CN106978410B

CN106978410B - 一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN106978410B
Application number: CN201710207690.1A
Authority: CN
Inventors: 胡登兵; 缪长征; 金鹏
Original assignee: Pu Rui Biological Technology Co Ltd (ming Guang)
Current assignee: Xinyoulan Health Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: CN106978410A

Abstract

本发明公开了一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用，所述双功能葡聚糖酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明的新型耐高温双功能葡聚糖酶的耐热性能良好，最适作用温度55℃，在pH 2.0‑6.5的条件下水解壳聚糖底物时的酶活稳定，能够高效水解100g/L的高浓度壳聚糖底物，8小时内彻底水解底物，产物为分子量在1500Da以下的低分子量壳寡糖，而且没有单糖副产物产生。酶活力能够达到1000U/ml，大大高于目前壳聚糖水解酶的普遍生产水平(10‑100U/ml)。

Description

一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶及其应用。

(二)背景技术

葡聚糖酶(Glucanase，E.C 3.2.1.73)可水解β-糖苷键而形成葡萄糖聚合物等小分子物质，属于纤维素酶类的一种。β-葡聚糖酶广泛应用于啤酒酿造、饲料等行业。

壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖。壳聚糖是自然界唯一带正电荷的碱性聚糖，广泛用于医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域。壳聚糖被作为增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准GB-2760。

壳寡糖是壳聚糖经过酶法或者化学裂解后得到的一种聚合度在2-20之间的寡糖产品，分子量≤3000Da，它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用。壳寡糖具有抗氧化，抗肿瘤，降血脂，降血压，抗菌抗炎等多种生物学活性，是一种极具开发潜力的食品，药品原料，也是一种绿色饲料添加剂，可部分替代抗生素，2014年被国家卫计委列为新食品原料。

壳聚糖水解酶类主要来源于微生物，主要包括细菌(芽孢杆菌、黄杆菌)、真菌(曲霉、毛霉、木霉等)。其中某些具有壳聚糖水解活性的酶本身是葡聚糖酶，属于非专一性酶，不仅能够内切水解葡聚糖，而且能够有效水解壳聚糖生成壳寡糖。而常见的专一性壳聚糖酶往往只能水解壳聚糖。普通的壳聚糖酶没有被列入可用于食品和药品的酶制剂种类，而葡聚糖酶是可用于食品和饲料添加的安全酶制剂。具有壳聚糖酶活性的葡聚糖水解酶用于壳寡糖的生产，安全性更有保障，更符合国家的食品安全法规。

壳聚糖酶解过程中需较长时间的高温反应(50-60℃，8小时)，因为高温可以促进底物的离子化，加速反应的进行；同时高浓度的壳聚糖底物具有较高的粘度，不利于实际生产操作，而高温能够有效降低底物粘度，加快反应速度，提升产物壳寡糖的纯度。常见壳聚糖酶耐热性能普遍较差(温度稳定范围35-45℃)，酶活力低(10-50U/ml)不能满足生产的需求。因此只有兼具耐高温性能好和高活性壳聚糖水解能力的酶，才能广泛地用于水解壳聚糖生产壳寡糖的生产中。

(三)发明内容

本发明提供了一种具有壳聚糖水解活性的新型耐高温双功能葡聚糖酶(即PRG酶)，该酶同时具有葡聚糖和壳聚糖水解活性，解决了现有壳聚糖生产中缺乏专一性、安全、耐高温且能够高效降解壳聚糖的水解酶的问题。PRG酶水解壳聚糖能力略高于葡聚糖底物的能力；PRG酶耐热性能良好，最适反应温度55℃，在70℃水浴环境中处理120min，残余酶活力还能够达到71％。PRG酶能够水解10％浓度的壳聚糖底物生产低分子量壳寡糖，平均分子量为1200。PRG酶在枯草芽孢杆菌表达系统中高效整合分泌表达，酶活力单位达到1000U/ml，具有重要的工业应用价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶，所述双功能葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，酶蛋白由306个氨基酸组成，其理论分子量：33009.1Da。

