CN105755023A - 一种玉米赤霉烯酮降解酶基因及高产菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶基因及高产菌株。一种玉米赤霉烯酮降解酶基因，包括(a)、(b)或(c)的DNA分子：(a)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA分子；(b)在严格条件下与(a)所述的核苷酸序列杂交且编码具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白的DNA分子；(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。本发明通过上述序列构建了用于生产玉米赤霉烯酮降解酶的高产菌株并进一步提供了一种高密度发酵的方法。通过高产菌株及高密度发酵方法可以高效分泌表达玉米赤霉烯酮降解酶，其发酵上清能迅速高效地降解ZEN。

Description

一种玉米赤霉烯酮降解酶基因及高产菌株
技术领域
本发明属于酶工程及发酵领域，尤其涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶基因及高产菌株，更具体地，涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶基因密码子优化、玉米赤霉烯酮降解酶高产菌株的构建及高密度发酵方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是由镰刀菌属产生的一种非固醇类雌激素类真菌毒素，最初由Stob等从发霉玉米中分离得到。ZEN在世界各地的谷物及其副产品污染广泛，在适合真菌生长的自然环境中，像玉米、大麦、小麦等谷物中经常能检测到高含量的ZEN。ZEN通过污染的谷物农副产品及饲料进入食物链，并在人体与动物体内累积。进入人体与动物体内的ZEN引起雌激素综合症状，导致动物体内雌激素过多，引起不孕不育，并有很强的致癌致畸作用。
ZEN在谷物饲料中的污染，在全球造成了巨大的经济损失。为了保障食品安全，对真菌毒素ZEN的脱毒技术具有重大的意义。传统的物理化学方法并不能有效去除谷物中的毒素，并会破坏谷物的营养成分，影响食物的口感。酶降解不仅可以高效的将ZEN转化为无毒性产物，环保安全，而且酶催化反应与一性强、降解效率高，不会破坏谷物的营养物质。2002年，Naoko等从粉红粘帚霉中克隆了ZEN内酯水解酶基因zhd101并在大肠杆菌表达，结果重组的大肠杆菌表现出很强的水解内酯酶的能力，该酶把ZEN降解。但是，目前zhd101表达得到的酶液降解ZEN的效率都比较低，也还没有通过基因优化、构建多拷贝等策略提高zhd101在毕赤酵母中表达量的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种玉米赤霉烯酮降解酶zhd101(GenBank:AB076037.1)基因的优化序列。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种玉米赤霉烯酮降解酶基因，包括(a)、(b)或(c)的DNA分子：
(a)具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的DNA分子；
(b)在严格条件下与(a)所述的核苷酸序列杂交且编码具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白的DNA分子；
(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。
采取上述技术方案的有益效果为：SEQIDNO.1所示的核苷酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性优化后的基因序列，该序列密码子适应指数(CAI)由0.63％提高到0.91％，GC含量由原来的56.6％降低到43.6％，并提高mRNA稳定性，延长了mRNA的半衰期。经后期实验证实，优化后的序列有利于玉米赤霉烯酮降解酶的高产。
本领域技术人员以SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为基础进行适当改变，例如添加标签序列、限制性酶切位点、保护碱基以及其他用于调控或表达的元件等，使改变后的核苷酸序列编码的蛋白质仍然可以具有、维持或者提高玉米赤霉烯酮降解酶活性。
