CN102776142A - 一种产腈水合酶优良菌种的选育方法 - Google Patents

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熊光辉
沈瑞华
杨涛
顾稀平
曹艳
张小琴
水瑞芬
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Abstract

本发明公开了一种产腈水合酶优良菌种的选育方法，对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养得到单菌落，经过摇瓶发酵得到二次出发菌种，再通过低温驯化培养，优选性能优良的腈水合酶酶菌种，其酶活性高达1643万μ/mg，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%，同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。为后续的丙烯酰胺生产提供高效的催化剂。

Description

一种产腈水合酶优良菌种的选育方法
技术领域
本发明涉及一种产腈水合酶优良菌种的选育方法。
背景技术
腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺(acrylamide,AM)的催化剂,能催化丙烯腈(acrylonitrile,AN)水合生成丙烯酰胺。该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键技术。在工业生产中，当丙烯酰胺达到一定浓度后，腈水合酶的催化速率显著降低，丙烯酰胺浓度很难有进一步提高，终浓度通常为300～400 g/L。要得到丙烯酰胺晶体，还要通过蒸气浓缩及结晶才能得到98%的含量，生产中得到的结果表明，提高丙烯酰胺溶液百分比浓度可减少蒸气用量，所以提高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种产腈水合酶优良菌种的选育方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
（1）接种发酵液的制备：在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液；
（2）耐受性培养：按照步骤（1）制备菌体发酵液，当发酵培养100h时，每隔1-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，同时，每隔1-2h取样进行平板菌落计数和酶活测定，筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种；
（3）低温驯化培养：步骤（2）中得到二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10-20℃的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况；
（4）扩大培养：将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，从而得到酶活性最高的菌株。
优选地，所述的斜面和平板培养基的配方为：葡萄糖15-20 g/l，K2HPO4 0.5-0.6g/l，酵母浸膏4.5-5.0g/l，MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l，味精0.9-1.0，磷酸氢二钾 0.5-0.6，尿素7-7.5g/l，消泡剂100ppm，琼脂20.0 -25.0g/l；
优选地，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 0.6-0.8g/l，酵母浸膏7.0-9.0g/l，MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l，味精1.4-1.5 g/l，脲7.0-8.0 g/l，消泡剂150ppm。
本发明的优点在于：对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养和低温驯化培养，优选得到腈水合酶酶活性高达1643万μ/mg的菌株，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%。同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。
具体实施方式
以下实施例仅为了进一步说明本发明，并不限制本发明的内容。
实施例1 
1、斜面和平板培养基的配制
葡萄糖15-20 g/l，K2HPO4 0.5-0.6g/l，酵母浸膏4.5-5.0g/l，MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l，味精0.9-1.0，磷酸氢二钾 0.5-0.6，尿素7-7.5g/l，消泡剂100ppm，琼脂20.0 -25.0g/l。
2、发酵培养基配制
葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 0.6-0.8g/l，酵母浸膏7.0-9.0g/l，MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l，味精1.4-1.5 g/l，脲7.0-8.0 g/l，消泡剂150ppm。
3、耐受性实验
在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液，每隔1.5h向摇瓶发酵液中加入含量99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，通过平板菌落计数观察菌种生长情况，发现113.5h时，菌体的存活率最低，只有0.0013%，腈水合酶活性为510万μ/mg。
2、低温驯化实验
将上述113.5h时得到的二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况，获得30个残存菌落，将30个菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，发现18℃下培养一菌株的酶活性最高，其腈水合酶活性达到1643万μ/mg，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%，同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。

Claims (3)

1. 一种产腈水合酶优良菌种的选育方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）接种发酵液的制备：在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后得到具有腈水合酶活性的发酵液；
（2）耐受性培养：按照步骤（1）制备菌体发酵液，当发酵培养100h时，每隔1-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，同时，每隔1-2h取样进行平板菌落计数和酶活测定，筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种；
（3）低温驯化培养：步骤（2）中得到二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10-20℃的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况；
（4）扩大培养：将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2℃，培养100h后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，从而得到酶活性最高的菌株。
2.根据权利要求1所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法，其特征在于：所述的斜面和平板培养基的配方为：葡萄糖15-20 g/l，K2HPO4 0.5-0.6g/l，酵母浸膏4.5-5.0g/l，MgSO4·7H20 0.8 -1.0 g/l，味精0.9-1.0，磷酸氢二钾 0.5-0.6，尿素7-7.5g/l，消泡剂100ppm，琼脂20.0 -25.0g/l。
3.根据根据权利要求1所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法，其特征在于：所述的发酵培养基配方为：葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 0.6-0.8g/l，酵母浸膏7.0-9.0g/l，MgSO4·7H20 1.2-1.3 g/l，味精1.4-1.5 g/l，脲7.0-8.0 g/l，消泡剂150ppm。
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