CN104561064A

CN104561064A - 一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用

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Publication number: CN104561064A
Application number: CN201410843293.XA
Authority: CN
Inventors: 裴晓林; 王秋岩; 杨立荣; 吴坚平
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104561064B

Abstract

本发明公开了一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用，所述重组腈水合酶基因由SEQ？ID？NO.2所示α亚基、SEQ？ID？NO.3所示β亚基和SEQ？ID？NO.4所示活化元件依次连接构成；本发明实现了源自亚硫酸杆菌E-36中假定腈水合酶基因在大肠杆菌细胞中的功能表达，提供了一种高效表达该酶的基因工程菌，可以高效转化芳香腈生产相应酰胺化合物。

Description

一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种高效水合芳香腈的腈水合酶基因和一种高效表达该重组酶的基因工程菌的构建，以及该基因工程菌在制备酰胺化合物中的应用。

(二)背景技术

腈化合物是一类含有氰基(-CN)的有机化合物。在化工领域，腈化合物可以作为重要的化工原料及中间体，广泛应用于化学品酰胺和羧酸及其衍生物的有机合成中。然而，采用化学法转化腈化合物通常需要强酸、强碱和高压等条件，势必对环境造成严重的污染。与化学水解法相比，生物催化法反应条件温和(常温、常压和中性pH值)，同时对环境污染的压力较小。更重要的是，由酶介导的生物催化法能实现化学、区域和对映体选择性等优点，提高其原子经济利用率。腈化合物的生物转化过程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中，腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺，而酰胺酶进一步将酰胺催化水解产生羧酸化合物；而腈水解酶可以直接将腈化合物转化为羧酸化合物。

在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌J1；专利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。目前，该领域的主要研究针对野生菌株进行筛选和培育，以达到工业生产的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标产物的纯度和实际产率。另外，已报道的腈水合酶具有稳定性差、对底物和产物的耐受性低等问题。随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建腈水合酶的基因工程菌株，不仅可以从源头阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量；而且可以采用蛋白质工程技术手段对其进行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如稳定性和底物耐受性等。同时，腈水合酶一般具有很强的底物特异性，往往对体积较大的芳香腈表现出很低的活力，限制了其在某些药物中间体的转化中的应用。因此，开发新型的针对芳香腈的腈水合酶具有较高的研究和应用价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可以高效转化芳香腈生产相应酰胺的重组腈水合酶及其催化腈化合物生成酰胺中的应用，该酶由α亚基、β亚基和活化元件基因编码构成。其中，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，活化元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种重组腈水合酶基因，所述重组腈水合酶基因由SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接构成。

本发明还涉及一种由所述的腈水合酶基因编码的重组腈水合酶，具体优选所述重组腈水合酶由SEQ ID NO.2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列、SEQ ID NO.3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO.6所示氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示活化元件编码的SEQ ID NO.7所示氨基酸序列依次连接构成。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。

由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围之列。

本发明还涉及一种由所述重组腈水合酶基因构建的重组载体。

本发明涉及一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明提供一种所述重组腈水合酶基因在制备重组腈水合酶中的应用，所述的应用为：将SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接，合成重组腈水合酶基因，将重组腈水合酶基因与载体连接，构建含重组腈水合酶基因的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离获得含重组腈水合酶的菌体细胞。

本发明提供一种所述的重组腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用，具体所述的应用为：以含重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以腈化合物为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液(优选20～30g/l)，所述底物的终浓度为0.2～1.0mol/L缓冲液(优选0.5～0.8mol/L)。

本发明所述的催化剂制备方法为：将含重组腈水合酶基因的重组基因工程接于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h，取培养液以体积浓度2％的接种量转接至含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6～1.0时，加入终浓度0.1mM的IPTG，18～37℃下诱导12～18h，离心，获得湿菌体。

本发明所述腈化合物为3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈或苯乙腈。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明实现了源自亚硫酸杆菌E-36中假定腈水合酶基因在大肠杆菌细胞中的功能表达，提供了一种高效表达该酶的基因工程菌，可以高效转化芳香腈生产相应酰胺化合物，转化率达到100％。

(四)附图说明

图1为实施例1亚硫酸杆菌E-36中腈水合酶基因的PCR扩增电泳图；M：核酸Marker；2～4：腈水合酶基因的PCR扩增产物。

图2为实施例2重组质粒pET28a(+)-NH_E36的图谱。

图3为实施例3基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH_E36诱导表达产物的SDS-PAGE电泳图；M：低分子量标准蛋白质；1：基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-NH_E36诱导后菌体破胞液；2：基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-NH_E36诱导菌体破胞上清液；3：基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-NH_36表达经过纯化后的重组腈水合酶，箭头指示重组腈水合酶E36的位置。

