CN107881163A

CN107881163A - 一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用

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Publication number: CN107881163A
Application number: CN201710908224.6A
Authority: CN
Inventors: 杨立荣; 周海胜; 吴坚平; 徐刚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明公开了一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用，该耐热腈水合酶包括：碱基序列如SEQ ID NO.4所示的编码α亚基的基因、碱基序列如SEQ ID NO.5所示的编码β亚基的基因以及碱基序列如SEQ ID NO.6所示的编码活性元件的基因。本发明从锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans)SI859A克隆得到腈水合酶基因，该基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功进行了异源表达，获得具有高表达量和高活性的腈水合酶，比活达到了404.5U/mg蛋白，该腈水合酶对芳香族腈化合物和脂肪族腈化合物均有较高的催化活力，是一种底物谱广、热稳定性高、极具工业应用潜力的腈水合酶。

Description

一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

背景技术

腈是一类重要的前体化合物，经水合反应合成酰胺及其衍生物，在化学合成中处于及其重要的地位。传统氰基的水合反应需要强酸、强碱和高温等苛刻的反应条件，势必产生大量废液，对环境造成了严重的污染。

与传统化学水解法比较，生物转化法具有条件温和、反应高效、环境友好，且能实现化学、区域和对映体选择性等优点。腈水合酶(Nitrile hydratase,EC 4.2.1.84)催化腈类化合物(-CN)生成相应的酰胺(CONH₂)，被应用于化学品的工业催化生产中，对传统化学合成工艺的绿色化学改造有着重要的意义。

在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号ZL88106735的专利文献公开了一种野生玫瑰色红球菌J1；专利号为ZL86100062的专利文献公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利文献公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。

采用野生微生物是生产丙烯酰胺、烟酰胺的重要方法。然而，野生菌株的腈水合酶存在活力稳定性较差，对底物和产物的耐受性不高，产品质量不够稳定等问题。而且，在腈水合酶的基因簇中往往同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标产物的纯度和实际产率，增加酰胺分离纯化的难度和生产成本。

随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建表达外源腈水合酶的基因工程菌株，不仅可以提高腈水合酶在细胞内的表达量，从源头上阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量。锰氧化细菌在海洋锰循环中起着举足轻重的作用，目前的研究和应用主要集中于促进高锰污水处理方面，而对锰氧化细菌中腈水解酶类的发现和应用还未见报道。

另一方面，在生物催化反应中，温度是一个非常关键的因素。这不仅影响催化剂的活力和稳定性，而且还直接决定了反应液中各种物质的溶解度、反应速率，以及反应介质的粘度等。因此，提高催化剂酶蛋白的热稳定性显得尤为重要。目前，除了上述已经工业化应用的三种腈水合酶，已报道的大部分腈水合酶都表现出了热不稳定性。如30℃条件下，来源于Rhodococcus sp.R312和P.chlororaphis B23(Prasad S.Bhalla T.C.Nitrilehydratases(NHases):At the interface of academia and industry[J].Biotechnol.Adv.2010,28:725-741.)的腈水合酶保持10min则完全失活。热稳定差也是限制腈水合酶大规模应用的因素之一。

发明内容

本发明提供了一种腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用，该腈水合酶具有活力高、底物谱广、热稳定性好和适合工业化应用的特点。

本发明提供了一种耐热腈水合酶，包括：碱基序列如SEQ ID NO.4所示的编码α亚基的基因、碱基序列如SEQ ID NO.5所示的编码β亚基的基因以及碱基序列如SEQ ID NO.6所示的编码活化元件的基因。

上述耐热腈水合酶属于多亚基酶蛋白，其中的α亚基、β亚基和活化元件均克隆自锰氧化橙单锰胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A。α亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

