CN102586167B - 一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法，该重组菌株由以下步骤构建得到：(1)通过融合PCR将P43启动子+信号肽基因与subtilisin-like protease基因连接，再将融合PCR扩增产物转化入枯草芽孢杆菌WB800，得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S；(2)PCR扩增茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因，然后将扩增产物转化入枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG。将枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800S/proMTG发酵、纯化，得到可溶性的转谷氨酰胺酶。本发明方法可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的转谷氨酰胺酶，省去了繁琐的细胞破碎、纯化后激活酶原等过程，简化了发酵生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于转谷氨酰胺酶基因工程领域，具体涉及一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法。
背景技术
微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTG)是一种通过催化多肽链中酰基基团转移使蛋白质之间发生共价交联反应的转移酶。它催化蛋白分子之间发生交联反应，提高蛋白质的水溶性、持水性、塑性和热稳定性等，从而提高蛋白质的应用价值。该酶已在医药工业、食品工业和纺织工业等广泛利用，有“21世纪超级粘合剂”的美称，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种，显示出显著的应用前景及优势，因而引起了人们的高度重视。
国外在转谷氨酰胺酶特性及应用性的研究已经有很多报道，主要是利用从动物器官组织中提取的酶样品进行试验。但是动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵，因此该酶的生产应用一直受到很大的限制。
日本Ando等(Ando H，Adachi M，Umeda K，et al.Purification and characteristicsof a novel transglutaminase derived from microorganisms.Agric BiolChem.1989，53：2613-2617.)首先报道以轮枝链霉菌属发酵生产微生物转谷氨酰胺酶(MTG)，获得了巨大的经济效益，吸引了国内外各方的广泛关注和极大的兴趣。
国内亦有大量文献报道。目前，主要是通过以下几种方法来提高MTG的产量：第一，通过诱变育种筛选高效产酶的菌株，包括传统诱变育种和太空诱变育种，如日本味之素公司就是采用经诱变的茂原链霉菌发酵生产MTG(AndoH，Adachi M，Umeda K，et al.Purification and characteristics of a noveltransglutaminase derived from microorganisms[J].Agric Biol Chem.1989，53：2613-2617.)，但是这种方法获得的高产菌很容易退化，生产不稳定；国内王璋等(王璋，王灼维，袁辉，等.微生物转谷氨酰胺酶生产菌的“神舟四号”飞船搭载育种研究[J].食品与发酵工业，2003，29(1)：6-12.)将MTG生产菌搭载到“神舟四号”飞船进行育种研究，但是效果也不理想。
第二，通过基因工程的方法构建高效表达MTG的工程菌株，但是目前基因工程生产MTG所用的宿主主要为大肠杆菌，需要经过细胞破碎后才能获得，如在王莉等(王莉，常忠义，李平作.转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达.中国生物工程杂志.2004，11：56-60)构建了基因工程菌成功地表达了MTG，所产生的MTG不仅存在于胞内，而且还以包涵体的形式存在，要获得具有活性的MTG需要经过细胞破碎，包涵体变性、复性等复杂过程，其过程很是繁琐，很难实现工业化生产。Christian K等(Christian K.Marx，Thomas C.2008.Hertel.Purification and activation of a recombinant histidine-tagged pro-transglutamine aftersoluble expression in Escherichia coli and partial characterization of the activeenzyme.Enzyme and Microbial Technology.2008，42：568-575)报道的生产MTG的方法，虽然实现了MTG的可溶性表达，但是MTG是以酶原的形式存在于胞内，面临细胞破碎、酶原激活等问题；
针对以上问题，现在国内外基因工程生产MTG主要集中在胞外生产MTG，如Yoshimi Kikuchi等(Yoshimi Kikuchi，Masayo Date，kei-ichi Yokoyama etal.Secretion of Active-Form Streptoverticillium mobaraense Transglutaminase byCorynebacterium glutamicum：Processing of the Pro-Transglutaminase by aCosecreted Subtilisin-Like Protease from Streptomyces albogriseolus[J].Applied andEnvironmental Microbiology.2003，Jan.358-366)报道将一种蛋白酶与转谷氨酰胺酶原同时转入谷氨酸棒杆菌中，在30h时有pro-MTG的表达，在45h时开始有MTG的产生，在70h时达到最大产量，其产量为142mg/L，酶活为58.2U/L。该报道虽然克服了利用大肠杆菌作为宿主时存在的一系列问题，但是同样存在一些问题，如发酵时间过长，要70h才能达到最大产量、产量不高，不能实现工业化生产。