图4为实施例9中3-氰基吡啶及其转化产物高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

DNA聚合酶(PrimerSTAR HS，×2)、DNA Marker、限制性内切酶(Nde I、XhoI)和T4DNA连接酶菌购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara^TM)。细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购自康宁生命科技有限公司(Axygen^TM)。E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和质粒pET-28a(+)购自Novagen公司；低分子量蛋白质Marker、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司。

LB培养基(g/L)：10蛋白胨；10氯化钠；5酵母粉，pH 7.0，溶剂为水。

实施例1：全长腈水合酶基因的克隆

采用细菌基因组提取试剂盒提取亚硫酸杆菌E-36(Sulfitobacter sp.E-36ATCCBAA-1142)的基因组。再根据亚硫酸杆菌E-36基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1)设计引物NH_E36-Up和NH_E36-Down，以亚硫酸杆菌E-36基因组为模板，PCR扩增全长腈水合酶基因，如图1所示。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收，获得的全长腈水合酶基因由SEQ ID NO.2所示α亚基(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)、SEQ ID NO.3所示β亚基(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和SEQ ID NO.4所示活化元件(编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.7所示)组成，SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接构成，具体步骤参考该试剂盒的使用说明书。上游引物NH_E36-Up(含有Nde I酶切位点)如SEQ ID NO.8所示，下游引物NH_E36-Down(含有Hind III酶切位点)如SEQ ID NO.9所示。

上游引物NH_E36-Up：5’-ggaattccat atgacatccc acgggcatga tc-3’

下游引物NH_E36-Down：5’-ccgctcgagc tacagcgtga tagcttgccc-3’

PCR反应体系和PCR反应条件：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃2min；

2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

实施例2：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH_E36的构建和鉴定

为了实现来源于亚硫酸杆菌E-36基因组中腈水合酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内的高效功能表达，选择含有T7启动子的pET28a(+)作为表达载体。将载体pET28a(+)和全长腈水合酶基因经Nel I和Xho I双酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒进行酶切产物的回收。

双酶切体系和反应条件：

37℃保温5h。

采用核酸电泳初步确定两者的浓度，以基因/质粒(mol/mol,2:1)进行混合，加入T4DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pET28a(+)-NH_E36(示意图如图2所示)。然后，将重组质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET28a(+)-NH_E36及重组菌株的正确性，最终获得基因工程菌E.colipET28a(+)-NH_E36。

实施例3：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH_E36的腈水合酶表达与纯化

将基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH_E36甘油保藏菌种接于5mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h。取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h。在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞，用磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。在冰浴中，采用超声破碎仪破碎细胞，在5000～10000×g条件下离心5～30min，收集细胞破碎上清液，细胞破碎上清液以0.5～2.0mL/min的流速经过镍(Ni-)柱，再由磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0，含250mM咪唑)进行洗脱，收集目标蛋白。基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH_E36的表达和纯化采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图3所示。

实施例4：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH E36催化3-氰基吡啶生成烟酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.14g。然后用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞悬液。向重悬液中加入终浓度0.8mol/L缓冲液的3-氰基吡啶，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶的残留，其转化率为100％，烟酰胺的得率＞99％。

底物和产物的检测采用高效液相色谱法(HPLC)：高效液相色谱仪(Agilent 1100，USA)，紫外(UV)检测器，检测波长为230nm，色谱柱为Varian PURSUIT C18反向色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相为磷酸乙腈缓冲液(pH2.8)，流速设定为0.5～1.0mL/min。在此条件下，3-氰基吡啶及其转化产物(烟酰胺和烟酸)的HPLC色谱图如图4所示，保留时间分别为19.3，7.6和6.7min。

首先，用蒸馏水分别配置不同浓度的3-氰基吡啶溶液(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L)和烟酰胺溶液(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L)的标准溶液，HPLC法检测积分得到峰面积，根据峰面积绘制底物和相应产物标准曲线，并得到回归方程。3-氰基吡啶和烟酰胺的回归方程分别为：y＝1373.8x和y＝1279.9x(y：峰面积；x：3-氰基吡啶和烟酰胺浓度，mmol/L)，回归方程的R²分别为0.994和0.998。样品中各物质的含量由该回归方程计算得到。

