CN104450657A - 腈水合酶及其编码基因和应用 - Google Patents

腈水合酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腈水合酶及其编码基因和应用，该腈水合酶由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明从产酸克雷伯菌KCTC 1686中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。

Description

腈水合酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种腈水合酶及其编码基因和应用。
背景技术
腈是一类重要的化合物，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成，在有机合成中占有及其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法，与化学水解法相比生物转化法具有条件温和、环境污染小、并能实现化学、区域和对映体选择性等优点。生物转化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺，酰胺酶进一步将酰胺催化水解生成羧酸化合物，而腈水解酶可以直接催化腈生成酰胺化合物。
产腈水合酶微生物的分布是相当广泛的，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1；专利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095；专利号为ZL03115536.7的专利公开了一种野生丙酸棒杆菌。
目前，利用微生物法生产丙烯酰胺、烟酰胺的方法主要从菌株的筛选和驯化以及生产工艺的建立和改造等方面开展工作。但是，其中普遍存在野生菌种的酶活稳定性差、对底物和产物的耐受性不高、产品质量不够稳定等问题，同时在野生菌株中除腈水合酶外，还存在酰胺酶和腈水解酶，其可以造成副产物烟酸和丙烯酸的生成，从而严重影响烟酰胺和丙烯酰胺的产量和质量，同时增加分离纯化的难度和生产成本。
随着生物技术的迅速发展，人们认识到用基因工程技术手段来构造具有腈水合酶活性的基因工程菌株可以用来解决上述的难题。用基因工程菌来表达腈水合酶有许多野生菌所不具有的优点，如可以单独克隆表达腈水合酶，阻断催化反应过程中副反应的发生，不会使酰胺在产生的同时又有部分被降解，从而提高产品的产量和质量；另外基因工程菌的适应性强、发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产。当前，重组腈水合酶的研究已经引起人们广泛的重视，经过众多科研工作者的多年努力也取得了相当多的成就，但是还存在着诸多问题，如酶的表达水平低、热稳定性不高、对底物和产物的耐受性差，这严重制约了腈水合酶的工业化应用。
发明内容
本发明提供了一种高表达量、高活性且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。
一种腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该腈水合酶的命名为NHaseK。
本发明还提供了一种编码所述的腈水合酶的基因。
优选的，所述的基因包含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的编码α亚基的基因和如SEQ IDNO.2所示的编码β亚基的基因。该碱基序列来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686(Klebsiellaoxytoca KCTC 1686)，由1278个碱基组成。自5’端第1位到609位碱基编码腈水合酶α亚基；自5’端第625位到1278位碱基编码腈水合酶β亚基。进一步，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
所述的基因还包含编码腈水合酶激活子的碱基序列。所述腈水合酶激活子的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。为提高表达活性，所述基因经过修饰后连接有激活子的基因(SEQ IDNO.3)。进一步地，碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还公开了一种腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还公开了一种任一所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
本发明又公开了一种所述的腈水合酶在制备酰胺化合物中的应用。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。
由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。
本发明提供了一种包含所述腈水合酶基因的重组载体和转化子。
本发明还提供了一种所述重组载体和转化子转化得到的基因工程菌。
本发明又提供了一种所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。
所述的腈化合物为式(I)和(II)所示腈化合物生成对应酰胺中的应用：
式(I)～(II)中：
X：OH，H，NH2，烷基；
R：H，任选地被NH2取代的、分支的或不分支的、具有1-12个C原子的饱和的烷基；分子的或不分支的、具有双键和1-12个C原子的不饱和烷基；具有3-6个C原子的环烷基；
R′：H，具有1-3个C原子的烷基；
R″：单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地被1个或2个Cl，Br，F取代；具有1-6个C原子的烷基腈基团。
本发明从产酸克雷伯菌KCTC 1686中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。
附图说明
图1为本发明腈水合酶基因的PCR扩增电泳图；
M：核酸Marker；1和2：腈水合酶的PCR扩增产物。
图2为本发明重组质粒pET-30a(+)-NHaseK的图谱。
图3为本发明基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图。
M：低分子量标准蛋白质；1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞液；
2：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK诱导后菌体破胞液；
3：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK诱导菌体破胞上清液；
4：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK诱导菌体破胞沉淀，箭头分别指示α亚基、β亚基和激活子P17K的位置。
