CN101481665A

CN101481665A - 生物催化法制备2,2-二甲基环丙甲酰胺及其菌株

Info

Publication number: CN101481665A
Application number: CNA2008101637492A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 王亚军; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2009-07-15
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101481665B

Abstract

本发明提供了一株从土壤及污水中富集、筛选高腈水合酶活性微生物菌种——Rhodococcus boritolerans FW815，以及应用该菌株进行生物催化法制备2，2－二甲基环丙甲酰胺的工艺。利用该菌产生的腈水合酶转化2，2－二甲基环丙甲腈制备2，2－二甲基环丙甲酰胺，反应介质为水，反应体系组成单纯，生物催化效率高，转化时间短，底物转化率高，产物2，2－二甲基环丙甲酰胺得率高且提炼工艺简单。

Description

生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺及其菌株

(一)技术领域

本发明涉及一株具有高腈水合酶活性的菌株及其在生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。

(二)背景技术

腈是一类含氰基官能团的化合物，在有机合成中具有非常重要的地位。氰基是一种重要的Cl源，通常作为“水稳定负碳离子”被引入有机物中，形成胺、亚胺、酰胺、脒、羧酸和羰基化合物等。但是，传统的腈化学转化具有能量消耗大，反应条件苛刻，需要强酸或强碱、高温和金属催化剂，反应选择性低等缺点，并伴随大量副产物的形成。腈化合物也存在于自然环境和细菌、真菌、植物、动物中，在生物系统中，已知的腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶催化腈转化成对应的酰胺和羧酸。腈生物转化与生物催化提供了许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，并显示出优良的选择性，而且，生物转化反应条件温和、转化率高、产物纯度高、产物提炼相对容易，符合绿色化学发展方向。

2，2-二甲基环丙甲酰胺是制备西司他丁手性前体S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺(S-(+)-2，2-dimethylcyclopropanecarboxamide)的关键原料(U.S.5,273,903，U.S.5,427,934)，2，2-二甲基环丙甲酰胺生产方法分为化学合成法和生物转化法。化学法合成2，2-二甲基环丙甲酰胺具有反应条件苛刻、反应步骤冗长、副产物多、产物得率低和废水多等缺陷。利用腈水合酶催化2，2-二甲基环丙甲腈水合制备2，2-二甲基环丙甲酰胺能够克服化学合成工艺的缺陷，符合原子经济和可持续发展(有机腈生物代谢途径见图1)。

(三)发明内容

本发明目的是克服现有的2，2-二甲基环丙甲酰胺生产技术的不足，提供一种从土壤及污水中富集、筛选高腈水合酶活性微生物菌种——Rhodococcus boritolerans FW815，以及应用该菌株进行生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺的工艺。

本发明采用的技术方案是：

Rhodococcus boritolerans FW815，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学430072，保藏编号CCTCC No：M208108，保藏日期2008年07月14日。经鉴定，该菌株属于红球菌属(Rhodococcus)的boritolerans种(无准确中文命名)，菌株编号为FW815。

该新菌株的特征如下：

菌落形态：在固体牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养2天，菌落呈圆形，直径约2毫米，中央隆起，边缘光滑、整齐，呈淡黄色，随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变深至淡红色。

细胞形态：细胞呈直的短杆状，0.8～1.2×0.2～0.5微米，细胞以单个出现，无芽孢形成，不运动。

生理生化特征：革兰氏染色阴性，甲基红试验阴性；液体石蕊牛奶培养基中培养有反应，硝酸盐还原阳性，反硝化作用阳性，产硫化氢，柠檬酸盐利用阳性，明胶水解阳性，酪氨酸水解阳性，酪素水解阳性，尿酶阳性，过氧化氢酶阳性，β-半乳糖苷酶阳性，卵磷脂酶阳性，丙二酸盐实验阳性，精氨酸脱羧酶阳性；淀粉水解阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性；培养基中存在铁离子条件下，腈水合酶阳性。

16S rDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物：p16S-8：5′-aga gtt tgatcc tgg ctc ag-3′和p16S-1541：5′-aag gag gtg atc cagccg ca-3′扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1476bp，该菌与菌(Rhodococcus boritolerans)的同源性最高(homology，99.93％/1445bps，based on 16S rDNA)。

