CN117089559B - 一种褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用 - Google Patents
一种褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。本发明提供的核酸能够在毕赤酵母中大量表达，从而能够大量获得褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶不仅具有水解polyG及polyM段的双功能内切活性，还具有一定的转糖基活性，是一种多功能多糖裂解酶。此外，本发明的褐藻胶裂解酶能够快速催化褐藻胶/多聚古罗糖醛酸段生成以不饱和二糖、三糖为主的多种功能活性寡糖产物，具有商业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用，尤其涉及一种优化的褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用。
背景技术
褐藻胶在褐藻中含量丰富，广泛存在于裙带菜、海带、马尾藻等大型藻类的细胞壁和细胞间质中，约占其干重的40%。褐藻胶是褐藻酸（又称海藻酸）及其衍生物的统称，是由L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid, G）和D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid, M）糖单元由β-1，4糖苷键连接形成的线性高分子多糖，按照G和M的排列方式可分为多聚古罗糖醛酸段(poly guluronic acid, polyG)、多聚甘露糖醛酸段(poly mannuronic acid,polyM)、MG 交替或随机排列的杂聚糖段（polyMG）。
褐藻胶降解产生功能性活性寡糖---褐藻寡糖，已有研究表明，酶解法得到的不饱和寡糖较化学、物理等方法得到的饱和寡糖具有更佳的抗氧化、抗菌等功能活性。根据底物专一性不同，褐藻胶裂解酶可分为聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3）、聚古罗糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11）和可裂解两种底物的双功能裂解酶3类。双功能褐藻胶裂解酶较单一裂解酶底物广泛性更佳，在褐藻胶高效降解方面具有广泛应用前景。
虽然与褐藻胶水解有关的双功能裂解酶已有报道，但是能够高效水解褐藻胶生成多种寡糖，同时又能发挥转糖基化作用的褐藻胶裂解酶目前仍缺乏相关报道。
发明内容
申请人在研究中发现，具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的褐藻胶裂解酶具备双功能多糖裂解酶内切酶活，能够水解褐藻胶、polyG及polyM生产多种寡糖，但现有编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的褐藻胶裂解酶的基因表达水平较低，无法大量获得具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的褐藻胶裂解酶。
为了能够大量获得具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的褐藻胶裂解酶，申请人在毕赤酵母中对编码SEQ ID NO：1的基因序列进行了密码子优化，得到了SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；在SEQ ID NO：2的基础上，申请人进一步人工优化，获得了一种可在毕赤酵母中编码快速水解褐藻胶/多聚古罗糖醛酸段生成多种寡糖的多功能褐藻胶裂解酶的全优基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
基于此，本发明提供了一种编码褐藻胶裂解酶的基因，所述基因序列如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示，在优选的实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO：3所示。
根据本发明，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有表1所示标签的编码序列。
表1
另一方面，本发明还提供了包含上述编码基因的重组载体，所述重组载体优选为重组表达载体；例如，可以适用于毕赤酵母的表达载体，如，pPICZαA载体。
本发明中，所述重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、噬菌体、粘粒及反转录病毒等，本发明优选pPICZαA载体；在一个实施方式中，因上述基因含有自身信号肽序列，可以对pPICZαA进行改造，去除其α因子分泌信号肽序列。
