CN103937823A - 增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 - Google Patents
增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103937823A CN103937823A CN201410091226.7A CN201410091226A CN103937823A CN 103937823 A CN103937823 A CN 103937823A CN 201410091226 A CN201410091226 A CN 201410091226A CN 103937823 A CN103937823 A CN 103937823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xylanase
- s7xyn
- subtilis
- samyq
- pbep43
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 title claims abstract description 29
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000004076 pulp bleaching Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 6
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 claims description 4
- 230000002478 diastatic effect Effects 0.000 claims 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 abstract description 11
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 abstract description 11
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 abstract description 7
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 abstract description 7
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 abstract description 7
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 38
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 22
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 6
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 6
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 5
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 3
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 3
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 2
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetate Chemical compound [Na+].NCC([O-])=O WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 206010004173 Basophilia Diseases 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710196208 Fibrinolytic enzyme Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用。增强纤维素结合能力的改良木聚糖酶基因的完整全基因序列为SEQ.ID.NO1。含有所述改良木聚糖酶基因的重组载体pBEP43-SamyQ-S7XYN转化到枯草芽孢杆菌，携带该质粒的菌株Bacillus subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN的保藏号为CCTCC M2014033。本发明将该木聚糖酶基因和纤维素结合域融合，实现融合基因在枯草芽孢杆菌中的表达，重组融合木聚糖酶S7XYN可有效识别和结合纤维素或纸浆，融合木聚糖酶结合微晶纤维素、芦苇浆能力较未融合酶分别提高了35倍和25倍，纸浆辅助漂白效果明显改善。
Description
技术领域
本发明涉及一种木聚糖酶，特别是涉及一种能在枯草芽孢杆菌中高效表达的重组融合木聚糖酶基因序列和高表达该融合木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，以及从该工程菌中生产得到的重组融合木聚糖酶。
背景技术