综合上述鉴定结果，该菌株属于Rhodococcus boritolerans。

本发明涉及的微生物菌株R.boritolerans FW815是通过以下程序筛选获得的：

1)配制1.0升含腈化合物液体富集培养基，富集培养基成分终浓度如下：葡萄糖5.0～25.0g/L，MgSO₄ 1.0～5.0×10^-1g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0g/L，KH₂PO₄ 0.5～2.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5～5.0×10^-3g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5～5.0×10^-3g/L，CaCl₂ 0.5～5.0×10^-2g/L，外消旋2，2-二甲基环丙甲腈0.2～2.0g/L，溶剂为水；这里，外消旋2，2-二甲基环丙甲腈作为富集培养基的唯一碳源和氮源。将采集于浙江省内的化工厂周边的土样、水样按一定的比例接种至含2，2-二甲基环丙甲腈富集培养基中，在30℃、150rpm条件下，摇床振荡培养直至培养液变浑浊后，按照2％(v/v)接种量转接到新鲜的无菌富集培养基中，继续30℃、150rpm条件下，摇床振荡培养3～4天。如此重复3～5个循环。

2)制备一定数量的试管斜面和固体平板，固体培养基成分终浓度如下：葡萄糖5.0～25.0g/L，酵母粉3.0～15.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0～8.0g/L，MgSO₄ 1.0～5.0×10^-1g/L，K₂HPO₄ 1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1～3.0×10^-2g/L，CoCl₂·6H₂O 0.1～3.0×10^-2g/L，NaCl 0.5～2.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶剂为水，培养基pH值自然，121℃灭菌20分钟。将最后一次的富集培养液逐级稀释、涂布到平板培养基上，30℃培养至形成可观察到的单菌落，挑取单菌落转接至无菌斜面，30℃培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。

3)制备5.0升液体发酵培养基，发酵培养基成分终浓度如下：2～20.0g/L葡萄糖，0.5～5.0g/L蛋白胨，1.0～10.0g/L酵母膏，0.5～5.0g/L NaCl，0.5～5.0g/L K₂HPO₄，0.5～5.0g/L KH₂PO₄，0.1～1.0g/L MgSO₄，5.0～50.0×10^-3g/L FeSO₄·7H₂O，0～1.0×10^-1g/L CoCl₂，0.1～1.0×10^-1g/L CaCl₂，0.1～10.0g/L己内酰胺，溶剂为水，pH值自然，121℃灭菌20分钟。保藏在试管斜面上的单菌落逐一接种到含诱导剂的发酵培养基中，30℃培养48～72h，分别移取5～20.0ml发酵液，离心，收集菌体并用无菌生理盐水洗涤菌体3次，洗涤过的菌体分散于10.0ml pH7.0磷酸缓冲液(50.0mM)中，充分分散后加入5～40.0μL外消旋2，2-二甲基环丙甲腈，25～35℃转化1～30分钟，转化液经离心、微滤后采用气相色谱分析各支菌株的腈水合酶活性。

所述R.boritolerans FW815具有高腈水合酶活性，可用于微生物发酵制备2，2-二甲基环丙甲酰胺。

涉及2，2-二甲基环丙甲腈生物水合反应原理如下列反应式所示：

2，2-二甲基环丙甲腈 2，2-二甲基环丙甲酰胺

所述应用为：在以外消旋2，2-二甲基环丙甲腈为底物、R.boritoleransFW815发酵产生的腈水合酶为催化剂、水或磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于25～35℃下进行反应，反应结束后反应液经分离纯化得到所述外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺。

所述腈水合酶来自含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞由如下方法制得：R.boritolerans FW815接种至含铁离子的适用于R.boritolerans的发酵培养基中28～32℃培养36～96小时，得到发酵液经分离得到所述含酶菌体细胞。