另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选地，所述重组菌株为毕赤酵母，如，Pichia pastorisX-33。
本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆菌(如大肠杆菌(Escherichia coli))或酵母菌(如毕赤酵母(Pichia pastoris))，更优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastorisX-33)。
另一方面，本发明还提供了上述基因、载体或菌株在降解褐藻胶中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种降解褐藻胶的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶的编码基因、载体或菌株对褐藻胶进行处理的步骤。
在一个实施方式中，所述处理的温度为20℃-65℃，如，20℃、30℃、35℃、40℃等，优选，35℃；pH为2-11，如，pH为6、7、8、9、10或11等，优选，7。
另一方面，本发明提供了一种降解古罗糖醛酸寡糖的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶的编码基因、载体或菌株对古罗糖醛酸寡糖进行处理的步骤；在一个实施方式中，所述古罗糖醛酸寡糖包括古罗糖醛酸四糖、古罗糖醛酸五糖、古罗糖醛酸六糖或古罗糖醛酸七糖或更高聚合度的古罗糖醛酸寡糖。
另一方面，本发明提供了一种制备较底物聚合度更高的不饱和古罗糖醛酸寡糖的方法，所述方法包括以古罗糖醛酸寡糖为底物，利用上述褐藻胶裂解酶的编码基因、载体或菌株对古罗糖醛酸寡糖进行处理从而制备较底物聚合度更高的不饱和古罗糖醛酸寡糖的步骤。
在一个实施方式中，所述底物为古罗糖醛酸四糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸六糖；在一个实施方式中，所述底物为古罗糖醛酸五糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸六糖；在一个实施方式中，所述底物为古罗糖醛酸六糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸七糖和不饱和古罗糖醛酸八糖；在一个实施方式中，所述底物为古罗糖醛酸七糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸八糖。
本发明提供的优化的SEQ ID NO：2所示的编码褐藻胶裂解酶的基因（Vnalg7）可以在毕赤酵母中表达，高密度发酵粗酶液蛋白浓度可以达到1.43g/L，为目前报道的褐藻胶裂解酶异源表达最高表达量；经进一步人工优化的如SEQ ID NO：3所示的编码褐藻胶裂解酶的基因（Ovnalg7）核酸在毕赤酵母中的表达量更佳，蛋白表达量约为Vnalg7表达蛋白浓度的120.70%，从而能够大量获得褐藻胶裂解酶Ovnalg7。
对褐藻胶裂解酶Vnalg7及Ovnalg7的酶活性进行测试，结果显示，褐藻胶裂解酶Vnalg7的发酵粗酶液酶活性可达3620 U/ml，是目前文献报道中PL7家族褐藻胶裂解酶异源表达的最高粗酶活，而经进一步人工优化基因序列所得褐藻胶裂解酶Ovnalg7的酶活性更佳，为Vnalg7粗酶活性的129.14%。
本发明通过实验验证发现，褐藻胶裂解酶Ovnalg7具有多功能特性，不仅具有高效的内切水解活性---可以水解polyG、也可以水解polyM，并且还具有一定的转糖基活性。Ovnalg7的酶促最适反应pH为7.0（磷酸缓冲体系），最适反应温度为35℃。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为毕赤酵母表达外源蛋白Vnalg7及Ovnalg7的SDS-PAGE结果，其中Marker为蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为 180、140、100、75、60、45、35、25、15、10kDa；第一泳道为外源蛋白Vnalg7，第二泳道为外源蛋白Ovnalg7；
图2为毕赤酵母表达外源蛋白褐藻胶裂解酶Vnalg7及Ovnalg7的酶活比较；
图3为pH对重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7酶活的影响曲线；
图4为温度对重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7酶活的影响曲线；
图5为pH值对重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7稳定性的影响曲线；