本发明还提供一种所述双功能葡聚糖酶的编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明涉及一种由所述双功能葡聚糖酶编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

本发明所述双功能葡聚糖酶基因(即PRG)的重组载体优选为pAX01-PRG。将本发明的新型双功能葡聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其受到强启动子木糖启动子调控，优选插入到质粒pAX01上的BamH I和SacII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于木糖启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒pAX01-PRG。工程菌优选含双功能葡聚糖酶基因PRG的重组枯草芽孢杆菌BS168。

此外，本发明还提供一种所述双功能葡聚糖酶在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用，具体所述的应用以含双功能葡聚糖酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的纯酶为催化剂，以壳聚糖为底物，以pH5.0、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，55℃反应8小时，反应液经过陶瓷微滤膜(0.1微米孔径)过滤，然后滤液冷冻干燥，获得分子量小于1500Da的低分子量壳寡糖，产物收率高达105％(该反应是水合反应，每一个化学键断裂，都会有一个水分子加入到了产物中，因此最终产率高于100％)。

进一步，所述反应体系中，底物终浓度为100g/L，所述催化剂用量为5U/ml。

进一步，本发明所述催化剂按如下方法制备：(1)将含双功能葡聚糖酶编码基因的重组工程菌(枯草芽孢杆菌BS168)单菌落接种至LB液体培养基，37℃、200rpm转速摇床培养过夜(10小时)，获得种子液；

(2)将种子液以十分之一体积的接种量接种至装有5升发酵培养基的发酵罐中，37℃，搅拌桨转速200rpm，通气量20升/分钟，培养12小时至OD600＝2，加入终浓度2mg/ml的D-木糖作为诱导剂，相同条件下(37℃，搅拌桨转速200rpm，通气量20升/分钟)培养诱导48小时，高速离心机10000rpm离心发酵液，弃菌体，收集上清液，通过微孔滤膜(孔径0.22微米)和陶瓷膜(孔径0.1微米)先后过滤处理后，获得澄清粗酶液；所述发酵培养基质量组成：5％玉米淀粉，1％工业蛋白胨，0.5％玉米浆干粉，1％(NH₄)₂SO₄，0.2％MgSO₄，0.5％NaCl，溶剂为去离子水，pH值7.0；

(3)采用DEAE sepharose阴离子交换树脂对粗酶液进行纯化，以pH6、20mM Tris-HCl缓冲液为平衡液，目的蛋白的洗脱液为含100mM NaCl的pH6、20mM Tris-HCl缓冲液，洗脱后收集含有目的蛋白的洗脱液，即为催化剂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的新型耐高温双功能葡聚糖酶的耐热性能良好，最适作用温度55℃，耐高温性能超过已有的商品化壳聚糖降解酶。PRG酶是一种优良的酸性壳聚糖水解酶，在pH 2.0-6.5的条件下水解壳聚糖底物时的酶活稳定，最佳催化pH值为5.0，恰好能够满足配置高浓度壳聚糖底物所需的酸性环境要求(pH5.0左右)。PRG酶能够高效水解100g/L的高浓度壳聚糖底物，8小时内彻底水解底物，产物为分子量在1500Da以下的低分子量壳寡糖，而且没有单糖副产物产生。本发明的新型耐高温重组双功能葡聚糖酶通过枯草芽孢杆菌表达系统高效分泌表达后能够达到较高的发酵水平，酶活力能够达到1000U/ml，大大高于目前壳聚糖水解酶的普遍生产水平(10-100U/ml)。本发明首次使用枯草芽孢杆菌表达系统发酵生产壳聚糖酶，发酵原料价格低廉，生产周期较短(3天左右)，上清液直接收集粗酶液，可直接用于实际生产，整体工艺路线简单。本发明的新型耐高温重组双功能葡聚糖在壳寡糖工业生产中使用可大大降低生产成本，显示出更大的应用潜力。