所述反应体系中含酶菌体细胞用量为0.1～0.2g DCW(细胞干重)/L。

所述含铁离子的适用于R.boritolerans的发酵培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～15.0g/L，酵母粉6～12.0g/L，蛋白胨1～5.0g/L，NaCl 0.5～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0g/L，KH₂PO₄ 0.5～2.0g/L，MgSO₄ 0.05～0.5g/L，己内酰胺0.05～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5～50×10^-3g/L，CaCl₂ 0.01～2.0g/L，溶剂为水，pH 5～9。

本发明的R.boritolerans FW815腈水合酶属于铁离子依赖的诱导酶，在发酵培养基中需要补充诱导剂和铁离子才能制备有活性的生物催化剂。含酰基、氨基等官能团有机物如底物2，2-二甲基环丙甲腈、产物2，2-二甲基环丙甲酰胺、谷氨酸钠、己内酰胺、尿素、乙酰胺、丙烯酰胺、丙烯腈是可能的R.boritolerans FW815腈水合酶诱导剂，诱导剂的添加量控制在0.05～5.0g/l范围内。在28～32℃诱导培养36～96h，获得具有2，2-二甲基环丙甲腈水合活性的发酵液，发酵液经离心、微滤等方法收集菌体，为后续生物转化提供高活力的生物催化剂R.boritolerans FW815菌体细胞，发酵液体积酶活达166.80U/ml。稳定性实验揭示，R.boritolerans FW815细胞可以重复使用4～6个批次。

所述反应体系中底物2，2-二甲基环丙甲腈浓度为10～100.0mM。

所述底物2，2-二甲基环丙甲腈可分3～6次投入至反应体系中，每次投入量为5～40.0mM。

所述含酶菌体细胞经回收后重复使用，可重复使用3～6个批次。

具体的，所述应用如下：

(1)R.boritolerans FW815接种至斜面培养基，25～35℃培养1～3天，得到斜面菌种于4℃保藏备用；所述斜面培养基成分终浓度如下：葡萄糖5.0～25.0g/L，酵母粉3.0～15.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0～8.0g/L，MgSO₄ 1.0～5.0×10^-1g/L，K₂HPO₄ 1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1～3.0×10^-2g/L，NaCl 0.5～2.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶剂为水，pH值自然；

(2)斜面菌种接种至种子培养基，25～35℃、100～300rpm振荡培养1～3天，得到种子液；种子培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～30.0g/L，酵母膏0.1～10.0g/L，NaCl 0.1～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，KH₂PO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，MgSO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，溶剂为水，pH 5～9；

(3)种子液以1～10％(v/v)接种量接种至发酵培养基，28～32℃培养36～96小时，发酵液分离收集菌体、生理盐水充分洗涤，得到含酶细胞；发酵培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～15.0g/L，酵母粉6～12.0g/L，蛋白胨1～5.0g/L，NaCl 0.5～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0g/L，KH₂PO₄ 0.5～2.0g/L，MgSO₄ 0.05～0.5g/L，己内酰胺0.05～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5～50.0×10^-3g/L，CaCl₂ 0.01～2.0g/L，溶剂为水，pH5～9；

(4)以纯水或磷酸盐缓冲液为溶剂配制反应体系，反应体系中含酶菌体细胞用量0.1～0.2g DCW/L、底物2，2-二甲基环丙甲腈浓度为10～100.0mM，于30±2℃下进行转化；

(5)转化结束后，转化液分离收集含酶菌体细胞，得到的澄清无细胞转化液经减压蒸馏、结晶，得到所述2，2-二甲基环丙甲酰胺。

所述反应体系溶剂优选为纯水，生物水合反应在50ml具塞锥形瓶中进行，移取0.25～0.50ml R.boritolerans CCTCC M 208108发酵液，离心收集细胞，R.boritolerans CCTCC M 208108细胞分散于10.0ml蒸馏水(细胞用量0.1～0.2g DCW/l)中，底物2，2-二甲基环丙甲腈摩尔浓度10～100.0mM，转化温度30℃，转化时间2～10min。在转化进程中，移取800.0μl转化液至1.5ml EP管，加入100.0μl 5.0mol/l HCl终止反应，再加入100.0μl5.0mol/l NaOH中和，6000～14000rpm离心5～20min，上清液经0.45μm微滤膜过滤，取透过液进行气相色谱分析，测定2，2-二甲基环丙甲腈与2，2-二甲基环丙甲酰胺的含量。

