CN104561065A

CN104561065A - 一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN104561065A
Application number: CN201410843384.3A
Authority: CN
Inventors: 裴晓林; 王秋岩; 杨立荣; 吴坚平
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在催化腈化合物生成酰胺和生物降解除草剂敌草腈中的应用，本发明实现了源自慢生型大豆根瘤菌USDA？110中假定腈水合酶基因的功能表达，证明了一种腈水合酶的活化元件在表达过程中的关键作用。同时，本发明提供了一种在大肠杆菌内构建腈水合酶基因工程菌的方法，在腈水合酶基因在活化元件的参与下获得具有高表达量和高活性的腈水合酶。

Description

一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种来自根瘤菌的耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌，以及该基因工程菌在制备酰胺化合物和降解除草剂--敌草腈中的应用。

(二)背景技术

腈化合物是一类含有氰基(-CN)的有机化合物。在化工领域，腈化合物可以作为重要的化工原料，广泛应用于化学品酰胺和羧酸及其衍生物的有机合成中。然而，采用化学法转化腈化合物通常需要强酸、强碱和高压等条件，势必对环境造成严重的污染。与化学水解法相比，生物催化法反应条件温和(常温、常压和中性pH值)，同时对环境污染的压力较小。更重要的是，由酶介导的生物催化法能实现化学、区域和对映体选择性等优点，提高其原子经济利用率。另外，腈化合物可以作为除草剂应用于农林业领域。然而，腈化合物通常具有细胞毒性，大量使用势必将在环境中大量积累，而如何从环境中去除将更加严峻。腈化合物的生物转化过程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中，腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺，而酰胺酶进一步将酰胺催化水解产生羧酸化合物；而腈水解酶可以直接将腈化合物转化为羧酸化合物。

在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌J1；专利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。目前，该领域的主要研究针对野生菌株进行筛选和培育，以达到工业生产的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标产物的纯度和实际产率。另外，已报道的腈水合酶具有稳定性差、对底物和产物的耐受性低等问题。随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建腈水合酶的基因工程菌株，不仅可以从源头阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量；而且可以采用蛋白质工程技术手段对其进行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如稳定性和底物耐受性等。同时，从基因分子水平进行分析，目前已报道的腈水合酶基因序列具有很高的同源度，如来源于Rhodococcus属的铁型腈水合酶的序列同源度大于95％。因此，开发基因序列多样性的腈水合酶基因具有较高的研究价值和应用潜力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在催化腈化合物生成酰胺和生物降解除草剂--敌草腈中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种耐热重组腈水合酶基因，所述耐热重组腈水合酶基因由SEQ IDNO.2所示α亚基(氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)、SEQ ID NO.3所示β亚基(氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和SEQ ID NO.4所示活化元件(氨基酸序列为SEQ IDNO.7所示)依次连接组成，由于在β亚基基因上游的SD序列比较弱，不利于核糖体的结合和后续的蛋白翻译，人工添加一段强SD序列，实现该亚基的高效表达，因此优选β亚基上游依次连接SEQ ID NO.8所示的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO.9所示间隔序列。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。

由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。

本发明还涉及一种由所述的耐热腈水合酶基因编码的耐热重组腈水合酶，所述耐热重组腈水合酶为SEQ ID NO.2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列、SEQ ID NO.3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO.6所示氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示活化元件基因编码的SEQ ID NO.7所示氨基酸序列依次连接构成。

本发明提供一种由所述耐热重组腈水合酶基因构建的重组载体。

本发明提供一种由所述耐热重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明还提供一种所述耐热重组腈水合酶基因在制备耐热重组腈水合酶中的应用，所述的应用为：在SEQ ID NO.3所示β亚基基因序列的上游添加SEQ ID NO.8(aaggag)所示的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO.9(atatacc)所示间隔序列，形成含SD序列和间隔序列的β亚基，将SEQ ID NO.2所示α亚基、含SD序列和间隔序列的β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接，合成含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段，将含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段与载体连接，构建含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离获得含耐热重组腈水合酶的菌体细胞。

本发明涉及一种所述的耐热重组腈水合酶在催化腈化合物(优选3-氰基吡啶)生成酰胺(优选烟酰胺)中的应用，具体所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以3-氰基吡啶为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含烟酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得烟酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液(优选22.4g/L)，所述底物的终浓度为0.2～1.0mol/L缓冲液(优选0.8mol/L)。