(四)附图说明

图1枯草芽孢杆菌重组载体图谱。

图2枯草芽孢杆菌表达双功能葡聚糖酶的纯化蛋白电泳图，泳道M为中分子量蛋白marker，1为不带重组质粒BS168菌株发酵液上清，2为带有重组质粒的BS168菌株发酵液上清，3为经过超滤和陶瓷膜过滤后的BS168发酵液上清粗酶液，4为阴离子交换树脂纯化后的酶液，5为纯化后酶蛋白。

图3双功能葡聚糖酶的最适反应温度柱形图。

图4双功能葡聚糖酶的最适反应pH值柱形图。

图5双功能葡聚糖酶的温度耐受性能曲线图。

图6双功能葡聚糖酶的pH耐受性能柱形图。

图7双功能葡聚糖酶水解壳聚糖的产物HPLC图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

大肠杆菌菌株(Escherichia coli)JM109、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS168、载体pAX01购自德国MoBiTec公司。

质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自美国Thermol公司。

LB液体培养基质量组成：0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％NaCl，溶剂为去离子水，pH7.0。

LB固体培养基质量组成：0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％NaCl，琼脂2％，溶剂为去离子水，pH7.0。

发酵培养基质量组成：5％玉米淀粉，1％工业蛋白胨，0.5％玉米浆干粉，1％硫酸铵，0.2％MgSO₄，0.5％NaCl，溶剂为去离子水，pH7.0。

实施例1、PRG酶基因的克隆

运用DNA提取试剂盒，提取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCCM 2016558基因组DNA，以DNA为模板，设计双功能酶引物(PRG5EcoRI，PRG3NotI)进行PCR扩增，将PCR产物由BamHI和SacII进行双酶切，然后与经过同样酶切的表达载体pAX01相连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经15μg/ml的红霉素抗生素筛选后，菌落PCR获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，所获得重组载体含有PRG酶基因完整的开放阅读框，此载体被命名为pAX01-PRG，载体图谱见图1。该PRG酶基因，全长918bp，编码306个氨基酸，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

扩增所用引物如下：

PRG5-EcoRI：5’GAATTCATGGTCAAGAAGAAAAAG 3’

PRG3-BamHI：5’GGATCCGTAAGTCCACCAATTACCAC3’

实施例2、包含PRG酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌的构建

将实施例1中获得的重组表达载体pAX01-PRG采用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化枯草芽孢杆菌BS168，电转化后涂布于LB(neo+)平板上进行筛选，得到枯草芽孢杆菌重组菌株，记为重组菌株pAX01-PRG-168。枯草芽孢杆菌电转化方法如下：

一、感受态细胞的制备

(1)从新鲜培养的平板上接种一个枯草芽孢杆菌BS168单菌落至3ml LB液体培养基中，250rpm，37℃培养过夜(16h)。

(2)接种1.5ml过夜培养的种子至150ml(装于500ml的三角瓶中)新鲜的LB培养基中，200rpm，37℃培养，至菌数达到约1×10⁸cells/ml。

(3)将菌液转移至50ml的离心管中，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，离心收集菌体。

(4)弃上清，用30ml冰冷的10％甘油重新垂悬菌体(轻轻吹打)，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，离心收集菌体。