枯草芽孢杆菌是美国FDA公认的几种Generally recognized as safe(GRAS)生物之一，因此被广泛应用在食品工业，相比较于大肠杆菌等革兰氏阴性菌，枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，其胞质空间没有脂多糖(内毒素的主要成分)，因此更安全。同时枯草芽孢杆菌具有天然的高效分泌系统，可以将目的蛋白直接分泌到胞外，另外相对于胞内环境，胞外的环境更有利于重组蛋白的折叠，不容易形成包涵体。
枯草芽孢杆菌作为基因工程生产外源重组蛋白具有显著优势，据报道，目前60％的商业化酶都是以枯草芽孢杆菌作为宿主生产的。罗宁等(罗宁，杨慧林，沈徐凯，郑明英.转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌WB800中的表达.现代食品科技.2011，7：734-737)报道了以枯草芽孢杆菌生产MTG的方法，但是是以酶原的形式表达，没有活性，经纯化后，需要用胰蛋白酶激活才具有生物活性。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株重组的枯草芽孢杆菌，该菌株是将转谷氨酰胺酶酶原基因和一种金属蛋白酶基因同时转入枯草芽孢杆菌WB800后得到的，该菌株能够同时表达转谷氨酰胺酶酶原和一种金属蛋白酶，通过该金属蛋白酶切割转谷氨酰胺酶酶原，在发酵液中直接获得具有生物活性的转谷氨酰胺酶。
本发明的另一目的在于提供一种由上述重组的枯草芽孢杆菌生产转谷氨酰胺酶的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株重组的枯草芽孢杆菌，由以下步骤构建得到：
(1)构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S：PCR扩增白浅灰链霉菌蛋白酶subtilisin-like protease基因；PCR扩增P43启动子+samyQ信号肽基因；然后通过融合PCR将P43启动子+信号肽基因与subtilisin-like protease基因连接，再将融合PCR扩增产物连接入PKS2质粒基因，最后将重组的PKS2质粒转化入枯草芽孢杆菌WB800，得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S；
(2)构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG：PCR扩增茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因，然后将扩增产物连接入表达载体pBEP43中，得到融合表达质粒pBEP43-proMTG；将质粒pBEP43-proMTG转化入步骤(1)的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG，该菌株能够高水平表达可溶性的转谷氨酰胺酶。
枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2011492。
上述重组的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG可用于生产转谷氨酰胺酶。
上述重组的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG用于生产转谷氨酰胺酶，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG在37℃的LB培养基中培养12～14h，得到活化的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG；然后将活化的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG以体积比1-2％的接种量接种到LB培养基中，37℃发酵24-96h，将发酵液离心、取上清液，将上清液纯化即得到可溶性的转谷氨酰胺酶。
所述的LB培养基中添加有卡那霉素；
所述的发酵时间优选48h；
所述的离心是8000rpm离心5min；
所述的纯化是用亲和层析柱纯化，以咪唑溶液洗脱；
所述的亲和层析柱优选HisTrap FF crude柱。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明先将一种来自白浅灰链霉菌的金属蛋白酶subtilisin-like protease基因通过同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌WB800基因组上，构建枯草芽孢杆菌WB800S，然后将茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的基因克隆至表达载体pBEP43，转化枯草芽孢杆菌WB800S，利用金属蛋白酶subtilisin-like protease切割转谷氨酰胺酶酶原，实现了可溶性表达转谷氨酰胺酶，而且可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的转谷氨酰胺酶，省去了繁琐的细胞破碎、纯化后激活酶原等过程，简化了发酵生产工艺。
附图说明
图1是subtilisin-like protease基因PCR扩增产物电泳结果图。
图2是P43启动子和samyQ信号肽编码基因PCR扩增产物电泳结果图。
图3是融合基因PCR扩增产物电泳结果图。