由于选择水为介质，转化体系非常单纯，仅由水、R.boritoleransCCTCC M 208108细胞和2，2-二甲基环丙甲腈组成；R.boritoleransCCTCC M 208108能高效转化2，2-二甲基环丙甲腈，转化液中仅存在微量的2，2-二甲基环丙甲腈，底物转化率接近100％，这样，充分生物水合后，转化液中主要由溶剂水、R.boritolerans CCTCC M 208108细胞和产物2，2-二甲基环丙甲酰胺组成。转化结束后，对转化液实施离心或微滤等固液分离操作，回收R.boritolerans CCTCC M 208108细胞用于下一个批次的生物转化，转化液经减压蒸馏，室温结晶，得到2，2-二甲基环丙甲酰胺晶体。

本发明中2，2-二甲基环丙甲腈和2，2-二甲基环丙甲酰胺分析都采用毛细管气相色谱方法：气相色谱仪型号GC-14C(Shimadzu，Japan)，毛细管柱型号UA-5(Frontier Lab，Japan)，进样口和检测器的温度均为220℃，柱温140℃，载气N₂，载气流速1.0ml/min。在此分析条件下，底物2，2-二甲基环丙甲腈、产物2，2-二甲基环丙甲酰胺的保留时间分别为1.55min和2.10min。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株具有高腈水合酶活性的微生物菌种——Rhodococcus boritolerans FW815，利用该菌产生的腈水合酶转化2，2-二甲基环丙甲腈制备2，2-二甲基环丙甲酰胺，反应介质为水，反应体系组成单纯，生物催化效率高，转化时间短，底物转化率高，产物2，2-二甲基环丙甲酰胺得率高且提炼工艺简单。

(四)附图说明

图1为有机腈生物代谢途径；

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：筛选具有催化2，2-二甲基环丙甲腈水合活性微生物菌株

采集浙江省内的化工厂周边的土样，取1.0g土样分散到10.0ml 0.95％生理盐水溶液中，充分混匀；取2.0ml菌悬液接种至50.0ml含1.0‰(v/v)2，2-二甲基环丙甲腈富集培养基(配制：10.0g葡萄糖，1.0gK₂HPO₄，0.2gMgSO₄，1.0gKH₂PO₄，0.002gFeSO₄·7H₂O，0.002g CoCl₂·6H₂O，0.015gCaCl₂，pH自然，水补足至1.0L；培养基121℃灭菌20分钟，冷却至室温后加入1.0mL 2，2-二甲基环丙甲腈，这里，外消旋2，2-二甲基环丙甲腈作为富集培养基的唯一碳源和氮源)中，在30℃、150rpm条件下振荡培养直至培养液浑浊；将第1批富集培养物按接种量2％(v/v)转接到新鲜的无菌富集培养基(同上)中，继续在30℃、150rpm条件下振荡培养3天，获得第2批富集培养物；如此重复3个循环，获得菌种分离所需的富集培养物。

对第3批富集培养物逐级稀释、涂布到固体平板上，30℃培养至形成明显的单菌落；将平板上形成的单菌落转接到无菌试管斜面(配制：葡萄糖15.0g，酵母粉7.5g，(NH₄)₂SO₄ 3.0g，NaCl 1.5g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄ 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.015g，20.0g琼脂，pH 7.0，水补足至1.0L，培养基121℃灭菌20分钟，冷却制成斜面)，30℃、150rpm培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。