碳水化合物结合结构域（CBM）是一类广泛存在于很多种水解酶中的非催化活性结构域，该结构域通过连接肽（Linker）和酶的催化结构域（CD）构成水解酶的主要结构。不同的CBM能分别识别并结合不同的多糖，如几丁质、β-葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉和木聚糖等。纤维素是许多商品的重要原材料，在原材料的加工处理阶段使用CBM可起到靶向定位作用。如将CBM与果胶降解酶结合，酶在CBM的作用下定位到含纤维素的衣料上，在粗斜纹棉布的石磨砂洗工艺中取得了较好的效果，同时CBM的融合还能增强洗涤相关酶和与纺织物的紧密结合，从而降低酶用量。
木聚糖酶在水解自然界中广泛存在的半纤维素起到了重要的作用。木聚糖酶的来源相对广泛，真菌和反刍动物瘤胃、在海洋及陆地细菌、蜗牛、海洋藻类、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。但不同来源，不同种类的木聚糖酶催化特性不一样。嗜盐芽孢杆菌S7木聚糖酶来源于嗜碱性细菌嗜盐芽孢杆菌S7（简称S7-xyn，GenBank:AY687345），申请人获批的中国发明专利（CN201010256129.0）实现了其在毕赤酵母中的表达，该木聚糖酶S7-xyn的相对分子质量和等电点pI分别为43kDa和4.5；在pH分别为9和10的条件下，其最适温度分别为75℃和70℃。木聚糖酶S7-xyn能够同时在高温和碱性环境中，保持高酶活力，符合纸浆漂白的工艺要求，该酶已经被证实可应用于麦草浆辅助漂白。但我们在近一步推广S7-xyn的应用时发现，S7-xyn既不能吸附不溶性的木聚糖，也不能吸附纤维素，对纤维素和半纤维素的识别能力和结合能力较弱，严重削弱了其在制浆造纸工业中的应用前景。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种具有纤维素结合能力的木聚糖酶基因，是一种能在枯草芽孢杆菌中高效表达的重组融合木聚糖酶基因序列；
本发明的目的之二是提供含有所述改良木聚糖酶基因的重组载体；
本发明的目的之三是提供含有所述的重组载体的枯草芽孢杆菌；
本发明目的之四是提供所述枯草芽孢杆菌生产的重组融合木聚糖酶在纸浆漂白中的应用，通过重组融合木聚糖酶提供纸浆漂白效果。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种增强纤维素结合能力的改良木聚糖酶基因，其完整全基因序列为SEQ.ID.NO1。
一种含有所述改良木聚糖酶基因的重组载体pBEP43-SamyQ-S7XYN，该改良木聚糖酶基因的重组载体的S7XYN是指两拷贝黑曲霉（Aspergillus niger）纤维二糖水解酶的纤维素结合域与来源于嗜盐芽孢杆菌嗜（Bacillus halodurans）S7木聚糖酶的融合基因；SamyQ为来自Bacillus amyloliquefasciensα-淀粉酶的信号肽；pBEP43为枯草芽孢杆菌表达载体。
一种含有所述的重组载体的枯草芽孢杆菌，由所述重组载体pBEP43-SamyQ-S7XYN转化枯草芽孢杆菌得到，携带该质粒的菌株Bacillus subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN的保藏号为CCTCC M2014033。
所述枯草芽孢杆菌生产的重组融合木聚糖酶在纸浆漂白中的应用。
具体而言，本发明技术方案包括如下几个部分：
（1）获得一种具有纤维素结合能力的木聚糖酶基因，其具体序列为SEQ.ID.NO1所示。该基因是将来自于黑曲霉（Aspergillus niger）纤维二糖水解酶的纤维素结合域CBMCelA（GenBank:AF156269，SEQ.ID.NO2）自我连接成2个拷贝后，与来源于嗜盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）S7木聚糖酶（GenBank:AY687345，SEQ.ID.NO3）的C端融合，即融合基因为s7xyn-CBMCelA-CBMCelA，标记为S7XYN。其中CBMCelA的N端携带有黑曲霉纤维二糖水解酶自身的连接肽（linker peptide），因此将CBMCelA自我连接成两拷贝后连接在S7xyn的C端。同时考虑枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的密码子偏好性以及改善外源基因mRNA在宿主中的稳定性，对原始基因进行了优化，具体序列如SEQ.ID.NO1，共有1659个碱基。优化后的序列与原始基因相比，核苷酸同源性仅为76%。该融合基因可通过委托生物技术公司以PCR合成的方法来获得。
（2）携带上述融合木聚糖酶基因的表达载体构建
首先构建一个携带具有强分泌能力的信号肽载体pBEP43-SamyQ。根据α-淀粉酶基因amyQ的信号肽设计引物利用PCR扩增SanyQ序列，并通过分子生物学技术将SamyQ信号肽序列引入枯草芽孢杆菌表达载体pBEP43。其中枯草芽孢杆菌表达载体pBEP43构建过程参见论文（Luo WH,Guo Y,Han SY.High-level expreesion of Douchi fibrinolytic enzyme in Bacillus subtilis WB800.应用与环境生物学报,2007,13(4):565～569）。这样得到大肠杆菌-枯草杆菌芽孢穿梭载体pBEP43-SamyQ。将合成基因连接在市售通用的任意T载体上（如pUCm-T Vector、pGEM-T载体、PMD18-T、PMD19-T等），得到pMD18-S7XYN重组质粒。根据步骤（1）中设计的融合基因序列，设计上下游引物，将全基因合成产物克隆到上述大肠杆菌-枯草杆菌芽孢穿梭载体pBEP43-SamyQ中，并转化大肠杆菌，阳性转化子提取质粒得到枯草芽孢杆菌表达载体pBEP43-SamyQ-S7XYN。