图4为表达质粒pET-30a(+)-NHaseK的构建示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。
实施例中的材料与方法如下：
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》。
本发明实施例中所使用的限制性内切酶EcoRI、HindIII和T4 DNA连接酶购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-30a(+)购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白质、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。本发明采用的产酸克雷伯菌KCTC 1686(Klebsiellaoxytoca KCTC 1686)购自韩国典型微生物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures(KCTC))
实施例1
一、从产酸克雷伯菌KCTC 1686(Klebsiella oxytoca KCTC 1686)基因组中克隆腈水合酶和其激活子基因
根据Klebsiella oxytoca KCTC 1686基因组DNA序列(GenBank登录号：CP003218.1)设计引物NH-F和NH-R。
NH-F序列：5’-CCGGAATTCATGAGCCATAAACACGACCACG-3’
NH-R序列：5’-TTCCCAAGCTTGTTATGGTGTAACTCCATTATCG-3
在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点EcoRI、HindIII(下划线所示)。以Klebsiellaoxytoca KCTC 1686基因组DNA为模板，NH-F和NH-R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
1)预变性：95℃5min；
2)变性：98℃10s；退火：57℃15s；延伸：72℃60s；共循环30次；
3)延伸：72℃10min；
4)4℃保存2.0h。
用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带，大小为1700bp左右(如图1所示)。用DNA回收纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照该试剂盒说明书。
二、表达载体和工程菌的构建
先将纯化回收后的目的片段和提取的pET-30a(+)空质粒分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切。之后用DNA回收纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。最后用T4 DNA连接酶将目的片段与pET-30a(+)质粒进行连接，连接体系如下表1所示：
表1 pET-30a(+)-NHaseK重组表达质粒连接体系
将上述各试剂进行轻轻混合，并放于16℃金属浴中连接12h。之后用连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，涂平板、挑单菌落进行LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子。用Axygen质粒提取试剂盒从E.coli DH5a阳性转化菌株中提取重组质粒pET-30a(+)-NHaseK，并用其转化表达宿主E coli BL21(DE3)感受态细胞。用PCR法来验证转化的重组子，验证无误后的基因工程菌即为E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK。
三、重组腈水合酶的表达
将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK接于5mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取1mL培养液转接至50mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，20℃下诱导18h。其诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图，如图3所示。
实施例2  基因工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺
酶活力单位定义为：在反应条件下，每分钟催化底物反应产生1μmol产物的酶量。
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入1.5ml丙烯腈，35℃下进行水合反应，反应2小时。之后用气相色谱法检测反应体系内的丙烯腈和丙烯酰胺的含量。结果发现反应体系内已无丙烯腈残留，全部转化为丙烯酰胺。
实施例3  基因工程菌催化丁腈生成丁酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入7.0g丁腈，35℃下进行水合反应，反应2小时。之后用气相色谱法检测反应体系内的丁腈和丁酰胺的含量。结果发现反应体系内已无丁腈残留，全部转化为丁酰胺。
实施例4  基因工程菌催化甲基丙烯腈生成甲基丙烯酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入3.0g甲基丙烯腈，30℃下进行水合反应，反应2小时。之后用气相色谱法检测反应体系内的甲基丙烯腈和甲基丙烯酰胺的含量。结果发现反应体系内已无甲基丙烯腈残留，全部转化为甲基丙烯酰胺。
实施例5  基因工程菌催化3-氰基吡啶生成烟酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入5.0g 3-氰基吡啶，35℃下进行水合反应，反应2小时。之后用高效液相色谱法检测反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶残留，全部转化为烟酰胺。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为C18柱(5μm，4.6×150mm)。
实施例6  基因工程菌催化苯甲腈生成苯甲酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入3.5g苯甲腈，35℃下进行水合反应，反应2小时。之后用高效液相色谱法检测反应体系内的苯甲腈和苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯甲腈残留，全部转化为苯甲酰胺。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为C18柱(5μm，4.6×150mm)。
