CN111394326A

CN111394326A - 呕吐毒素降解酶ddh及其在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用

Info

Publication number: CN111394326A
Application number: CN202010228476.6A
Authority: CN
Inventors: 赵丽红; 马秋刚; 秦晓娟; 郭永鹏; 计成
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111394326B

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及呕吐毒素降解酶DDH及其编码基因和应用；本发明所涉及的呕吐毒素降解酶DDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了编码上述呕吐毒素降解酶DDH的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；本发明还公开了上述呕吐毒素降解酶DDH的制备方法及其在单端孢霉烯族毒素脱毒上的应用，及其作为单端孢霉烯族毒素生物降解剂的制备方法和应用，本发明的呕吐毒素降解酶DDH在单端孢霉烯族毒素脱毒领域具有广阔的应用前景。

Description

呕吐毒素降解酶DDH及其在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及呕吐毒素降解酶DDH及其编码基因和应用，尤其是在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用。

背景技术

单端孢霉烯族毒素(Trichothecene mycotoxins)为一大类由镰刀菌产生的霉菌毒素，主要包括呕吐毒素(又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，Deoxynivalenol，DON)、T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)、镰刀菌烯酮-X(Fusarenon X,FUS)等。这类毒素容易污染小麦、大麦、玉米等农作物，常常在这些谷物粮食及动物饲料中检出，且有超标现象。这类毒素会引起动物呕吐、拒食、消化道黏膜损伤、生产性能和免疫机能下降，对畜牧养殖者造成严重经济损失。目前在饲料工业用于霉菌毒素脱毒的方法主要为两大类，一类是物理吸附脱毒，比如添加一些蒙脱石类的无机吸附剂和酯化甘露聚糖类的有机吸附剂；另一种是生物降解方法，通过微生物或其产生的酶对霉菌毒素进行生物转化，使毒素代谢生成无毒或低毒产物。生物降解方法安全、高效和环保，是目前霉菌毒素脱毒的研究热点。已报到的能够降解呕吐毒素的微生物有优杆菌(Eubacterium sp.)、德沃斯氏菌(Devosia sp.)、诺卡氏细菌(Nocardioides sp.)和芽孢杆菌(Bacillus sp.)等。关于呕吐毒素降解酶的研究报道很少，仅发现两个，其一为来源于德沃斯氏菌的脱氢酶(DepA)和醛酮还原酶(DepB)，另外一个是来源于鞘氨醇单胞菌的醛酮还原酶。其降解途径是将DON分子中C3-OH脱氢氧化生成3-keto-DON，然后生成的3-keto-DON被还原生成差向异构体3-epi-DON，与DON比这两种产物毒性均降低。目前还没其他来源的酶能够降解DON的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种来源于耐盐海杆菌(Pelagibacterium Halotolerans)的呕吐毒素降解酶DDH及其在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用。

本发明的目的在于提供一种具有脱毒功能的呕吐毒素降解酶DDH，该酶具有降解单端孢霉烯族毒素功能。本发明的另一目的在于提供上述呕吐毒素降解酶DDH的编码基因。

本发明的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株或细胞。

本发明的另一目的在于提供上述呕吐毒素降解酶DDH的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述呕吐毒素降解酶DDH的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述呕吐毒素降解酶DDH的生物降解剂。

本发明的另一目的在于提供上述含有呕吐毒素降解酶DDH的生物降解剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种降解单端孢霉烯族毒素的方法。

本发明的另一目的在于提供含有上述呕吐毒素降解酶DDH的生物降解剂在单端孢霉烯族毒素脱毒方面的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明所述的具有脱毒功能的呕吐毒素降解酶DDH的氨基酸序列可以为：

SEQ ID NO.1所示序列；

或者SEQ ID NO.1所示序列中的一个或两个氨基酸残基被取代和/或缺失和/或插入；

或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，优选95％序列一致性，并具有呕吐毒素降解酶DDH的功能的序列。

本发明还提供了编码所述呕吐毒素降解酶DDH的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列；

或者SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列中的一个或两个核苷酸残基被取代和/或缺失和/或插入；

或者与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％以上的序列一致性，优选95％序列一致性的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1：