（3）生产重组融合木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌的获得
将质粒pBEP43-SamyQ-S7XYN转化枯草芽孢杆菌宿主菌，如WB600、WB800等。在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基挑选转化子，并经过刚果红-木聚糖平板筛选。工程菌能外泌木聚糖酶，将菌落周围的木聚糖分解使得刚果红不能与之牢固结合，而平板上其他部分含有木聚糖能与刚果红结合使之不能被NaCl洗脱液洗脱，因此脱色后在菌落周围形成透明圈，由此可以筛选出阳性产木聚糖酶B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN重组子。阳性重组子经进一步接种LB培养基发酵复筛，选取木聚糖酶活力最高的菌株作为产酶菌株扩大培养。B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN发酵过程中，上清木聚糖酶活性随着培养时间延长逐步增加，在摇瓶发酵36h后上清的酶活可达到较高值50U/mL。是Gashaw Mamo等在大肠杆菌中分泌表达酶活14U/mL的3.6倍（Gashaw Mamo，Osvaldo Delgado，Alejandra Martinez，et al.Cloning,sequence analysis,and expression of a gene encoding an endoxylanase from Bacillus halodurans S7].Molecular Biotechnology,2006,(33):149-159），较毕赤酵母发酵周期120h缩短了三分之二（中国发明专利CN201010256129.0）。
本发明工程菌B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN，其中S7XYN是指两拷贝黑曲霉（Aspergillus niger）纤维二糖水解酶的纤维素结合域CBMCelA与来源于嗜盐芽孢杆菌嗜盐芽孢杆菌S7木聚糖酶的融合基因；SamyQ则为来自Bacillus amyloliquefasciens淀粉酶基因（amyQ）的信号肽基因。该基因工程菌株Bacillus subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN于2014年1月17日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M2014033。
（4）重组融合木聚糖酶附助纸浆漂白
上述枯草芽孢杆菌工程发酵培养36h后，发酵液经12000rpm离心2min，取上清，即可应用于纤维素结合能力试验和纸浆辅助漂白。纤维素结合能力试验显示，较单一木聚糖酶S7-xyn（中国发明专利CN201010256129.0），重组融合木聚糖酶对微晶纤维素的吸附能力是单一木聚糖酶S7-xyn的35倍。在纸浆吸附性能上，重组融合木聚糖酶S7XYN对麦草浆的吸附能力提高了2.9倍，对芦苇浆的吸附能力提高了25倍，对竹浆的吸附能力提高了 4.5倍。将重组木聚糖酶酶液以10U/g绝干浆的添加量与芦苇浆混合均匀，pH值调至9.0（甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），浆浓控制6％，然后通过恒温水浴在70℃温度下进行恒温处理90min后进行化学漂白，含有CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN同单一木聚糖酶S7-xyn（中国发明专利CN201010256129.0）和对照组（不经酶处理环节，其他工序均不变）比较，白度较S7-xyn和对照组分别提高了1.8%ISO和3.8%ISO，卡伯值比S7-xyn和对照组分别下降12.8%和26.2%。漂白效果有明显提高。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明采用枯草芽孢杆菌生产重组融合木聚糖酶，生产时间仅为36h较常用的毕赤酵母发酵周期120h缩短三分之二时间，发酵效率大大提高。同时，利用发明中的枯草芽孢杆菌工程菌生产的重组融合木聚糖酶，在木聚糖酶C端引入了纤维素结合域，大大增强了重组酶识别、结合纤维素和半纤维素的能力，为“定位锚定”提供了保障。同时，重组木聚糖酶不仅保持其单酶的嗜高温、耐高碱性质并且进一步提高了温度稳定性，提高了木聚糖酶在纸浆漂白中的助漂效果和能力，有良好的应用前景。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1：整合纤维素结合域的重组木聚糖酶基因的获得
