CN101186911A - 一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用 - Google Patents
一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌－大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH－1和紫红红球菌TH－2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体地说涉及一种利用诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒构建高效表达腈水合酶基因工程菌的方法以及所得到的基因工程菌株和应用。
背景技术
利用丙烯酰胺(Acrylamide，分子式为C3H5NO，结构式为H2C＝CHCONH2)合成的各种类型的聚丙烯酰胺(PAM)在三次采油、水处理、造纸、采矿、冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产中具有非常广泛的应用。
丙烯酰胺的生产一般是以丙烯腈为原料，进行催化水合而成。丙烯酰胺的生产经历了硫酸水合法、铜催化法、微生物法三个发展阶段。由于微生物法具有反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等优点，与其他方法相比，微生物法具有明显的优势。
在利用微生物法的最初阶段，主要是筛选和驯化具有腈水合酶活性的菌株。在微生物方面的主要进展有：日本，山田秀明研究组在专利《生物学生产酰胺的方法》(专利号：ZL88106735))公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1，日本化学工业株式会社在专利《利用微生物制备酰胺的方法》(专利号：ZL86100062)公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌，英国西巴特殊化学水处理有限公司在专利《紫红红球菌菌株NCIMB 41164及其生产腈水合酶的用途》(申请号：200480035487.1)中公开了一种了紫红红球菌NCIMB 41164菌株或其突变体，美国亚什兰许可和知识产权有限公司在专利《腈水合酶生产菌株紫红红球菌M33的培养方法》(申请号：200480043243.8)”中公开了一种紫红红球菌M33，上海市农药所在专利《微生物催化法生产丙烯酰胺》(申请号：03115536.7)中公开了野生丙酸棒杆菌及其驯化菌株等不同的微生物进行丙烯酰胺的微生物法生产。在生产方法方面，清华大学化工系公开了《一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法》(专利号：ZL 03109806.1)，《提高腈水合酶产物耐受性的定向培育法》(专利号：ZL 03130658.6)和《葡萄糖-Co2+耦合补加发酵制备腈水合酶的工艺方法》(专利号：ZL 03121944.6)；河南焦作多生多化工股份有限公司公开了《微生物凝聚法生产丙烯酰胺的方法》(申请号：200410010364.4)；德国施托克豪森公司公开了《用一种生物催化剂制备一种丙烯酰胺水溶液的方法》(申请号：02808905.7)；《傅里叶变换红外在线测量丙烯腈和丙烯酰胺》等等。在转化丙烯腈生产丙烯酰胺的基因研究方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；日本三菱丽阳株式会社公开了《改良型腈水合酶》(申请号：200580016665.0)，提供了对腈水合酶基因进行定点突变来提高耐热性的方法；清华大学从诺卡氏菌中克隆获得了腈水合酶基因并申请了专利《一种腈水合酶及其编码基因与应用》(专利号：ZL 200410042576.0)，进一步对该基因在重组大肠杆菌中的突变和高表达进行了研究。
诺卡氏菌和红球菌属于革兰氏阳性菌株，具有比较厚的细胞壁。同时，作为腈代谢酶系的天然表达菌株，诺卡氏菌和红球菌中还可能存在某些分子伴侣，或良好的氧化还原环境，使得胞内表达的腈水合酶与重组大肠杆菌相比，具有更高的热稳定性和底物、产物耐受性。为此，采用诺卡氏菌和红球菌宿主进行腈水合酶基因的过表达在工业生产中具有更广阔的前景。
发明内容
本发明目的之一是提供一种高效表达腈水合酶的基因工程菌的构建方法。
本发明目的之二是提供高效表达腈水合酶的基因工程菌株。
本发明目的之三是提供利用腈水合酶基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法。
本发明一种高效表达腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18和pNV19，既含有诺卡氏菌/红球菌的复制起点pAL5000，又含有大肠杆菌的复制起点，因此既可以在诺卡氏菌/红球菌中表达，又可以在大肠杆菌中表达的特点；可以方便地在重组大肠杆菌中实现对外源基因的重组改造，然后转移至重组诺卡氏菌/红球菌中进行目标基因的表达。
本发明一种高效表达腈水合酶基因工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：
(1)根据目的启动子基因的DNA序列设计引物，以含有目的启动子基因的DNA为模板进行PCR方法扩增，得到启动子基因；