MRQLSSKLLKMVLAGTTAFGLLAVPAFAQTAISDLAPVTDEMLANPDDGDWLAYGRAVDNYRFSPLDQIN

TDNVDQLQMVWARGLETGPMQTSPIVYDGVMFIANPGDTIQALDAVTGDLIWQYRRRLPDTNTLHSLGDR

KRGISIYGDHLYFMSWDNFLVALDMKTGQLAWEVDRGQGTDLVSNTSGPIVANGVIVAGSTCQYSAFGCF

ISGHDAETGEELWRNTFIPQPGEEGDETWGNDYESRWMTGVWGQITYDPELDLVFYGSSAVGPASEVQRG

TPGGTLYGTNTRFAVDPQTGEIAWRHQTLPRDNWDQECTFEMIVADTDVNPSDSMDGLRAIGASASGEGR

RVLTGVPCKTGTMWQFDAETGEFLWARDTAYTNMIESIDETGLVTVNEDVILDEIGVPVEHCPAYLGGRD

WPPSAFNPNTGIYYIPLNNTCQISTPRDNEPTALDVYNTDSSYTLPPEETNVGRIDAIDISTGETVWSWE

QPAAQYSPVMTTAGNLLFTGGGDRYLKAFNAETGDMLWRSRLASDASGHAITYEVDGRQYVAIPAGPAGF

SSALMIAEGNVDQGGSNSAVYVFALPEE

SEQ ID NO.2：

GTGAGGCAATTGTCTTCCAAACTGTTGAAAATGGTCCTTGCGGGGACCACCGCTTTCGGGCTGCTCGCCGTACCGGCGTTCGCCCAGACCGCGATCAGCGATCTGGCGCCGGTGACCGACGAAATGCTTGCGAATCCCGATGACGGCGACTGGCTCGCCTATGGTCGCGCTGTCGACAACTATCGGTTCAGCCCGCTCGACCAGATCAATACCGACAATGTCGATCAGCTTCAGATGGTCTGGGCCCGCGGCCTGGAAACCGGCCCGATGCAGACCTCGCCGATCGTTTACGATGGCGTCATGTTCATCGCCAACCCCGGCGACACCATCCAGGCTCTGGACGCTGTAACCGGCGATCTGATCTGGCAGTACCGCCGCCGCCTGCCCGATACCAACACCCTGCATTCGCTCGGTGACCGCAAGCGTGGCATCTCGATCTATGGCGACCACCTCTACTTCATGAGCTGGGACAACTTCCTTGTCGCCCTCG

ACATGAAGACCGGCCAGTTGGCCTGGGAAGTCGACCGTGGCCAGGGCACCGACCTTGTGTCCAACACCTCCGGCCCGATCGTGGCAAATGGCGTGATCGTCGCCGGCTCGACCTGCCAGTATTCTGCCTTCGGGTGCTTCATCTCCGGCCATGACGCCGAAACCGGTGAAGAACTCTGGCGCAACACCTTCATCCCACAGCCGGGTGAAGAGGGTGACGAAACCTGGGGCAATGACTACGAATCGCGCTGGATGACCGGCGTTTGGGGCCAGATCACCTATGATCCCGAACTCGACCTCGTCTTCTACGGCTCGAGCGCTGTGGGCCCGGCTTCCGAAGTCCAGCGTGGCACTCCGGGCGGAACGCTCTACGGCACCAACACCCGCTTTGCGGTCGACCCGCAGACCGGCGAGATCGCCTGGCGTCACCAGACCCTGCCCCGCGATAACTGGGACCAGGAATGCACGTTCGAAATGATCGTCGCCGATACCGACGTGAACCCGAGCGATTCCATGGATGGCCTGCGCGCCATCGGTGCGAGCGCTTCGGGCGAAGGCCGCCGCGTGCTGACCGGCGTGCCGTGCAAGACCGGTACGATGTGGCAGTTCGATGCCGAGACCGGTGAATTCC

TCTGGGCTCGTGACACCGCCTATACCAACATGATCGAAAGCATCGACGAAACCGGTCTCGTGACCGTCAACGAAGATGTCATCCTCGATGAGATTGGCGTTCCGGTGGAGCACTGCCCGGCCTATCTCGGTGGCCGCGATTGGCCGCCCTCCGCGTTCAATCCGAACACGGGCATCTACTACATCCCGCTCAACAACACGTGCCAGATTTCCACGCCACGTGACAACGAGCCGACAGCCCTTGACGTGTACAACACCGATTCCTCGTACACGCTGCCGCCCGAAGAGACCAATGTTGGCCGTATCGACGCCATCGACATCTCGACCGGCGAAACCGTCTGGAGCTGGGAACAGCCCGCTGCACAGTACTCGCCGGTCATGACGACTGCCGGCAATCTGCTGTTCACCGGTGGCGGCGATCGCTATCTCAAGGCTTTCAACGCCGAAACCGGCGATATGCTGTGGCGCTCGCGCCTCGCATCGGATGCTTCGGGCCATGCGATCACCTATGAGGTCGATGGCCGTCAGTACGTCGCGATCCCGGCAGGTCCTGCCGGCTTCTCGTCGGCTCTGATGATCGCCGAAGGCAATGTCGACCAGGGTGGCAGCAATTCCGCAGTCTATGTCTTCGCTCTGCCTGAAGAGTAA

SEQ ID NO.3：

ATGCGCCAGCTGAGTAGCAAGCTGCTGAAAATGGTGCTCGCGGGTACCACCGCGTTTGGTCTGCTCGCGGTTCCAGCCTTTGCCCAGACCGCGATCAGTGATCTGGCGCCAGTTACGGATGAAATGCTCGCCAATCCGGATGATGGCGATTGGCTCGCCTATGGTCGCGCCGTGGACAATTACCGCTTTAGTCCGCTGGACCAGATCAACACCGACAACGTTGACCAGCTGCAAATGGTGTGGGCCCGTGGTCTGGAAACCGGTCCGATGCAAACCAGCCCAATCGTGTACGACGGCGTTATGTTCATCGCCAACCCGGGCGATACGATCCAAGCGCTGGATGCGGTGACCGGCGATCTGATTTGGCAGTATCGTCGCCGTCTGCCGGATACCAACACGCTGCATAGTCTGGGCGACCGCAAACGCGGTATCAGCATCTACGGCGACCATCTGTACTTTATGAGCTGGGACAATTTTCTGGTGGCGCTGGATATGAAAACCGGTCAGCTGGCGTGGGAAGTTGATCGTGGCCAAGGCACCGATCTGGTGAGCAATACGAGCGGTCCGATTGTGGCCAACGGCGTGATTGTTGCGGGCAGTACGTGCCAGTACAGTGCGTTTGGCTGCTTCATCAGTGGTCACGACGCGGAAACGGGTGAGGAACTGTGGCGCAATACGTTCATCCCGCAGCCGGGCGAAGAAGGCGATGAAACGTGGGGCAACGACTATGAAA