本发明中选用的纤维素结合域CBMCelA来源于黑曲霉Aspergillus niger（含有自身连接肽，linker peptide，GenBank:AF156269），原始基因序列如SEQ.ID.NO2所示。黑曲霉的密码子偏好性明显不同于枯草芽孢杆菌，CodingGC含量为53.76%，而嗜盐芽孢杆菌中Coding GC含量仅为44.32%。同时，S7木聚糖酶原始基因（Genbank:AY68734，SEQ.ID.NO3）来源于嗜盐芽孢杆菌，虽然与表达宿主枯草芽孢杆菌同属芽孢杆菌，那两种菌对密码子的偏好性仍有一定差别，如枯草杆菌中Coding GC44.36%，高出嗜盐芽孢杆菌两个百分点。上述菌种密码子使用频率及偏好性可参考密码子使用频率库（condon usage database：http://www.kazusa.or.jp/codon/）。同时考虑本发明中的S7XYN是两种多肽的融合基因，为增加融合基因mRNA的稳定性，避免mRNA的二级结构形成，以及肽链合成速度与tRNA的专用频率匹配，将融合基因中在表达宿主枯草芽孢杆菌中使用频率低的密码子以及影响核糖体识别、多肽合成效率的碱基替换掉，获得重组融合基因S7XYN。重组基因序列S7XYN中含有S7xyn以及两拷贝CBMCelA，线性排列为N-S7xyn-CBMCelA-CBMCelA-C，三条基因以CBMCelA自身连接肽（linker peptide）相连接，含有1659个碱基，DNA序列为 SEQ.ID.NO1。经优化后的融合基因与原始基因经BLASTN2.2.29+程序比对，核苷酸序列同源性仅为76%，见图1。将此序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，获得携带SEQ.ID.NO1的重组质粒pMD18-S7XYN。
本发明获得重组基因、重组载体的具体实验方法参见分子克隆实验指南（第三版，冷泉港出版社出版）。
实施例2：信号肽载体pBEP43-SamyQ的获得
商用枯草芽孢杆菌载体pHT43上携带有α-淀粉酶基因amyQ的信号肽，具有较好的引导外源蛋白分泌能力。根据pHT43载体信息，设计SamyQF扩增引物序列SEQ.ID.NO4和SamyQR扩增引物序列SEQ.ID.NO5，两引物末端分别引入限制内切酶Kpn Ⅰ和HindⅢ的酶切位点（划线部分）。PCR反应体系50μL，其中ddH2O33.5μL，10×PCR Buffer5μL，dNTP mix(2.5mM each)8μL，pHT43（10μg/L）1μL，SanyQF和SanyQR（20μM)1μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL。PCR反应参数为：94℃2min；94℃30sec，52℃30sec，72℃20sec，30个循环；72℃7min。PCR产物经柱纯化后与质粒PBE43在37℃用Kpn Ⅰ和HindⅢ同时酶切2h，琼脂糖凝胶回收纯化SamyQ片段及pBEP43载体线性条带。接着，用T4DNA连接酶连接这两个片段，于22℃连接2h或以上，连接产物转化大肠杆菌Mach1T1，并涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基37℃过夜培养。用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取转化子的质粒并经Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定，获得携带信号肽的重组载体pBEP43-SamyQ。
实施例3：重组表达载体pBEP43-SamyQ-S7XYN的构建
以重组质粒pMD18-S7XYN为模板，扩增含有纤维素结合域CBMCelA和S7xyn的融合基因S7XYN。设计S7XynF上游引物SEQ.ID.NO6和S7XynR下游引物SEQ.ID.NO7，上游引物引入限制内切酶BamH Ⅰ位点，下游引物引入Xba Ⅰ的酶切位点，划线部分显示。PCR反应体系50μL，其中ddH2O33.5μL，10×PCR Buffer5μL，dNTP mix(2.5mM each)8μL，pMD18-S7XYN（10μg/L）1μL，S7XynF和CBMCelA R（20μM)1μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL。PCR反应参数为：94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，30个循环；72℃7min。PCR产物经柱纯化后与质粒pBEP43-SamyQ在37℃用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ同时过夜酶切，琼脂糖凝胶回收纯化S7XYN片段及pBEP43-SamyQ载体线性条带。接着，用T4DNA连接酶连接这两个片段，于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM110，并涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基37℃过夜培养。用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取转化子的质粒并经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切鉴定，获得携带大肠杆菌-枯草芽孢 杆菌穿梭表达载体pBEP43-SamyQ-S7XYN。
实施例4：重组表达载体pBEP43-SamyQ-S7XYN转化枯草芽孢杆菌