(5)弃上清，用15ml冰冷的10％的甘油垂悬菌体重悬菌体，冰浴15min，然后4℃，4,500rpm，15min，离心收集菌体。

(6)用2ml预冷的10％的甘油之中重悬菌体，细胞浓度1×10¹⁰cells/ml。

(7)将感受态细胞分装于1.5ml的离心管中，每份50μl，超低温速冻之后，于-70℃保藏。

二、电转化

(1)冰上融化感受态细胞，然后加入载体3μl到感受态细胞中。

(2)冰浴5min，加入到预冷的电击杯中，冰浴2min。

(3)设置仪器参数。电压1500V，电击时间2.5ms。

(4)将菌体转移到0.2cm狭缝的电转化杯中，轻弹几下杯子让样品沉到底部。装好杯子。电击一次。

(5)电击完毕取出杯子并立即加入500μl SMMP溶液，洗脱感受态细胞，加入到1.5ml离心管中，37℃，250rpm，复苏1h。

(6)涂布相应的LB抗性平板(neo+)，37℃培养36-48h。

(7)SMMP溶液：55ml 2×SMM，40ml 4×PAB，5ml 10％(w/v)BSA，调pH值到7.0，过滤除菌。

2×SMM：25ml 0.2M的马来酸(顺丁烯二酸)钠盐，40ml 0.1N NaOH，调pH值到6.5，加入5ml 1M MgCl₂，42.7g蔗糖，溶解定容至125ml，过滤除菌。

4×PAB：牛肉膏6g，酵母膏6g，蛋白胨20g，葡萄糖4g，NaCl 14g，K₂HPO₄ 14.72g，KH₂PO₄ 5.28g。

实施例3、PRG酶重组菌株的高效表达和纯化

将实施例2重组菌株pAX01-PRG-168接种LB液体培养基，37℃、200rpm转速摇床，过夜培养，即为种子液。

将种子液按照体积百分比10％的接种量接种至装有5升发酵培养基的10升发酵罐中，37℃，200rpm搅拌转速，通气量20升/分钟，培养12小时至OD600＝2，加入终浓度为2mg/ml的D-木糖作为诱导剂，37℃，200rpm转速，通气量20升/分钟，诱导48小时。10000rpm离心，取上清液，通过微孔滤膜(孔径0.22微米)和陶瓷膜(孔径0.1微米)先后过滤后，获得澄清粗酶液。

采用DEAE sepharose阴离子交换树脂对粗酶液进行纯化，平衡液为pH6.0的20mMTris-HCl缓冲液，目的蛋白的洗脱液为含100mM NaCl的pH6.0、20mM Tris-HCl缓冲液，收集目的蛋白，即为PRG酶纯酶溶液，总体积约为5.5ml，其酶活单位约为10000U/ml。

纯化后的目的蛋白采用SDS-PAGE电泳进行纯度和分子量分析，电泳结果见图2。SDS-PAGE电泳方法按照分子克隆中参考方法进行。

实施例4、PRG酶的壳聚糖酶活力测定

采用DNS法进行总活力检测。

1个酶活单位(U)定义为：在规定条件(pH 5.0，55℃，质量浓度1％胶体壳聚糖底物)下，每分钟释放出具有相当于1μmol葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量(μmol/min)，得出实施例3制备的PRG酶纯酶水解壳聚糖底物的总活力约为10000U/ml。

实施例5、PRG酶的葡聚糖酶活力测定

采用DNS法进行总活力检测。

1个酶活单位(U)定义为：在规定条件(pH 5.0，55℃，质量浓度1％beta-1,3葡聚糖底物)下，每分钟释放出具有相当于1μmol葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量(μmol/min)，得出实施例3制备的PRG酶纯酶水解葡聚糖底物的总活力约为8500U/ml。

实施例6、PRG酶水解壳聚糖底物的性质测定

1、比活力测定

将实施例3制备的PRG酶纯酶，采用Bradford试剂盒(上海生工公司)测定蛋白浓度，得出该PRG酶纯酶蛋白浓度约为2.1mg/ml，酶蛋白的活力单位数为10000U/ml，经过计算，可得出实施例3制备的PRG酶纯酶的比活力为4761U/mg。

2、最适反应温度及pH测定

最适反应温度：将实施例3制备的PRG酶纯酶用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)稀释为1000U/ml的酶液。取25微升酶液，分别加入5ml、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)，终浓度100g/L胶体壳聚糖底物，酶终浓度达到5U/ml。上述体系分别在不同温度(25、30、35、4、45、50、55、60、65、70、75℃)条件下反应20分钟，通过DNS法测定体系中的还原糖的含量，从而计算PRG酶的酶活。以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图3。