图6为温度对重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7稳定性的影响曲线；
图7为重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7对不同底物的酶活测定结果图，以最高酶活测定结果定义为100%，其余底物水解活性表示为相对活性；
图8A-图8H为重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7水解褐藻胶和古罗糖醛酸寡糖产物的LC-MS结果；其中，图8A：LV-Algin水解结果，图8B：古罗糖醛酸单糖（G1）水解结果，图8C：古罗糖醛酸二糖（G2）水解结果，图8D：古罗糖醛酸三糖（G3）水解结果，图8E：古罗糖醛酸四糖（G4）水解结果，图8F：古罗糖醛酸五糖（G5）水解结果，图8G：古罗糖醛酸六糖（G6）水解结果，图8H：古罗糖醛酸七糖（G7）水解结果；其中，图8A-图8H中的竖坐标轴为相对丰度（RelativeAbundance）；
图9A-图9H为LV-Algin及古罗糖醛酸寡糖标准品的LC-MS结果；其中，图9A：LV-Algin，图9B：古罗糖醛酸单糖（G1），图9C：古罗糖醛酸二糖（G2），图9D：古罗糖醛酸三糖（G3），图9E：古罗糖醛酸四糖（G4），图9F：古罗糖醛酸五糖（G5），图9G：古罗糖醛酸六糖（G6），图9H：古罗糖醛酸七糖（G7）；其中，图9A-图9H中的竖坐标轴为相对丰度（RelativeAbundance）。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本实施方式中，基于SEQ ID NO：1所示的褐藻胶裂解酶，通过密码子优化获得了在毕赤酵母中表达的基因序列SEQ ID NO：2（Vnalg7），通过进一步人工优化获得了基因序列SEQ ID NO：3（Ovnalg7）。
SEQ ID NO：1(褐藻胶裂解酶)：
MKSKLVNIVGSAVLLSSFAAHSAEVNLVNPSFEQDFSGWTEVDPTAVSGVAYDGAKSAKFSGNGARLEQSVPVTSNTEYTLSAYVLADANIGVEVGSDTFSKTASNSDWAQTTITFNSGDATEITIFGEYSGAEGRVDLFKLTSSEIIDPPTTSLPVFDLDPALPPSGNFDLLDWKLDLPVDDNGNASGDAQEVKEGELSSGFENSEFFYTGDDGGLVFISPVEGATTSANTKYTRSEMREMLRRGDTSISTTGITKNNWVFASAPSDDQNNSGGVDGVLEATLAVNAVTTTGDSSQVGRVIVGQIHANNDEPIRLYYRLLPGHTKGSLYFAHEPNEDASSDPEQFINLIGSSASNASEPEDGIALNELFFYRIEVQGNQLIVTIKRDDHEDVTETVDMTTSGYDVSGQYMYFKAGVYNQNNSGDPTDYVQATFYYLTNSHDGYEFP
SEQ ID NO：2：
atgaagtccaagttggttaacattgttggttccgccgttttgttgtcctcctttgccgctcactctgccgaagttaacttggttaacccatcctttgaacaagacttttccggttggactgaagttgatcctactgccgtttccggtgttgcttatgatggtgctaagtctgctaaattttctggtaacggtgccagattggaacaatccgttccagttacttctaacactgaatacaccttgtctgcttacgttttggctgatgctaatattggtgttgaagttggttctgatactttttctaagactgcttctaactctgattgggctcaaactactattacctttaactctggagatgctactgaaattactatttttggtgaatactccggtgctgaaggtagagtcgatttgtttaaattgacttcttctgaaatcatcgacccaccaaccacctccttgccagtttttgatttggatccagctttgccaccttctggtaactttgatcttttggattggaagttggatttgccagttgacgataacggtaacgcttctggtgatgctcaagaagttaaggagggtgaattgtcttctggttttgaaaatagtgaatttttctacaccggtgatgatggtggtttggtttttatttctccagttgaaggagctactacttctgctaacactaagtacactagaagtgaaatgagagagatgttgagaagaggtgatacttctattagtactactggaattactaagaacaactgggtttttgctagtgctccatctgatgatcaaaacaactctggtggtgttgatggtgttttggaagctaccttggctgttaacgctgttaccactactggtgattcttctcaagtcggtagagttattgttggtcaaattcatgctaacaacgatgaaccaattagattgtactatagattgttgccaggtcatactaaaggtagtttgtactttgctcatgaacctaacgaagatgccagttccgatccagaacaatttattaacttgattggatcttccgcctctaacgcttccgagcctgaagatggtattgccttgaacgagttgtttttttacagaatcgaagttcaaggtaaccaacttattgttacaattaagagagacgaccatgaagacgttactgaaactgttgatatgacaacttcaggttatgatgtctctggtcagtatatgtactttaaggctggtgtttacaatcaaaacaattcaggtgatccaactgattacgttcaagctactttttactaccttaccaactctcatgatggttacgaatttccataa
SEQ ID NO：3：
atgaagtctaagttggttaacattgttggttctgctgttttgttgtcttcttttgctgctcattctgctgaagttaacttggttaacccatcttttgaacaagatttttctggttggactgaagttgatccaactgctgtttctggtgttgcttacgatggtgctaagtctgctaagttttctggtaacggtgctagattggaacaatctgttccagttacttctaacactgaatacactttgtctgcttacgttttggctgatgctaacattggtgttgaagttggttctgatactttttctaagactgcttctaactctgattgggctcaaactactattacttttaactctggtgatgctactgaaattactatttttggtgaatactctggtgctgaaggtagagttgatttgtttaagttgacttcttctgaaattattgatccaccaactacttctttgccagtttttgatttggatccagctttgccaccatctggtaactttgatttgttggattggaagttggatttgccagttgatgataacggtaacgcttctggtgatgctcaagaagttaaggaaggtgaattgtcttctggttttgaaaactctgaatttttttacactggtgatgatggtggtttggtttttatttctccagttgaaggtgctactacttctgctaacactaagtacactagatctgaaatgagagaaatgttgagaagaggtgatacttctatttctactactggtattactaagaacaactgggtttttgcttctgctccatctgatgatcaaaacaactctggtggtgttgatggtgttttggaagctactttggctgttaacgctgttactactactggtgattcttctcaagttggtagagttattgttggtcaaattcatgctaacaacgatgaaccaattagattgtactacagattgttgccaggtcatactaagggttctttgtactttgctcatgaaccaaacgaagatgcttcttctgatccagaacaatttattaacttgattggttcttctgcttctaacgcttctgaaccagaagatggtattgctttgaacgaattgtttttttacagaattgaagttcaaggtaaccaattgattgttactattaagagagatgatcatgaagatgttactgaaactgttgatatgactacttctggttacgatgtttctggtcaatacatgtactttaaggctggtgtttacaaccaaaacaactctggtgatccaactgattacgttcaagctactttttactacttgactaactctcatgatggttacgaatttccataa
本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以获得模板及引物，利用PCR进行扩增即可获得有关序列。而后，利用重组法便可大批量地获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
此外，还可用公知的人工化学合成方法来合成有关核苷酸序列。