首先制备枯草芽孢杆菌感受态细胞。37℃过夜培养的平板中挑取单菌落，接种到装有5mL HS培养基的50mL三角瓶中，于37℃培养过夜。从过夜培养的HS培养物中取1mL接种到20mL的LS培养基中，在30℃摇床培养3-4h。把LS培养物分装到1.5mL离心管中（1mL/管），-80℃保存备用。接下来重组表达载体pBEP43-SamyQ-S7XYN转化枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800。从-80℃取出枯草芽孢杆菌感受态细胞，在室温下使之完全融化。每1mL LS培养物加入10μL0.1M EDTA，轻轻混匀，室温放置5min。加入1-2μg pBEP43-SamyQ-S7XYN质粒DNA，轻轻混匀。于37℃摇床培养1h。将适当体积转化产物均匀涂布于带有氨苄霉素的LB平板上，直至液体被吸收，倒置平板。平板于37℃培养箱培养。待转化子长出后，挑单菌落培养经质粒提取、酶切，获得B.subtilis WB800重组菌。同时，通过刚果红平板法初步筛选重组木聚糖酶高产菌。将构建得到的B.subtilis WB800重组菌接种在含有0.25%木聚糖的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，用1mg/mL刚果红染液染色，再用2M NaCl浸泡脱色15min，然后用清水洗去浮色。挑选在刚果红平板上产生水解圈较大的菌株进一步培养进行产酶能力测定。
实施例5：产木聚糖酶工程菌B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN摇瓶培养及重组木聚糖酶活力鉴定
从37℃过夜培养的平板中挑取单菌落，接种到装有10mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，于37℃培养至对数生长期。取0.5mL重组菌菌液接种到装有50mL LB液体培养基（含有终浓度5μg/mL的氨苄青霉素）的250mL三角瓶中，在37℃，200rpm摇床培养。从培养开始的第8小时开始，每隔一段时间从三角瓶中取0.3mL培养液，测定培养液的OD600和木聚糖酶活性。培养液经12000rpm离心2min，取上清，加蒸馏水稀释至适当的倍数，准确称取1mL酶稀释液，加入1mL的1%木聚糖溶液（pH9.0）于25mL的比色管中，立即放置到70℃恒温水浴锅中反应30min，然后立即用流水冷却，加入3mL DNS试剂并摇匀，立即置沸水中显色反应5min，取出流水冷却，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以蒸馏水代替酶液作为空白，于分光光度计测定OD540，以木糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。木聚糖酶酶活单位定义：在上述的测定条件下，将每分钟水解底物生成1μmoL还原糖所需酶量定义为一个酶活单位（U/mL）。
随着培养时间的增加，B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN发酵上清中木聚糖酶活性也持续增加，在摇瓶发酵36h后上清的酶活达到较高值50U/mL。是Gashaw Mamo等在 大肠杆菌中分泌表达酶活（14U/mL）的3.6倍，且发酵时间仅需36h。同目前常见的毕赤酵母发酵周期120h相比，此枯草芽孢杆菌菌株生产重组木聚糖酶发酵周期缩短了了三分之二。
实施例6：重组木聚糖酶适宜的pH、温度及温度稳定性
重组木聚糖酶S7XYN最适pH测定。使用不同的pH缓冲液（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）分别配制1%山毛榉木聚糖底物溶液及重组木聚糖酶液，然后在70℃下测定重组木聚糖酶在各种不同pH值下的酶活力。结果发现，C端融合2拷贝纤维素结合域CBMCelA的重组融合木聚糖酶S7XYN，同无纤维素结合域的S7xyn（中国发明专利CN201010256129.0）比较，其pH作用范围不再出现双峰，pH范围变窄，最适pH值为9.0，而在pH6.0活力不足40％。说明整合两拷贝的CBMCelA对木聚糖酶的最适pH值和pH作用范围有一定影响。但本专利中的重组木聚糖酶最适pH9.0仍有效保证了适用于纸浆漂泊工艺中的高碱性工艺。
重组木聚糖酶S7XYN的最适温度测定。配制pH为9.0，1%山毛榉木聚糖底物溶液，将用蒸馏水适当稀释的重组木聚糖酶液在不同反应温度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）下进行酶促反应，准确反应30min，测定酶活力。C端融合2拷贝纤维素结合域CBMCelA的重组融合木聚糖酶S7XYN的最适作用温度仍是75℃，同无纤维素结合域的能力的S7xyn中国发明专利CN201010256129.0）相同，也表现出嗜高温的性质。
重组木聚糖酶S7XYN酶的温度稳定性。将酶液置于65℃时保温，每隔1h取样测酶活力，共保温测定4h，然后在70℃下测定重组木聚糖酶在不同时间点下的相对酶活力。65℃保温4h后，融合2拷贝纤维素结合域CBMCelA的重组融合木聚糖酶S7XYN的相对酶活力仍剩余75.6%，同无纤维素结合域的S7xyn剩余活力63.2%（授权专利CN201010256129.0）相比，提高20％。说明融合纤维素结合域后，重组木聚糖酶的热稳定性进一步提高了20％。
实施例:7：重组木聚糖酶吸附纤维素能力实验
