CN102776142A - 一种产腈水合酶优良菌种的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产腈水合酶优良菌种的选育方法,对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养得到单菌落,经过摇瓶发酵得到二次出发菌种,再通过低温驯化培养,优选性能优良的腈水合酶酶菌种,其酶活性高达1643万μ/mg,比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%,同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。为后续的丙烯酰胺生产提供高效的催化剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种产腈水合酶优良菌种的选育方法。
背景技术
腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺(acrylamide,AM)的催化剂,能催化丙烯腈(acrylonitrile,AN)水合生成丙烯酰胺。该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键技术。在工业生产中,当丙烯酰胺达到一定浓度后,腈水合酶的催化速率显著降低,丙烯酰胺浓度很难有进一步提高,终浓度通常为300~400 g/L。要得到丙烯酰胺晶体,还要通过蒸气浓缩及结晶才能得到98%的含量,生产中得到的结果表明,提高丙烯酰胺溶液百分比浓度可减少蒸气用量,所以提高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足,提供一种产腈水合酶优良菌种的选育方法。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案为:
(1)接种发酵液的制备:在无菌室内,将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内,将锥形瓶放入摇床进行发酵培养,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液;
(2)耐受性培养:按照步骤(1)制备菌体发酵液,当发酵培养100h时,每隔1-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养,同时,每隔1-2h取样进行平板菌落计数和酶活测定,筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种;
(3)低温驯化培养:步骤(2)中得到二次出发菌种,取其发酵液5ml稀释100倍后,平皿涂布,分别置于10-20℃的培养箱里低温培养100h,观察菌体生长情况;
(4)扩大培养:将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活,从而得到酶活性最高的菌株。
优选地,所述的斜面和平板培养基的配方为:葡萄糖15-20 g/l,K2HPO4 0.5-0.6g/l,酵母浸膏4.5-5.0g/l,MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l,味精0.9-1.0,磷酸氢二钾 0.5-0.6,尿素7-7.5g/l,消泡剂100ppm,琼脂20.0 -25.0g/l;
优选地,所述的发酵培养基配方为:葡萄糖20-25g/l,K2HPO4 0.6-0.8g/l,酵母浸膏7.0-9.0g/l,MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l,味精1.4-1.5 g/l,脲7.0-8.0 g/l,消泡剂150ppm。
本发明的优点在于:对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养和低温驯化培养,优选得到腈水合酶酶活性高达1643万μ/mg的菌株,比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%。同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。
具体实施方式
以下实施例仅为了进一步说明本发明,并不限制本发明的内容。
实施例1
1、斜面和平板培养基的配制
葡萄糖15-20 g/l,K2HPO4 0.5-0.6g/l,酵母浸膏4.5-5.0g/l,MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l,味精0.9-1.0,磷酸氢二钾 0.5-0.6,尿素7-7.5g/l,消泡剂100ppm,琼脂20.0 -25.0g/l。
2、发酵培养基配制
葡萄糖20-25g/l,K2HPO4 0.6-0.8g/l,酵母浸膏7.0-9.0g/l,MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l,味精1.4-1.5 g/l,脲7.0-8.0 g/l,消泡剂150ppm。
3、耐受性实验
在无菌室内,将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内,将锥形瓶放入摇床进行发酵培养,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液,每隔1.5h向摇瓶发酵液中加入含量99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养,通过平板菌落计数观察菌种生长情况,发现113.5h时,菌体的存活率最低,只有0.0013%,腈水合酶活性为510万μ/mg。
2、低温驯化实验
将上述113.5h时得到的二次出发菌种,取其发酵液5ml稀释100倍后,平皿涂布,分别置于10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃的培养箱里低温培养100h,观察菌体生长情况,获得30个残存菌落,将30个菌落的菌种进行摇瓶发酵,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活,发现18℃下培养一菌株的酶活性最高,其腈水合酶活性达到1643万μ/mg,比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%,同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。
Claims (3)
1. 一种产腈水合酶优良菌种的选育方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)接种发酵液的制备:在无菌室内,将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内,将锥形瓶放入摇床进行发酵培养,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液;
(2)耐受性培养:按照步骤(1)制备菌体发酵液,当发酵培养100h时,每隔1-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养,同时,每隔1-2h取样进行平板菌落计数和酶活测定,筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种;
(3)低温驯化培养:步骤(2)中得到二次出发菌种,取其发酵液5ml稀释100倍后,平皿涂布,分别置于10-20℃的培养箱里低温培养100h,观察菌体生长情况;
(4)扩大培养:将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵,摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2℃,培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活,从而得到酶活性最高的菌株。
2.根据权利要求1所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法,其特征在于:所述的斜面和平板培养基的配方为:葡萄糖15-20 g/l,K2HPO4 0.5-0.6g/l,酵母浸膏4.5-5.0g/l,MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l,味精0.9-1.0,磷酸氢二钾 0.5-0.6,尿素7-7.5g/l,消泡剂100ppm,琼脂20.0 -25.0g/l。
3.根据根据权利要求1所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法,其特征在于:所述的发酵培养基配方为:葡萄糖20-25g/l,K2HPO4 0.6-0.8g/l,酵母浸膏7.0-9.0g/l,MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l,味精1.4-1.5 g/l,脲7.0-8.0 g/l,消泡剂150ppm。
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