根据本发明，所述培养条件为常规培养条件，如使用BMGY液体培养基(例如，含有1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，1％甘油，灭菌后添加过滤除菌的1.34％酵母基础氮源、0.02％生物素)，在25-30℃下培养20-24h；然后将菌体转移至BMMY培养基(例如，1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，灭菌后添加过滤除菌的1.34％酵母基础氮源、0.02％生物素，0.5％甲醇)中继续培养，每隔24h加入0.8-1.2％（v/v）的甲醇，培养120h，离心得到上清即为Vnalg7或Ovnalg7粗酶液。所述粗酶液可以采用本领域公知的方法进行纯化，从而得到纯化的Vnalg7或Ovnalg7酶。
为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对本发明提供的褐藻胶裂解酶Vnalg7或Ovnalg7进行添加修饰，例如，可以通过在本发明提供的褐藻胶裂解酶Vnalg7或Ovnalg7的氨基末端和/或羧基末端连接表1所示的标签(如Poly-His、c-Myc、FLAG和Strep-tagⅡ中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的褐藻胶裂解酶Vnalg7或Ovnalg7的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
上述褐藻胶裂解酶Vnalg7或Ovnalg7可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
本发明中，使用所述褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的方法包括：将褐藻胶样品与所述褐藻胶裂解酶孵育。相对于每克以褐藻胶计的褐藻胶样品，所述褐藻胶裂解酶的用量可为50-160U。所述接触条件可以包括：温度为35-40℃，pH值为7.0。所述孵育的时间可以为5-120min。优选地，所述接触可在Na+存在下进行。所述褐藻胶样品可以为不同粘度的褐藻胶，如低粘度褐藻胶、中等粘度褐藻胶等。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
本实施例中用于毕赤酵母表达菌株Pichia pastorisX-33和表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司，表达载体pPICZαA经人工自行改造，已去除α因子分泌信号肽序列。
酶类及其他生化试剂：PCR试剂及限制性内切酶等均购自Vazyme公司，中等粘度褐藻胶(MV-Algin)、低粘度褐藻胶(LV-Algin)购自Sigma公司，多聚古罗糖醛酸段（polyG，平均分子量：∼5.5kDa，M/G比：0.20，纯度∼95%）、多聚甘露糖醛酸段（polyM，平均分子量：∼6.44kDa，M/G比：12.56，纯度∼80%）、标准品饱和α-L-古罗糖醛酸寡糖和β-D-甘露糖醛酸寡糖（G1-G7、M1-M7，报告纯度≥95%）均购自青岛博智汇力生物技术有限公司，其它试剂均可从普通生化试剂公司购买。
培养基：
大肠杆菌培养基LC：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，配制固体培养基时添加1.5％琼脂粉；
毕赤酵母培养基YPD：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖2％，115℃灭菌；
BMGY培养基：蛋白胨2％，酵母提取物1％，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，甘油1％，灭菌后添加过滤除菌的酵母基础氮源1.34％、生物素0.02％；
毕赤酵母诱导表达培养基BMMY：蛋白胨2％，酵母提取物1％，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，灭菌后添加过滤除菌的酵母基础氮源1.34％、生物素0.02％，甲醇0.5％。
实施例1、含有本发明的Vnalg7或Ovnalg7基因的重组菌株的构建
(1)构建重组载体pPICZp-alg
设计特异性引物pPICZp-alg-F/pPICZp-alg-R
pPICZp-alg-F：aaaaaacaactaattattcgaaacggaattcatgaagtccaagttggtt;
pPICZp-alg-R：aaccaacttggacttcatgaattccgtttcgaataattagttgtttttt。
以含有SEQ ID NO：3所示核酸序列的质粒为模板，pPICZp-alg-F/pPICZp-alg-R为引物进行PCR扩增，PCR的反应参数为：95℃预变性30sec，然后95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸，35个循环后72℃继续延伸5min。PCR扩增产物经DpnI消化，去除甲基化模板质粒，得到pPICZp-alg重组载体。