将实施例4中得到的重组融合木聚糖酶S7XYN和单一木聚糖酶S7-xyn（中国发明专利CN201010256129.0）各取10U单位，与0.5g吸附底物（微晶纤维素或纸浆，如芦苇浆、竹浆和麦草浆）在pH7.0的磷酸盐缓冲体系中混合，控制终体积为10mL。其中磷酸盐缓冲体系包括50mM磷酸盐，100mM NaCl和0.1%（w/v）牛血清蛋白（BSA）。混合后将反应液置于25℃，80rpm的摇床中吸附反应2h，空白对照组用相同的条件处理，但缓冲 液中不加吸附底物。然后12000rpm离心5min沉淀多糖和吸附的蛋白，再次测定上清中的木聚糖酶酶活，上清中损失的酶活认为因为部分酶吸附到微晶纤维素或纸浆上引起的，由此计算可吸附到纤维素上的酶量，即吸附百分比（%）=（初始酶活-上清液酶活）/初始酶活。实验发现未融合纤维素结合域的单一木聚糖酶S7-xyn对微晶纤维素基本没有吸附能力，而融合CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN对微晶纤维素的吸附能力是单一木聚糖酶S7-xyn的35倍。而在纸浆吸附性能上，同单一木聚糖酶S7-xyn相比，重组融合木聚糖酶S7XYN对麦草浆的吸附能力提高了2.9倍，对芦苇浆的吸附能力提高了25倍，对竹浆的吸附能力提高了4.5倍。以上结果表明，和未融合CBM的S7-xyn相比，融合CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN对微晶纤维素和三种不同纸浆均具有明显的吸附能力，可促进木聚糖酶与纸浆中的半纤维素充分接触，有效水解半纤维素，使木质素充分的溶出以利于化学漂白试剂的进入，达到“定位漂白”的效果。最终改善木聚糖酶对芦苇浆的助漂效率，提高白度，降低卡伯值。
实施例:8重组木聚糖酶辅助芦苇浆漂白应用
以10U/g（每克绝干浆用10U）的木聚糖酶液（分别为CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN和中国发明专利CN201010256129.0单一木聚糖酶S7-xyn）与芦苇浆在塑料袋混合均匀，pH值调至9.0（甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），纸浆浓度控制6％，然后通过恒温水浴在70℃温度下进行恒温处理90min，每隔15min揉搓塑料袋一次，使浆样与酶液完全反应，至规定90min时间后取出洗涤，平衡后测水分，接着依次进行DQP三段工序漂白。二氧化氯漂白（D）：将相对于绝干浆质量1.5%的ClO2与经过酶处理后的芦苇浆混合均匀，用H2SO4将pH值调至3.0，将浆浓调至10%，然后通过恒温水浴在60℃温度下进行恒温处理45min，其中每隔15min揉搓塑料袋一次，使浆样与漂液完全反应，至规定45min时间后取出洗涤，平衡后测水分。螯合处理（Q）：将相对于绝干浆质量0.2%EDTA与经过D工序处理过的芦苇浆混合均匀，用H2SO4将pH值调至3.0，将浆浓调至10％，然后通过恒温水浴在60℃温度下进行恒温处理30min，其中每隔15min揉搓塑料袋一次，使浆样与漂液完全反应，至规定30min时间后取出洗涤，平衡后测水分。过氧化氢处理（P）：将相对于绝干浆质量3.0%的H2O2，1.2%的NaOH和0.2%的MgSO4放入塑料袋中混合均匀以后，将浆浓调至10％，然后通过恒温水浴在90℃温度下进行恒温处理240min，每隔15min揉搓塑料袋一次，使浆样与漂液完全反应，至规定240min时间后取出洗涤。漂白后的浆样抄纸后测定白度和卡伯值。同样经过上述处理，含有CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN测试组的白度为80.7%ISO，卡伯值为1.63，中国发明专利CN201010256129.0单一木聚糖酶S7-xyn测试 组的白度为78.9%ISO，卡伯值为1.87；对照测试组（不经酶处理环节，其他工序均不变）的白度为77.1%ISO，卡伯值为2.21；含有CBMCelA的重组木聚糖酶S7XYN测试组的白度较S7-xyn和对照组分别提高了1.8%ISO和3.8%ISO；卡伯值比S7-xyn和对照组分别下降12.8%和26.2%，对于芦苇浆和DQP三段漂白工艺，测试结果表明重组融合木聚糖酶S7XYN漂白效果有非常明显的提高。
由实施例6、7、8可见，应用实施例5中获得工程菌B.subtilis WB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN生产的重组融合木聚糖酶，同未融合纤维素结合域的单一木聚糖酶S7-xyn（中国发明专利CN201010256129.0）相比，不仅保留了单一木聚糖酶嗜高温、耐高碱的性质，更进一步提高了温度稳定性，而且大大改善了酶对纤维素及纸浆得吸附能力，为靶向定位和提高助漂效果提供了可靠保证。
序列表
SEQ.ID.NO1：增强纤维素结合能力的改良木聚糖酶基因
SEQ.ID.NO2：黑曲霉Aspergillus niger原始基因
SEQ.ID.NO3：S7木聚糖酶原始基因
SEQ.ID.NO4：SamyQF扩增引物序列
GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGATTCAAAAACGAAAGCG
SEQ.ID.NO5：SamyQR扩增引物序列
CCCAAGCTTCTCCAAATTCTTTCCGAGCT
SEQ.ID.NO6：S7XynF上游引物
CGCGGATCCATGATTACTTTGTTTAAGAAGCC
SEQ.ID.NO7：S7XynR下游引物
CCGGTCTAGACAAGCATTGGGAGTAGTAAG 。
Claims (4)
1.一种增强纤维素结合能力的改良木聚糖酶基因，其特征在于，其完整全基因序列为SEQ.ID.NO1。
2.一种含有权利要求1所述改良木聚糖酶基因的重组载体pBEP43-SamyQ-S7XYN，其特征在于，该改良木聚糖酶基因的重组载体的S7XYN是指两拷贝黑曲霉（Aspergillus niger）纤维二糖水解酶的纤维素结合域与来源于嗜盐芽孢杆菌嗜（Bacillus halodurans）S7木聚糖酶的融合基因；SamyQ为来自Bacillus amyloliquefasciensα‐淀粉酶的信号肽；pBEP43为枯草芽孢杆菌表达载体。