实施例5：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH E36催化4-氰基吡啶生成异烟酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.25g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.8mol/L的4-氰基吡啶，25℃下进行反应，反应1.5小时。采用HPLC法检测反应体系内的4-氰基吡啶和异烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无4-氰基吡啶残留，转化率为100％，异烟酰胺得率＞99％。HPLC检测方法同实施例4。

实施例6：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH E36催化苯甲腈生成苯甲酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.23g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入0.5M苯甲腈，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的苯甲腈和苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯甲腈残留，转化率为100％，本甲酰胺的得率＞99％。HPLC检测方法同实施例4。

实施例7：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH E36催化3-甲基苯甲腈生成3-甲基苯甲酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.16g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.5mol/L的3-甲基苯甲腈，25℃下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的3-甲基苯甲腈和3-甲基苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-甲基苯甲腈残留，转化率为100％，3-甲基苯甲酰胺得率＞99％。检测方法同实施例4。

实施例8：基因工程菌株E.coli pET28a(+)-NH E36催化苯乙腈生成苯乙酰胺

取100ml实施例3基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在5000～10000×g条件下离心5～30min收集菌体，细胞湿重为1.18g。然后，用50ml磷酸缓冲液(50～200mM，pH5.0～8.0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加入终浓度0.5mol缓冲液的苯乙腈，25℃下进行反应，反应1.5小时。采用HPLC法检测反应体系内的苯乙腈和苯乙酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯乙腈残留，转化率为100％，苯乙酰胺得率＞99％。检测方法同实施例4。

对比例1

Prasad S.(Indian Journal of Microbiology,47:34-41,2007)等从土壤筛选到一株紫红红球菌PA-34(Rhodococcus rhodochrous PA-34)来催化3-氰基吡啶的水合反应。发现在1L的反应体系中，含9.0g野生菌细胞(干重)，12h内完全转化7M 3-氰基吡啶水合生成855g烟酰胺，其生产率为71.2g烟酰胺/L/h。本发明的工程菌E.colipET28a(+)-NH E36，在50ml体系中，含1.14g湿细胞，1h内完全转化0.8M 3-氰基吡啶水合生成4.88g烟酰胺，其生产率为97.6g烟酰胺/L/h。

对比例2

Wieser M.(FEMS Microbiology Letters,169:17-22,1998)等分离和纯化了来源于野生菌Rhodococcus rhodochrous J1的两种腈水合酶：低分子量和高分子量腈水合酶。这两种腈水合酶对芳香腈显示出很高的催化活力，如苯甲腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶和4-氰基吡啶。然而，由于在野生菌细胞中含有酰胺酶基因，可以进一步将烟酰胺转化为烟酸，降低了目标产物的纯度和得率。另外，该野生菌分别在日本、美国和中国等申请了专利，也是目前瑞士龙沙集团催化3-氰基吡啶制备烟酰胺的生产菌株。本发明构建的基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH E36同样对芳香腈显示出较高的活力，具有很高的应用价值。

Claims

1.一种重组腈水合酶基因，其特征在于所述重组腈水合酶基因由SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接构成。

2.一种由权利要求1所述的腈水合酶基因编码的重组腈水合酶。

3.如权利要求2所述的重组腈水合酶，其特征在于所述重组腈水合酶由SEQ ID NO.2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO.5所示氨基酸序列、SEQ ID NO.3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO.6所示氨基酸序列和SEQ ID NO.4所示活化元件编码的SEQ ID NO.7所示氨基酸序列依次连接构成。

4.一种由权利要求1所述重组腈水合酶基因构建的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求2所述重组腈水合酶基因在制备重组腈水合酶中的应用，其特征在于所述的应用为：将SEQ ID NO.2所示α亚基、SEQ ID NO.3所示β亚基和SEQ ID NO.4所示活化元件依次连接，合成重组腈水合酶基因，将重组腈水合酶基因与载体连接，构建含重组腈水合酶基因的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离获得含重组腈水合酶的菌体细胞。

7.一种权利要求1所述的重组腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，以腈化合物为底物，在25℃下进行反应，反应结束后，获得含酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液，所述底物的终浓度为0.2～1.0mol/L缓冲液。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的催化剂制备方法为：将含重组腈水合酶基因的重组基因工程接于含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h，取培养液以体积浓度2％的接种量转接至含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.6～1.0时，加入终浓度0.1mM的IPTG，18～37℃下诱导12～18h，离心，获得湿菌体。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述腈化合物为3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈或苯乙腈。