图4是转谷氨酰胺酶酶原基因PCR扩增产物电泳结果图。
图5是枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG发酵上清液SDS-PAGE电泳结果图。
图6是枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG发酵上清液纯化后的SDS-PAGE电泳结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一株重组的枯草芽孢杆菌，由以下步骤构建得到：
步骤一：构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S
(1)PCR扩增subtilisin-like protease基因：
白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)subtilisin-like protease的核苷酸序列是从NCBI获得，见序列表SEQ ID No.1。以1μL白浅灰链霉菌(购买于广东省微生物菌种保藏中心)基因组DNA为PCR反应模板，subtilisin-likeprotease基因正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，扩增出一条与subtilisin-like protease基因大小相符的DNA片段，如图1所示，图中泳道1为DNA marker；泳道2、3均为PCR产物(subtilisin-like protease编码基因)。
(2)PCR扩增P43启动子+samyQ信号肽编码基因：
P43启动子+samyQ信号肽的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2。将pBEP43质粒(该质粒可参照以下文献记载的方法构建：罗宁，杨慧林，沈徐凯，郑明英.转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌WB800中的表达.现代食品科技.2011，7：734-737)稀释100倍后取1μL作为PCR反应模板，P43启动子+samyQ信号肽基因正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7，扩增出一条大小与SEQ ID No.2相符的DNA片段，如图2所示，图中泳道1为DNAmarker；泳道2、3均为PCR产物(P43启动子+samyQ信号肽)。
(3)融合PCR扩增P43启动子+samyQ信号肽编码基因及subtilisin-likeprotease基因：
分别将P43启动子+samyQ信号肽编码基因、subtilisin-like protease基因PCR扩增的产物胶回收，然后取等摩尔比例的扩增产物作为模板，所用正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.5，扩增出一条与目的产物大小相符的DNA片段，如图3所示，图中泳道1为DNA marker；泳道2、3均为PCR产物。
(4)融合质粒PKS2-subtilisin-like protease的构建：
将温敏性质粒PKS2(该质粒是在NYU Langone Medical Center的KonstantinShatalin馈赠的PKS1的基础上，将其中的三个BamHI酶切位点消除而得)用EcoRV单酶切，去磷酸化，然后用T4DNA连接酶连接上下同源臂，所使用的同源臂是枯草芽孢杆菌amyE基因，将融合PCR的产物插入上下同源臂之间，即成功构建融合质粒PKS2-subtilisin-like protease。
(5)subtilisin-like protease基因整合到枯草杆菌WB800基因组上：
将构建好的融合质粒PKS2-subtilisin-like protease转化枯草芽孢杆菌WB800，通过同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌WB800基因组上，转化方法参见以下文献记载Natalia P，Zakataeva，Oksana V et al.A simple method tointroduce marker-free genetic modification into chromosome of naturallynontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol.2010，85：1201-1209)，得到新的菌株B.subtilis WB800S。
步骤二：构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG
(1)PCR扩增转谷氨酰胺酶酶原基因：
茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列从文献(Washizu，K；Ando，K；Koikeda，S et al.Molecular Cloning of the Gene forMicrobial Transglutamine from Streptomyces mobaraensis and Its Expression inStreptomyces lividans[J].Biosci.Biotech.Biochem.1994，58(1)，82-87.)中获得，转谷氨酰胺酶酶原基因的序列见序列SEQ ID No.3，以1μL茂原链霉菌(购于广东省微生物菌种保藏中心)基因组DNA为PCR反应模板，转谷氨酰胺酶酶原基因正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示，扩增出一条大小上述文献报道相符的DNA片段，如图4所示，图中泳道1为DNAmarker；泳道2、3均为PCR产物(转谷氨酰胺酶酶原基因)。
(2)表达质粒pBEP43-proMTG的构建：