(2)构建重组菌株
重组质粒(pPICZp-alg)经限制性内切酶SacI线性化并进一步浓缩，而后经电击转化至毕赤酵母Pichia pastorisX-33中，获得重组酵母菌株。
转化方法：接种Pichia pastorisX-33单菌落于5mL YPD液体培养基，30℃、200rpm过夜培养，取适量毕赤酵母菌液接种至100mL YPD液体培养基中，使初始OD600约为0.5，继续30℃、200rpm培养至OD600达到1.3-1.5。4℃条件下1500g离心5min后，弃上清收集毕赤酵母菌体，用等体积预冷无菌水重悬菌体，相同条件下离心收集菌体。再用1/2体积预冷无菌水重悬菌体，相同条件下离心收集菌体，该操作重复两次。再加入1/5体积预冷1M山梨醇，重悬菌体，相同条件下离心收集菌体。最后，加入50-100μl预冷1M山梨醇，重悬菌体。取80μL菌悬液至预冷1.5mL离心管中，与10μL用于转化的浓缩质粒，混合均匀，转移至2mm电转杯中，冰上预冷5min。将电转杯外壁的水擦拭干净，放入电转仪中，选择fungi模式，1.5kV，33A条件下电击。电击结束后迅速加入1mL预冷的1M山梨醇，重悬菌液并转移至1.5mL离心管中，30℃条件下静置复壮1-2h，获得重组酵母菌株。
(3)重组菌株的验证
将转化后的重组酵母菌株涂布于含有100μg/mL博莱霉素(Zeocin+)抗性的YPD平板上，30℃温箱中培养2-4天，至单菌落出现。挑取单菌落于100μL 0.2M LiACo和1％SDS混合液中充分悬浮，70℃加热10min，加入300μL无水乙醇，利用涡旋震荡仪充分混匀，12000rpm离心5min，去除上清。再加入1mL 70％乙醇，充分混匀，12000rpm离心2min，尽量将上清去除干净，加入20μL ddH2O溶解沉淀，12000rpm离心2min，上清即为毕赤酵母基因组DNA。
以上述获得的毕赤酵母基因组DNA为模板，特异性引物5’AOX(GACTGGTTCCAATTGACAAGC)和3’AOX(GCAAATGGCATTCTGACATCC)为引物进行PCR验证，PCR的反应参数为：95℃预变性5min，然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸，35个循环后72℃继续延伸10min。获得正确表达Ovnalg7的重组毕赤酵母菌株。
采用上述相似的方法，构建含有Vnalg7基因的重组Pichia pastorisX-33菌株。
挑取YPD平板上生长的新鲜的正确表达Vnalg7和Ovnalg7的重组酵母菌株以及不含有褐藻胶裂解酶基因的对照酵母菌株单菌落，分别接种于BMGY培养基中，30℃、200rpm培养过夜，然后转移菌体于50mL BMMY培养基中，使OD600约为1.0，30℃、200rpm继续培养，每隔24h加入1％甲醇，诱导表达120h，离心得上清为Vnalg7或Ovnalg7粗酶液。
将所述Ovnalg7及Vnalg7粗酶液进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，其中Marker为ExcelBandTMPM2510；结果显示，Vnalg7和Ovnalg7均能够在重组毕赤酵母中进行表达，且上清液中蛋白纯度较高，全优基因表达的Ovnalg7较Vnalg7蛋白表达量更高，而SEQ ID NO：4所示原始基因编码的外源蛋白表达量低(结果未示出)，由此说明本发明提供的Vnalg7和Ovnalg7序列在毕赤酵母中能够提高目的蛋白的表达量。
SEQ ID NO：4
atgaaaagcaagttagtcaatattgtcggcagtgccgttttactgagctcttttgccgcacacagtgccgaagtcaatctcgttaacccaagttttgaacaagatttttctggatggacagaagttgatccaaccgctgtctccggtgttgcctatgacggtgcaaagtcagcaaaattctctggcaatggtgcacgtctagagcagtcagttccggtcacaagcaataccgaatacacgctgagcgcgtacgtgctggcagatgcgaacatcggcgtggaggttggcagcgacacctttagtaaaaccgcctcaaactcagattgggcgcaaaccaccattaccttcaactcaggagatgcaacggaaatcaccatctttggtgaatacagtggcgctgagggccgtgtcgatctcttcaaactcacatcttctgaaatcattgacccaccgaccacttcattgccagtcttcgatctcgaccctgcccttccgccatcaggcaacttcgacttattggattggaaactcgacctgccagttgatgataacggtaacgcgtctggtgatgctcaagaagtgaaagaaggcgaactctctagcggctttgagaacagcgagttcttctacactggtgatgacggcggtttggtgttcatctcacccgtcgaaggcgcaaccacatctgcaaataccaaatacacacgttcagaaatgcgtgaaatgcttcgtcgtggcgacaccagcatctcaaccacaggcatcaccaaaaacaactgggtattcgcgagcgcaccaagcgatgatcaaaacaattctggcggtgtggatggcgttttagaagcaacattggccgtcaacgcggtaacgacaacgggtgattccagccaagtgggccgcgtgatcgttggtcagatccacgcaaataacgatgaaccaatccgcctctactatcgtttattgccgggtcacaccaaaggttcgctttactttgcgcatgaacctaacgaagacgcgtcatcagatccagagcagttcattaatcttattggtagctcagcatccaacgcttcagaacctgaagatggcatcgcattgaacgagttattcttctaccgaatcgaagtgcaaggtaaccaacttatcgtcaccattaaacgtgatgaccacgaagacgtcactgaaacggtagatatgaccaccagcggctatgatgttagcggccaatacatgtacttcaaagcgggcgtgtataaccaaaacaactcaggtgacccaactgactatgttcaagcaaccttctactacctaaccaactcgcacgacgggtatgaattcccgtag
实施例2、Vnalg7或Ovnalg7酶活性质分析
1、Ovnalg7及Vnalg7酶活测定方法：用pH 7.0、50mM的磷酸缓冲液分别配制底物（1%褐藻胶(MV-Algin、LV-Algin)、polyG及polyM），于1.5mL离心管中分别加入900μL上述底物，再加入100μL适宜稀释度的Ovnalg7/Vnalg7粗酶液，迅速混合均匀，35℃条件下反应10min，沸水浴煮沸10min终止反应，以失活酶-底物-缓冲液反应体系为空白对照测定OD235。一个活性单位(U)定义为在最适反应条件下(pH 7.0，温度35℃)，每分钟使OD235增加0.1吸光度所需的酶量。对Ovnalg7及Vnalg7的酶活检测结果如图2所示：以LV-Algin为底物时，褐藻胶裂解酶Vnalg7的发酵粗酶液酶活性可达3620 U/ml，高于文献报道如SEQ ID NO：4所示原始基因E. coliBL21 (DE3)异源表达粗酶活，是目前文献报道中PL7家族褐藻胶裂解酶异源表达的最高粗酶活，而经进一步人工优化基因序列所得褐藻胶裂解酶Ovnalg7的酶活性更佳，为Vnalg7粗酶活性的129.14%。
2、Ovnalg7反应最适pH测定
利用不同pH（pH 2.0-pH 11.0）的缓冲液配制1% LV-Algin底物，并稀释Ovnalg7粗酶液至适宜稀释度，测定pH对Ovnalg7酶活性的影响，结果如图3所示，表明：Ovnalg7发挥酶促反应的最适pH为pH 7.0磷酸缓冲液。
3、Ovnalg7反应最适温度测定
用最适pH缓冲液配制1% LV-Algin底物，并稀释Ovnalg7粗酶液至适宜稀释度，在20-65℃温度条件下每隔5℃测定Ovnalg7酶活性，结果如图4所示，结果表明：Ovnalg7发挥酶促反应的最适温度为35℃。
4、Ovnalg7的pH稳定性分析
用不同pH缓冲液稀释Ovnalg7酶液至适宜稀释度，在4℃环境中分别预孵育1h后，与最适pH缓冲液配制的1.0％ LV-Algin底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力，结果如图5所示，结果表明：在pH 6.0-11.0的范围内预处理1h，Ovnalg7的相对酶活均保持60％以上。这表明重组褐藻胶裂解酶Ovnalg7对pH值耐受范围较广。
5、Ovnalg7的温度稳定性分析
将最适pH缓冲液稀释的适宜稀释度的Ovnalg7酶液在不同温度(35、45、55℃)下热处理6h（每隔0.5h取样）后，分别与用最适pH缓冲液配制的1.0％ LV-Algin底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力，结果如图6所示，结果表明：Ovnalg7在上述温度下预处理6h后仍然具有一定的残余活性，表明重组褐藻胶裂解Ovnalg7具有一定的热稳定性。
6、不同金属离子对Ovnalg7酶活影响
在最适反应条件下，在反应体系中分别加入一定浓度的金属离子和化学试剂，测定Ovnalg7酶活，结果如下表2所示，Tween-20 对Ovnalg7酶活具有一定的促进作用, Na+存在下对酶活无抑制作用。
表2
7、Ovnalg7的底物特异性测定