GCCGCTGGATGACGGGTGTTTGGGGCCAGATCACCTATGACCCGGAGCTGGATCTGGTGTTTTACGGTAGCAGTGCCGTGGGTCCAGCCAGCGAAGTGCAACGTGGTACCCCGGGCGGTACGCTGTACGGTACCAACACCCGCTTCGCGGTGGATCCGCAAACCGGCGAAATCGCGTGGCGCCATCAGACGCTGCCACGTGATAACTGGGACCAAGAATGCACGTTCGAGATGATTGTGGCCGACACCGATGTGAACCCGAGCGATAGCATGGACGGTCTCCGCGCGATTGGTGCCAGTGCGAGCGGTGAAGGTCGTCGTGTGCTGACCGGCGTGCCATGCAAAACCGGTACGATGTGGCAGTTCGATGCGGAGACCGGCGAATTTCTGTGGGCCCGCGATACGGCCTACACGAACATGATCGAAAGCATCGACGAAACCGGTCTGGTTACGGTTAACGAGGATGTGATTCTGGACGAGATCGGTGTGCCAGTTGAACATTGTCCGGCGTATCTGGGTGGCCGTGATTGGCCACCGAGCGCCTTTAACCCGAATACCGGCATCTACTACATCCCGCTGAACAACACGTGCCAGATCAGCACCCCACGCGACAACGAACCAACGGCGCTGGATGTGTACAACACCGACAGCAGCTATACCCTCCCACCGGAGGAAACCAACGTGGGCCGCATTGATGCGATCGATATCAGCACCGGCGAAACCGTGTGGAGTTGGGAACAACCGGCCGCCCAGTATAGCCCGGTTATGACGACCGCGGGCAATCTGCTGTTTACCGGCGGCGGTGACCGCTATCTGAAAGCGTTTAATGCCGAGACCGGCGATATGCTGTGGCGCAGCCGTCTGGCGAGTGATGCCAGTGGCCATGCGATTACCTACGAAGTTGACGGTCGCCAGTATGTTGCCATTCCAGCCGGTCCAGCCGGTTTCAGCAGCGCGCTGATGATCGCCGAAGGCAATGTTGACCAAGGCGGCAGCAACAGTGCGGTTTACGTTTTTGCGCTGCCAGAAGAGTAA

本发明还提供了包含上述呕吐毒素降解酶DDH的重组载体，优选为pET-31b-DDH。

本发明还提供了包含上述呕吐毒素降解酶DDH的重组菌株，优选为重组菌株Rosseta(DE3)/DDH。

本发明还提供了一种制备呕吐毒素降解酶DDH的方法，包括以下步骤：

(1)用包含编码呕吐毒素降解酶DDH基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养所述重组菌株，诱导呕吐毒素降解酶DDH表达；

(3)利用镍离子亲和层析获得纯化后的呕吐毒素降解酶DDH。

本发明还提供了上述呕吐毒素降解酶DDH的应用，尤其在单端孢霉烯族毒素脱毒方面的应用，所述的单端孢霉烯族毒素包括但不限于呕吐毒素和T-2毒素等。

本发明还提供一种单端孢霉烯族毒素生物降解剂，包含呕吐毒素降解酶DDH以及生理上可接受的配伍载体，所述生理上可接受的配伍载体包括但不限于复合微生态制剂、芽孢杆菌菌剂、乳酸菌菌剂、酵母细胞壁、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、麦芽糖糊精、环糊精、滑石粉、蒙脱石或寡糖中的一种或多种。

本发明还提供一种降解单端孢霉烯族毒素的方法，包括将上述呕吐毒素降解酶DDH或上述单端孢霉烯族毒素生物降解剂处理含有单端孢霉烯族毒素的材料。

上述方法中，所述处理为将上述呕吐毒素降解酶DDH或上述单端孢霉烯族毒素生物降解剂和含有单端孢霉烯族毒素的材料混合。

上述方法中，所述单端孢霉烯族毒素包括但不限于呕吐毒素和T-2毒素。

上述方法中，所述含有单端孢霉烯族毒素的材料包括但不限于谷物、粮食、食品、饲料、粮食加工副产物、粮油、陈化粮、茶叶、水果、果汁或中草药等包括各种含有单端孢霉烯族毒素的材料。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种具有降解呕吐毒素功能的呕吐毒素降解酶DDH及其编码基因和应用，尤其涉及其在降解单端孢霉烯族毒素方面的应用，试验证实呕吐毒素降解酶DDH能够高效降解DON、T-2等单端孢霉烯族毒素。本发明第一次报道来源于耐盐海杆菌中的呕吐毒素降解酶DDH能够降解单端孢霉烯族毒素，且该酶催化效率高，在饲料和谷物原料单端孢霉烯族毒素生物脱毒领域有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组质粒pET-31b-DDH的表达产物纯化后SDS-PAGE图；其中泳道1为纯化的重组呕吐毒素降解酶DDH，泳道M为蛋白分子量标准(116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)；