(2)将启动子基因与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14～16h，得连接反应物；
(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性基因kan+)，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒；
(4)根据腈水合酶基因序列设计上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的诺卡氏菌Nocardia YS-2002的总DNA为模板进行PCR扩增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI进行双酶切，再用T4连接酶将腈水合酶DNA序列插入大肠杆菌质粒pET28，获得重组质粒pET28-NHase；再用试剂盒定点突变方法将腈水合酶基因的α亚基起始密码子gtg突变为atg，获得突变腈水合酶基因NHaseM；
(5)以步骤(4)获得的突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列为模板进行PCR扩增，获得突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列，然后用BamHI和HindIII对突变腈水合酶基因NHaseM与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14-16h，得连接反应物；
(6)将步骤(5)连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培养基上，挑选阳性克隆，并在LB培养基中37℃过夜培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因及突变腈水合酶基因NHaseM的穿梭质粒；
(7)将步骤(6)所得穿梭质粒以电穿孔转化法转化宿主细胞，即获得具有目的启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM的基因工程菌。
上述构建方法步骤(1)中所述的目的启动子基因为酰胺酶启动子基因或大肠杆菌tac启动子基因。
上述构建方法中所述的酰胺酶启动子基因，其-35区和-10区序列分别为：TTGTGG和TAACGT；它来自诺卡氏菌Nocardia YS-2002，用上游引物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT和下游引物CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT，以诺卡氏菌Nocardia YS-2002的DNA为模板进行PCR扩增可得酰胺酶启动子基因。
上述构建方法中所述的大肠杆菌tac启动子基因，其-35区和-10区序列分别为：TTGACA和TATAAT。大肠杆菌tac启动子基因来自质粒pMAL-p2x(美国NEB公司)，以上游引物CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT和下游引物CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT为扩增引物，以质粒pMAL-p2x的DNA为模板进行PCR扩增可得大肠杆菌tac启动子基因。
上述构建方法步骤(2)中所述的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒为诺卡氏菌-红球菌穿梭质粒pNV18或pNV19(pNV18：DDBJ数据库，AB267085pNV19：DDBJ数据库，AB267086)及其衍生质粒。
所述的衍生质粒可以是pNV18.1等。
上述构建方法步骤(2)中酶切产物的纯化可以采用PCR产物回收试剂盒或其它分子克隆中常用的纯化方法。
上述构建方法步骤(4)中所述的腈水合酶基因是指来自于诺卡氏菌的原始腈水合酶基因(Genbank：AY168347)或经过突变、重排、缺失等方法获得的与来自诺卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70％、蛋白质序列一致性大于等于70％的同源基因。
上述构建方法步骤(4)中所述的试剂盒定点突变方法(ExSiteTM PCR-basedsite-directed mutagenesis kit，Stratagene，USA)见Yue SHI等(Enzyme andMicrobial Technology，2004，35(6-7)，557-562)；可将腈水合酶基因的α亚基起始密码子gtg突变为atg，从而获得突变腈水合酶基因NHaseM。
上述构建方法步骤(4)中所述的突变腈水合酶基是指α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因。
上述构建方法步骤(3)中所述的目的启动子基因的诺卡氏菌-大肠杆菌
穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因的pNV18质粒及其衍生质粒。
上述构建方法步骤(6)中所述的穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因及突变腈水合酶基因NHaseM的pNV18质粒及其衍生质粒。