本发明还提供一种所述的耐热重组腈水合酶在生物降解除草剂--敌草腈中的应用，具体所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以敌草腈(2,6-二氯苯甲腈)为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含2,6-二氯苯甲酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得2,6-二氯苯甲酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液(优选25.2g/L)，所述底物的终浓度为0.05～0.5mol/L缓冲液(优选0.2mmol/L)。

本发明所述催化剂按如下方法制备：将含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程种接于含100μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h；取培养液以体积浓度5％的接种量转接至含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h，将诱导培养液离心，收集湿菌体，即获得催化剂。

本发明所述催化剂更优选按如下步骤制备：将基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05甘油保藏菌种接于5mL含100μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h；取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h，在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞(即催化剂)，用磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明实现了源自慢生型大豆根瘤菌USDA 110中假定腈水合酶基因的功能表达，证明了一种重组腈水合酶的活化元件在表达过程中的关键作用。同时，本发明提供了一种在大肠杆菌内构建重组腈水合酶基因工程菌的方法，使腈水合酶基因在活化元件的参与下获得具有高表达量和高活性的腈水合酶。

(四)附图说明

图1为本发明慢生型大豆根瘤菌USDA 110和耐热重组腈水合酶基因的PCR扩增电泳图；M：核酸Marker；1：慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组；2：耐热重组腈水合酶基因的PCR扩增产物。

图2为本发明重组质粒pET28a(+)-NH05的图谱。

图3为本发明基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图；M：低分子量标准蛋白质；1：E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)空载质粒对照菌体破碎上清液；2：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导后菌体破碎液；3：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导菌体破碎上清液；4：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导菌体破胞沉淀，箭头指示腈水合酶的位置。

图4为重组腈水合酶NH05纯化的SDS-PAGE电泳图；M：低分子量标准蛋白质；1：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导后菌体破碎上清液；2：重组腈水合酶NH05经镍柱纯化获得的纯酶液；3：重组腈水合酶蛋白粉。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

DNA聚合酶、DNA Marker、限制性内切酶(Nde I、Hind III)和T4DNA连接酶菌购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara^TM)。

细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购自康宁生命科技有限公司(Axygen^TM)。

E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和质粒pET-28a(+)购自Novagen公司；低分子量蛋白质Marker、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司。

引物合成与基因序列的测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。

LB培养基(g/L)：10蛋白胨；10氯化钠；5酵母粉，pH 7.0，溶剂为水。

实施例1：全长腈水合酶基因的克隆

采用细菌基因组提取试剂盒(AxyPrep，康宁生命科学有限公司)提取慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110(美国农业菌种保藏中心，NRRLB-4361)的基因组，核酸电泳检测如图1所示。

根据慢生型大豆根瘤菌USDA 110的基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1)设计引物NH05-Up和NH05-Down，以慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组为模板，PCR扩增全长腈水合酶基因，如图2所示。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收，获得的基因片段由SEQ ID NO.2所示α亚基(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)、SEQ ID NO.3所示β亚基(编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示)和SEQ ID NO.4所示活化元件(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示)依次连接构成。

上游引物NH05-Up(含有Nde I酶切位点)和下游引物NH05-Down(含有Hind III酶切位点)如下所示：上游引物NH05-Up：5’-ggaattccatatgcagcccatcccatggc-3’；

下游引物NH05-Down：5’-cccaagcttctacctaaaatcctccggcttcagc-3’。

PCR反应体系和PCR反应条件：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

实施例2：设计具有大肠杆菌SD序列和间隔序列的全长腈水合酶基因

为了实现腈水合酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内的可溶性功能表达，在腈水合酶β亚基因上游添加或替换大肠杆菌的SD序列(如SEQ ID NO.8所示)和间隔序列(如SEQ ID NO.9所示)。根据腈水合酶基因序列(由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4依次连接组成)设计引物Link-Up和Link-Down，以实施例1中的PCR产物为模板，通过重叠PCR法扩增获得含有大肠杆菌SD序列和间隔序列的腈水合酶基因。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收。

大肠杆菌的SD序列(SEQ ID NO.8所示)如下所示：

5’-aaggag-3’

间隔序列如下(SEQ ID NO.9所示)所示：

5’-atatacc-3’

Link-Up(含大肠杆菌的SD序列和间隔序列)和Link-Down(含大肠杆菌的SD序列和间隔序列)如下所示：

Link-Up：5’-cgtcaaggagatataccatgaacggcgtgcacgacatggg-3’