进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的DNA分子。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：SEQIDNO.1所示的核苷酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性优化后的基因序列，该序列密码子适应指数(CAI)由0.63％提高到0.91％，GC含量由原来的56.6％降低到43.6％，并提高mRNA稳定性，延长了mRNA的半衰期。经后期实验证实，优化后的序列有利于玉米赤霉烯酮降解酶的高产。
进一步，所述严格条件为钠浓度为50-300mM的溶液中，反应温度为50-68℃。
例如：在进行分子杂交的过程中，可以为在6×SSC、质量分数为0.5％的SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，质量分数为0.1％的SDS和1×SSC、质量分数为0.1％的SDS各洗膜一次。其中SDS的中文名称为十二烷基硫酸钠，1×SSC包括0.15mol/LNaCl和0.015mol/L柠檬酸；SDS以及不同浓度倍数的SSC均为本领域的常用试剂。
本发明还提供一种上述的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质。
本发明提供一种检测上述的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶活的方法，包括以下步骤：
1)配制不同浓度的玉米赤霉烯酮溶液作为标准液，检测玉米赤霉烯酮的浓度，以玉米赤霉烯酮浓度为横坐标、玉米赤霉烯酮峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
2)测定酶活：向含有玉米赤霉烯酮的标准液的溶液中加入含有待测的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的溶液混合，37-45℃条件下反应，在玉米赤霉烯酮完全降解前加入甲醇终止反应，检测并根据标准曲线计算反应后的溶液中玉米赤霉烯酮的含量；玉米赤霉烯酮的降解率按照公式进行计算：(反应前玉米赤霉烯酮的含量-反应后玉米赤霉烯酮的含量)/反应前玉米赤霉烯酮的含量×100％；玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮的酶活定义：每分钟降解1μg玉米赤霉烯酮所需要的酶量作为一个酶活单位U。
本发明首次提出了用于检测玉米赤霉烯酮降解酶酶活的检测方法。该方法具有操作简单、灵敏度高、所需时间短等优点。
进一步，上述的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶活的方法，具体包括以下步骤：
1)玉米赤霉烯酮标准曲线的绘制：分别配制0-20μg/mL的玉米赤霉烯酮溶液作为标准液，过滤后，通过HPLC检测，以玉米赤霉烯酮浓度为横坐标，玉米赤霉烯酮峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
2)酶活的测定方法：
向440μL缓冲液中加入10μL浓度1.0mg/mL的玉米赤霉烯酮标准溶液，再加入50μL含有玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶液，混匀，在37℃反应15min后立即加入500μL甲醇终止反应，通过HPLC检测玉米赤霉烯酮的残留量，根据下面的公式计算玉米赤霉烯酮的降解率：
其中ZEN代表玉米赤霉烯酮。
ZHD降解ZEN的酶活定义：每分钟降解1μgZEN所需要的酶量作为一个酶活单位U。
其中，ZHD为玉米赤霉烯酮降解酶的简写。
通过选择合适的玉米赤霉烯酮标准液的浓度范围使制作的标准曲线线性关系比较好；严格控制酶活测定时的反应条件，有利于提高检测的灵敏度。
本发明首次提出了用于检测玉米赤霉烯酮降解酶酶活的检测方法。该方法具有操作简单、灵敏度高、所需时间短等优点。
本发明还提供一种重组载体，包括上述的玉米赤霉烯酮降解酶基因。
具体操作时，可以将上述玉米赤霉烯酮降解酶基因以单拷贝或多拷贝的形式插入出发载体，用于进行玉米赤霉烯酮降解酶的表达。
也可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
本发明还提供一种高产菌株，包括上述的重组载体。