所述的活化元件存在于锰氧化橙单锰胞菌的腈水合酶基因簇中。该活性元件基因表达后是一种激活蛋白，该激活蛋白质能够在腈水合酶的表达和组装过程中发挥作用，确保腈水合酶的正确表达，从而获得高活力的腈水合酶。本发明活化元件表达的激活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步地，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明从锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A克隆得到腈水合酶基因，该基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功进行了异源表达，获得具有高表达量和高活性的腈水合酶，比活达到了404.5U/mg蛋白，该腈水合酶对芳香族腈化合物和脂肪族腈化合物均有较高的催化活力，是一种底物谱广、热稳定性高、极具工业应用潜力的腈水合酶。

本发明还提供了一种编码所述腈水合酶的基因的表达盒、重组载体和转化子。

本发明所述的载体可以是pET-30a(+)，pET-21a(+)，pET-22b(+)，pET-28a(+)，pETDuet-1，但不仅限于所述的这些载体。较佳的是将SEQ ID NO.4所示腈水合酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上，形成重组表达载体pENHase-1229。

本发明所采用的宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)菌株。将上述重组表达载体pENHase-1229转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，其中含有pENHase-1229重组质粒的菌株，即为基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pENHase-1229。此菌株可在常规的IPTG诱导条件下表达腈水合酶蛋白。该基因工程菌的液体培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH为7.0。培养工程菌的温度为18～37℃，转速为180～220rpm。

本发明提供了一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为如权利要求1或2所述的耐热腈水合酶基因。

本发明还提供了所述的工程菌在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

具体地，所述腈化合物为丙烯腈、3-羟基丙腈、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈和苯乙腈中的一种。

本发明还提供一种利用耐热腈水合酶催化腈化合物水合反应生成酰胺的方法，包括：

(1)制备所述的工程菌；

(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；

(3)将静息细胞悬液与底物、腈化合物混合，反应制得产物。

作为优选，所述反应的温度为20～40℃，反应液的pH值为6.0～9.0。

作为优选，所述静息细胞悬液的制备方法包括：将所述工程菌活化后，扩大培养至OD₆₀₀达到0.6～1.2，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明从锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、热稳定性高的腈水合酶。

(2)现有腈水合酶一般对脂肪族腈化合物有较高活力，对芳香族的腈化合物一般活力很低。本发明所述的腈水合酶对芳香族腈化合物和脂肪族腈化合物均有较高的催化活力。

附图说明

图1为实施例1中腈水合酶基因的PCR扩增电泳图；

M：核酸Marker；1：腈水合酶的PCR扩增产物。

图2为实施例2中重组质粒pENHase-1229的图谱。

图3为实施例3中基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pENHase-1229诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图；

M：低分子量标准蛋白质；1：基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pENHase-1229诱导菌体破胞上清液；2：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229表达经过纯化后的耐热重组腈水合酶，箭头指示重组腈水合酶1229(NHase-1229)的位置。

图4为实施例4中重组腈水合酶的热稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。

实施例中的材料与方法如下：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》。

本发明实施例中所使用的限制性内切酶BamHI、HindIII和T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET-28a(+)购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白质、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

本发明采用的锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A购自美国标准生物品保藏中心(American Type Culture Collection)，编号为ATCC BAA-1229。

腈水合酶酶活采用标准反应体系进行测定，反应体系为0.5mL，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)含100mM 3-氰基吡啶，添加适量细胞悬液起始反应。25℃振荡反应2min，立即添加0.5mL纯乙腈终止反应，12000×g离心1min，上清液采用高效液相色谱法(HPLC)测定体系中所生成的烟酰胺量。

腈水合酶活力定义：1单位(U)为在25℃条件下1min催化形成1μmol烟酰胺所需要的酶量。

实施例1耐热腈水合酶1229基因的克隆

采用细菌基因组提取试剂盒提取锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229的基因组。再根据锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.7)设计引物Ama_Alpha F和Ama_Act R，以锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组为模板，PCR扩增全长腈水合酶基因。在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点BamHI、HindIII(下划线所示)。

PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带。用DNA回收纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照该试剂盒说明书。

