CN102199581B

CN102199581B - 一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102199581B
Application number: CN201110082679XA
Authority: CN
Inventors: 吴子丹; 孙长坡; 伍松陵; 路子显
Original assignee: Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Academy of Sciences, State Bureau of Food and Materials Reserve
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2031-03-31
Also published as: CN102199581A

Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因与应用，该酶来源于粉红粘帚霉（Gliocladiumroseum），是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中的SEQIDNO：1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；（b）将序列表中的SEQIDNO：1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有降解玉米赤霉烯酮活性的由SEQIDNO：1衍生的蛋白质。本发明所述的玉米赤霉烯酮降解酶对玉米赤霉烯酮（ZEN）具有高效降解作用。

Description

一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因，以及玉米赤霉烯酮降解酶的应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素。1999年，D.Mello等人研究发现，ZEN能降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿的出生重。ZEN对人体的影响主要是引发肿瘤、诱导DNA收缩、导致染色体失常等，此外，ZEN可与17β-雌二醇受体结合，导致脂肪氧化反应、细胞凋亡并导致蛋白质和DNA合成的抑制，还可抑制其它大分子的生物合成。

国内外大量文献表明ZEN对动物、人类都会产生毒害，人们食用被其污染的食物会导致肝癌、睾丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病。主要影响动物繁殖机能，导致动物繁殖机能紊乱。玉米赤霉烯酮还具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性，对肿瘤发生也有一定的影响。

ZEN的去毒方法可以分为物理、化学和生物三大类，其中辐照技术、吸附技术和臭氧去毒效果都很明显，是降低谷物中玉米赤霉烯酮污染的重要技术。用臭氧(O₃)和双氧水处理染毒的谷物，可以显著降低谷物中ZEN的毒性，并且随着臭氧(O₃)和双氧水的浓度、温度上升以及处理时间的延长，谷物中ZEN的毒性有下降趋势。

但传统的物理和化学方法有一定的局限性，随着生物技术的应用，对ZEN的降解有了新的进展。Makoto Kimara等发现，Clonostachys Rosea菌株对玉米赤霉烯酮结构中的内酯环有破坏作用，该菌株作用于玉米赤霉烯酮后，其雌激素的性质远弱于玉米赤霉烯酮。[Makoto Kimara, Naoko Takahashi-Ando,Takumi Nishiuchi Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination[J].Pesticide Biochemistry and Physiology 2006 86( 3)117-123.（Makoto Kimara等，减少镰刀霉菌毒素污染的分子生物学和生物技术，农药生物化学和生理学，2006）]。

Naoko等从粉红粘帚霉霉中克隆了ZEN内酯水解酶基因zhd101并在大肠菌表达，结果重组的大肠杆菌表现出很强的水解内酯酶的能力，该酶把ZEN降解。Tomok等把zhd101转化到玉米中，结果玉米也表现出对ZEN的降解能力。[Naoko Takahashi-Ando, Makoto Kimura, Hideaki Kakeya et al, A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone :enzyme purification and gene cloning[J]. Journal of Biochemistry, 2002,365:1-6. (Naoko等，一种新的玉米赤霉烯酮降解内酯：酶的纯化和克隆，生物化学杂志，2002)；Tomoko I, Naoko T A, Noriyuki O,et al. Reduced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene[ J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(5): 1622-1629.（Tomok等，通过降解基因来减少玉米籽粒中真菌毒素玉米赤霉烯酮的污染，应用与环境微生物，2007）]。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因，该酶对玉米赤霉烯酮（ZEN）可以完全降解。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明所提供的玉米赤霉烯酮降解酶被命名为zlhy-6，来源于粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）ACCC No.31535（中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC）。

所述玉米赤霉烯酮降解酶，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中的SEQ ID NO：1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有降解玉米赤霉烯酮活性的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID NO：1由264个氨基酸残基组成。

上述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：

（a）序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

（b）编码序列表中SEQ ID NO：1蛋白质序列的多核苷酸。

其中，序列表中的SEQ ID NO：2由795个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第795位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、细胞系、工程菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种表达所述玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是将含有上述玉米赤霉烯酮降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到玉米赤霉烯酮降解酶。

其中，所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。所述酵母菌优选为巴氏德毕赤酵母（Pichia pastoris），更优选为巴氏德毕赤酵母GS115。

用于构建所述重组大肠杆菌及重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在大肠杆菌及巴氏德毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达的pEB、pPIC9K、pPIC9、pPIC3.5K等。

上述重组表达载体均可按常规方法构建。

本发明还提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明的优点：进行表达的玉米赤霉烯降解酶可以对粮食中真菌毒素玉米赤霉烯酮进行消减，对控制粮食污染起到有效的作用。

附图说明

图1重组质粒pPIC9K-zlhy-6的表达产物的SDS-PAGE图（白光扫描），

泳道1，表达产物；泳道M，蛋白分子量标准，

图2玉米赤霉烯酮降解酶能力测定图。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1 玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6的获得及玉米赤霉烯酮降解酶的表达

1. 玉米赤霉烯酮降解酶基因质粒文库的建立

将标准菌株粉红粘帚霉ACCC No.31535（购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）的安培管管口打碎后加入300-500μL液体PDA培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，PH自然），然后将菌株的悬浮液接入100ml同样的培养基，摇床条件为220转/分钟，30℃，72小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。提取RNA（Trizol法）;