Link-Down：5’-tcatggtatatctccttgacgtcatgacggcgctcccggc-3’

PCR反应体系和PCR反应条件：

分段PCR扩增体系：

分段PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

总PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环35次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

实施例3：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH05的构建和鉴定

将质粒载体pET28a(+)和含有大肠杆菌SD序列和间隔序列的腈水合酶基因(实施例2制备)经Nel I和Hid III双酶切，两者等量混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pET28a(+)-NH05(示意图如图2所示)。然后，将重组质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET28a(+)-NH05及重组菌株的正确性。

实施例4：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH05的腈水合酶表达与纯化

将基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05甘油保藏菌种接于5mL含100μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h。取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h。

在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞，用磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。在冰浴中，采用超声破碎仪破碎细胞，在5000～10000×g条件下离心5～30min，分别收细胞破碎上清液和破碎沉淀，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图3所示。以E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)空载质粒菌体破碎上清液和基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-NH05未诱导菌体破碎上清液液为对照。

细胞破碎上清液以0.5～2.0mL/min的流速经过镍(Ni-)柱，再由磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0，含250mM咪唑)进行洗脱，收集目标蛋白进行真空干燥，得到重组腈水合酶NH05酶蛋白粉。纯化后的重组腈水合酶NH05的SDS-PAGE电泳图如图4所示。

实施例5：重组腈水合酶NH05的热稳定性

将重组腈水合酶NH05溶液(实施例4制备的重组腈水合酶NH05酶蛋白粉用50～200mM磷酸缓冲液(pH 4.0～8.0)配制成，蛋白浓度为0.1～2mg/ml)分别于30和40℃条件下保存不同的时间，采用HPLC法测定腈水合酶的残余活力，确定重组腈水合酶NH05的热稳定性。计算酶稳定性中的活力衰减公式如：N(t)＝N₀e^-λt，其中λ是衰减常数，由腈水合酶活力对数ln(N_t)为纵坐标，时间t为横坐标，线性回归后求得衰减常数λ。酶活力半衰期(t_1/2)计算公式：t_1/2＝ln2/λ。重组腈水合酶NH05在30和40℃条件的半衰期分别为26h和10h。

实施例6：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH05催化3-氰基吡啶生成烟酰胺

取100ml实施例4基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，湿菌体重量为1.12g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.4mol/L缓冲液的3-氰基吡啶，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶残留，全部转化为烟酰胺，转化率为100％，烟酰胺的得率>99％。

HPLC检测条件为：高效液相色谱仪(Agilent 110，USA)，紫外(UV)检测器，检测波长为210nm，色谱柱为Varian PURSUIT C18反向色谱柱(4.6mm×250mm)；10mM磷酸缓冲液/乙腈(90/10，v/v，pH2.8)为流动相；流速为0.5mL/min。

实施例7考察反应过程中最适的3-氰基吡啶浓度

将实施例6中3-氰基吡啶终浓度分别改为0.2mol/L，0.4mol/L，0.6mol/L，0.8mol/L和1.0mol/L，其他操作同实施例6。结果发现，当3-氰基吡啶浓度在0.2～0.8mol/L范围内，体系中已无3-氰基吡啶残留，全部转化为烟酰胺，转化率为100％，烟酰胺的得率＞99％；当3-氰基吡啶浓度为1.0mol/L时，体系中底物的转化率仅为85.4％。因此，反应中最高的3-氰基吡啶浓度为0.8mol/L。

实施例8：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH05降解敌草腈为2,6-二氯苯甲酰胺

取100ml实施例4基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05的诱导培养物，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，湿菌体重量为1.26g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.1mmol/L缓冲液的敌草腈，25℃下条件进行反应，反应时间12h。采用HPLC法检测反应体系内的敌草腈和2,6-二氯苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无敌草腈残留，全部转化为2,6-二氯苯甲酰胺，转化率为100％，2,6-二氯苯甲酰胺得率>99％。

HPLC检测条件为：高效液相色谱仪(Agilent 110，USA)，紫外(UV)检测器，检测波长为221nm，色谱柱为Varian PURSUIT C18反向色谱柱(4.6mm×250mm)；甲醇/水(60/40，v/v，1L含60μL三氟乙酸)为流动相；流速为0.5mL/min。