3.一种含有权利要求2所述的重组载体的枯草芽孢杆菌，其特征在于，由所述重组载体pBEP43-SamyQ-S7XYN转化枯草芽孢杆菌得到，携带该质粒的菌株Bacillus subtilisWB800/pBEP43-SamyQ-S7XYN的保藏号为CCTCC M2014033。
4.权利要求3所述枯草芽孢杆菌生产的重组融合木聚糖酶在纸浆漂白中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410091226.7A CN103937823A (zh) | 2014-03-12 | 2014-03-12 | 增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410091226.7A CN103937823A (zh) | 2014-03-12 | 2014-03-12 | 增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103937823A true CN103937823A (zh) | 2014-07-23 |
Family
ID=51185694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410091226.7A Pending CN103937823A (zh) | 2014-03-12 | 2014-03-12 | 增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103937823A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039374A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-11-11 | 齐鲁工业大学 | 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586167A (zh) * | 2012-03-01 | 2012-07-18 | 华南理工大学 | 一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法 |
-
2014
- 2014-03-12 CN CN201410091226.7A patent/CN103937823A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586167A (zh) * | 2012-03-01 | 2012-07-18 | 华南理工大学 | 一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAMO G.ET AL.: "AY687345", 《GENBANK》 * |
| 薛冲冲: "纤维素结合域对S7-xyn和RML产酶酶活及酶学性质的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039374A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-11-11 | 齐鲁工业大学 | 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用 |
| CN105039374B (zh) * | 2015-08-10 | 2017-12-01 | 齐鲁工业大学 | 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced β-glucosidase and filter paper activity using strong artifical cellobiohydrolase 1 promoter | |
| Guerriero et al. | Destructuring plant biomass: focus on fungal and extremophilic cell wall hydrolases | |
| CN102947442B (zh) | 用于糖化纤维素材料的组合物 | |
| Singhania et al. | Cellulases | |
| Ribeiro et al. | A novel thermostable xylanase GH10 from Malbranchea pulchella expressed in Aspergillus nidulans with potential applications in biotechnology | |
| EP2751265A1 (en) | Novel cellobiohydrolase enzymes | |
| Heidorne et al. | Characterization of hemicellulases and cellulases produced by Ceriporiopsis subvermispora grown on wood under biopulping conditions | |
| CN101896602A (zh) | 耐热和耐酸的β-木糖苷酶、编码基因、相关生物和方法 | |