当以Ama_Alpha F和Ama_Beta R为引物进行PCR时，得到腈水合酶结构基因(SEQID NO.4和SEQ ID NO.5)，约1400bp。以Ama_Alpha F和Ama_Act R为引物时，PCR得到腈水合酶以及活化元件基因的大小约为1700bp的基因片段(SEQ ID NO.7)，如图1所示。活化元件基因的序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2重组耐热腈水合酶表达质粒和基因工程菌的构建

为了实现耐热腈水合酶1229基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内的高效功能表达，选择优化后的含有T7启动子的pET28a(+)作为表达载体。将载体pET28a(+)和全长腈水合酶基因经BamHI和HindIII双酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒进行酶切产物的回收。

双酶切体系和反应条件：

基因或质粒 20μl；

BamHI酶 2μl；

HindIII酶 2μl；

加双蒸水至40 μl；

37℃保温 3h。

采用核酸电泳初步确定两者的浓度，以基因/质粒(mol/mol,2:1)进行混合，加入T4DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pENHase-1229(示意图如图2所示)。然后，将重组质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pENHase-1229及重组菌株的正确性，最终获得耐热腈水合酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229。

实施例3基因工程E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的腈水合酶1229表达和纯化

将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229甘油保藏菌种接于5mL含50μg/mlKan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h。取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD600)达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h。在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞，用磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。在冰浴中，采用超声破碎仪破碎细胞，在5000～10000×g条件下离心5～30min，收集细胞破碎上清液，细胞破碎上清液以0.5～2.0mL/min的流速经过镍(Ni^-)柱，再由磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0，含250mM咪唑)进行洗脱，收集目标蛋白。Ni柱纯化后的蛋白比活为404.5U/mg蛋白。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的表达和纯化采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图3所示。

实施例4腈水合酶1229的热稳定性测定

将重组酶NHase-1229溶液(50mM磷酸缓冲液，pH8.0，蛋白浓度为1mg/ml)分别于30，40，50和60℃条件下保存不同的时间，采用标准方法测定腈水合酶的残余活力，确定重组酶的热稳定性。

在30～60℃范围内，考察重组NHase-1229的热稳定性，如图4所示，重组NHase-1229在30，40，50和60℃条件下的半衰期分别为：48h，18h，1.5h和15min。

实施例5基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化丙烯腈生成丙烯酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.12g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞悬液。向重悬液中加入终浓度1.0mol/L的丙烯腈，25℃下进行反应，反应25min。采用HPLC法检测反应体系内的丙烯腈和丙烯酰胺的含量。结果发现反应体系内已无丙烯腈的残留，其转化率为100％，丙烯酰胺的得率＞99％。

实施例6基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化3-羟基丙腈生成3-羟基丙烯酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.01g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞悬液。向重悬液中加入终浓度1.0mol/L的3-羟基丙腈，25℃下进行反应，反应15min。采用HPLC法检测反应体系内的3-羟基丙腈和3-羟基丙烯酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-羟基丙腈的残留，其转化率为100％，3-羟基丙烯酰胺的得率＞99％。

实施例7基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化3-氰基吡啶生成烟酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.21g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞悬液。向重悬液中加入终浓度0.9mol/L缓冲液的3-氰基吡啶，25℃下进行反应，反应0.5小时。采用HPLC法检测反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶的残留，其转化率为100％，烟酰胺的得率＞99％。

实施例8基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化4-氰基吡啶生成异烟酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.15g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.8mol/L的4-氰基吡啶，25℃下进行反应，反应1.0小时。采用HPLC法检测反应体系内的4-氰基吡啶和异烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无4-氰基吡啶残留，转化率为100％，异烟酰胺得率＞99％。

实施例9基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化苯甲腈生成苯甲酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.25g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入0.5mol/L苯甲腈，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的苯甲腈和苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯甲腈残留，转化率为100％，本甲酰胺的得率＞99％。

实施例10基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化3-甲基苯甲腈生成3-甲基苯甲酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.26g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.5mol/L的3-甲基苯甲腈，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的3-甲基苯甲腈和3-甲基苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-甲基苯甲腈残留，转化率为100％，3-甲基苯甲酰胺得率＞99％。