实施例7  基因工程菌催化苯乙腈生成苯乙酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入3.0g苯乙腈，35℃下进行水合反应，反应2小时。之后用高效液相色谱法检测反应体系内的苯乙腈和苯乙酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯乙腈残留，全部转化为苯乙酰胺。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为C18柱(5μm，4.6×150mm)。
实施例8  基因工程菌催化α-甲基苯乙腈生成α-甲基苯乙酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入2.5g α-甲基苯乙腈，35℃下进行水合反应，反应30min。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的α-甲基苯乙腈和α-甲基苯乙酰胺的含量及其光学纯度。结果发现基因工程菌在催化外消旋α-甲基苯乙腈时，表现出S-异构体立体选择性。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为AY-RH手性柱(5μm，4.6×150mm，CHIRALPAK)。
实施例9  基因工程菌催化2，2-二甲基环丙腈生成2，2-二甲基环丙酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入1.5g 2，2-二甲基环丙腈，35℃下进行水合反应，反应30min。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的2，2-二甲基环丙腈和2，2-二甲基环丙酰胺的含量及其光学纯度。结果发现基因工程菌在催化外消旋2，2-二甲基环丙腈时，表现出S-异构体立体选择性。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为AY-RH手性柱(5μm，4.6×150mm，CHIRALPAK)。
实施例10  基因工程菌催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺
取25ml实施例1工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK的静息细胞悬液。向重悬液中加入1.0g 2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈，35℃下进行水合反应，反应30min。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈和2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺的含量及其光学纯度。结果发现基因工程菌在催化外消旋2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈时，表现出S-异构体立体选择性。所用高效液相色谱仪为Agilent 1100，色谱柱为AY-RH手性柱(5μm，4.6×150mm，CHIRALPAK)。
对比例1
Fallon，R.d.(Applied Microbiology and Biotechnology，47，156-161，1997)等用恶臭假单胞菌NRRL-18668(Pseudomonas putida NRRL-18668)来催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈的水合反应。发现该野生菌含有的腈水合酶能催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈水合生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺，并表现出(S)型立体选择性，酶活力为7.1×10-3μmol/min/mg湿细胞。其最适反应温度为30℃，当温度超过30℃时酶蛋白开始快速失活。本发明的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈时，其酶活力达到40.0×10-3μmol/min/mg湿细胞。最适反应温度为35℃，在40℃以下酶蛋白表现出相当好的稳定性。
对比例2
Shun-Ichi Masutomo(Bioscience Biotechnology and Biochemistry，59(4)，720-722，1995)等用假单胞菌B21C9(pseudomonas sp.B21C9)来催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈的水合反应。发现该野生菌含有的腈水合酶能催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈水合生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺，并表现出一定的(S)型立体选择性，但是其活性较低，仅为1.8×10-4μmol/min/mg干细胞。本发明的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseK催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈时，其酶活力达到7.8×10-2μmol/min/mg干细胞。

Claims (10)

1.一种腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，其特征在于，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种编码权利要求1所述的腈水合酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，包含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的编码α亚基的序列和如SEQ ID NO.2所示的编码β亚基的序列。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
5.如权利要求2所述的基因，其特征在于，还包含编码腈水合酶激活子的序列。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，所述腈水合酶激活子的碱基序列如SEQ IDNO.3所示。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
8.一种腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种包含权利要求2～7任一所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
10.如权利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。
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