所述高产菌株为玉米赤霉烯酮降解酶ZHD的高产菌株，表达的玉米赤霉烯酮降解酶能高效迅速的降解ZEN及其衍生物。
进一步，所述高产菌株为重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株包括含有上述玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组载体，在该重组载体中，所述玉米赤霉烯酮降解酶基因以三个拷贝的形式存在。
发明人在研究中体外构建玉米赤霉烯酮降解酶基因多拷贝的重组载体，并且以重组毕赤酵母菌株为高产菌株，高产菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶产量较高。尤其，当转化含三拷贝玉米赤霉烯酮降解酶基因载体时，高产菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶产量更高。
本发明还提供一种上述玉米赤霉烯酮降解酶基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
本发明提供一种生产玉米赤霉烯酮降解酶的方法，包括以下步骤：培养上述的高产菌株，并由培养产物中收集玉米赤霉烯酮降解酶。
进一步，包括以下步骤：
1)挑取上述高产菌株的单菌落接种至YPD培养基中，28℃条件下培养48h，得到种子培养液；
2)以初始发酵体积10％的接种量将种子培养液接种于基础盐培养基中，发酵温度为25℃，pH为6.0，控制溶氧在20-30％之间；
3)当溶氧迅速上升至60％时，开始流加体积分数为50％的甘油，并控制溶氧在20-30％之间；当菌体密度OD600达到300左右时，停止补加甘油，溶氧上升至60％左右并维持30min，之后进入步骤4)；
4)降低温度至22℃，补加酵母粉至终浓度为7％-15％(质量百分数)，然后流加甲醇诱导玉米赤霉烯酮降解酶的表达，并控制溶氧在20-30％之间。
优选地，步骤4)中，补加酵母粉至终浓度为10％(质量百分数)。
上述进一步技术方案的有益效果为：
本发明通过合适的控制条件实现了玉米赤霉烯酮降解酶的高度发酵。
在一般的高密度发酵过程中，产生的蛋白容易被菌株自身的蛋白酶酶解，发明人在研究中意外的发现，补加酵母粉至终浓度为7％-15％(质量百分数)可以避免蛋白的降解。
本发明通过上述方法，利用毕赤酵母中的高密度发酵产生玉米赤霉烯酮降解酶，玉米赤霉烯酮降解酶蛋白大量表达，发酵上清表现出高效的ZEN降解能力，最高酶活高达150.1U/mL。
附图说明
图1pHBM905BDM-zhd多拷贝表达载体建流程图。
图2pHBM905BDM-zhd多拷贝表达载体酶切鉴定图。其中：M为λ-E.coliT14Idigestmarker；1-4为pZHD101，pZHD102，pZHD103和pZHD104SalI酶切产物。
图3X1c，X2c，X3c和X4c摇瓶表达ZHD蛋白SDS-PAGE电泳图。其中：M为蛋白marker；1-4为重组毕赤酵母P.PastorisGS115X1c，X2c，X3c和X4c诱导72h表达上清。
图4ZEN标准曲线。其中横坐标为ZEN浓度，纵坐标为HPLC检测的峰面积。
图5重组玉米赤霉烯酮降解酶ZHD降解ZEN的HPLC检测图。其中：图a为ZEN标准品(20μg/mL)；图b-d为ZHD降解ZEN0,15,30min的HPLC检测图；图e为无酶对照处理ZEN2h的HPLC检测图。
图6上罐发酵中DO、酶活和OD600的曲线。
图7上罐发酵中不同诱导时间表达ZHD蛋白SDS-PAGE电泳图。其中：M为蛋白marke；1-9为甲醇诱导0、12、24、36、48、60、72、84和96h的表达上清。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供zhd101基因根据毕赤酵母密码子偏好性优化后的基因序列，优化后的基因序列命名为zhd。优化后的基因序列如序列表中SEQID.No1所示。优化过后的基因序列zhd密码子适应指数(CAI)由0.63％提高到0.91％，GC含量由原来的56.6％降低到43.6％，并提高mRNA稳定性，延长了mRNA的半衰期。优化的基因由GenScript公司合成。
本发明所述的毕赤酵母高产菌株通过下列技术方案构建实现：