对将保藏在试管斜面上的菌种逐一实施活力检测。自每一菌株的保藏斜面中挑取一接种环菌体接种到含300.0μl/L 2，2-二甲基环丙甲腈的无菌发酵培养基中，这里，2，2-二甲基环丙甲腈发挥诱导剂的作用，发酵培养基的配方如下：10.0g/L葡萄糖，5.0g/L酵母粉，2.0g/L蛋白胨，1.0g/LNaCl，1.0g/L K₂HPO₄，1.0g/L KH₂PO₄，0.2g/L MgSO₄，3.0×10^-2g/LFeSO₄·7H₂O，3.0×10^-2g/L CoCl₂，5.0×10^-2g/L CaCl₂，溶剂为水，pH 7.0。30℃、150rpm培养2天，收集发酵液。各移取10.0ml发酵液，9000rpm离心8min，弃上清，收集菌体，菌体用10.0ml生理盐水洗涤3次，再用10.0ml pH7.0磷酸缓冲液(50.0mM)将洗涤过的细胞分散在转化瓶中，置于水浴摇床30℃预热5min，加入底物20.0μl，反应10min，取800.0μl转化液，加100.0μl 5.0M HCl终止反应，加入100.0μl 5.0M NaOH中和转化液，10,000rpm下离心10min，上清液采用0.45μm微滤膜过滤。得到的澄清的滤液进行气相色谱分析2，2-二甲基环丙甲酰胺浓度，计算各支菌种的腈水合酶活力。在筛选菌株中，R.boritolerans FW815(CCTCC M208108)活力最强。

实施例2：生物催化剂R.boritolerans CCTCC M 208108细胞制备

从本发明选育得到的新腈水合酶产生菌种R.boritolerans CCTCC M208108的试管斜面上挑取一环菌体，接种至20.0ml无菌种子培养基(配制：葡萄糖10.0g，酵母膏3.0g，NaCl 1.0g，K₂HPO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.3g，MgSO₄ 0.2g，pH自然，水补足至1.0L。培养基121℃灭菌20分钟)中，30℃、150rpm条件下振荡培养24h。

考察不同诱导剂的诱导效果，设计对照组发酵培养基，组成为：10.0g/l葡萄糖，8.0g/l酵母粉，1.0g/l KH₂PO₄，1.0g/l K₂HPO₄，1.0g/l NaCl，0.2g/l MgSO4，0.01g/l FeSO4，0.05g/l CaCl₂，溶剂为水；实验组发酵培养基分别在对照发酵培养基中添加1.0g/l谷氨酸钠、己内酰胺、尿素、乙酰胺、2，2-二甲基环丙甲腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺等化合物。实验组和对照组发酵培养基调节至pH7.0，121℃灭菌20min。

种子液以2％(v/v)接种量转接至装有50.0ml无菌发酵培养基的250ml的三角瓶中，30℃，150rpm，摇床培养48h。对照组和谷氨酸钠、己内酰胺、尿素、乙酰胺、2，2-二甲基环丙甲腈、2，2-二甲基环丙甲酰胺试验组发酵液的体积酶活分别为95.2U/ml，105.7U/ml，153.7U/ml，111.6U/ml，114.2U/ml，119.5U/ml，96.3U/ml。

收集诱导剂为己内酰胺的发酵液，10,000rpm离心10min后，弃上清收集菌体，菌体用0.95％生理盐水洗涤3次，菌体再用10.0ml pH7.0磷酸缓冲液(50mM)洗涤一次，收集的菌泥即为具有(±)-2，2-二甲基环丙甲腈水合酶活性生物催化剂，4℃冰箱保藏、备用。

实施例3：磷酸盐缓冲体系中2，2-二甲基环丙甲酰胺生物转化

2，2-二甲基环丙甲酰胺生物合成选用本发明制备的生物催化剂R.boritolerans CCTCC M208108菌体细胞。转化体系选择10.0ml pH7.0磷酸缓冲液(50.0mM)，R.boritolerans CCTCC M 208108细胞终浓度0.1gDCW/L，底物分3批投料，每批添加5.0μL2，2-二甲基环丙甲腈，转化温度30℃，每批转化5min，合计转化时间15min。转化结束后，10,000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清液，转化液再经0.45μm微滤膜过滤，透过液经气相色谱分析，3批转化率分别为100％、99.1％和100％，产物2，2-二甲基环丙甲酰胺累积浓度1.07×10^-2M。