上述构建方法步骤(7)中所述的宿主为诺卡氏菌或紫红红球菌。
上述宿主所述的诺卡氏菌是诺卡氏菌Nocardia YS-2002或其诱变株；其中诺卡氏菌Nocardia YS-2002是发明人从来自胜利油田采集的菌株通过筛选得到；Nocardia YS-2002的诱变株可采用Nocardia YS-2002在紫外灯下加入LiCl2方法进行诱变获得。
上述宿主所述的紫红红球菌是紫红红球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC33278(在美国菌种保藏中心保藏)或其驯化株或诱变株。
上述构建方法步骤(7)中所述的获得具有目的启动子和突变腈水合酶基因的基因工程菌可以是诺卡氏基因工程菌或紫红红球菌基因工程菌。
利用上述构建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，携带tac启动子基因或酰胺酶启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株中所述的突变腈水合酶基因是指α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因。
上述腈水合酶基因工程菌株，携带tac启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是诺卡氏菌TH-1，Nocardia，于2007年7月12日保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.2104，它带有tac启动子和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是紫红红球菌TH-2，R.rhodochrous，于2007年7月12日保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.2105，它带有tac启动子和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株，携带酰胺酶启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是诺卡氏菌Nocardia/pNV-Pa-NHM，它带有酰胺酶启动子和突变腈水合酶基因NHaseM。
上述腈水合酶基因工程菌株是紫红红球菌rhodochrous/pNV-Pa-NHM，它带有酰胺酶启动子和突变腈水合酶基因NHaseM。
利用上述腈水合酶基因工程菌生产丙烯酰胺的方法，按照如下步骤进行：
(1)将在4℃保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO4 0.5～0.75g/L，K2HPO4 0.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，pH7.5，其余为水；
(2)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(1)的腈水合酶基因工程菌液接种到装有培养基的种子罐中，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得腈水合酶基因工程菌的种子液；所述的培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO4 0.5～0.75g/L，K2HPO4 0.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，泡敌0.2～0.3g/L，pH7.5，其余为水；
(3)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(2)所得种子液转接种到装有培养基的发酵罐中，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液；所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH2PO4 0.5～1.0g/L，K2HPO40.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L，CoCl2 0.04～0.12mM，丙烯酰胺2～6mM，泡敌0.2～0.3g/L，pH 7.5～8.5，其余为水；
(4)将发酵液稀释为5～8g/L(干重)的菌液，然后用中空纤维微滤膜对收获的菌体进行微滤洗涤，清洗时采用正洗和反洗双向反复操作直至洗涤液的色度为5～20，蛋白质浓度为3～10ppm；正洗压力控制为0.06～0.1MPa，反洗压力控制为0.01～0.1MPa；再将菌液配成10～20g/L(干重)，体积分数5～8％，打入水合反应釜，调节丙烯腈流量至0.5～1.0m3/h，然后向水合釜内流加丙烯腈，流加速度从高向低逐步调小；反应釜夹套通-5～-9℃冷冻盐水或液氨，在16～26℃，pH6.7～7.5条件下进行水合反应1～3小时；接着用循环泵将水合液打入中空纤维超滤膜分离系统，用正洗和反洗方法反复操作滤去水合液中的细胞杂质和杂蛋白，直至水合液的色度为5～15，蛋白质浓度为5～15ppm，得到丙烯酰胺水合液。