以优化过的基因序列zhd为模板，在引物ZHD-FP(5’GTCAATGAGAACTAGATCCACTATTTCAACTC3’)和ZHD-RP(5’GGCCACTACAAATGCTTCTGGGT3’)引导下进行PCR反应。PCR产物补加1mMdTTP，并用T4DNA聚合酶12℃处理20min，回收作为片段部分。毕赤酵母表达载体pHBM905BDM用NotI和CpoI完全酶切处理，胶回收大片段作为载体部分。将处理好的目的片段与载体按摩尔比3∶1混合以后，加入等体积的SolutionI连接酶，16℃处理2h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。经PCR鉴定和测序鉴定，获得的正确重组表达质粒pHBM905BDM-zhd-1copy，命名为pZHD101。当pZHD101质粒得到之后，利用生物砖的方法体外构建了zhd多拷贝质粒，ZHD表达盒包含5’AOX1启动子、分泌信号肽、zhd基因、3’AOX1终止子，构建好的zhd1-4拷贝质粒分别命名为pZHD101、pZHD102、pZHD103和pZHD104，并通过酶切验证。
将得到的1-4拷贝重组表达质粒分别用SalI酶切，回收大片段，电转毕赤酵母PichiapastorisGS115，得到含有zhd不同拷贝数的重组毕赤酵母菌株，分别命名为X1c、X2c、X3c和X4c。将重组毕赤酵母菌株分别接种至含25mLBMGY培养基的250mL锥形瓶中，28℃振荡培养至菌体OD600为30左右时，离心收集菌体，用25mL无菌的BMMY重悬，每24h添加250μL甲醇诱导，继续28℃，220rpm振荡培养。连续诱导3天后，离心收取上清，即得到4个不同的毕赤酵母重组菌发酵的粗酶液。通过12％SDS-PAGE胶检测，发现转化3拷贝质粒的菌株X3c的蛋白表达量是最高的。即得到一株高产ZHD酶的毕赤酵母重组菌株，并通过高密度发酵获得高活性酶液。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
一、重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pHBM905BDM-zhd的构建
(一)优化后的基因zhd的扩增
优化的基因序列zhd由南京GenScript公司合成，设计引物扩增目的基因。优化的基因序列zhd的序列如SEQIDNO.1所示，具体序列如下：
ATGAGAACTAGATCCACTATTTCAACTCCTAATGGTATCACTTGGTACTATGAGCAAGAGGGAACAGGTCCAGATGTCGTTTTGGTTCCAGATGGTTTGGGAGAATGTCAAATGTTTGACTCTTCCGTTTCTCAAATTGCTGCTCAGGGTTTTAGAGTTACTACATTCGATATGCCTGGAATGTCCAGATCAGCTAAGGCTCCACCTGAAACTTACACAGAGGTTACTGCTCAGAAGTTGGCTTCATACGTTATCTCTGTTTTGGATGCTTTGGACATCAAGCATGCTACTGTTTGGGGTTGTTCATCTGGAGCTTCTACAGTTGTTGCTTTGTTGTTGGGTTACCCAGACAGAATTAGAAACGCTATGTGTCATGAATTGCCTACTAAGTTGTTGGATCACTTGTCCAATACAGCTGTTTTGGAGGACGAAGAGATTTCAAAAATCTTGGCTAACGTTATGTTGAATGATGTTTCTGGTGGTTCTGAAGCTTGGCAAGCTATGGGAGACGAGGTTCATGCTAGATTGCACAAGAACTACCCAGTTTGGGCTAGAGGTTATCCTAGAACTATCCCACCTTCTGCTCCAGTTAAGGATTTGGAAGCTTTGAGAGGAAAACCATTGGACTGGACTGTTGGTGCTGCTACTCCTACAGAGTCCTTTTTCGATAACATCGTTACTGCTACAAAGGCTGGTGTTAATATCGGATTGTTGCCTGGTATGCACTTCCCTTATGTTTCCCACCCAGATGTTTTCGCCAAGTATGTTGTTGAGACCACCCAGAAGCATTTGTAG。
用于扩增zhd的上游引物ZHD-FP：5’-GTCAATGAGAACTAGATCCACTATTTCAACTC3’，如SEQIDNO.2所示；
用于扩增zhd的下游引物ZHD-RP：5’-GGCCACTACAAATGCTTCTGGGT-3’，如SEQIDNO.3所示。
上游引物ZHD-FP和下游引物ZHD-RP的终浓度均为10μM，-20℃储存备用。
PCR反应体系原料配比如下：