图2示重组呕吐毒素降解酶DDH在不同温度条件下对DON的降解情况；

图3示重组呕吐毒素降解酶DDH在不同pH条件下对DON的降解情况；

图4示DON及其产物3-keto-DON的UPLC–QTOF-MS/MS图；其中，图4(A)示DON二级质谱图；图4(B)示产物3-keto-DON二级质谱图。

具体实施方式

本发明公开了一种具有脱毒功能的呕吐毒素降解酶DDH及其编码基因和其在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明实施例中使用的主要实验材料和试剂为：

大肠杆菌表达载体pET-31b、克隆菌株大肠杆菌DH5α、表达菌株大肠杆菌Rosseta(DE3)均购自Invitrogen公司。限制性核酸内切酶和DAN聚合酶购自NEB公司，呕吐毒素购自sigma公司，其它试剂为国产分析纯。

如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员用到的常规手段。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1呕吐毒素降解酶DDH蛋白的获得及表达

以耐盐海杆菌ANSP101基因组DNA为扩增模板，扩增DDH蛋白的编码基因，构建含有DDH蛋白编码基因序列的重组表达载体及其工程菌，并表达DDH蛋白。具体步骤如下：

1、编码呕吐毒素降解酶DDH基因的克隆

1.1按以下步骤提取耐盐海杆菌基因组DNA：

从甘油管中取50μL保藏菌液接种划线于LB固体平板上，37℃静置培养12h。

从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，180r/min，37℃条件下培养12h。

将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清。

向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，枪头吹打使菌体悬浮，37℃温浴60min；12000r/min离心1min收集菌体，弃上清。

向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。

向管子里加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀。

加入25μL裂解液S，颠倒混匀；57℃水浴放置20min，其间颠倒混匀1-2次。

加入250μL缓冲液B，旋涡振荡5s充分混匀。

加入250μL无水乙醇，旋涡振荡15s充分混匀。

将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入700μL漂洗液WB，离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入700μL漂洗液WB，12000r/min离心3min，倒掉废液。

将吸附柱放入一个干净的离心管中，室温放置数分钟，向吸附膜的中间部位悬空滴加150μL洗脱液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。

1.2呕吐毒素降解酶DDH编码基因扩增，步骤如下：

依照载体pET-31b多克隆位点，选择NdeI和XhoI为酶切位点，设计上游引物P1和下游引物P2，由上海生工生物工程技术有限公司合成。设计上游引物P1和下游引物P2序列如下：

上游引物P1：5′-GGAGATATACATATGAGGCAATTGTCTTCCAAA-3′

下游引物P2：5′-GTGGTGGTGGTGCTCGAGCTCTTCAGGCAG-3′

以耐盐海杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，其反应条件为表1：

表1 PCR扩增反应条件

DNA模板	1μL
		上游引物P1	2μL
下游引物P2	2μL
		2×Pfu PCR Mix	25μL
ddH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>	20μL
		总体积	50μL

扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸2min反应30个循环；72℃彻底延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2、含有呕吐毒素降解酶DDH编码基因序列的重组表达载体构建

线性化载体的制备：用NdeI和XhoI双酶切pET-31b质粒，酶切体系如表2：

表2酶切体系

pET-31b质粒	30μL
		NdeI	1μL
XhoI	1μL
		10×CutSmart Buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>	13μL
		总体积	50μL

酶切条件：37℃水浴30min。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收质粒酶切片段。

同源重组克隆：利用艾德莱一步法无缝克隆试剂盒进行重组表达载体的构建，反应体系如表3：

表3重组表达载体构建的反应体系

2×OneStep Cloning Mix	5μl
		线性化pET-31b质粒	2μL
PCR产物	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	1μL
总体积	10μL

反应条件：轻轻混匀，在50℃反应30分钟。反应结束后，将PCR管置冰上后连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经Amp抗性筛选，挑取阳性转化子，提取重组质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株DH5α/pET-31b-DDH，然后将正确的重组质粒pET-31b-DDH转化大肠杆菌Rosseta(DE3)。

3、呕吐毒素降解酶DDH在大肠杆菌中的诱导表达和纯化

3.1呕吐毒素降解酶DDH诱导表达

将转化有pET-31b-DDH质粒的重组大肠杆菌Rosseta(DE3)接种于5mL液体LB培养基中活化过夜，按1：100比例转接到500mL装液量为300mL的三角瓶中，180r/min，37℃条件下培养至OD600为0.7，添加终浓度为0.4mM IPTG诱导目的蛋白表达。

3.2呕吐毒素降解酶DDH纯化

收集发酵液，4℃，12000rpm离心30min，弃上清；用pH7.4的PBS溶液重悬菌体，4℃，12000rpm离心30min，弃上清，重复洗涤菌体三次。然后将菌体细胞重悬在1mg/mL的bindingbuffer中，超声破碎，4℃，12000rpm离心10min，收集上清并过滤。由于表达的DDH蛋白C端带有组氨酸标签(6×His)，因此使用镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化重组蛋白，平衡、上样、洗脱等步骤参见Qiagen使用手册。纯化后的蛋白用截留管(10kDa)超滤去除其中含有的咪唑，采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果，结果如图1所示，泳道1为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株表达的蛋白质的分子量约为65kDa，与理论分子量大小一致。