上述生产丙烯酰胺的方法步骤(1)中所述的腈水合酶基因工程菌是指诺卡氏菌Nocardia/pNV-Pa-NHM、诺卡氏菌TH-1、紫红红球菌R.rhodochrous/pNV-Pa-NHM或紫红红球菌TH-2。
上述生产丙烯酰胺的方法中所述的泡敌是聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚，可从市场上购买。
上述生产丙烯酰胺的方法中步骤(2)中当大量种子细胞形态为链球状时，结束种子培养，生物量约为3～6g/L。
上述生产丙烯酰胺的方法中步骤(3)中至菌体形态为单个小球状，生物量≥8g/L，腈水合酶酶活≥1850U/ml。
上述生产丙烯酰胺的方法步骤(4)中所述的腈水合酶基因工程菌细胞可以重复使用3～8次。
上述生产丙烯酰胺的方法中清洗时采用正洗和反洗双向反复操作，是为了防止堵塞。
上述生产丙烯酰胺的方法步骤(4)中当丙烯酰胺浓度达到25％～40％(W％V)，丙烯腈浓度小于0.1％(W％V)，丙烯酸副产物≤0.5％(W％V)时，可停止水合反应。
本发明采用诺卡氏菌或红球菌为宿主菌株，采用诺卡氏菌/红球菌-大肠杆菌穿梭质粒高表达腈水合酶基因，通过穿梭质粒上启动子基因的筛选优化及腈水合酶基因的突变改造，提高重组菌株腈水合酶的活性、热稳定性和产物、底物耐受性；采用基因重组诺卡氏菌或基因重组红球菌游离细胞为催化剂，可实现大宗化学品丙烯酰胺的微生物法生产。
本发明的优点和有益效果：(1)本发明所得腈水合酶基因工程菌株腈水合酶表达水平高；(2)本发明腈水合酶酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；(3)本发明方法生产的丙烯酰胺质量高，适于工业化的生产。
附图说明
图1携带tac启动子(Ptac)的腈水合酶表达穿梭质粒pNV-Ptac-NHM的示意图。
图2携带酰胺酶启动子(Pa)的腈水合酶表达穿梭质粒pNV-Pa-NHM的示意图。
具体实施方式
实施例1
携带tac启动子的穿梭质粒pNV18-Ptac-NHM的构建
以质粒pMAL-p2x(美国NEB公司)为模板进行PCR扩增，上游引物为CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT(下划线部分为EcoRI酶切位点)和下游引物为CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT(下划线部分为BamHI酶切位点)得到含有tac启动子(-35区和-10区序列为：TTGACA和TATAAT)的DNA序列；用EcoR I和BamH I双酶切tac启动子基因和穿梭质粒pNV18，37℃反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，然后采用T4 DNA连接酶在4℃进行连接反应14h；将连接反应产物转化宿主菌E.coli JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有tac启动子的穿梭质粒；用BamHI和HindIII双酶切所得的含有tac启动子的穿梭质粒，用T4DNA连接酶连接插入α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因(突变方法见Yue SHI等，Enzyme and MicrobialTechnology，2004，35(6-7)，557-562)，转化E.coli JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，验证正确的穿梭质粒即为携带tac启动子的突变腈水合酶基因表达穿梭质粒pNV-Ptac-NHM(见图1)。
实施例2
携带酰胺酶启动子(Pa)的穿梭质粒pNV18-Pa-NHM的构建
以发明人实验室驯化筛选的诺卡氏菌Nocardia YS-2002(保存在清华大学化工系生物化公所生物信息与生物催化工程实验室)的总DNA为模板进行PCR扩增，上游引物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT(下划线部分为EcoRI酶切位点)和下游引物CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT(下划线部分为BamHI酶切位点)，获得酰胺酶启动子基因Pa的DNA序列；用EcoR I和BamH I双酶切Pa和穿梭质粒pNV18，37℃反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化后，在4℃采用T4 DNA连接酶进行连接反应14h。将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(Kan+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养12h。收获细胞，提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得含有pa的质粒；用BamHI和HindIII双酶切含有pa的质粒、用T4DNA连接酶连接插入α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因(突变方法见Yue SHI等，Enzyme and Microbial Technology，2004，35(6-7)，557-562)，转化E.coli JM109的感受态细胞，挑选阳性克隆，摇瓶培养后提取小量质粒再次进行酶切和电泳验证。验证正确的穿梭质粒即为携带Pa启动子的突变腈水合酶基因表达穿梭质粒pNV-Pa-NHM(见图2)。
