含量较低未被检测出。说明本发明的枯草芽孢杆菌RBs-EGF对肠道损伤引发的炎症因子升高具有较好的抑制作用。

表2各组断奶仔鼠第11天血清炎症因子水平

表2的说明：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌。

表3各组断奶仔鼠第15天血清炎症因子水平

表3的说明：WB800益生菌即野生型枯草芽孢杆菌。

(3)十二肠绒毛形态学观察

试验第11、15天时，将采血后的小鼠解剖，快速剪下每组断奶仔鼠的十二指肠、空肠、回肠组织约2cm直接放入固定液(4％甲醛溶液)，经过过夜→取材→水洗30min→脱水(70％乙醇3h、80％过夜、90％乙醇2h、95％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h)→水杨酸甲酯透明过夜→透蜡→包埋→制作蜡块。用于HE染色，肠道结构形态见图10。第11天和15天重组EGF预防组、治疗组、预防+治疗组的十二指肠绒毛高度和宽度明显优于对照组，且绒毛排列整齐。对每组小鼠肠绒毛至少选择10个典型视野，统计分析绒毛高度。

由图11和图12结果显示：与野生型枯草芽孢杆菌WB800预防组、治疗组、预防+治疗组相比，本发明的重组EGF预防组、治疗组、预防+治疗组在第9天、15天，十二指肠、空肠绒隐比高(P<0.05)。因此本发明重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF能够防止炎症对肠绒毛的损伤，促进肠绒毛发育。

将本发明产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌灌胃小鼠，通过仔鼠的肠道结构形态、绒毛高度、血清指标等综合分析，验证了本发明菌株具有较好的修复肠绒毛损伤功能。所以本发明的菌株有望作为一种新型饲料添加剂，为绿色养殖的推广打下坚实的基础。

参考文献

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用

<141> 2019-04-26

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<220>

<221> gene

<222> (1)..(159)

<400> 1

aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60

atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120

cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159

<210> 2

<211> 337

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(337)

<400> 2

gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat gttttcgctt 60

gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 120

cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttac cgtgatttcg 180

tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 240

attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 300

atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacac 337

<210> 3

<211> 87

<212> DNA

<213> 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(87)

<400> 3

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc gtttgcg 87

Claims (4)

1.一株表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ） RBs-EGF，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019175。

2.一株表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF的制备方法，其特征在于：

将枯草芽孢杆菌组成型启动子P43，信号肽SacB基因及猪表皮生长因子连接，以载体PDG1730为出发载体，构建得到重组表达载体PDG-P43-SacB-pEGF，用所得的重组表达载体转化枯草芽孢杆菌WB800，得到一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019175，利用酵母浸出物为碳源的无机盐培养基为发酵培养基，发酵培养含猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-

EGF，

其中：

所述的猪表皮生长因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的枯草芽孢杆菌组成型启动子p43基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的信号肽SacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的一株 表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF 的制备方法，其特征在于：所述的无机盐发酵培养基按如下配方制备：酵母浸出物4～6g/L,胰蛋白胨8～12g/L和氯化钠8～12g/L。

4.权利要求1所述的表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF在制备饲用微生物制剂中的应用。

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