实施例2温度对呕吐毒素降解酶DDH降解DON活性的影响

将固体呕吐毒素溶解到乙腈中配成500μg/mL的母液，辅基PMS(吩嗪硫酸甲酯)溶解到超纯水中配成5mM的母液，按如下500μL反应体系进行实验：350μL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05M，pH9.0)，50μL DDH蛋白(23.5μg)，50μL辅基PMS溶液，50μL DON溶液。以未加入DDH蛋白的体系作为对照。反应在不同温度(20、25、30、35、40、45℃)条件下进行1h后加入500μL甲醇终止反应，12000rpm离心1min，取上清用Millex-GV滤膜(0.22μm)过滤，采用高效液相色谱法检测体系中残留的DON含量。

高效液相色谱检测DON的色谱条件为：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相：乙腈-水(1：9)；流速：1mL/min；泵压：100bar；进样量：20μL；紫外检测器检测波长：λ＝218nm；采集时间：15分钟。

DON的降解率(％)＝(1-处理组中剩余DON量/对照组中DON量)×100％

结果以温度35℃条件下的DON降解率为100％，其它温度条件下以相对降解率表示。结果如图2所示，呕吐毒素降解酶DDH降解DON最适温度为35℃

实施例3pH对呕吐毒素降解酶DDH降解DON活性的影响

为测试在不同pH条件呕吐毒素降解酶DDH对DON降解活性的影响，采用案例实施2所用的反应体系：350μL缓冲液(0.05M磷酸钠缓冲液，pH6-8；0.05M甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9-11)，50μL DDH蛋白(23.5ug)，50μL辅基PMS溶液，50μL DON溶液。反应在35℃下进行1h后加入500μL甲醇终止反应，12000rpm离心1min，取上清用Millex-GV滤膜(0.22μm)过滤，采用案例实施2所述方法检测体系中残留的DON含量。

结果如图3所示，呕吐毒素降解酶DDH降解DON最适pH为9.0。

实施例4呕吐毒素降解酶DDH降解DON酶促反应动力学参数测定

呕吐毒素降解酶DDH降解DON的酶活定义：在最适反应条件下(温度为35℃，pH为9.0)，每分钟降解1纳摩尔DON所需要的酶量。

采用案例实施2所用的500μL反应体系：390μL缓冲液(0.05M磷酸钠缓冲液，pH9)，10μL DDH蛋白(4.7ug)，50μL辅基PMS溶液，50μL DON溶液，其中DON终浓度分别为50、100、150、200、300、500和700μM，35℃反应30min；测定不同浓度DON体系中DDH催化降解DON的初始反应速率，根据米氏方程，用Graphpad8.0进行Michaelis-Menten回归分析，求解DDH催化降解DON的Km和最大反应速率Vm，根据体系中加入的酶量，进一步求解Kcat值。结果如表4所示。

表4呕吐毒素降解酶DDH催化降解DON反应动力学参数

底物	Vmax(U mg-1)	Km(mM)	Kcat(s-1)	Kcat/Km(M-1S-1)
					DON	547.6	0.4222	0.595	1409.2

实施例5呕吐毒素降解酶DDH降解DON的作用机理

为测定呕吐毒素降解酶DDH降解DON的产物结构，将固体呕吐毒素溶解到乙腈中配成2000μg/mL的母液，按如下20mL反应体系进行实验：14mL磷酸钠缓冲液(0.05M，pH7.0)，2mL DDH蛋白(940μg)，2mL辅基PMS溶液，2mL DON溶液。以未加入DDH蛋白的体系作为对照。反应在35℃条件下进行24h后加入20mL乙酸乙酯萃取三次，萃取到降解产物的乙酸乙酯溶液在旋转蒸发瓶中35℃条件下蒸发，直至蒸干。蒸干后剩余的残渣用质谱级的1.5mL甲醇溶解。上样前用Millex-GV滤膜(0.22μm)过滤，采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术检测体对照组内DON和实验组内降解产物。

UPLC-MS/MS色谱-质谱条件：色谱柱：Acquity C18色谱柱，2.1mm×100mm×1.7μm；流动相:0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，梯度洗脱程序:0-9min，95％-5％A，9-12min，5％A，12-13min，5％-95％A，13-15min，95％A；流速：0.4mL/min；进样体积：5μL，采集时间：15分钟。ESI负离子模式；毛细管电压：3kV；离子源温度：100℃；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气(N2)流速：500L/h；碰撞气：氩气；在线校准选择亮氨酸脑啡肽(Leucineenkephalin)，浓度：1ng/μL；数据采集方式：全扫描；m/z范围：50-1200，数据使用Metabolynx XS软件分析。

结果如图4所示，呕吐毒素降解酶DDH降解DON的产物为3-Keto-DON。实施例6呕吐毒素降解酶DDH催化降解T-2毒素的效率

将固体T-2毒素溶解到乙腈中配成500μg/mL的母液，辅基PMS(吩嗪硫酸甲酯)溶解到超纯水中配成5mM的母液，按如下500μL反应体系进行实验：350μL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05M，pH9.0)，50μL DDH蛋白(23.5μg)，50μL辅基PMS溶液，50μL T-2溶液。以未加入DDH蛋白的体系作为对照。在35℃条件下反应12h后加入500μL甲醇终止反应，12000rpm离心1min，取上清用Millex-GV滤膜(0.22μm)过滤，采用高效液相色谱法检测体系中残留的T-2含量。