实施例11基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229催化苯乙腈生成苯乙酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.18g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.5mol缓冲液的苯乙腈，25℃下进行反应，反应1.0小时。采用HPLC法检测反应体系内的苯乙腈和苯乙酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯乙腈残留，转化率为100％，苯乙酰胺得率＞99％。

对比例1来源于锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229腈水合酶的结构基因的(不含活化元件)表达菌种构建及催化3-氰基吡啶生成烟酰胺

将实施例1中PCR扩增得到的不含活化元件的1400bp基因片段用DNA纯化试剂盒纯化回收，并将目标基因片段连接到表达质粒pET-28a(+)上，获得重组质粒，将重组质粒转化E.coli感受态细胞，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a_nh08αβ。具体方法与实施例1一致。

将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a_nh08αβ接种于5mL LB培养基中，当培养液的OD600达到0.6时，添加0.1mM IPTG，再将摇瓶转移至18℃摇床中，继续培养14h，诱导重组腈水合酶表达。培养结束后获得基因工程菌细胞，按实施例7中的做法，催化3-氰基吡啶，反应24小时没有检测到烟酰胺的产生。

对比例2

余越春等(Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略.工业微生物,2014,44(2):14-19.)将红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源腈水合酶在E.coli BL21(DE3)中过量表达。通过培养条件优化，得到最佳表达条件为：37℃培养菌体浓度(OD600)到1.0时，加入终浓度为0.1g/L的CoCl2·6H20，0.6mmol/L的IPTG，然后在24℃下诱导表达24h。采用Strep-tag/Strep-Tactin亲和层析纯化重组腈水合酶，最终得到的重组腈水合酶的活性为(109.9±5.5)U/mg。

对比例3

Petrillo K.L.(Over-expression in Escherichia coli of a thermallystable and region-selective nitrile hydratase from Comamonas testosterone 5-MGAM-4D[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,67:664-670.)等将来源于野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(Comamonas testosterone 5-MGAM-4D)的腈水合酶通过大肠杆菌基因工程菌进行重组表达，测定了重组酶的稳定性，在50℃下保温60min，剩余酶活83％。

本发明提供的腈水合酶半衰期(酶活剩余50％的时间)也有1.5小时，与已经工业化的源于野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D(Comamonas testosterone 5-MGAM-4D)的腈水合酶的热稳定性相当，说明本发明提供的腈水合酶明显的工业化潜力。

对比例4

Wieser M.(FEMS Microbiology Letters,169:17-22,1998)等分离和纯化了来源于野生菌Rhodococcus rhodochrous J1的两种腈水合酶：低分子量和高分子量腈水合酶。

这两种腈水合酶对芳香腈显示出很高的催化活力，如苯甲腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶和4-氰基吡啶；对脂肪腈的催化活力却要低很多。而且，由于在野生菌细胞中含有酰胺酶基因，可以进一步将酰胺转化为羧酸，降低了目标产物的纯度和得率。本发明提供的腈水合酶对芳香腈和脂肪腈均有很高的催化活力，显示出极高的应用价值。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种耐热腈水合酶、工程菌及其在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgggatccat gacgggatcg cacggcag 28

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccaagcttt caggcgtgcg caagatagg 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttt cagtcgtgtg ggttcggcag g 31