(2)以RNA为模板逆转录合成cDNA序列；

2、玉米赤霉烯酮降解酶基因的获得

以步骤1中获得的cDNA序列为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物1：5'-CCGGAATTCATGCGCACTCGCAGCACAATC-3'（划线部分碱基为EcoRⅠ识别位点）和

引物2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAAGATGCTTCTGCGTAGTTTC-3'（划线部分碱基为NotⅠ识别位点）

在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为：先升温至94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持1分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接pMD19-T Vector 转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pMD19-T-zlhy-6测序鉴定。则该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：2，其对应的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：1。

3、含有玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建

所获得的PCR产物两端具有（EcoRⅠ）和（NotⅠ）限制性内切酶识别位点，用（EcoRⅠ）和（NotⅠ）限制性内切酶对PCR产物和质粒pPIC9K(北京茂健联星科技有限公司)同时进行双酶切反应，酶切体系20 μL：目的片段或质粒8 μL，0.1%BSA 2μL，10×H Buffer 2 μL，EcoRⅠ1 μL，NotⅠ1 μL，ddH₂O6μL，酶切条件是37℃反应3h。经琼脂糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10μL：目的片段3μL，pPIC9k载体5μL 10×T4 DNA 连接缓冲液 1μL，T4 DNA 连接酶（350U/μL）1μL。4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，经氨苄抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为pPIC9k-zlhy-6。

对pPIC9K-zlhy-6进行测序，证明融合连接入质粒pPIC9K的DNA序列与序列表SEQ ID NO：2相同，构建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重组表达载体pPIC9K-zlhy-6正确。

4、玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母中的表达

将重组表达载体pPIC9K-zlhy-6用SalⅠ限制性内切酶酶切使之线性化后，采用电击方式，将线性化的载体pPIC9K-zlhy-6导入毕赤酵母GS115（北京茂健联星科技有限公司）中，经选择性培养基培养，筛选His⁺和抗G418的高表达菌株。挑取选择性培养基上长出的单菌落接种于5ml YPD液体培养基（酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L）中，30℃培养12-24小时后，转入500ml BMGY培养基（1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源（YNB）1.34%、100mM磷酸缓冲液PH6.0、4×10^-5生物素，1%甘油）中继续培养至菌液的OD₆₀₀=2-3，离心收集菌体，再用无碳源BMMY培养基（1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源（YNB）1.34%、100mM磷酸缓冲液PH6.0、4×10^-5生物素，0.5%甲醇）将稀释至OD₆₀₀=1后加入0.5%甲醇进行诱导培养，培养期间每隔24小时补加甲醇至终浓度为0.5%，培养至118小时即可停止培养。离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图1所示（泳道1为表达产物，箭头表示目的条带，泳道2为Marker（71KDa，50KDa，37KDa，25KDa，16KDa，8KDa，2KDa））表明重组菌株在甲醇诱导下表达的蛋白质的分子量约28KDa，与从氨基酸推段出的理论分子量（28kDa）大小一致。

4、玉米赤霉烯酮降解酶表达产物的纯化

宿主为大肠杆菌时进行表达的玉米赤霉烯酮降解酶使用GE公司组氨酸标记亲和柱纯化目的蛋白。具体的方法参照HisTrap FF组氨酸标签融合蛋白纯化实验流程的说明书进行；而在毕赤酵母中表达的玉米赤霉烯酮降解酶可以直接分泌到培养液的上清中，直接用于酶活性测定。

实施例2玉米赤霉烯酮降解酶的活性检测

样品处理：重组的毕赤酵母菌株（实验组）和野生型毕赤酵母菌株（对照组，空质粒整合的毕赤酵母菌株）接入BMGY培养基中继续培养至菌液的OD₆₀₀=2-3，室温离心收集菌体，重悬于BMMY培养基培养5天，每天取出1mL培养液，12000rpm离心5min，收集上清。取上清液980 μL置1.5 mL离心管中，再加入20μL 1000ppm的ZEN，使终浓度达到20ppm 。添加后30℃反应2h-10h后处理放到4℃中等待检测。取处理好的样品20μL进高效液相色谱检测ZEN的残留。检测方法按照GB/T 23504-2009方法进行。高效液相色谱检测条件：Agilent Eclipse XDB-C18, 150 mm×4.6 mm(5 μm)色谱柱，流动相：水/乙腈/甲醇=46%/46%/8%, 荧光检测器检测Ex=274 nm Em=440 nm，柱温30 ℃，流速1.0 ml/min，进样量20 μL。通过高效液相色谱检测得知经过在毕赤酵母中诱导表达的酶液与ZEN处理后没有检测到ZEN的残留，如图2所示，而对照组控制质粒的发酵液上清中ZEN基本上没有降解。可以表明，zlhy-6基因克隆表达出的降解酶具有降解ZEN的活性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶，是由序列表中的SEQ ID NO：1 的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因为下述核苷酸序列之一：

（a）序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

（b）编码序列表中SEQ ID NO：1蛋白质序列的多核苷酸。

4.含有权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因的表达载体。

5. 含有权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因的转基因细胞系。

6. 含有权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因的宿主菌。

7.权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

8.权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶编码基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

9.一种表达权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是将含有权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到玉米赤霉烯酮降解酶。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；用于构建所述重组表达载体的出发载体为pEB、pPIC9K、pPIC9、pPIC3.5k。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述宿主为巴氏德毕赤酵母。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述宿主为巴氏德毕赤酵母GS115。