结果表明，呕吐毒素降解酶DDH催化降解T-2的效率为82.6％。

实施例7一种单端孢霉烯族毒素生物降解剂及其制备方法

称取添加剂总质量的90％的载体(麦麸与淀粉按质量比2:1比例混合)，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入实施例1制得的呕吐毒素降解酶DDH，得到单端孢霉烯族毒素生物降解剂。

实施例8一种单端孢霉烯族毒素生物降解剂及其制备方法

称取添加剂总质量的85％的载体(麦芽糖糊精与蔗糖按质量比3:1比例混合)，然后再按添加剂总质量的10％的比例混入酵母细胞壁，再按添加剂总质量的5％的比例混入实施例1制得的呕吐毒素降解酶DDH，得到单端孢霉烯族毒素生物降解剂。

实施例9一种单端孢霉烯族毒素生物降解剂及其制备方法

先将占添加剂总质量的90％的淀粉与占添加剂总质量的5％的枯草芽孢杆菌混合，然后再按添加剂总质量的5％的比例混入实施例1制得的呕吐毒素降解酶DDH，得到单端孢霉烯族毒素生物降解剂。

实施例10单端孢霉烯族毒素生物降解剂处理含有DON的饲料

将实施例8所述单端孢霉烯族毒素生物降解剂处理含有DON的饲料(DON＝50ppm)按0.1％比例混合，在体外模拟动物胃肠液中消化24h，用于降解饲料中的DON。

模拟胃液：准确称取2g含有DON的饲料，再添加2mg降解剂，放入100mL锥形瓶中，加入25mL PBS(0.1MpH6.0),调pH到6.8，混匀。加入1mL配制好的淀粉酶溶液，39℃，150r/min消化2h。加10mL0.2M HCl，用1M HCl或1M NaOH溶液调pH至2.0，加1mL新鲜配制的酸性蛋白酶(50000U/g)，混匀，用parafilm封口，于39℃恒温摇床培养6h(150r/min)。

模拟小肠液：模拟胃液孵育6h以后，再加入5mL 0.6MNaOH溶液，用1M HCl或1MNaOH将pH调到6.8后加入新鲜配制的肠道外源酶混悬液(蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶＝3:1:1)，用parafilm封口，于39℃恒温摇床分别培养18h(150r/min)。

反应结束后测定DON的降解率为80.46％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 呕吐毒素降解酶DDH及其在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用

<130> MP2006051Z

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> PRT

<213> DDH

<400> 1

Met Arg Gln Leu Ser Ser Lys Leu Leu Lys Met Val Leu Ala Gly Thr

1 5 10 15

Thr Ala Phe Gly Leu Leu Ala Val Pro Ala Phe Ala Gln Thr Ala Ile

20 25 30

Ser Asp Leu Ala Pro Val Thr Asp Glu Met Leu Ala Asn Pro Asp Asp

35 40 45

Gly Asp Trp Leu Ala Tyr Gly Arg Ala Val Asp Asn Tyr Arg Phe Ser

50 55 60

Pro Leu Asp Gln Ile Asn Thr Asp Asn Val Asp Gln Leu Gln Met Val

65 70 75 80

Trp Ala Arg Gly Leu Glu Thr Gly Pro Met Gln Thr Ser Pro Ile Val

85 90 95

Tyr Asp Gly Val Met Phe Ile Ala Asn Pro Gly Asp Thr Ile Gln Ala

100 105 110

Leu Asp Ala Val Thr Gly Asp Leu Ile Trp Gln Tyr Arg Arg Arg Leu

115 120 125

Pro Asp Thr Asn Thr Leu His Ser Leu Gly Asp Arg Lys Arg Gly Ile

130 135 140

Ser Ile Tyr Gly Asp His Leu Tyr Phe Met Ser Trp Asp Asn Phe Leu

145 150 155 160

Val Ala Leu Asp Met Lys Thr Gly Gln Leu Ala Trp Glu Val Asp Arg

165 170 175

Gly Gln Gly Thr Asp Leu Val Ser Asn Thr Ser Gly Pro Ile Val Ala

180 185 190

Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln Tyr Ser Ala Phe Gly

195 200 205

Cys Phe Ile Ser Gly His Asp Ala Glu Thr Gly Glu Glu Leu Trp Arg

210 215 220

Asn Thr Phe Ile Pro Gln Pro Gly Glu Glu Gly Asp Glu Thr Trp Gly

225 230 235 240

Asn Asp Tyr Glu Ser Arg Trp Met Thr Gly Val Trp Gly Gln Ile Thr

245 250 255

Tyr Asp Pro Glu Leu Asp Leu Val Phe Tyr Gly Ser Ser Ala Val Gly

260 265 270

Pro Ala Ser Glu Val Gln Arg Gly Thr Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly

275 280 285

Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Asp Pro Gln Thr Gly Glu Ile Ala Trp

290 295 300

Arg His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe

305 310 315 320

Glu Met Ile Val Ala Asp Thr Asp Val Asn Pro Ser Asp Ser Met Asp

325 330 335

Gly Leu Arg Ala Ile Gly Ala Ser Ala Ser Gly Glu Gly Arg Arg Val

340 345 350

Leu Thr Gly Val Pro Cys Lys Thr Gly Thr Met Trp Gln Phe Asp Ala

355 360 365

Glu Thr Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr Ala Tyr Thr Asn Met