10×pfu buffer 5μL
dNTP Mixture 5μL
上游引物ZHD-FP 2.5μL
下游引物ZHD-RP 2.5μL
Pfu DNA Polymerase 0.5μL5 -->
zhd模板 0.5μL
灭菌水 34μL
总体积 50μL
其中″zhd模板″指合成的SEQIDNO.1所示DNA序列片段。
上述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃变形30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环之后72℃继续延伸10min，4℃保存
本发明中，PfuNDApolymerase、dNTPMixture购自TaKaRa公司。
(二)重组质粒pHBM905BDM-zhd构建
选取质粒pHBM905BDM，用NotI和CpoI酶切，胶回收大片段作为载体。PCR产物添加1mMdTTP，用T4DNAPolymerase12℃处理20min，胶回收目的片段。将处理好的目的片段与载体按摩尔比3∶1混合以后，加入等体积的SolutionI连接酶，16℃处理2h。将上述4μL连接产物与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30min，之后42℃热击45s，再放置冰上1-2min，加入200μLNZY培养基，37℃，200rpm振荡培养1h。将上述培养物涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，筛选重组子得到重组质粒pHBM905BDM-zhd，命名为pZHD101。
本发明中，pHBM905BDM质粒本实验室保存；限制性内切酶、dTTP、T4DNAPolymerase、SolutionI连接酶均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自Transgene公司。
NZY培养基：1％NZamine(caseinhydrolysate)，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，10mMMgCl2，10mMMgSO4，20mM葡萄糖。
(三)zhd多拷贝质粒的构建
当pZHD101单拷贝质粒得到之后，利用生物砖的方法体外构建了pHBM905BDM-zhd多拷贝质粒，ZHD表达盒包含5’AOX1启动子、分泌信号肽、zhd基因、3’AOX1终止子。利用同尾酶的酶切和酶连，得到多拷贝表达盒式结构的串联重复的重组质粒(见图1)。在单拷贝pZHD101重组质粒的基础上，先用EcoRI和XbaI限制性内切酶对pZHD101酶切处理，胶回收纯化作为载体，然后用EcoRI和SpeI限制性内切酶对pZHD101双酶切，胶回收纯化大小1.8kb的ZHD表达盒片段。之后将ZHD表达盒片段与载体按摩尔比3∶1混匀转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取重组质粒与单拷贝pZHD101质粒进行大小比对，再用Sa/I酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳图检测(见图2)，切下的两片段大小约为2kb和8.8kb，与预期理论大小相符，则两拷贝pHBM905BDM-zhd-2copies重组质粒构建成功，命名为pZHD102。
按照同样的方法构建三拷贝、四拷贝重组质粒分别命名为pZHD103和pZHD104。
(四)重组质粒的线性化与电转
将重组质粒pZHD101、pZHD102、pZHD103和pZHD104分别用限制性内切酶SalI酶切线性化，用DNA溶液回收试剂盒分别纯化，再分别通过电击转化PichiapastorisGS115感受态细胞，得到含zhd不同拷贝数的重组毕赤酵母，分别命名为X1c、X2c、X3c和X4c。
二、重组毕赤酵母菌株的筛选
将重组毕赤酵母菌株X1c-X4c同时进行摇瓶诱导表达，分别接种至含25mLBMGY培养基的250mL锥形瓶中，28℃振荡培养至菌体OD600为30左右时，离心收集菌体，用25mL无菌的BMMY培养基重悬，每24h添加250μL甲醇诱导，继续28℃，220rpm振荡培养。连续诱导3天后，离心收取上清，即得到四个不同的毕赤酵母重组菌发酵的粗酶液。通过分别检测上清液中蛋白的含量及12％的SDS-PAGE胶检测，发现转化三拷贝质粒的菌株X3c的蛋白表达量是最高的(见图3)，是一株高产ZHD酶的毕赤酵母重组菌株。
BMGY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％无氨基酵母氮源(YNB)，1％硫酸铵，10％1M磷酸钾缓冲液pH6.0(v/v)，1％甘油。
BMMY培养基：1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％无氨基酵母氮源(YNB)，1％硫酸铵，10％1M磷酸钾缓冲液pH6.0(v/v)。
三、玉米赤霉烯酮降解酶ZHD酶活检测
挑取重组毕赤酵母菌X3c的单菌落，接种于25mLBMGY液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养至OD600为30左右时，离心收集菌体，用25mL无菌的BMMY液体培养基重悬，继续28℃、220rpm振荡培养，每24h添加250μL甲醇诱导，连续诱导3天。将培养液在4℃、12000rpm离心10min，收集上清液即为粗酶液。
ZEN标准曲线的绘制：
取7支1.5mL的EP管，分别配置浓度为0、2、4、6、8、10、20μg/mL的ZEN溶液，0.22μm膜过滤，通过HPLC检测。流动相：乙腈/＝60/40，紫外检测波长254nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL。以ZEN浓度为横坐标，ZEN峰面积为纵坐标绘制标准曲线，见图4。
粗酶液降解ZEN酶活的测定方法如下：
取440μL50mM的Tris-HCl缓冲液(pH9.5)于2.0mL的EP管中，加入10μL终浓度1.0mg/mL的ZEN标准溶液，加入50μL粗酶液，混匀，在37℃反应15min后立即加入500μL甲醇终止反应，通过HPLC检测ZEN的残留量。ZEN的降解率计算公式如下：
ZHD降解ZEN的酶活定义：每分钟降解1μgZEN所需要的酶量作为一个酶活单位U。
ZHD指玉米赤霉烯酮降解酶。
如图5所示，用上述制得的粗酶液降解ZEN，ZEN降解率高达65.8％，酶活达到22.7U/mL。
四、重组酵母菌株X3c高密度发酵
基础盐培养基含有：2％NH4H2PO4，0.09％CaCO3，1.2％K2SO4，1％MgSO4·7H2O，0.4％KH2PO4，0.06％KOH，4％甘油，0.24mL/L豆油，4mL/LPTM1，pH6.0。
其中PTM1含有：0.6％CuSO4·5H2O，0.008％KI，0.3％MnSO4·H2O，0.02％Na2MoO4·2H2O，0.002％H3BO3，2％ZnSO4·7H2O，6.5％FeSO4·7H2O，0.05％CoCl2·6H2O，0.02％生物素，0.5％H2SO4(V/V)。
挑取单菌落接种至YPD培养基中，28℃，220rpm培养48h，获得种子培养液。
整个发酵过程分为三个阶段：
第一阶段，以初始发酵体积10％的接种量将种子培养液接种于基础盐培养基中，温度25℃，用氨水调节pH为6.0，通过调节通气量与搅拌转速，控制溶氧在20-30％之间。从接种开始29-30h之后，发酵罐中的甘油被耗尽，溶氧迅速上升至60％。
第二阶段，当溶氧迅速上升至60％时，开始流加50％的甘油(v/v)，并控制溶氧在20-30％之间。当菌体密度OD600达到300左右时，停止补加甘油，溶氧上升至60％左右并维持30min，之后进入第三阶段。
第三阶段，降低温度至22℃，补加酵母粉至终浓度为10％，然后开始流加甲醇诱导蛋白的表达，并控制溶氧在20-30％之间。每12h取样，通过12％的SDS-PAGE胶检测，并测定降解ZEN的酶活(如图6和图7所示)。在发酵136h时，ZHD酶降解ZEN的酶活最高，达到150.1U/mL，是摇瓶表达水平的6.6倍。
发明人又进一步尝试了在第三阶段中，补加酵母粉至终浓度为7％(质量分数)以及补加酵母粉至终浓度为15％(质量分数)，均能得到类似的结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶基因，其特征在于，包括(a)、(b)或(c)的DNA分子：
(a)具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的DNA分子；
(b)在严格条件下与(a)所述的核苷酸序列杂交且编码具有玉米赤霉烯酮降解酶活性的蛋白的DNA分子；
(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。
