CN106566820A - α‑淀粉酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了α‑淀粉酶的制备方法，其能解决现有技术中通过枯草芽孢杆菌制备α‑淀粉酶后期纯化步骤繁琐、得到纯品不易的技术问题。其包括以下步骤：（2）在α‑淀粉酶基因上游添加e3 SD序列、下游添加组氨酸标签，获得改造后的α‑淀粉酶基因；（3）将改造后的α‑淀粉酶基因连接到载体pxmj19‑aph213上，获得重组表达载体pxmj19‑aph213‑amy；（4）将重组表达载体pxmj19‑aph213‑amy转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；（5）培养重组菌，分泌表达α‑淀粉酶；（6）α‑淀粉酶的纯化，包括：将含有α‑淀粉酶的上清进行亲和层析，介质为镍柱。

Description

α-淀粉酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及α-淀粉酶的制备方法。
背景技术
α-淀粉酶是一种广泛分布于动植物和微生物中，能水解淀粉、糖原等的α-1,4糖苷键，生成糊精和还原糖的一种酶，由于产物的末端残基的碳原子构型为α构型，所以称为α-淀粉酶。
枯草芽孢杆菌是当今工业酶制剂生产应用最广泛的菌种之一。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够生成α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶，并且产酶量高、安全性好。因此，部分科研单位和企业通过枯草芽孢杆菌制备α-淀粉酶，该方法虽然产量高，但纯化步骤繁琐，得到纯品不易。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了α-淀粉酶的制备方法，其能解决现有技术中通过枯草芽孢杆菌制备α-淀粉酶后期纯化步骤繁琐、得到纯品不易的技术问题。
其技术方案是这样的，其包括以下步骤：
（1）获取枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
（2）在所述α-淀粉酶基因上游添加e3 SD序列、下游添加组氨酸标签，获得改造后的α-淀粉酶基因，所述e3 SD序列如SEQ ID NO：2所示；
（3）将所述改造后的α-淀粉酶基因连接到载体pxmj19-aph213上，获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy，所述载体pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
（4）将所述重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；
（5）培养所述重组菌，分泌表达α-淀粉酶；
（6）α-淀粉酶的纯化，包括：
a、将重组菌的培养物进行离心，获得含有α-淀粉酶的上清；
b、将所述含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析，介质为镍柱，获得含有α-淀粉酶的洗脱液；
c、将所述含有α-淀粉酶的洗脱液进行脱盐，获得纯化的α-淀粉酶溶液。
进一步的，步骤（6）中，亲和层析中用于平衡、上样的缓冲液A为：300mM NaCl，20mMTris，pH8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B为：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。
进一步的，步骤（6）中，所述脱盐的介质为脱盐柱，优选为加莱克G25脱盐柱。
本发明的上述制备方法，其有益效果在于：（1）谷氨酸棒杆菌不产内毒素，安全性好；（2）本发明中的α-淀粉酶基因选自枯草芽孢杆菌，本身带有信号肽，在表达过程中产生的α-淀粉酶能够分泌到胞外，同时谷氨酸棒杆菌自身分泌到胞外的蛋白较少、无胞外蛋白酶，进而使得α-淀粉酶的纯化操作简便，而且α-淀粉酶在培养基中较为稳定；（3）α-淀粉酶的末端加有组氨酸标签，只需一步亲和层析纯化便可以得到较纯的α-淀粉酶，相对于从枯草芽孢杆菌培养物上清中纯化α-淀粉酶较为简单。
附图说明
图1为载体pxmj19-aph213的结构图。
图2为α-淀粉酶的SDS-PAGE电泳图，图中泳道1为蛋白Marker，泳道2为谷氨酸棒杆菌上清，泳道3为含有α-淀粉酶的上清经过镍柱纯化后未被吸附的流串液，泳道4为含有α-淀粉酶的上清，泳道5为纯化的α-淀粉酶溶液。
具体实施方式
枯草芽孢杆菌168（以下简称枯草芽孢杆菌）、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（以下简称谷氨酸棒杆菌）和大肠杆菌DH5α（以下简称大肠杆菌）均购自中国高校工业微生物资源数据平台；载体pxmj-19购自普如汀生物技术（北京）有限公司；
质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen，XhoI和HindIII内切酶、T4连接酶购自Thermo；镍柱为1ml His-Tag，购自Roche；脱盐柱为G25脱盐柱，购自加莱克。
实验例1 α-淀粉酶的制备。
（1）载体pxmj19-aph213的制备。
载体pxmj19-aph213的结构如图1所示，其构建过程如下：
以引物aph213F和aph213R从载体xk99e载体上扩增出aph213基因，所用的引物如下：
aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac
aph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg
PCR条件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。
上述引物的设计使得aph213基因扩增过程中，在aph213基因上游形成EcoRV切点、下游形成HindIII 切点，aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；回收PCR产物并以EcoRV和HindIII酶切，通过T4DNA连接酶，连接到同样经过EcoRV和HindIII酶切的载体pxmj-19上，获得载体pxmj19-aph213。
载体pxmj19-aph213的扩增过程如下：
a、在50ml离心管中加入3ml的LB培养基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；
b、挑取带有载体pxmj19-aph213的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中，在37℃，230rpm的条件下培养12h，以扩增pxmj19-aph213质粒；