实施例3
基因重组诺卡氏菌TH-1的构建
将实施例1构建的带有tac启动子和突变腈水合酶基因高表达穿梭质粒pNV-Ptac-NHM以电穿孔法转化诺卡氏菌Nocardia YS-2002的感受态细胞，可得基因重组诺卡氏菌TH-1。其中，诺卡氏菌感受态细胞的制备采用《分子克隆指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)中革兰氏阳性菌感受态细胞的制备方法。取1μl纯化后的质粒于一个1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电转杯一起置于冰上预冷；将50μl制备好的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；打开电转仪，调节电压为1250V；将穿梭质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，轻轻敲击使得混合物均匀进入电转杯的底部，同时注意混合物中不能有气泡。将电转杯放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入800μl的SOC液体培养基(配方见《分子克隆指南》)，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。置于28℃，220rpm摇床培养2h；取200μl菌液涂布于含有20μg/ml卡那抗生素的LB固体培养基平板，放入28℃培养箱培养60～72小时后出现重组诺卡氏菌的单菌落，得基因重组诺卡氏菌Nocardia/pNV-Ptac-NHM，菌株名为：TH-1。
实施例4
基因重组红球菌TH-2的构建
将实施例1所得pNV-Ptac-NHM穿梭质粒以电传孔法转化宿主细胞红球菌R.rhodochrous ATCC 33278，其中电转化方法同实施例3，获得基因重组红球菌R.rhodochrous/pNV-Ptac-NHM，菌株名为：TH-2。
实施例5：
诺卡氏菌TH-1腈水合酶的表达试验
采用500ml带挡板的三角摇瓶，装培养基的量为10％，将实施例3所得诺卡氏菌TH-1和诺卡氏菌Nocardia YS-2002(简称“野生菌”)在28℃摇床分批培养，摇床转速为200rpm，培养92小时。所述培养基的组成比例为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，泡敌0.2g/L，pH值为7.5，二价钴离子40ppm，其余为水；结果表明，采用tac启动子表达腈水合酶的重组诺卡氏菌的生长情况与原始菌株基本一致，酶活表达情况则有所不同。在发酵培养48小时，重组菌的酶活达到2939U/ml，而野生菌酶活为2711U/ml，重组菌酶活比野生菌提高了8.4％；发酵培养72小时，重组菌酶活(3331U/ml)比野生菌(2838U/ml)提高17.4％。继续发酵培养到92小时，重组菌酶活高达4015U/ml。其中，腈水合酶的酶活检测采用标准的气相色谱内标法，酶活的国际单位定义为：每分钟催化生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量；1μmol丙烯酰胺/(min·ml菌液)＝1U/ml。
实施例6
紫红红球菌TH-2腈水合酶基因的表达试验
将实施例4所得基因重组紫红红球菌TH-2进行72h摇瓶培养，并以原始野生菌株R.rhodochrous ATCC 33278为对照，在28℃、摇床转速200转/min条件下培养48小时，培养基的组成比例为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨7g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.5，甲基丙烯酰胺0.2g/L，其余为水。结果表明，野生紫红红球菌的腈水合酶活性很低，总酶活仅为49U/ml，但重组紫红红球菌TH-2的总酶活提高到352U/ml，比野生菌株提高了约7.2倍。
实施例7、
利用诺卡氏菌TH-1生产丙烯酰胺的试验
挑取诺卡氏菌TH-1固体平板上光滑、湿润的单菌落，接种在50ml种子培养基中(500ml摇瓶)中，28℃培养48h，摇床转速200转/min(所述培养基的组成比例为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.5，其余为水)，得活化的诺卡氏菌TH-1；然后以体积比为0.5％的接种量接种到500L种子罐中，搅拌转速250转/min，28℃培养40hr，种子细胞形态变为链球状，结束种子培养(培养基组成同前)，以体积比为10％的接种量转接装液量为3吨的5m3发酵罐(发酵培养基的组成比例为：葡萄糖30g/L，酵母膏5.0g/L，尿素7.5g/L，KH2PO4 0.75 g/L，K2HPO4 0.75g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，味精0.75g/L，CoCl2 0.06mM，丙烯酰胺4mM，泡敌0.2g/L，pH 7.5，其余为水)，28℃条件下培养至40h时，菌体形态为单个小球状，生物量为10g/L，腈水合酶酶活为2780U/ml。
停止培养，将3吨发酵液稀释到4吨，采用微滤膜洗涤细胞，正洗压力压力约0.08MPa、反洗压力约0.09Mpa；按照5％的体积分数配制细胞悬浮液，重悬液的酶活力约为2300 U/ml。调节初始丙烯腈流量1.0m3/h，向水合釜内流加丙烯腈，流加速度从高向低逐步调小；反应釜夹套通-5℃冷冻盐水，保证水合温度维持在20℃左右，pH7.5，2小时后测定丙烯酰胺浓度达到30％(W％V)，结束水合反应。采用循环泵将丙烯酰胺水溶液打入中空纤维超滤膜分离系统进行超滤分离，结果得到30％的丙烯酰胺水溶液，外观清澈透明；经检测杂蛋白含量为8ppm，色度为10，丙烯腈浓度0.01％(W％V)，丙烯酸副产物浓度0.1％，是高质量的丙烯酰胺水剂产品。
基因工程菌游离细胞反复使用6次后，腈水合酶显著失活，将细胞离心、收集后进行废弃处理。
实施例8
利用紫红红球菌TH-2生产丙烯酰胺的试验
按照实施例7所描述的方法，挑取基因重组紫红红球菌TH-2的单菌落，进行摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，得到12g/L的重组红球菌，腈水合酶酶活为690U/ml。收获重组红球菌游离细胞，按照实施例7所描述的方法，微滤洗涤后，催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺。按照10％的体积分数配制细胞悬浮液，重悬液的酶活力约为1000U/ml。调节初始丙烯腈流量1.0m3/h，向水合釜内流加丙烯腈，流加速度从高向低逐步调小。反应釜夹套通-5℃冷冻盐水，保证水合温度维持在20℃左右，pH7.5，2小时后测定丙烯酰胺浓度达到20％(W％V)，结束水合反应。采用循环泵将丙烯酰胺水溶液打入中空纤维超滤膜分离系统进行超滤分离，结果得到20％的丙烯酰胺水溶液，外观清澈透明，杂蛋白含量为15ppm，色度为20，丙烯腈浓度0.08％(W％V)，丙烯酸副产物浓度0.4％，是合格的丙烯酰胺水剂产品。
Claims (13)
1.一种高效表达腈水合酶基因工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：
(1)根据目的启动子基因的DNA序列设计引物，以含有目的启动子基因的DNA为模板进行PCR方法扩增，得到启动子基因；
(2)将启动子基因与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14～16h，得连接反应物；
(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(kan+)，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因的诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒；
(4)根据腈水合酶基因序列设计上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的诺卡氏菌Nocardia YS-2002的总DNA为模板进行PCR扩增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI进行双酶切，再用T4连接酶将腈水合酶DNA序列插入大肠杆菌质粒pET28，获得重组质粒pET28-NHase；再用试剂盒定点突变方法将腈水合酶基因的α亚基起始密码子gtg突变为atg，获得突变腈水合酶基因NHaseM；
(5)以步骤(4)获得的突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列为模板进行PCR扩增，获得突变腈水合酶基因NHaseM的DNA序列，然后用BamHI和HindIII对突变腈水合酶基因NHaseM与诺卡氏菌-大肠杆菌穿梭质粒进行双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接酶在3～5℃进行连接反应14-16h，得连接反应物；
(6)将步骤(5)连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培养基上，挑选阳性克隆，并在LB培养基中37℃过夜培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，可得带有目的启动子基因及突变腈水合酶基因NHaseM的穿梭质粒；
(7)将步骤(6)所得穿梭质粒以电穿孔转化法转化宿主细胞，即获得具有目的启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM的基因工程菌。
2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于步骤(1)中所述的目的启动子基因为酰胺酶启动子基因或大肠杆菌tac启动子基因。
3.按照权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述的大肠杆菌tac启动子基因，其-35区和-10区序列分别为：TTGACA和TATAAT。