实施例9考察反应过程中最适的敌草腈浓度

将实施例8中3-氰基吡啶的终浓度分别改为0.05mmol/L，0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L和0.4mmol/L，其他操作同实施例8。结果发现，当敌草腈浓度在0..05～0.2mmol/L范围内，体系中已无敌草腈残留，全部转化为2,6-二氯苯甲酰胺，转化率为100％，产物的得率＞99％；当3-氰基吡啶浓度为0.3mmol/L和0.4mmol/L时，体系中底物的转化率分别仅为69.8和52.4％。因此，反应中最高的敌草腈浓度为0.2mmol/L。

实施例10：活化元件基因对重组腈水合酶NH05功能的影响

根据慢生型大豆根瘤菌USDA 110的基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1)设计下游引物NH05-β-Down，以慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组为模板，PCR扩增腈水合酶NH05的结构基因，仅包含了SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基的基因序列。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收。

上游引物NH05-Up：5’-ggaattccatatgcagcccatcccatggc-3’；

下游引物NH05-β-Down(含有Hind III酶切位点)如下所示：

下游引物NH05-β-Down：5’-cccaagctttcacgccaggtccagat-3’。

PCR反应体系和PCR反应条件：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：56℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

将质粒载体pET28a(+)和上述PCR产物经Nel I和Hid III双酶切，两者等量混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pET28a(+)-NH05-αβ(不含活化元件基因)。然后，将重组质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET28a(+)-NH05-αβ及重组菌株的正确性。

将基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05-αβ甘油保藏菌种接于5mL含100μg/mlKan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h。取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h。取100ml基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05-αβ的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，湿菌体重量为11.8g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中分别加入终浓度0.4mol/L缓冲液的3-氰基吡啶和0.1mmol/L缓冲液的敌草腈，25℃下条件进行反应，反应时间12h。采用HPLC法进行检测分析，没有检测到产物烟酰胺和2,6-二氯苯甲酰胺。据此可以确定，活化元件基因在重组腈水合酶NH05的表达过程中至关重要，直接决定其在大肠杆菌细胞中的活力。

对比例1

Zhao A.(Appl Biochem Biotechnol,53,65-73,1995)等采用马红球菌SHB-121(Rhodococcus equi SHB-121)催化3-氰基吡啶的水合反应。发现该野生菌生产的腈水合酶能催化3-氰基吡啶生产烟酰胺，然而该酶不仅催化活力低，而且热稳定性较差。在40℃条件下，该腈水合酶的稳定性仅为22min。本发明的重组腈水合酶NH05在40℃条件的半衰期达到了10h。

对比例2

Li B.(Organic Process Research&Development,15:291-293,2011)等采用大肠杆菌基因工程菌催化3-氰基吡啶制备烟酰胺，反应体系中最高的底物浓度为40g/L，采用分批补料策略在5.5h内可以催化200g/L 3-氰基吡啶完全转化为烟酰胺。本发明中采用基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH05催化3-氰基吡啶制备烟酰胺，最高底物浓度为0.8mol/L，而且在1h内完全转化为烟酰胺，转化率为100％。

Claims

1.一种耐热重组腈水合酶基因，其特征在于所述耐热重组腈水合酶基因由SEQ IDNO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接构成。

2.一种由权利要求1所述的耐热重组腈水合酶基因编码的耐热重组腈水合酶。

3.如权利要求2所述的耐热重组腈水合酶，其特征在于所述耐热重组腈水合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列、SEQ IDNO.3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO.6所示氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示活化元件基因编码的SEQ ID NO.7所示氨基酸序列依次连接构成。

4.一种由权利要求1所述耐热重组腈水合酶基因构建的重组载体。

5.一种由权利要求4所述耐热重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求2所述耐热重组腈水合酶基因在制备耐热重组腈水合酶中的应用，其特征在于所述的应用为：在SEQ ID NO.3所示β亚基基因序列的上游添加SEQ ID NO.8所示的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO.9所示间隔序列，形成含SD序列和间隔序列的β亚基，将SEQ ID NO.2所示α亚基、含SD序列和间隔序列的β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接，合成含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段，将含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段与载体连接，构建含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离获得含耐热重组腈水合酶的菌体细胞。

7.一种权利要求1所述的耐热重组腈水合酶在催化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以3-氰基吡啶为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含烟酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得烟酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液，所述底物的终浓度为0.2～1.0mol/L缓冲液。

9.一种权利要求1所述的耐热重组腈水合酶在生物降解敌草腈中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以敌草腈为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含2,6-二氯苯甲酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得2,6-二氯苯甲酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液，所述底物的终浓度为0.05～0.5mol/L缓冲液。