370 375 380

Ile Glu Ser Ile Asp Glu Thr Gly Leu Val Thr Val Asn Glu Asp Val

385 390 395 400

Ile Leu Asp Glu Ile Gly Val Pro Val Glu His Cys Pro Ala Tyr Leu

405 410 415

Gly Gly Arg Asp Trp Pro Pro Ser Ala Phe Asn Pro Asn Thr Gly Ile

420 425 430

Tyr Tyr Ile Pro Leu Asn Asn Thr Cys Gln Ile Ser Thr Pro Arg Asp

435 440 445

Asn Glu Pro Thr Ala Leu Asp Val Tyr Asn Thr Asp Ser Ser Tyr Thr

450 455 460

Leu Pro Pro Glu Glu Thr Asn Val Gly Arg Ile Asp Ala Ile Asp Ile

465 470 475 480

Ser Thr Gly Glu Thr Val Trp Ser Trp Glu Gln Pro Ala Ala Gln Tyr

485 490 495

Ser Pro Val Met Thr Thr Ala Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly Gly Gly

500 505 510

Asp Arg Tyr Leu Lys Ala Phe Asn Ala Glu Thr Gly Asp Met Leu Trp

515 520 525

Arg Ser Arg Leu Ala Ser Asp Ala Ser Gly His Ala Ile Thr Tyr Glu

530 535 540

Val Asp Gly Arg Gln Tyr Val Ala Ile Pro Ala Gly Pro Ala Gly Phe

545 550 555 560

Ser Ser Ala Leu Met Ile Ala Glu Gly Asn Val Asp Gln Gly Gly Ser

565 570 575

Asn Ser Ala Val Tyr Val Phe Ala Leu Pro Glu Glu

580 585

<210> 2

<211> 1767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaggcaat tgtcttccaa actgttgaaa atggtccttg cggggaccac cgctttcggg 60

ctgctcgccg taccggcgtt cgcccagacc gcgatcagcg atctggcgcc ggtgaccgac 120

gaaatgcttg cgaatcccga tgacggcgac tggctcgcct atggtcgcgc tgtcgacaac 180

tatcggttca gcccgctcga ccagatcaat accgacaatg tcgatcagct tcagatggtc 240

tgggcccgcg gcctggaaac cggcccgatg cagacctcgc cgatcgttta cgatggcgtc 300

atgttcatcg ccaaccccgg cgacaccatc caggctctgg acgctgtaac cggcgatctg 360

atctggcagt accgccgccg cctgcccgat accaacaccc tgcattcgct cggtgaccgc 420

aagcgtggca tctcgatcta tggcgaccac ctctacttca tgagctggga caacttcctt 480

gtcgccctcg acatgaagac cggccagttg gcctgggaag tcgaccgtgg ccagggcacc 540

gaccttgtgt ccaacacctc cggcccgatc gtggcaaatg gcgtgatcgt cgccggctcg 600

acctgccagt attctgcctt cgggtgcttc atctccggcc atgacgccga aaccggtgaa 660

gaactctggc gcaacacctt catcccacag ccgggtgaag agggtgacga aacctggggc 720

aatgactacg aatcgcgctg gatgaccggc gtttggggcc agatcaccta tgatcccgaa 780

ctcgacctcg tcttctacgg ctcgagcgct gtgggcccgg cttccgaagt ccagcgtggc 840

actccgggcg gaacgctcta cggcaccaac acccgctttg cggtcgaccc gcagaccggc 900

gagatcgcct ggcgtcacca gaccctgccc cgcgataact gggaccagga atgcacgttc 960

gaaatgatcg tcgccgatac cgacgtgaac ccgagcgatt ccatggatgg cctgcgcgcc 1020

atcggtgcga gcgcttcggg cgaaggccgc cgcgtgctga ccggcgtgcc gtgcaagacc 1080

ggtacgatgt ggcagttcga tgccgagacc ggtgaattcc tctgggctcg tgacaccgcc 1140

tataccaaca tgatcgaaag catcgacgaa accggtctcg tgaccgtcaa cgaagatgtc 1200

atcctcgatg agattggcgt tccggtggag cactgcccgg cctatctcgg tggccgcgat 1260

tggccgccct ccgcgttcaa tccgaacacg ggcatctact acatcccgct caacaacacg 1320

tgccagattt ccacgccacg tgacaacgag ccgacagccc ttgacgtgta caacaccgat 1380

tcctcgtaca cgctgccgcc cgaagagacc aatgttggcc gtatcgacgc catcgacatc 1440

tcgaccggcg aaaccgtctg gagctgggaa cagcccgctg cacagtactc gccggtcatg 1500

acgactgccg gcaatctgct gttcaccggt ggcggcgatc gctatctcaa ggctttcaac 1560

gccgaaaccg gcgatatgct gtggcgctcg cgcctcgcat cggatgcttc gggccatgcg 1620

atcacctatg aggtcgatgg ccgtcagtac gtcgcgatcc cggcaggtcc tgccggcttc 1680

tcgtcggctc tgatgatcgc cgaaggcaat gtcgaccagg gtggcagcaa ttccgcagtc 1740

tatgtcttcg ctctgcctga agagtaa 1767

<210> 3

<211> 1767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgccagc tgagtagcaa gctgctgaaa atggtgctcg cgggtaccac cgcgtttggt 60