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 4

atgacgggat cgcacggcag ggacggtgat caccacggcc atcaccacga ccgtgatcac 60

gacaaccatc tcgacccgat gaccgcgcgg gtcatggcgc tggagacgat cctcaccgaa 120

aagggcatgg tcgacccgga cgccctcgac gccatcatcg acacctacga gaccaaggtc 180

gggccgcgca acggcgccag cgtcgtcgcc aaggcctgga gcgacccgga ctacgccgac 240

tggctggcgc gcgacgcaac cgccgccatt gcctcgcttg gcttcaccgg ccgccagggc 300

gagcacatgc aggcggtgtt caacaccccg gagcgccaca acctcgtcgt ctgcaccctg 360

tgctcctgct atccgtggtc agtgctcggc ctgccgccgg tctggtacaa gtcgccgccc 420

tatcgctcgc gcgccgtctc cgatccgcgc ggcgtcctgc gcgaattcgg cgtcgcgctg 480

ccggacggcg tctcggtgcg agtctgggac tccaccgccg agctgcgcta cctcgtcgtg 540

cccgagcgcc cggcgggtac cgagggactg tccgaggcgg cgctggcggc gctcgtcacc 600

cgcaagtcca tgatcggtac cgagcgtgac ctgagcccgc atgccgcgcc ggagacggcg 660

gcatga 666

<210> 5

<211> 663

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 5

atgaacggcc cccacgatct cggcggtcgg cacggcttcg ggccgatcgc gccgaaggca 60

gacgagccgc tgttccatgc gccctgggag cgccgcgccc tcgccctgac gctcgccgcc 120

ggtgcgatgg gccattggtc gatcgacgaa agccgcgccg cccgtgagga tcgccacccg 180

gccgactatt acggttcgtc ctattacgag atctggacca agggccttga gacgctgctc 240

ctgcgccacg gcctcatcag ccatcgcgaa ttgcgcgccg ggcggcccct cgacctgacc 300

gtgccgccga accgcatcct gaaggccgat gccgtcgcgc cggcccttgc caagggcagt 360

ccggccaacc gcgatcccga aggcagcacg cccgttttcg cgccgggcga cagggtccgc 420

acgctgaacc tgcagccgcg ccatcacatc cgcctgcccg cctatgcccg cgagaaggcc 480

ggcaccatcg aaaccgttca gggtttccat gtcttcgcgg atgccagcgc caagggcgac 540

gaccatgtcg cgcactggct ctacacggtg gtcttcgacg cattcacgct gtggggcggc 600

gacgcttcgc ccaacgacac cgtctccatc gatgcctggg agccctatct tgcgcacgcc 660

tga 663

<210> 6

<211> 408

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 6

atgcctggga gccctatctt gcgcacgcct gagaccggca tcgccgcatc gcccggcctg 60

ccacgcgatg cggcgggtga acccgtcttc ttcgcgccct ggcaggccaa ggccttcgcc 120

atgaccgtcg cgctgaacga gcgcggcatc cttgcctgga ccgactgggc tgccgcgctc 180

ggccgcgcct gcgccagcct gcccgccgcc ggcccctcgc ccgaagcaac agcggatgcc 240

tatttcaccg catggctcgt cgcgctcgaa gaaatcctca cggcacgggc gctggtaagc 300

gccaatgccg tcgacgcggc gcaggccgtc tggcaccgcg ccgccgaggc cacgccccac 360

ggcacgccga tccgcttcga ggccggcctg ccgaacccac acgactga 408

<210> 7

<211> 1701

<212> DNA

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 7

atgacgggat cgcacggcag ggacggtgat caccacggcc atcaccacga ccgtgatcac 60

gacaaccatc tcgacccgat gaccgcgcgg gtcatggcgc tggagacgat cctcaccgaa 120

aagggcatgg tcgacccgga cgccctcgac gccatcatcg acacctacga gaccaaggtc 180

gggccgcgca acggcgccag cgtcgtcgcc aaggcctgga gcgacccgga ctacgccgac 240

tggctggcgc gcgacgcaac cgccgccatt gcctcgcttg gcttcaccgg ccgccagggc 300

gagcacatgc aggcggtgtt caacaccccg gagcgccaca acctcgtcgt ctgcaccctg 360

tgctcctgct atccgtggtc agtgctcggc ctgccgccgg tctggtacaa gtcgccgccc 420

tatcgctcgc gcgccgtctc cgatccgcgc ggcgtcctgc gcgaattcgg cgtcgcgctg 480

ccggacggcg tctcggtgcg agtctgggac tccaccgccg agctgcgcta cctcgtcgtg 540