| CN100575484C (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用 | |
| CN106488982A (zh) | 酶组合物及其用途 | |
| CN103348005A (zh) | 突变体纤维二糖水解酶 | |
| Thomas et al. | Industrial enzymes: xylanases | |
| Cianchetta et al. | Hydrolytic potential of Trichoderma sp. strains evaluated by microplate-based screening followed by switchgrass saccharification | |
| Li et al. | Improvement of the optimum pH of Aspergillus niger xylanase towards an alkaline pH by site-directed mutagenesis | |
| Weerachavangkul et al. | Alkaliphilic endoxylanase from lignocellulolytic microbial consortium metagenome for biobleaching of eucalyptus pulp | |
| MX2011000552A (es) | Glicosidasa modificadas de la familia 6 con especificidad alterada del sustrato. | |
| US20150152400A1 (en) | Use of co2 to deactivate a cellulolytic microorganism used in the biochemical conversion of lignocellulosic materials | |
| Rastegari | Molecular mechanism of cellulase production systems in penicillium | |
| CN103937823A (zh) | 增强纤维素结合能力的木聚糖酶基因及其生产菌株与应用 | |
| Kim et al. | Construction of a recombinant Escherichia coli JM109/A-68 for production of carboxymethylcellulase and comparison of its production with its wild type, Bacillus velezensis A-68 in a pilot-scale bioreactor | |
| CN106190874A (zh) | 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法 | |
| Qin et al. | Improved cellulolytic efficacy in Penicilium decumbens via heterologous expression of Hypocrea jecorina endoglucanase II | |
| CN114317500A (zh) | 木聚糖酶Scxyn5及其编码基因和应用 | |
| Paul et al. | Microbial xylanases, their structural characteristics, and industrial applications: A biotechnological advancement | |
| Kant et al. | Fungal cellulases: a comprehensive review |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CI01 | Publication of corrected invention patent application |
Correction item: Biological Conservation Information Correct: CCTCC NO:M2014033 2014.01.17 Number: 30 Volume: 30 |
|
| CI02 | Correction of invention patent application |
Correction item: Biological Conservation Information Correct: CCTCC NO:M2014033 2014.01.17 Number: 30 Page: The title page Volume: 30 |
|
| ERR | Gazette correction |
Free format text: CORRECT: PRESERVATION OF BIOLOGICAL INFORMATION; FROM: NONE TO: CCTCC NO:M2014033 2014.01.17 |
|
| RECT | Rectification | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140723 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |