CN107245369B - 一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的方法，所述方法包括在生产植物油过程中添加具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶或用具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶处理成品植物油。本发明方法可以有效去除植物油中的玉米赤霉烯酮，在没有额外使用任何设备，不改变现有生产工艺，也不影响植物油的生产效率的情况下，生产得到的植物油玉米赤霉烯酮的残留量仅为0‑20μg/kg，最大限度的降低玉米赤霉烯酮污染风险，确保了粮油食品的质量安全。

Description

一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法

技术领域

本发明涉及植物油生产领域。更具体地，涉及一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等多种菌种产生的雌激素类有毒次级代谢产物，广泛污染玉米、麦类等谷物及粮油制品，是世界上污染范围最广泛的真菌毒素之一。ZEN具有很强的生殖毒性、免疫毒性、胚胎毒性及致畸、致癌、致突变作用等，会导致人类和动物的生殖障碍，内分泌系统紊乱。

近年来，随着灾害性天气的频繁出现和耕作制度的改变，致使中国玉米等作物在种植、收获、储藏过程中受到真菌毒素污染的情况愈加严重，其中ZEN是污染范围和危害最为严重的真菌毒素之一，直接导致了生产植物油原料受真菌毒素污染的风险增加，加之ZEN具有不溶于水，易溶于油脂类物质的物理特性，常常富集和积累于粮油制品中危害人类健康，由此引起的食品安全问题不容忽视。对此，中国相关监管部门高度重视，2016年对北京地区市售的30种油样检测结果表明，ZEN检出率为100％，最高含量为333μg/kg。中国虽尚未对植物油中ZEN的限量加以规定，但该值也明显高于中国在GB 2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定玉米等制品中ZEN含量不高于60μg/kg的限量。因此，植物油中ZEN的有效防控已经成为保障粮油食品安全，保障国人身体健康和生命安全的重要议题。

针对ZEN的物理吸附去除法，具有吸附毒素的同时也吸附大量的营养物质，吸附能力有限等缺点，对植物油中的ZEN去除存在很大的局限性。而化学去除法是通过添加化学物质而去除ZEN，易造成植物油的二次污染，也不适用于植物油中ZEN的去除。

因此，需要寻找处理工艺简便、快捷、安全、高效、易于规模化应用的方法以解决植物油中ZEN污染及危害人类健康的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法，该方法可以有效去除植物油产品中的玉米赤霉烯酮(ZEN)，最大限度的降低玉米赤霉烯酮污染风险，最终确保粮油食品的质量安全。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法，所述方法包括生产植物油过程中添加具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶或用具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶处理成品植物油。

在本发明的具体实施方式中，在生产植物油过程中，所述生物酶在适于其进行酶反应的阶段被添加。

本发明在生产植物油的全过程中，只要能满足生物酶进行酶反应的条件均可加入生物酶进行处理，生物酶的添加与生产植物油的过程同步进行，无需额外使用任何设备，不改变现有生产工艺，也不影响植物油的生产效率，就能达到去除玉米赤霉烯酮的目的。另外，生物酶可高效、专一地靶向与玉米赤霉烯酮结合，不与植物油中的维生素E、甾醇等营养物质反应，生产的植物油安全、无残留、不会造成植物油中营养成分含量和品质的破坏和损失。

现阶段，工业上植物油的生产过程主要包括提油、水化脱胶、脱酸、碱炼、水洗、干燥、脱色、脱蜡、脱臭，得到成品植物油(如图1所示)。本发明所述生物酶添加的阶段包括但不限于在提油、碱炼、脱蜡过程中被添加或在提油、水化脱胶、脱酸、碱炼、水洗、干燥、脱色、脱蜡、脱臭反应后得到的中间产物中被添加。例如，可以将生物酶添加到经过提油后得到的毛油中。

在本发明的另一个具体实施方式中，在生物酶处理成品植物油时，所述生物酶与成品植物油进行酶反应。

需要注意的是，本发明方法还适用于利用植物油生产过程中得到的中间产物或成品植物油为原料生产得到的相关制品中玉米赤霉烯酮的去除，例如维生素E、甾醇、磷脂、调和油等。

本发明酶反应的条件根据不同酶所需条件来确定，优选的为：温度：30-80℃；时间：1min-5h；搅拌速度：80-500rpm。

本发明中生物酶的加入量根据样品中ZEN含量和生物酶制剂比酶活确定，例如，生物酶的加入量可以为样品质量的0.01％-1％。

在本发明优选的实施方式中，所述具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶为玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N1、ZENdease-N2、ZENdease-N3；

其中，所述ZENdease-N1为由序列表SED ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述ZENdease-N2为由序列表SED ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述ZENdease-N3为由序列表SED ID NO.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

进一步，为了达到更优的效果，本发明可在酶反应后，进行分离，使玉米赤霉烯酮降解物质由油中转移到水中，以达到去除玉米赤霉烯酮的目的。

其中，所述分离采用可实现分离的任何离心机，包括但不限于蝶式离心机、涡旋式离心机；优选的，所述离心的转速为1000-10000rpm。

利用本发明上述生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮植物油，不需增加额外设备和投资，不改变现有生产工艺的基础上，得到的植物油中玉米赤霉烯酮的残留量仅为0-20μg/kg。

本发明所述植物油包括但不限于玉米油、大豆油、花生油、菜籽油。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明利用了现有的植物油工业化生产工艺，生物酶的添加可在生产植物油的过程中同步进行，例如可以在提油、碱炼脱酸、脱蜡等阶段添加，亦或生产过程中得到的中间产物中添加，无需额外购置设备、不改变生产工艺，具有操作简单，方便易行，处理成本低廉等优点。

(2)本发明生物酶能够高效、专一地靶向与玉米赤霉烯酮结合，并将其分解成无毒产物，随即转移至水中，通过分离即可将其完全去除，且所用生物酶不与植物油中的维生素E、甾醇等营养物质反应，可保证生产的植物油安全、无残留、不造成植物油中营养成分含量和品质的破坏和损失。

(3)本发明适用于任何油料植物生产的植物油中玉米赤霉烯酮的去除。例如，可以为大豆油、玉米油、花生油、菜籽油等植物油等，无需调整工艺，均能有效地去除，得到不含玉米赤霉烯酮的植物油。

(4)本发明相比碱炼法去除玉米赤霉烯酮或添加玉米赤霉烯酮吸附剂等方法，无需增加额外的处理环节，减少了因增加处理工艺而造成的得油率损失，因此，具有不改变得油率的优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1植物油的生产过程中可用生物酶处理的阶段。

图2示出重组质粒PET30a-ZENdease-N1的表达产物的SDS-PAGE图；

其中，泳道1表达产物；泳道M，蛋白分子量标准(97KD，66KD，45KD，31KD，21.5KD，14.4KD，6.5KD)。

图3示出重组质粒PET30a-ZENdease-N2的表达产物的SDS-PAGE图；

其中，泳道1,2表达产物；泳道M，蛋白分子量标准(97KD，66KD，45KD，31KD，21.5KD，14.4KD，6.5KD)。

图4示出重组质粒PET30a-ZENdease-N3的表达产物的SDS-PAGE图；

其中，泳道1表达产物；泳道M，蛋白分子量标准(97KD，66KD，45KD，31KD，21.5KD，14.4KD，6.5KD)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法；实施例中的所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。

实施例1玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N1的制备

1、玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的获得

通过化学合成方法得到ZENdease-N1全长基因，以此合成的基因为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物1：5'-GAAATTCATATGCCTTCTTCACTT-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.3所示，划线部分碱基为NdeI识别位点)

引物2：5'-CCCGTCGACAGCCCCATCCTT-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.4所示，划线部分碱基为SalI识别位点)

在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约0.8kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接PET30a Vector，转化大肠杆菌BL21，获得重组质粒PET30a-ZENdease-N1测序鉴定。则该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列如序列表SED IDNO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SED ID NO.2所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建

上述所获得的PCR产物两端具有Nde I和Sal I限制性内切酶位点，用(Nde I)和(Sal I)限制性内切酶对PCR产物和质粒PET30a同时进行双酶切反应，酶切体系50μL：目的片段或质粒20μL，10×K Buffer 5μL，Nde I 2μL，Sal I 2μL，ddH₂O 21μL，酶切条件是37℃反应3h。酶切产物经柱回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性菌落培养，重组表达载体经PCR鉴定、酶切鉴定，测序验证。经琼脂糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10μL：目的片段5μL，PET30a载体2μL 10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶(350U/μL)1μL,ddH₂O 1μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后PET30a-ZENdease-N1。超声波破碎，离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。对PET30a-ZENdease-N1进行测序，证明融合连接入载体PET30a的DNA序列与如序列表SED ID NO.1所示序列相同，构建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重组表达载体PET30a-ZENdease-N1正确。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大肠杆菌中的表达纯化

将重组表达载体PET30a-ZENdease-N1转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性LB平板。挑取平板平板上的单菌落到1L LB培养基中培养，待细菌生长到OD值为1左右时，加入0.5mL浓度为0.6mol/L的IPTG诱导表达过夜，次日收菌纯化蛋白。将过夜表达的菌体离心收集，弃上清，加入30mL重悬缓冲液，将细菌沉淀悬起后超声破碎细菌，将破碎的细胞悬液转入高速离心管中，高速离心后把上清加入到Ni-NTA亲和柱中，让其流过亲和介质。用10倍柱体积的漂洗缓冲液漂洗亲和介质，洗掉非特异性结合的杂蛋白，用5mL洗脱缓冲液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZENdease-N1蛋白的表达纯化分析。用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图1所示：泳道1为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株表达的蛋白质的分子量约31.5KD，与从氨基酸推段出的理论分子量(31.5KD)大小一致。

实施例2玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N2的制备

1、玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的的获得通过化学合成方法得到ZENdease-N2全长基因，以此合成的基因为模板，在引物3和引物4的引导下进行PCR反应，扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物3：5'-GAAATTCATATGCGGACAAGATCG-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.7所示，划线部分碱基为Nde I识别位点)

和引物4：5'-CCCGTCGACTAGATACCTCCG-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.8所示，划线部分碱基为Sal I识别位点)

在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约0.8kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接PET30a Vector，转化大肠杆菌BL21，获得重组质粒PET30a-ZENdease-N2测序鉴定。则该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列为如序列表SEDID NO.5所示，其对应的氨基酸序列如序列表SED ID NO.6所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建

所获得的PCR产物两端具有Nde I和Sal I限制性内切酶位点，用(Nde I)和(SalI)限制性内切酶对PCR产物和质粒PET30a同时进行双酶切反应，酶切体系50μL：目的片段或质粒20μL，10×K Buffer 5μL，Nde I 2μL，Sal I 2μL，ddH₂O 21μL，酶切条件是37℃反应3h。酶切产物经柱回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性菌落培养，重组表达载体经PCR鉴定、酶切鉴定，测序验证。经琼脂糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10μL：目的片段5μL，PET30a载体2μL 10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶(350U/μL)1μL,ddH₂O 1μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后PET30a-ZENdease-N2。超声波破碎，离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。对PET30a-ZENdease-N2进行测序，证明融合连接入载体PET30a的DNA序列与如序列表SED ID NO.5所示序列相同，构建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重组表达载体PET30a-ZENdease-N2正确。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大肠杆菌中的表达纯化

将重组表达载体PET30a-ZENdease-N2转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性LB平板。挑取平板平板上的单菌落到1L LB培养基中培养，待细菌生长到OD值为1左右时，加入0.5mL浓度为0.6mol/L的IPTG诱导表达过夜，次日收菌纯化蛋白。将过夜表达的菌体离心收集，弃上清，加入30mL重悬缓冲液，将细菌沉淀悬起后超声破碎细菌，将破碎的细胞悬液转入高速离心管中，高速离心后把上清加入到Ni-NTA亲和柱中，让其流过亲和介质。用10倍柱体积的漂洗缓冲液漂洗亲和介质，洗掉非特异性结合的杂蛋白，用5mL洗脱缓冲液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZENdease-N2蛋白的表达纯化分析。用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图2所示：泳道1、2为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株表达的蛋白质的分子量约29.2KD，与从氨基酸推段出的理论分子量(29.2KD)大小一致。

实施例3玉米赤霉烯酮降解酶ZENase-N3的制备

1、玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的获得

通过化学合成方法得到ZENase-N3全长基因，以此合成的基因为模板，在引物5和引物6的引导下进行PCR反应，扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物5：5'-GAAATTCATATGATGCGCACCCAATCCACCAT-3'(其核苷酸序列如序列表SEDID NO.11所示，划线部分碱基为Nde I识别位点)

和引物6：5'-CCCGTCGACTCATAGATACTTCCGCGTCG-3'(其核苷酸序列如序列表SEDID NO.12所示，划线部分碱基为Sal I识别位点)

在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约0.8kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接PET30a Vector，转化大肠杆菌BL21，获得重组质粒PET30a-ZENdease-N3测序鉴定。则该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列为如序列表SEDID NO.9所示，其对应的氨基酸序列为如序列表SED ID NO.10所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建

所获得的PCR产物两端具有Nde I和Sal I限制性内切酶位点，用(Nde I)和(SalI)限制性内切酶对PCR产物和质粒PET30a同时进行双酶切反应，酶切体系50μL：目的片段或质粒20μL，10×K Buffer 5μL，Nde I 2μL，Sal I 2μL，ddH₂O 21μL，酶切条件是37℃反应3h。酶切产物经柱回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性菌落培养，重组表达载体经PCR鉴定、酶切鉴定，测序验证。经琼脂糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10μL：目的片段5μL，PET30a载体2μL 10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNAΔ连接酶(350U/μL)1μL,ddH₂O 1μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后PET30a-ZENdease-N3。超声波破碎，离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。对PET30a-ZENdease-N3进行测序，证明融合连接入载体PET30a的DNA序列与如序列表SED ID NO.9所示相同，构建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重组表达载体PET30a-ZENdease-N3正确。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大肠杆菌中的表达纯化

将重组表达载体PET30a-ZENdease-N3转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性LB平板。挑取平板平板上的单菌落到1L LB培养基中培养，待细菌生长到OD值为1左右时，加入0.5mL浓度为0.6mol/L的IPTG诱导表达过夜，次日收菌纯化蛋白。将过夜表达的菌体离心收集，弃上清，加入30mL重悬缓冲液，将细菌沉淀悬起后超声破碎细菌，将破碎的细胞悬液转入高速离心管中，高速离心后把上清加入到Ni-NTA亲和柱中，让其流过亲和介质。用10倍柱体积的漂洗缓冲液漂洗亲和介质，洗掉非特异性结合的杂蛋白，用5mL洗脱缓冲液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZENdease-N3蛋白的表达纯化分析。用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图3所示：重组菌株表达的蛋白质的分子量约31.0KD，与从氨基酸推段出的理论分子量(31.0KD)大小一致。

实施例4生物酶法在玉米油精炼过程及玉米毛油中的应用

1、生物酶法在玉米油精炼过程中的应用

生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的玉米油具体工艺为：

(1)水化脱胶：通常采用高温水化工艺，油温为70℃-80℃，水温为80℃左右，在20min内一次加完，沉降3h-4h，然后将油脚分离出来。

(2)碱炼脱酸-生酶法去除ZEN工艺：加入碱液，调节pH值为7-8，控制温度在40-60℃，加入ZEN降解酶(根据ZEN含量确定加入量)，100-300rpm搅拌30min，调节温度进行碱炼，当皂粒明显析出后静置沉降6h-8h，然后将皂角分离出去。

(3)水洗干燥：水洗时将油温调整到85℃左右，加入与油同温的水进行水洗，静置1h左右，放掉废水。进行真空温度为90℃-105℃脱水干燥处理。

(4)脱色：脱色时将油温升至90℃左右，加入活性白土(加入量为油重的3％-5％)与油充分混合，脱色时间为20min-30min，脱色完毕后将油冷却至70℃以下。

(5)脱臭：将脱色油吸入脱臭锅中，脱臭温度170℃-180℃，脱臭时间3h-8h。脱臭完毕，将油冷却至70℃以下泵出过滤，即为成品油。

2、生物酶法在玉米毛油中的应用

(1)生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的玉米毛油中工艺

准确称量适量ZEN降解酶用水溶解(酶制剂含量根据ZEN含量调整)，加入毛油中，37℃，100-300rpm搅拌处理15-30min，利用蝶式离心机以转速为10000rpm离心，分离。

(2)毛油精炼，制备玉米油

A水化脱胶：通常采用高温水化工艺，油温为70℃-80℃，水温为80℃左右，在20min内一次加完，沉降3h-4h，然后将油脚分离出来。

B碱炼脱酸：加入碱液，最终使得毛油的pH值为7-8，全部碱液应在10min内一次加完。当皂粒明显析出后静置沉降6h-8h，然后将皂角分离出去。

C水洗干燥：水洗时将油温调整到85℃左右，加入与油同温的水进行水洗，静置1h左右，放掉废水，进行真空温度为90℃-105℃脱水干燥处理。

D脱色：脱色时将油温升至90℃左右，加入活性白土(加入量为油重的3％-5％)与油充分混合，脱色时间为20min-30min，脱色完毕后将油冷却至70℃以下。

E脱臭：将脱色油吸入脱臭锅中，脱臭温度170℃-180℃，脱臭时间3h-8h。脱臭完毕，将油冷却至70℃以下泵出过滤，即为成品油。

3、吸附法去除玉米油中玉米赤霉烯酮生产工艺

作为对比，本实施例中使用了常规生产中用到的物理吸附法去除玉米油中ZEN的工艺，在此过程中，毛油不经过脱毒，脱色、脱臭步骤不同，其他步骤同玉米油制备工艺，脱色和脱臭步骤具体为：

脱色：脱色时将油温升至90℃左右，加入活性炭(加入量为油重的2％-3％)与油充分混合，脱色时间为20min-30min，脱色完毕后将油冷却至70℃以下。

脱臭：将脱色油吸入脱臭锅中，脱臭温度250℃，脱臭时间3h-8h。脱臭完毕，将油冷却至70℃以下泵出过滤，即为成品玉米油。

以不添加吸附剂及生物酶生产的玉米油为对照，检测经上述生物酶法生产的玉米油、玉米毛油及吸附法生产的玉米油各指标，结果如下：

4、生物酶法在玉米成品油中的应用

准确称量适量ZEN降解酶用水溶解(酶制剂含量根据ZEN含量调整)，加入玉米成品油中，37℃，300-500rpm搅拌处理1-15min，利用涡旋式离心机以转速为1000rpm离心，分离。

表1玉米油中各指标含量

以不去除ZEN法制得的玉米油得率为100％计算相对得率

由表1可以看出，不去除ZEN法为毛油不经过物理吸附和生物脱除等工艺制备的玉米油中ZEN残留量为508μg/kg，超过国家食品限量标准；采取物理吸附法工艺制备的玉米油中ZEN残留量265μg/kg，超过国家食品限量标准，且维生素E和甾醇含量有明显下降；分别使用3种生物酶法工艺制备的玉米油中ZEN残留量均低于20μg/kg，且VE、甾醇和不去除ZEN法制得的玉米油在得油率上均无显著差异(p＜0.05)。

表2玉米毛油中各指标含量

以不去除ZEN法制得的玉米油得率为100％计算相对得率

如表2所示，玉米毛油分别使用3种ZEN降解酶采过生物酶法处理后，ZEN残留量均低于20μg/kg，制得的玉米油中ZEN和酶解产物菌为未检出，且其中维生素E、甾醇和玉米油得油率均无显著差异(p＜0.05)。

表3玉米成品油中各指标含量

以不去除ZEN法制得的玉米油得率为100％计算相对得率

由表3可以看出，不经过生物酶法处理的成品油中ZEN残留量为324μg/kg，采取三种生物酶分别处理后，均未检出ZEN，且维生素E和甾醇含量基本无降低(p＜0.05)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家粮食局科学研究院

<120> 一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法

<130> JLC17I0310E

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> ZENdease-N1核苷酸序列

<400> 1

atgccttcttcactttctcccacggtagatgtgtacagcaaggtcatgttggaattaccc 60

ccgaaaatcaaatcactgccgacgccgacggtccggaaggtcaacaccaacgatgggatg 120

tcatggcacgtgaaacagacgggcatgggacgagatcttattctgatacctgcctgcgaa 180

ggcgacagctctacctatgatcacctcggcgatctcctctcctcctcattcagaataacc 240

acattcgacatgcctggcttctccaggacgatcgcgccgcccttctcgatggaagacctc 300

acggtacagattttggcgactcaggtcgtcacgttgatggacgaacttgcgataccgaca 360

gcgaccttcttctcagtcgccgccgggagcttagtggcgatgggcttggtaacatactac 420

ccggaccgggtcgagcgaatcatcatccacgaggcccctctccacgttccccaaggattc 480

agactcttgaagctcaaggacgacgctcatgtgatgcaccaatgtcgcgaaatgtttccc 540

gcactcctgatggagagtagaacggcgtgggaagctatgggagccgagtaccatgctcgg 600

atggagaagaactatgtcacctggctcaggaagtacatcggccagctggaatgtcaccat 660

tgggacgagggattgctgcagagacctgtgtattggagcgttggatcgttgaatgtgatg 720

ggaggcttctacgacaacattattttggcgacgaaattaggcctcgaggtcgagatactt 780

ccgtgcaagcactatccacagctaacgataccggaaatactcgcggcacatattcgatgt 840

tgtgtgaaggatggggcttg a 861

<210> 2

<211> 286

<212> PRT

<213> ZENdease-N1氨基酸序列

<400> 2

Met Pro Ser Ser Leu Ser Pro Thr Val Asp Val Tyr Ser Lys Val Met

1 5 10 15

Leu Glu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Ser Leu Pro Thr Pro Thr Val Arg

20 25 30

Lys Val Asn Thr Asn Asp Gly Met Ser Trp His Val Lys Gln Thr Gly

35 40 45

Met Gly Arg Asp Leu Ile Leu Ile Pro Ala Cys Glu Gly Asp Ser Ser

50 55 60

Thr Tyr Asp His Leu Gly Asp Leu Leu Ser Ser Ser Phe Arg Ile Thr

65 70 75 80

Thr Phe Asp Met Pro Gly Phe Ser Arg Thr Ile Ala Pro Pro Phe Ser

85 90 95

Met Glu Asp Leu Thr Val Gln Ile Leu Ala Thr Gln Val Val Thr Leu

100 105 110

Met Asp Glu Leu Ala Ile Pro Thr Ala Thr Phe Phe Ser Val Ala Ala

115 120 125

Gly Ser Leu Val Ala Met Gly Leu Val Thr Tyr Tyr Pro Asp Arg Val

130 135 140

Glu Arg Ile Ile Ile His Glu Ala Pro Leu His Val Pro Gln Gly Phe

145 150 155 160

Arg Leu Leu Lys Leu Lys Asp Asp Ala His Val Met His Gln Cys Arg

165 170 175

Glu Met Phe Pro Ala Leu Leu Met Glu Ser Arg Thr Ala Trp Glu Ala

180 185 190

Met Gly Ala Glu Tyr His Ala Arg Met Glu Lys Asn Tyr Val Thr Trp

195 200 205

Leu Arg Lys Tyr Ile Gly Gln Leu Glu Cys His His Trp Asp Glu Gly

210 215 220

Leu Leu Gln Arg Pro Val Tyr Trp Ser Val Gly Ser Leu Asn Val Met

225 230 235 240

Gly Gly Phe Tyr Asp Asn Ile Ile Leu Ala Thr Lys Leu Gly Leu Glu

245 250 255

Val Glu Ile Leu Pro Cys Lys His Tyr Pro Gln Leu Thr Ile Pro Glu

260 265 270

Ile Leu Ala Ala His Ile Arg Cys Cys Val Lys Asp Gly Ala

275 280 285

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成引物1

<400> 3

gaaattcatatgccttcttcactt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成引物2

<400> 4

cccgtcgacagccccatcct t 21

<210> 5

<211> 801

<212> DNA

<213> ZENdease-N2核苷酸序列

<400> 5

atgcggacaagatcgactctcaaagacaagaatgggatcaactggtactacgaacaagaa 60

gggtctggcccccacgtggttcttatccccgatgggtggggagagtgccaaatgatggac 120

aagcccatgtctctaattgccgcccaggggtttacggtcaccacattcgacatgccggga 180

ttctcgaggtcttcagatgccccgccggagacttaccaggacgtcacagcccagaagctg 240

gccagctacgtcatcagcatcctagatgagctgcacgtcgattacgctacgttctggggc 300

tgcgccgccggcggtgcgaccgtgcttgcattggcggctgactaccccgagcgcatgcgc 360

aacgggctgccgcatgaagttccgacggctgctaatcccaaggaaaacctcaacgctttg 420

gctaagatggaagacgaggctatcgtgaagatcatggaaggggacatgctcaagcacatc 480

ttcggtcccgatttgacggcgtggcatgcgctgggcgaggaggcccacgccaggttgcgg 540

aaagcctatccccgctgggcccgcggctacccccttactctaccgtcgtctgcgcccact 600

ggagaagaggacttgaagaagcgaccgctggattggactgttggtggggatacggcgaca 660

cagtcgttcatcgataacattatcactgctgcgaaggccggaatcccgatcgggacgatc 720

ccgggcatgcactttccgtatgtctcgcatccggaggctctggtgaaacatattgtggat 780

actactcggaggtatctatg a 801

<210> 6

<211> 266

<212> PRT

<213> ZENdease-N2氨基酸序列

<400> 6

Met Arg Thr Arg Ser Thr Leu Lys Asp Lys Asn Gly Ile Asn Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro His Val Val Leu Ile Pro Asp Gly

20 25 30

Trp Gly Glu Cys Gln Met Met Asp Lys Pro Met Ser Leu Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Thr Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Phe Ser Arg Ser

50 55 60

Ser Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Asp Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Glu Leu His Val Asp Tyr Ala

85 90 95

Thr Phe Trp Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Thr Val Leu Ala Leu Ala

100 105 110

Ala Asp Tyr Pro Glu Arg Met Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala Ala Asn Pro Lys Glu Asn Leu Asn Ala Leu Ala Lys Met Glu

130 135 140

Asp Glu Ala Ile Val Lys Ile Met Glu Gly Asp Met Leu Lys His Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Asp Leu Thr Ala Trp His Ala Leu Gly Glu Glu Ala His

165 170 175

Ala Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Pro Arg Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Leu

180 185 190

Thr Leu Pro Ser Ser Ala Pro Thr Gly Glu Glu Asp Leu Lys Lys Arg

195 200 205

Pro Leu Asp Trp Thr Val Gly Gly Asp Thr Ala Thr Gln Ser Phe Ile

210 215 220

Asp Asn Ile Ile Thr Ala Ala Lys Ala Gly Ile Pro Ile Gly Thr Ile

225 230 235 240

Pro Gly Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Leu Val Lys

245 250 255

His Ile Val Asp Thr Thr Arg Arg Tyr Leu

260 265

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成引物3

<400> 7

gaaattcatatgcggacaagatcg 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成引物4