最适反应pH：将实施例3制备的PRG酶纯酶酶液用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)稀释为1000U/ml的酶液。取25微升酶液，分别加入5ml不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)100mM醋酸-醋酸钠缓冲液，终浓度100g/L的胶体壳聚糖底物，酶终浓度达到5U/ml。上述体系分别在50℃水浴条件下反应20分钟，通过DNS法测定体系中的还原糖的含量，分别计算酶活力。pH 3.0、3.5、4.0、4.5的条件采用100mM醋酸醋酸钠缓冲液，pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的条件采用50mM Tris-HCl缓冲液。采用最高酶活为100％，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。最适反应pH曲线见图4。

结果表明：PRG酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为5.0。

3、耐热性能测定

不同温度耐热性能：将实施例3制备的PRG酶纯酶用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)稀释到1000U/ml的酶液。分别取酶液25微升，加入到5ml、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)，终浓度100g/L胶体壳聚糖底物，酶浓度达到5U/ml。上述体系分别在不同温度下(30、40、50、60、70℃)的水浴保温10-120分钟后，采用实施例3中的酶活测定方法，测定残余酶活力。以未经处理的样品含有的酶活力为对照计算其他样品中的相对酶活，结果见图5。

结果显示PRG酶的耐热性能良好，在pH5.0，30-60℃环境中处理120min，酶活力基本没有损失；在70℃环境中处理120min，残余酶活力还能够达到71％，完全可达到水解壳聚糖制备壳寡糖的生产要求。

4、pH稳定性测定

将实施例3制备的PRG酶纯酶用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)稀释到1000U/ml的酶液。分别取酶液25微升，加入到5ml不同pH值(2、3、4、5、6、7、8)的缓冲液，终浓度浓度100g/L胶体壳聚糖底物，酶终浓度达到5U/ml，分别30℃放置8h，以未处理的酶液为对照，测定PRG酶的相对酶活。pH2和3缓冲液采用50mM的甘氨酸-盐酸缓冲液，pH4和5缓冲液采用100mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH4和5缓冲液采用200mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,pH6、7、8缓冲液采用50mM的Tris-HCl缓冲液。结果如图6所示。

PRG酶的最适催化pH为5.0，并且在pH 3-7范围内较为稳定，30℃保存8小时，残余相对酶活均可达到80％以上，完全可以满足壳聚糖水解所需的pH5.0的水解条件。

5、金属离子和EDTA对酶活力的影响

将实施例3制备的PRG酶纯酶用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)稀释到1000U/ml，在5ml、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)中加入终浓度100g/L胶体壳聚糖，加入酶5U/ml，再分别加入终浓度为5mM的Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺和EDTA。以不加任何金属离子的体系酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。结果如表1所示。

表1金属离子和EDTA对PRG酶活力的影响

结果表明，Mn²⁺和Co²⁺对酶催化有较强的增强作用，相对酶活力分别提高至230％和170％，Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺对酶催化有一定的激活作用，酶活性分别促进45％、43％、和11％；EDTA、Zn²⁺对酶催化没有影响；其余金属离子Ag⁺、Fe²⁺对酶催化均有不同程度的抑制作用；而SDS和Fe³⁺、Cu²⁺完全抑制了酶的催化活性。

实施例7、PRG粗酶水解高浓度壳聚糖底物的实验

水解反应体系：取实施例3制备的粗酶液500微升(约500U)加入到100ml、pH5.0、100mM醋酸醋酸钠缓冲液中，再加入终浓度100g/L的胶体壳聚糖底物，酶浓度为5U/ml，总反应体系100ml，55℃水浴反应8小时。反应结束后，反应体系10000rpm转速离心20min，取上清液，陶瓷膜过滤(0.1微米孔径)，流出液准备HPLC检测。