用pH 7.0、50mM的磷酸缓冲液分别配制1% 褐藻胶(MV-Algin、LV-Algin)、polyG及polyM底物，并与适宜稀释度的Ovnalg7酶液按9：1(体积比)的比例混合，然后在最适条件下测定Ovnalg7对于不同底物的酶活性，以最高酶活测定结果定义为100%相对活力，其余底物水解活性对应表示为相对活性，结果如图7所示，结果表明：Ovnalg7不仅能够快速水解polyG段，也可以水解polyM段，具有双功能活性，且对褐藻胶的水解活性最佳。
8、Ovnalg7水解褐藻胶/多聚古罗糖醛酸段的结果分析
分别以1.0％ LV-Algin、2.0% 古罗糖醛酸寡糖（G1-G7）为底物，利用Ovnalg7在最适反应条件下(磷酸缓冲液pH 7.0,温度35℃)进行水解，水解液用80%甲醇于-20℃沉淀2h以去除酶蛋白，离心后上清利用液相色谱质谱联用仪（LC-MS，Thermo scientific)，选用UPLC HSS T3柱（2.1×100mm，1.8μm），在ESI阴离子电离喷雾源，3.5 kV喷雾电压条件下，结合梯度洗脱流动相分析产物生成情况，结果如图8A-图8H所示(图8A：LV-Algin水解结果，图8B：古罗糖醛酸单糖（G1）水解结果，图8C：古罗糖醛酸二糖（G2）水解结果，图8D：古罗糖醛酸三糖（G3）水解结果，图8E：古罗糖醛酸四糖（G4）水解结果，图8F：古罗糖醛酸五糖（G5）水解结果，图8G：古罗糖醛酸六糖（G6）水解结果，图8H：古罗糖醛酸七糖（G7）水解结果)。结果表明:Ovnalg7能够快速水解褐藻胶及多种古罗糖醛酸寡糖产生以不饱和二糖及三糖为主要产物成分的多种褐藻寡糖，产物种类多样；Ovnalg7不能水解聚合度（DP）＜3的古罗糖醛酸寡糖（G1，G2，G3），其最小水解底物为古罗糖醛酸四糖（G4）；通过检测Ovnalg7对于DP≥4的古罗糖醛酸寡糖水解能力发现，其不仅具有内切水解能力，还可通过一定程度的转糖基化作用生成较底物聚合度更高的不饱和寡糖成分，且转糖基化最小底物为水解产生的不饱和古罗糖醛酸三糖（△G3）。如图8E所示，Ovnalg7水解G4糖，生成△G3和G1糖，产物中还生成了不饱和古罗糖醛酸六糖（△G6）；如图8F所示，Ovnalg7水解G5糖，生成△G3和G2糖，同时也生成△G6糖；如图8G、图8H所示，Ovnalg7水解G6及G7糖的产物种类较为多样，包含了单糖至八糖，除水解产生低聚合度寡糖外，同样出现了比底物聚合度更高的不饱和寡糖产物。LV-Algin及古罗糖醛酸寡糖标准品的液质分析结果如图9A-图9H所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种编码褐藻胶裂解酶的基因，所述基因序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
2.含有权利要求1所述基因的重组载体。
3.含有权利要求2所述重组载体的重组菌株。
4.权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株在降解褐藻胶中的应用。
5.一种降解褐藻胶的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株对褐藻胶进行处理的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述处理的温度为20℃-65℃；所述处理的pH为2-11。
7.一种降解古罗糖醛酸寡糖的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株对古罗糖醛酸寡糖进行处理的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述古罗糖醛酸寡糖包括古罗糖醛酸四糖、古罗糖醛酸五糖、古罗糖醛酸六糖或古罗糖醛酸七糖或更高聚合度的古罗糖醛酸寡糖。
9.一种制备不饱和古罗糖醛酸寡糖的方法，所述方法包括以古罗糖醛酸寡糖为底物，利用权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株对古罗糖醛酸寡糖进行处理从而制备较底物聚合度更高的不饱和古罗糖醛酸寡糖的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述底物为古罗糖醛酸四糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸六糖；或者，所述底物为古罗糖醛酸五糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸六糖；或者，所述底物为古罗糖醛酸六糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸七糖和不饱和古罗糖醛酸八糖；或者，所述底物为古罗糖醛酸七糖，所述不饱和古罗糖醛酸寡糖为不饱和古罗糖醛酸八糖。
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