实施例4：蒸馏水体系中(±)-2，2-二甲基环丙甲酰胺生物转化

2，2-二甲基环丙甲酰胺生物合成选用本发明制备的生物催化剂R.boritolerans CCTCC M 208108，4℃保藏R.boritolerans CCTCC M 208108细胞采用蒸馏水洗涤3次，按终浓度0.1g DCW/l分散至10.0ml蒸馏水中，底物分4批投料，每批添加5.0μl 2，2-二甲基环丙甲腈，转化温度30℃，每批转化5min，合计转化时间20min。转化结束后，10,000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清液，转化液再经0.45μm微滤膜过滤，透过液经气相色谱分析，转化液中检测不到底物2，2-二甲基环丙甲腈存在，从转化液中提炼到约15.7mg 2，2-二甲基环丙甲酰胺。

Claims

1.Rhodococcus boritolerans FW815，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学430072，保藏编号CCTCC No：M208108，保藏日期2008年07月14日。

2.R.boritolerans FW815在生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：在以2，2-二甲基环丙甲腈为底物、R.boritolerans FW815发酵产生的腈水合酶为催化剂、水或磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于25～35℃下转化2～10分钟，反应结束后反应液经分离纯化得到所述2，2-二甲基环丙甲酰胺。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述腈水合酶来自含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞由如下方法制得：R.boritolerans FW815接种至含铁离子的适用于R.boritolerans的发酵培养基中28～32℃培养36～96小时，得到发酵液经分离得到所述含酶菌体细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中含酶菌体细胞用量为0.1～0.2g DCW/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述适用于R.boritolerans的发酵培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～15.0g/L，酵母粉6～12.0g/L，蛋白胨1～5.0g/L，NaCl 0.5～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0g/L，KH₂PO₄0.5～2.0g/L，MgSO₄ 0.05～0.5g/L，己内酰胺0.05～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O0.5～50.0×10^-3g/L，CaCl₂ 0.01～2.0g/L，溶剂为水，pH5～9。

7.如权利要求3～6之一所述的应用，其特征在于所述反应体系中底物2，2-二甲基环丙甲腈浓度为10～100.0mM。

8.如权利要求3～6之一所述的应用，其特征在于所述底物2，2-二甲基环丙甲腈分3～6次投入至反应体系中，每次投入量为5～40.0mM。

9.如权利要求3～6之一所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞经回收后重复使用。

10.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用如下：

(1)R.boritolerans FW815接种至斜面培养基，25～35℃培养1～3天，得到斜面菌种于4℃保藏备用；所述斜面培养基成分终浓度如下：葡萄糖5.0～25.0g/L，酵母粉3.0～15.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0～8.0g/L，MgSO₄1.0～5.0×10^-1g/L，K₂HPO₄ 1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 1.0～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1～3.0×10^-2g/L，NaCl0.5～2.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，溶剂为水，pH值自然；

(2)斜面菌种接种至种子培养基，25～35℃、100～300rpm振荡培养1～3天，得到种子液；种子培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～30.0g/L，酵母膏0.1～10.0g/L，NaCl 0.1～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，KH₂PO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，MgSO₄ 0.5～5.0×10^-1g/L，溶剂为水，pH5～9；

(3)种子液以1～10％体积比接种量接种至发酵培养基，28～32℃培养36～96小时，发酵液分离收集菌体、生理盐水洗涤，得到含酶菌体细胞；发酵培养基成分终浓度如下：葡萄糖5～15.0g/L，酵母粉6～12.0g/L，蛋白胨1～5.0g/L，NaCl0.5～3.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0g/L，KH₂PO₄0.5～2.0g/L，MgSO₄0.05～0.5g/L，己内酰胺0.05～5.0g/L，FeSO₄·7H₂O0.5～50.0×10^-3g/L，CaCl₂ 0.01～2.0g/L，溶剂为水，pH5～9；

(4)以纯水或磷酸盐缓冲液为溶剂配制反应体系，反应体系中含酶菌体细胞用量0.1～0.2g DCW/L、底物2，2-二甲基环丙甲腈浓度为10～100.0mM，于30±2℃转化2～10分钟；

(5)转化结束后，转化液分离收集含酶菌体细胞，得到澄清无细胞转化液经减压蒸馏、结晶，得到所述2，2-二甲基环丙甲酰胺。