<400> 8

cccgtcgactagatacctcc g 21

<210> 9

<211> 870

<212> DNA

<213> ZENdease-N3核苷酸序列

<400> 9

atgcgcacccaatccaccatcacgaccccagacgggataacctggtactacgagcaagaa 60

ggcaccggtccgcacatagtcctaatcccagacggcatcggcgactgcgcgctattctcg 120

aagcctgtatcgctcatagccgccgccggctttactgtcaccacgttcgatatgccgggc 180

atgtcgcggtccgctcacggggccaacacgcccccggaaagctaccaggacatcacggcg 240

cccaagctagcgcgctacgtgatcagcctgctcgacgccctgcacatcgacgacgacgcc 300

gccaccttctggggcagcagctcgggcggcgccaccgtcctcgcgctcgcggccggatac 360

cccgatcgcgtgcggaatggaatcgtgcacgaggtgccgaccacccagcacgatttcttc 420

gaggagctgctccagaacgatgacgagagcatcgccaagacgctggcggcgcagatgccc 480

gccctgttcgtgggagacgctgcggcctgggacgcgctgggcgatgacgtccatgctagg 540

ctttggaggaactatagccgctgggctagggggtacccgcggacgctgccccagtcggtg 600

cctactgttcctgttggtggtagtggtggtggtggtggtggtggtgatcaggagcaggag 660

gaggaggaggaaaatgaggatcgggtgaggcggccgctagactggacggttggcgctggc 720

acgccgatggggatgttctttgataatgtcgtcacggccgcaaaggccggggtcagtatt 780

gggctgttacctgggatgcatctcccttatgtttcgcatccagaggccttcgcgagacat 840

gtcgttgatacgacgcggaagtatctatga 870

<210> 10

<211> 289

<212> PRT

<213> ZENdease-N3氨基酸序列

<400> 10

Met Arg Thr Gln Ser Thr Ile Thr Thr Pro Asp Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro His Ile Val Leu Ile Pro Asp Gly

20 25 30

Ile Gly Asp Cys Ala Leu Phe Ser Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala

35 40 45

Ala Gly Phe Thr Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala His Gly Ala Asn Thr Pro Pro Glu Ser Tyr Gln Asp Ile Thr Ala

65 70 75 80

Pro Lys Leu Ala Arg Tyr Val Ile Ser Leu Leu Asp Ala Leu His Ile

85 90 95

Asp Asp Asp Ala Ala Thr Phe Trp Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Thr

100 105 110

Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Pro Asp Arg Val Arg Asn Gly Ile

115 120 125

Val His Glu Val Pro Thr Thr Gln His Asp Phe Phe Glu Glu Leu Leu

130 135 140

Gln Asn Asp Asp Glu Ser Ile Ala Lys Thr Leu Ala Ala Gln Met Pro

145 150 155 160

Ala Leu Phe Val Gly Asp Ala Ala Ala Trp Asp Ala Leu Gly Asp Asp

165 170 175

Val His Ala Arg Leu Trp Arg Asn Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Gly Tyr

180 185 190

Pro Arg Thr Leu Pro Gln Ser Val Pro Thr Val Pro Val Gly Gly Ser

195 200 205

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gln Glu Gln Glu Glu Glu Glu Glu

210 215 220

Asn Glu Asp Arg Val Arg Arg Pro Leu Asp Trp Thr Val Gly Ala Gly

225 230 235 240

Thr Pro Met Gly Met Phe Phe Asp Asn Val Val Thr Ala Ala Lys Ala

245 250 255

Gly Val Ser Ile Gly Leu Leu Pro Gly Met His Leu Pro Tyr Val Ser

260 265 270

His Pro Glu Ala Phe Ala Arg His Val Val Asp Thr Thr Arg Lys Tyr

275 280 285

Leu

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成引物5

<400> 11

gaaattcatatgatgcgcacccaatccacc at 32

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成引物6

<400> 12

cccgtcgactcatagatacttccgcgtcg 29

Claims (8)

1.一种生物酶法生产不含玉米赤霉烯酮的植物油的方法，其特征在于，所述方法包括在生产植物油过程中添加具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶或用具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶处理成品植物油，其中，所述具有玉米赤霉烯酮降解活性的生物酶为玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N2或ZENdease-N3；

所述ZENdease-N2为由序列表SED ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述ZENdease-N3为由序列表SED ID NO.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在生产植物油过程中，所述生物酶在适于其进行酶反应的阶段被添加。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在生物酶处理成品植物油时，所述生物酶与成品植物油进行酶反应。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述酶反应的条件为：温度：30-80℃；时间：1min-5h；搅拌速度：80-500rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物油为玉米油、大豆油、花生油或菜籽油。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在酶反应后，进行分离。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分离是利用离心机进行，所述离心机为蝶式离心机或涡旋式离心机。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离心机的转速为1000-10000rpm。

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