4.按照权利要求1、2或3所述的构建方法，其特征在于步骤(4)中所述的腈水合酶基因为来自诺卡氏菌的腈水合酶基因或经过突变、重排、缺失等方法获得的与来自诺卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70％、蛋白质序列一致性大于等于70％的同源基因。
5.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述的突变腈水合酶基因是α亚基起始密码子gtg突变为atg的腈水合酶基因。
6.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤(3)中所述的穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因的pNV18质粒或pNV18衍生质粒。
7.按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于步骤(6)中所述的穿梭质粒为带有酰胺酶启动子基因或tac启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM的pNV18质粒或pNV18衍生质粒。
8.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于步骤(6)中所述的宿主为诺卡氏菌或紫红红球菌。
9.利用上述权利要求1～8任一所述的构建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于携带tac启动子基因或酰胺酶启动子基因和突变腈水合酶基因NHaseM。
10.按照权利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是诺卡氏菌TH-1，保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，保藏登记号为CGMCC No.2104。
11.按照权利要求9所述的腈水合酶基因工程菌株，其特征在于所述的菌株是紫红红球菌TH-2，保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物保藏中心，保藏登记号为CGMCC No.2105。
12.利用权利要求9、10或11所述的腈水合酶基因工程菌生产丙烯酰胺的方法，按照如下步骤进行：
(1)将在4℃保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培养基中，在28～30℃、摇床转速为150～250转/min的条件下培养32～56小时，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO4 0.5～0.75g/L，K2HPO4 0.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，pH7.5，其余为水；
(2)按照0.5～1.0％的体积百分比将步骤(1)的腈水合酶基因工程菌液接种到装有培养基的种子罐中，在28～30℃、摇床转速为200～300转/min的条件下培养32～48小时，得腈水合酶基因工程菌的种子液；所述的培养基的组成比例为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨7～10g/L，KH2PO4 0.5～0.75g/L，K2HPO4 0.5～0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，泡敌0.2～0.3g/L，pH7.5，其余为水；
(3)按照5.0～10.0％的体积百分比将步骤(2)所得种子液转接种到装有培养基的发酵罐中，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～48小时，得发酵液；所述培养基的组成比例为：葡萄糖20～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素7.5～10.0g/L，KH2PO4 0.5～1.0g/L，K2HPO4 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L，CoCl2 0.04～0.12mM，丙烯酰胺2～6mM，泡敌0.2～0.3g/L，pH 7.5～8.5，其余为水；
(4)将发酵液稀释为5～8g/L(干重)的菌液，然后用中空纤维微滤膜对收获的菌体进行微滤洗涤，清洗时采用正洗和反洗双向反复操作直至洗涤液的色度为5～20，蛋白质浓度为3～10ppm；正洗压力控制为0.06～0.1MPa，反洗压力控制为0.01～0.1MPa；再将菌液配成10～20g/L(干重)，体积分数5～8％，打入水合反应釜，调节丙烯腈流量至0.5～1.0m3/h，然后向水合釜内流加丙烯腈，流加速度从高向低逐步调小；反应釜夹套通-5～-9℃冷冻盐水或液氨，在16～26℃，pH6.7～7.5条件下进行水合反应1～3小时；接着用循环泵将水合液打入中空纤维超滤膜分离系统，用正洗和反洗方法反复操作滤去水合液中的细胞杂质和杂蛋白，直至水合液的色度为5～15，蛋白质浓度为5～15ppm，得到丙烯酰胺水合液。
13.按照权利要求12所述的生产丙烯酰胺的方法，其特征在于步骤(1)中所述的腈水合酶基因工程菌是诺卡氏菌TH-1或紫红红球菌TH-2。
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