HPLC所需设备：HPLC仪：Waters公司产品，型号2414，层析柱：糖氨基柱(AmindBEH,Waters)，流动相：乙腈/水(体积比2:3)，柱温40℃，上样量10微升，检测设备：Waters示差折光显示器。结果见图7。

由图7的结果，可以看出PRG粗酶水解壳聚糖的产物主要是具有较高生物活性的2-6聚合度的壳寡糖，没有单糖，没有水解完全的壳聚糖底物也很少。说明PRG粗酶催化壳聚糖水解是采用内切模式进行，水解较为彻底。壳二糖的抗炎生物活性最高。壳六糖具有很好的肿瘤细胞抑制活性。

现有的壳聚糖专一性降解酶的报道中，很多来源于海洋细菌的酶类，最适催化温度一般在30-45℃，很难满足壳聚糖水解生产壳寡糖的50-60℃催化条件的要求。报道的非专一酶，例如木瓜蛋白酶，绿色木霉纤维素酶等，虽然能够降解壳聚糖，但是活力很低，酶活力一般在10-100U/ml的水平。同时这些非专一性酶很多具有外切酶活性，产物中含有很大比例的单糖(N-乙酰葡萄糖胺)，众所周知，单糖是基本没有生物活性的，可以归为生产的副产物。PRG酶水解壳聚糖的产物主要是2-6聚合度的寡糖，不产生单糖。

PRG酶是一种性能优异的耐高温高活性葡聚糖酶，具有很强的壳聚糖水解能力。枯草芽孢杆菌重组分泌表达的PRG酶，表达量很高，发酵液上清中酶活力单位能够达到1000U/ml。发酵液上清直接作为粗酶液水解100g/L浓度的壳聚糖底物生产壳寡糖，在8小时内能够完成整个水解反应，主要产物是具有较高生物活性的2-6聚合度的壳寡糖，没有单糖副产物产生。本发明提供了一种高效降解壳聚糖的双功能葡聚糖酶，还证实作为食品安全微生物的枯草芽孢杆菌是表达壳聚糖水解酶类的适宜的宿主菌。本发明发现的PRG酶将会在工业壳寡糖生产中展现出有巨大的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 菩蕊生物科技（明光）有限公司

<120> 一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Met Val Lys Lys Lys Lys Asn Gly Arg Ser Arg Gly Lys Ala Val Met

1 5 10 15

Ser Cys Ala Ala Ser Ala Ala Ser Asn Lys His Thr Thr Tyr Thr Ser

20 25 30

Gly Thr Lys Asn Asn Val Ser Ser Ala Met Asp Ser Ala Val Ser Lys

35 40 45

Trp Asn Ser Trp Asp Ser Trp Lys Ala Ala Tyr Lys Ala Gly Thr Gly

50 55 60

Lys Tyr Tyr Val Lys Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Val Ser Ala His Gly

65 70 75 80

Tyr Gly Met Ala Thr Val Met Ala Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Asp Gly Tyr Lys Tyr Tyr Ala His Ser Asp Asn Asn Ala Tyr Met Ala

100 105 110

Trp Lys Asn Ser Ser Asn Val Gly Ala Asp Ser Ala Thr Asp Gly Asp

115 120 125

Met Asp Ala Tyr Ser Ala Asp Arg Trp Gly Ser Ala Gly Thr Asn Tyr

130 135 140

Ala Ala Lys Asn Asn Ala Met Gly Thr Asn Tyr Ala Ala Lys Asn Asn

145 150 155 160

Ala Met Asn Asp Val Asn Ser Lys Trp Thr Arg Gly Asp Trp Ala Thr

165 170 175

Asp Gly Ala Asp Thr Ala Thr Arg Ser Asp Met Asn His Lys Ala Ala

180 185 190

Thr Gly Asp Thr Lys Trp Asn Asn Val Asp Lys Thr Tyr Thr Asn Ser

195 200 205

Tyr Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Val Val Asn Gly Ser Thr

210 215 220

Tyr Lys Ala Ala Asn Asp Val Ser Asp Ser Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ser