cccgagcgcc cggcgggtac cgagggactg tccgaggcgg cgctggcggc gctcgtcacc 600

cgcaagtcca tgatcggtac cgagcgtgac ctgagcccgc atgccgcgcc ggagacggcg 660

gcatgaacgg cccccacgat ctcggcggtc ggcacggctt cgggccgatc gcgccgaagg 720

cagacgagcc gctgttccat gcgccctggg agcgccgcgc cctcgccctg acgctcgcgc 780

cggtgcgatg ggccattggt cgatcgacga aagccgcgcc gcccgtgagg atcgccaccc 840

ggccgactat tacggttcgt cctattacga gatctggacc caagggcctt gagacgctgc 900

tcgtgcgcca cggcctcatc agccatcgcg aattgcgcgc cgggcggccc ctcgacctga 960

ccgtgccgcc gaaccgcatc gtgaaggccg atgccgtcgc gccggccctt gccaagggca 1020

gtccggccaa ccgcgatccc gaaggcagca cgcccgtttt cgcgccgggc gacagggtcc 1080

gcacgctgaa cctgcagccg cgccatcaca tccgcctgcc cgcctatgcc cgcgagaagg 1140

ccggcaccat cgaaaccgtt cagggtttcc atgtcttcgc ggatgccagc gccaagggcg 1200

acgaccatgt cgcgcactgg ctctacacgg tggtcttcga cgcattcacg ctgtggggcg 1260

gcgacgcttc gcccaacgac accgtctcca tcgatgcctg ggagccctat cttgcgcacg 1320

cctgagaccg gcatcgccgc atcgcccggc ctgccacgcg atgcggcggg tgaacccgtc 1380

ttcttcgcgc cctggcaggc caaggccttc gccatgaccg tcgcgctgaa cgagcgcggc 1440

atccttgcct ggaccgactg ggctgccgcg ctcggccgcg cctgcgccag cctgcccgcc 1500

gccggcccct cgcccgaagc aacagcggat gcctatttca ccgcatggct cgtcgcgctc 1560

gaagaaatcc tcacggcacg ggcgctggta agcgccaatg ccgtcgacgc ggcgcaggcc 1620

gtctggcacc gcgccgccga ggccacgccc cacggcacgc cgatccgctt cgaggccggc 1680

ctgccgaacc cacacgactg a 1701

<210> 8

<211> 221

<212> PRT

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 8

Met Thr Gly Ser His Gly Arg Asp Gly Asp His His Gly His His His

1 5 10 15

Asp Arg Asp His Asp Asn His Leu Asp Pro Met Thr Ala Arg Val Met

20 25 30

Ala Leu Glu Thr Ile Leu Thr Glu Lys Gly Met Val Asp Pro Asp Ala

35 40 45

Leu Asp Ala Ile Ile Asp Thr Tyr Glu Thr Lys Val Gly Pro Arg Asn

50 55 60

Gly Ala Ser Val Val Ala Lys Ala Trp Ser Asp Pro Asp Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Trp Leu Ala Arg Asp Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Thr

85 90 95

Gly Arg Gln Gly Glu His Met Gln Ala Val Phe Asn Thr Pro Glu Arg

100 105 110

His Asn Leu Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Ser Val

115 120 125

Leu Gly Leu Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Pro Pro Tyr Arg Ser Arg

130 135 140

Ala Val Ser Asp Pro Arg Gly Val Leu Arg Glu Phe Gly Val Ala Leu

145 150 155 160

Pro Asp Gly Val Ser Val Arg Val Trp Asp Ser Thr Ala Glu Leu Arg

165 170 175

Tyr Leu Val Val Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Leu Ser Glu

180 185 190

Ala Ala Leu Ala Ala Leu Val Thr Arg Lys Ser Met Ile Gly Thr Glu

195 200 205

Arg Asp Leu Ser Pro His Ala Ala Pro Glu Thr Ala Ala

210 215 220

<210> 9

<211> 220

<212> PRT

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 9

Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Arg His Gly Phe Gly Pro Ile

1 5 10 15

Ala Pro Lys Ala Asp Glu Pro Leu Phe His Ala Pro Trp Glu Arg Arg

20 25 30

Ala Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Gly Ala Met Gly His Trp Ser Ile