通过PCR扩增获得表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段，通过BamHI、XbaI双酶切，克隆到载体pBEP43中，构建表达载体pBEP43-proMTG，并转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S成为工程菌B.subtilis WB800S/proMTG。
枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2011492。
实施例2
一种由实施例得到的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG生产转谷氨酰胺酶的方法，包括以下步骤：
(1)挑取枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG的单菌落于10mL LB培养基中(含Kan 10μg/mL)，37℃，200rpm活化12h，将活化的种子接种于50mL LB培养基中(含Kan 10μg/mL)接种量为1-2％(体积比)，37℃，200rpm分别发酵24h、48h、60h、72h后离心取上清液，上清液的SDS-PAGE电泳图如图5所示，发现发酵48h时MTG(转谷氨酰胺酶)产量最高。
(2)HisTrap柱亲和层析纯化MTG
采用GE公司AKTApurifier层析仪和5mL HisTrap FF crude柱纯化蛋白，包括以下步骤：
2.1用蒸馏水洗柱至基线平稳。
2.2用buffer B(0.5M咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH8.0)平衡柱子至基线平稳，流速为10mL/min。
2.3用bufferA(0.5MNaCl，20mM Tris·HCl，pH8.0)平衡柱子至基线平稳，流速为10mL/min。
2.4上样，流速为5mL/min。
2.5用buffer A平衡柱子至基线平稳，流速为5mL/min。
2.6用buffer B洗脱，见峰起开始收集蛋白。MTG纯化后SDS-PAGE的结果见图6(最右边的泳道是未经纯化的样品，中间的两条泳道是经过纯化的样品)，纯化效果见表1所示：
表1
传统方法利用链霉菌发酵生产转谷氨酰胺酶酶活只有2U/mL左右，且发酵周期长，生产条件复杂，本发明构建的基因工程菌生产的转谷氨酰胺酶酶活可以达到这一水平，而且周期短，相比于链霉菌而言，更容易培养；相比于谷氨酸棒杆菌生产的转谷氨酰胺酶，其酶活及产量都要高，因此本发明相比于其他生产转谷氨酰胺酶的方法具有很大的优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一株重组的枯草芽孢杆菌，其特征在于是由以下步骤构建得到：
(1)构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S：PCR扩增白浅灰链霉菌蛋白酶subtilisin-like protease基因；PCR扩增P43启动子+samyQ信号肽基因；然后通过融合PCR将P43启动子+信号肽基因与subtilisin-like protease基因连接，再将融合PCR扩增产物连接入PKS2质粒基因，最后将重组的PKS2质粒转化入枯草芽孢杆菌WB800，得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S；
(2)构建枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG：PCR扩增茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因，然后将扩增产物连接入表达载体pBEP43中，得到融合表达质粒pBEP43-proMTG；将质粒pBEP43-proMTG转化入步骤(1)的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG；
所述的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG已于2011年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011492。
2.权利要求1所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG在37℃的LB培养基中培养12～14h，得到活化的枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800S/proMTG；然后将活化的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG以体积比1-2％的接种量接种到LB培养基中，37℃发酵24-96h，将发酵液离心、取上清液，将上清液纯化即得到可溶性的转谷氨酰胺酶。
4.根据权利要求3所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于：所述的LB培养基中添加有卡那霉素。
5.根据权利要求3所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于：所述的发酵时间为48h。
6.根据权利要求3所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于：步骤(3)所述的离心是8000rpm离心5min。
7.根据权利要求3所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于：步骤(3)所述的纯化是用亲和层析柱纯化，以咪唑溶液洗脱。
8.根据权利要求3所述的重组的枯草芽孢杆菌在生产转谷氨酰胺酶中的应用，其特征在于：所述的亲和层析柱为HisTrap FF crude柱。
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