c、根据质粒提取试剂盒的说明书提取pxmj19-aph213质粒。
（2）枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因的扩增与改造。
以引物AmyF和AmyR从枯草芽孢杆菌的基因组上扩增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：
AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；
AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；
PCR条件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃7min。
上述引物的设计使得α-淀粉酶基因扩增过程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成组氨酸标签，上游酶切位点为HindIII，下游酶切位点为XhoI，α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，e3 SD序列如SEQ ID NO：2所示；
（3）构建重组载体。
回收PCR产物并用XhoI和HindIII酶切，通过T4DNA连接酶，连接到同样经过XhoI和HindIII酶切的载体pxmj19-aph213上，获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy，载体pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
（4）构建重组菌。
将重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入大肠杆菌中进行预扩增，培养基为LB培养基，氯霉素浓度为50ug/ml；提取后，用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中，在LBHIS恢复培养基中30℃培养，氯霉素浓度为30ug/ml。
（5）培养重组菌，分泌表达α-淀粉酶。
将长出的转化子转接到装有50ml培养基的250ml的三角瓶中进行培养，培养基为BHI培养基，培养条件为30℃，230rpm，48h。
（6）α-淀粉酶的纯化。
a、将重组菌的培养物进行离心，12000rpm、4℃、5min，获得含有α-淀粉酶的上清。
b、将含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析，首先用缓冲液A平衡镍柱，将含有α-淀粉酶的上清过滤并上样至平衡后的镍柱，继续用缓冲液A平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积；用100mmol的B液洗脱，收集洗脱的洗脱液，每管收集0.5ml；
缓冲液A为：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的缓冲液，缓冲液B为：300mM NaCl，250mM咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。
c、对含有α-淀粉酶的洗脱液通过脱盐柱进行脱盐，获得纯化的α-淀粉酶溶液，-20℃保存；
脱盐用的缓冲液为50mM的PBS缓冲液，pH为7.0。
实施例2 α-淀粉酶的鉴定。
（1）SDS-PAGE鉴定。
离心发酵液，取10ul的上清进行SDS-PAGE，以检测蛋白的条带大小及纯化的纯度，结果如图2所示，结果显示相对于空载体，带有重组α-淀粉酶载体的上清条带会多出一条约68kD的条带，且纯化结果也会有单一的条带，如图2所示，泳道5为纯化的α-淀粉酶，泳道1为蛋白Marker，泳道2为谷氨酸棒杆菌上清，泳道3为含有α-淀粉酶的上清经过镍柱纯化后未被吸附的流串液，泳道4为含有α-淀粉酶的上清。
（2）DNS法鉴定。
实验组在250ul PH5.0的柠檬酸磷酸氢二钠的缓冲液中加入50ul酶液，在60℃条件下孵育10min，加入450ul的DNS后煮沸7min，冷却后取200ul的混合液加入到3.8ml的双蒸水中混匀，对照组是在加入450ul的DNS后再加入50ul上清，其余和实验组相同，在540nm的条件下测吸光度。测得的结果为谷氨酸棒杆菌的α-淀粉酶活性为4.9U，带有空载体的谷氨酸棒杆菌α-淀粉酶活性为6.3U，带有重组表达载体的谷氨酸棒杆菌α-淀粉酶活性为17.4U，纯化后的α-淀粉酶活性为68.1U。
上述实验（1）（2）鉴定结果表面通过本发明的上述制备方法能够成功制备具有活性的α-淀粉酶。

Claims (3)

1.α-淀粉酶的制备方法，其包括以下步骤：
（1）获取枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
（2）在所述α-淀粉酶基因上游添加e3 SD序列、下游添加组氨酸标签，获得改造后的α-淀粉酶基因，所述e3 SD序列如SEQ ID NO：2所示；
（3）将所述改造后的α-淀粉酶基因连接到载体pxmj19-aph213上，获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy，所述载体pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
（4）将所述重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；
（5）培养所述重组菌，分泌表达α-淀粉酶；
（6）α-淀粉酶的纯化，包括：
a、将重组菌的培养物进行离心，获得含有α-淀粉酶的上清；
b、将所述含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析，介质为镍柱，获得含有α-淀粉酶的洗脱液；
c、将所述含有α-淀粉酶的洗脱液进行脱盐，获得纯化的α-淀粉酶溶液。
2.根据权利要求1所述的α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，亲和层析中用于平衡、上样的缓冲液A为：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B为：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的缓冲液。
3.根据权利要求1所述的α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，所述脱盐的介质为脱盐柱。
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