35 40 45

Asp Glu Ser Arg Ala Ala Arg Glu Asp Arg His Pro Ala Asp Tyr Tyr

50 55 60

Gly Ser Ser Tyr Tyr Glu Ile Trp Thr Lys Gly Leu Glu Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Arg His Gly Leu Ile Ser His Arg Glu Leu Arg Ala Gly Arg Pro

85 90 95

Leu Asp Leu Thr Val Pro Pro Asn Arg Ile Leu Lys Ala Asp Ala Val

100 105 110

Ala Pro Ala Leu Ala Lys Gly Ser Pro Ala Asn Arg Asp Pro Glu Gly

115 120 125

Ser Thr Pro Val Phe Ala Pro Gly Asp Arg Val Arg Thr Leu Asn Leu

130 135 140

Gln Pro Arg His His Ile Arg Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Glu Lys Ala

145 150 155 160

Gly Thr Ile Glu Thr Val Gln Gly Phe His Val Phe Ala Asp Ala Ser

165 170 175

Ala Lys Gly Asp Asp His Val Ala His Trp Leu Tyr Thr Val Val Phe

180 185 190

Asp Ala Phe Thr Leu Trp Gly Gly Asp Ala Ser Pro Asn Asp Thr Val

195 200 205

Ser Ile Asp Ala Trp Glu Pro Tyr Leu Ala His Ala

210 215 220

<210> 10

<211> 135

<212> PRT

<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydansSI859A)

<400> 10

Met Pro Gly Ser Pro Ile Leu Arg Thr Pro Glu Thr Gly Ile Ala Ala

1 5 10 15

Ser Pro Gly Leu Pro Arg Asp Ala Ala Gly Glu Pro Val Phe Phe Ala

20 25 30

Pro Trp Gln Ala Lys Ala Phe Ala Met Thr Val Ala Leu Asn Glu Arg

35 40 45

Gly Ile Leu Ala Trp Thr Asp Trp Ala Ala Ala Leu Gly Arg Ala Cys

50 55 60

Ala Ser Leu Pro Ala Ala Gly Pro Ser Pro Glu Ala Thr Ala Asp Ala

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Ala Trp Leu Val Ala Leu Glu Glu Ile Leu Thr Ala Arg

85 90 95

Ala Leu Val Ser Ala Asn Ala Val Asp Ala Ala Gln Ala Val Trp His

100 105 110

Arg Ala Ala Glu Ala Thr Pro His Gly Thr Pro Ile Arg Phe Glu Ala

115 120 125

Gly Leu Pro Asn Pro His Asp

130 135

Claims

1.一种耐热腈水合酶，其特征在于，包括：碱基序列如SEQ ID NO.4所示的编码α亚基的基因、碱基序列如SEQ ID NO.5所示的编码β亚基的基因以及碱基序列如SEQ ID NO.6所示的编码活性元件的基因。

2.如权利要求1所述的耐热腈水合酶，其特征在于，所述腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

3.一种编码如权利要求1或2所述腈水合酶的基因的表达盒、重组载体和转化子。

4.一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为如权利要求1或2所述的耐热腈水合酶基因。

5.如权利要求4所述的工程菌在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述腈化合物为丙烯腈、3-羟基丙腈、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈和苯乙腈中的一种。

7.一种利用耐热腈水合酶催化腈化合物水合反应生成酰胺的方法，其特征在于，包括：

(1)制备如权利要求3所述的工程菌；

(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；

(3)将静息细胞悬液与底物、腈化合物混合，反应制得产物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为20～40℃，反应液的pH值为6.0～9.0。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述静息细胞悬液的制备方法包括：将所述工程菌活化后，扩大培养至OD₆₀₀达到0.6～1.2，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液。