ctgctcgcgg ttccagcctt tgcccagacc gcgatcagtg atctggcgcc agttacggat 120

gaaatgctcg ccaatccgga tgatggcgat tggctcgcct atggtcgcgc cgtggacaat 180

taccgcttta gtccgctgga ccagatcaac accgacaacg ttgaccagct gcaaatggtg 240

tgggcccgtg gtctggaaac cggtccgatg caaaccagcc caatcgtgta cgacggcgtt 300

atgttcatcg ccaacccggg cgatacgatc caagcgctgg atgcggtgac cggcgatctg 360

atttggcagt atcgtcgccg tctgccggat accaacacgc tgcatagtct gggcgaccgc 420

aaacgcggta tcagcatcta cggcgaccat ctgtacttta tgagctggga caattttctg 480

gtggcgctgg atatgaaaac cggtcagctg gcgtgggaag ttgatcgtgg ccaaggcacc 540

gatctggtga gcaatacgag cggtccgatt gtggccaacg gcgtgattgt tgcgggcagt 600

acgtgccagt acagtgcgtt tggctgcttc atcagtggtc acgacgcgga aacgggtgag 660

gaactgtggc gcaatacgtt catcccgcag ccgggcgaag aaggcgatga aacgtggggc 720

aacgactatg aaagccgctg gatgacgggt gtttggggcc agatcaccta tgacccggag 780

ctggatctgg tgttttacgg tagcagtgcc gtgggtccag ccagcgaagt gcaacgtggt 840

accccgggcg gtacgctgta cggtaccaac acccgcttcg cggtggatcc gcaaaccggc 900

gaaatcgcgt ggcgccatca gacgctgcca cgtgataact gggaccaaga atgcacgttc 960

gagatgattg tggccgacac cgatgtgaac ccgagcgata gcatggacgg tctccgcgcg 1020

attggtgcca gtgcgagcgg tgaaggtcgt cgtgtgctga ccggcgtgcc atgcaaaacc 1080

ggtacgatgt ggcagttcga tgcggagacc ggcgaatttc tgtgggcccg cgatacggcc 1140

tacacgaaca tgatcgaaag catcgacgaa accggtctgg ttacggttaa cgaggatgtg 1200

attctggacg agatcggtgt gccagttgaa cattgtccgg cgtatctggg tggccgtgat 1260

tggccaccga gcgcctttaa cccgaatacc ggcatctact acatcccgct gaacaacacg 1320

tgccagatca gcaccccacg cgacaacgaa ccaacggcgc tggatgtgta caacaccgac 1380

agcagctata ccctcccacc ggaggaaacc aacgtgggcc gcattgatgc gatcgatatc 1440

agcaccggcg aaaccgtgtg gagttgggaa caaccggccg cccagtatag cccggttatg 1500

acgaccgcgg gcaatctgct gtttaccggc ggcggtgacc gctatctgaa agcgtttaat 1560

gccgagaccg gcgatatgct gtggcgcagc cgtctggcga gtgatgccag tggccatgcg 1620

attacctacg aagttgacgg tcgccagtat gttgccattc cagccggtcc agccggtttc 1680

agcagcgcgc tgatgatcgc cgaaggcaat gttgaccaag gcggcagcaa cagtgcggtt 1740

tacgtttttg cgctgccaga agagtaa 1767

Claims

1.具有脱毒功能的呕吐毒素降解酶DDH，其特征在于，具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或两个氨基酸残基获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列具有至少90％序列一致性，优选95％序列一致性，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述呕吐毒素降解酶DDH的核苷酸，其特征在于，具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2或3所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No.2或3所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列，优选95％序列一致性的核苷酸序列。

3.一种包含如权利要求2所述的核苷酸的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求2所述的核苷酸的重组菌株或细胞。

5.制备如权利要求1所述的呕吐毒素降解酶DDH的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、用如权利要求3所述的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

步骤2、培养所述重组菌株，诱导呕吐毒素降解酶DDH表达；

步骤3、纯化所述呕吐毒素降解酶DDH。

6.一种单端孢霉烯族毒素生物降解剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的呕吐毒素降解酶DDH，以及生理上可接受的配伍载体。

7.根据权利要求6所述的单端孢霉烯族毒素生物降解剂，其特征在于，所述生理上可接受的配伍载体包括但不限于复合微生态制剂、芽孢杆菌菌剂、乳酸菌菌剂、酵母细胞壁、小麦、麦麸、稻米、米糠、蔗糖、淀粉、麦芽糖糊精、环糊精、滑石粉、蒙脱石或寡糖中的一种或多种。

8.一种降解单端孢霉烯族毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的呕吐毒素降解酶DDH或如权利要求6所述的单端孢霉烯族毒素生物降解剂处理含有单端孢霉烯族毒素的材料。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述材料包括但不限于谷物、粮食、食品、饲料、粮食加工副产物、粮油、陈化粮、茶叶、水果、果汁或中草药中的一种或多种。

10.如权利要求1所述的呕吐毒素降解酶DDH或权利要求6～9任一项所述的单端孢霉烯族毒素生物降解剂在单端孢霉烯族毒素脱毒中的应用。