225 230 235 240

Cys Arg Trp Arg Thr Thr Asp Tyr Met Thr Gly Asp Asn Arg Ser Val

245 250 255

Val Gly Ser Tyr Asn Ser Gly Ala Tyr Ala Gly Val Ser Ala Met Thr

260 265 270

Ser Ser Ala Asn Ser Trp Asn Ser Trp Ser Lys Thr Ala Gly Ser Ser

275 280 285

Asn Gly Tyr Tyr Asp Ser Lys Ser Met Val Met Ser Gly Asn Trp Trp

290 295 300

Thr Tyr

305

<210> 2

<211> 918

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

atggtcaaga agaaaaagaa cggacgttcc agcgggaaag ctgttatgtc ctgtgcagct 60

tctgccgcct ctaacaaaca taccacttac acatctggca cgaaaaacaa tgttagctcc 120

gctatggata gcgctgtgtc aaaatggaac agttgggact cctggaaagc ggcatacaaa 180

gctggcaccg gcaagtacta cgtgaaatat agcgacggta gcacagtttc cgctcacgga 240

tatggcatgg caaccgttat ggcgggctat gacagcagcg ccacttatga cggctacaag 300

tactatgccc attctgataa taatgcttat atggcttgga aaaattcctc aaatgtcggt 360

gcagattccg caaccgatgg agacatggac gcttatagtg ccgaccggtg ggggtcagcg 420

gggactaact acgcggccaa gaacaacgcg atgggaacta attacgcggc taagaacaat 480

gccatgaacg acgtgaattc caagtggacg cgcggcgact gggctacgga cggtgccgac 540

acagctacta gatccgatat gaaccataaa gcagcgacag gagatacaaa atggaataat 600

gttgataaga cctacacaaa ctcttatacg ggttacagta gcacaacggg ggacgttgtc 660

aacgggagca cctataaagc agcgaacgac gtttcagatt cctattacgg ttataattct 720

tgtagatggc ggaccacaga ctacatgact ggagacaacc ggtctgtcgt aggcagctac 780

aattctggtg cctatgctgg tgttagtgca atgacctcat ccgccaattc ttggaattca 840

tggtcaaaaa cagcaggttc ttctaatggc tattatgact ccaaatcaat ggtgatgagt 900

ggtaattggt ggacttac 918

Claims

1.一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶，其特征在于所述双功能葡聚糖酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种由权利要求2所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含双功能葡聚糖酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的纯酶为催化剂，以壳聚糖为底物，以pH5.0、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，50℃反应8小时，反应液经陶瓷微滤膜过滤后，滤液冷冻干燥，获得壳寡糖。

7.如权利要求6所述的的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度为100g/L，所述催化剂用量为5U/ml。

8.如权利要求6所述的的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：(1)将带有双功能葡聚糖酶编码基因的工程菌接种至LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，获得种子液；LB液体培养基质量组成：0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％NaCl，溶剂为去离子水，pH值7.0；

(2)将种子液以十分之一体积的接种量接种至发酵培养基中，37℃，200rpm搅拌转速、通气量20升/分钟，培养至600nm吸光度值达到2，加入终浓度2mg/ml的D-木糖作为诱导剂，相同条件下诱导48小时，离心，收集上清液，通过微孔滤膜和陶瓷膜依次过滤后，获得澄清粗酶液；所述发酵培养基质量组成：5％玉米淀粉，1％工业蛋白胨，0.5％玉米浆干粉，1％硫酸铵，0.2％MgSO₄，0.5％NaCl，溶剂为去离子水，pH值7.0；

(3)采用DEAE sepharose阴离子交换树脂对粗酶液进行纯化，以pH6.0、20mM Tris-HCl缓冲液为平衡液，以含有100mM NaCl的pH6.0、20mM Tris-HCl缓冲液为目的蛋白的洗脱液，收集目的蛋白，即为催化剂。