2.根据权利要求1所述一种玉米赤霉烯酮降解酶基因，其特征在于，所述严格条件为钠浓度为50-300mM的溶液中，反应温度为50-68℃。
3.一种检测权利要求1或2所述的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配制不同浓度的玉米赤霉烯酮溶液作为标准液，检测玉米赤霉烯酮的浓度，以玉米赤霉烯酮浓度为横坐标、玉米赤霉烯酮峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
2)测定酶活：向含有玉米赤霉烯酮的标准液的溶液中加入含有待测的玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的溶液混合，37-45℃条件下反应，在玉米赤霉烯酮完全降解前加入甲醇终止反应，检测并根据标准曲线计算反应后的溶液中玉米赤霉烯酮的含量；玉米赤霉烯酮的降解率按照公式进行计算：(反应前玉米赤霉烯酮的含量-反应后玉米赤霉烯酮的含量)/反应前玉米赤霉烯酮的含量×100％；玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮的酶活定义：每分钟降解1μg玉米赤霉烯酮所需要的酶量作为一个酶活单位U。
4.根据权利要求3所述一种检测玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶活的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
1)制作玉米赤霉烯酮标准曲线：分别配制0-20μg/mL的玉米赤霉烯酮溶液作为标准液，过滤后，通过HPLC检测，以玉米赤霉烯酮浓度为横坐标、玉米赤霉烯酮峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
2)测定酶活：
向440μL缓冲液中加入10μL浓度为1.0mg/mL的玉米赤霉烯酮标准溶液，再加入50μL含有玉米赤霉烯酮降解酶基因编码的蛋白质的酶液，混匀，在37℃反应15min后立即加入500μL甲醇终止反应，通过HPLC检测玉米赤霉烯酮的残留量，根据下面的公式计算玉米赤霉烯酮的降解率：
其中ZEN代表玉米赤霉烯酮；
ZHD降解ZEN的酶活定义：每分钟降解1μgZEN所需要的酶量作为一个酶活单位U。
5.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的玉米赤霉烯酮降解酶基因。
6.一种高产菌株，其特征在于，包括权利要求5所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述一种高产菌株，其特征在于，所述高产菌株为重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株包括含有权利要求1或2所述玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组载体，在该重组载体中，所述玉米赤霉烯酮降解酶基因以三个拷贝的形式存在。
8.一种权利要求1或2所述玉米赤霉烯酮降解酶基因在降解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用。
9.一种生产玉米赤霉烯酮降解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求6或7所述的高产菌株，并由培养产物中收集玉米赤霉烯酮降解酶。
10.根据权利要求9所述一种生产玉米赤霉烯酮降解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)挑取权利要求6或7所述高产菌株的单菌落接种至YPD培养基中，28℃条件下培养48h，得到种子培养液；
2)以初始发酵体积10％的接种量将种子培养液接种于基础盐培养基中，发酵温度为25℃，pH为6.0，控制溶氧在20-30％之间；
3)当溶氧迅速上升至60％时，开始流加体积分数为50％的甘油，并控制溶氧在20-30％之间；当菌体密度OD600达到300左右时，停止补加甘油，溶氧上升至60％并维持30min，之后进入步骤4)；
4)降低温度至22℃，补加酵母粉至终浓度为7％-15％，该终浓度为质量百分数，然后流加甲醇诱导玉米赤霉烯酮降解酶的表达，并控制溶氧在20％-30％之间。
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