CN102140428A - 假单胞交替菌dhq25的培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
假单胞交替菌DHQ25的培养基及其制备方法，涉及一种培养基。提供一种适合于培养假单胞交替菌DHQ25，可显著提高其细胞密度的假单胞交替菌DHQ25的培养基及其制备方法。培养基组成(单位为g/L)为蛋白胨13～13.5，酵母粉4～4.5，葡萄糖0.05～0.15，NaCl 20～30，MgSO4·7H2O 0.1～0.3，CaCl2·2H2O 0.4～0.6，KCl 0.03～0.09，K2HPO4 0.04～0.06，KH2PO4 0.04～0.06，Fe2(SO4)3 0.0015～0.0025，用蒸馏水定容至1L。制备时，先PB设计实验，再做最速上升实验，最后进行中心组合设计。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种采用PB设计法与响应面法相结合确定其最佳培养基组成，用以获得较高细胞密度及杀藻活性物质的假单胞交替菌DHQ25的培养基及其制备方法。
背景技术
赤潮是在特定的环境条件下，海水中某些浮游植物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。赤潮的发生对海洋生态平衡、全人类健康及海洋产业经济社会效益都产生巨大的负面影响。目前，赤潮已成为一种世界性的公害，美国、日本、中国、加拿大、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国、香港等30多个国家和地区赤潮发生都很频繁。因此，研究赤潮防治方法，制定有关防治对策已经成为许多国家和地区的当务之急。目前藻类的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。生物方法是利用生物本身的一些特性来治理赤潮，因此较存在种种实用性局限的情况下生物法是一种比较可行又不会给生态环境带来负面影响的途径。生物防治方法主要是利用动物、植物和微生物相互之间的生态关系来消除赤潮，其中利用溶藻细菌等方法对有害赤潮进行生物防治是国内外研究热点。
在微生物控制试剂控制藻类生长研究中，细菌发挥重要作用。溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。当前国内对溶藻细菌及其活性代谢物的研究尚处于初步阶段。因此在这个阶段，关于溶藻细菌包括培养基成分、培养条件及菌株代谢情况的基础研究显得更为重要，清楚地认识溶藻细菌的生存及代谢对于溶藻物质的产生分离有着至关重要的认识，这将从源头提高人们对溶藻细菌及溶藻物质的认识与了解，为进一步分离活性物质、剖析溶藻机制打下基础。
培养基优化是一个非常繁琐的工作，同时起始成分及水平的设计也是非常重要的。如今，关于培养基筛选优化的方法有很多，包括单因素法、正交实验设计、PB(Plackett-Burman)设计法、全因子实验设计及均匀设计及响应曲面方法等。
PB设计法(Demain AL，Solomon NA.Manual of industrial microbiology and biotechnology.Washington DC：American Society for Microbiology，1986)是一种基于非完全平衡块原理的近饱和多因子两水平试验设计方法，它虽不能考察各因子之间的交互作用，但它利用软件设计最少实验数，从众多因素中快速有效筛出对评价指标影响显著的若干因子。响应面法是数学方法和统计方法结合的综合技术，它利用合理的试验设计及结果建立连续变量曲面模型，采用多元二次回归方程来考察因子间相互作用关系，最终目的是优化响应值。该方法具备试验次数少、周期短与精度高等优点，可弥补以前微生物优化中的一些不足，因而近年来广泛应用在加工工艺、生物技术及化学工程等领域中。
目前，国内对杀藻菌及其活性物质的研究尚处于起步阶段，通过杀藻细菌筛选高效专一，能够生物降解的杀藻物质尤其是活性蛋白，已为新型杀藻剂的研发利用提供了一个崭新的思路。而为了将该类活性蛋白物质应用于实践中，首先遇到的问题就是培养基成分及其培养过程的优化。微生物细菌的发酵是一个复杂而值得探索的过程，培养的细菌浓度直接关系到胞外蛋白类活性物质的产量，而通过培养基的优化时提高菌浓最有效最直接的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合于培养假单胞交替菌DHQ25，可显著提高其细胞密度的假单胞交替菌DHQ25的培养基及其制备方法。
所述假单胞交替菌DHQ25(Pseudoalteromonas sp.DHQ25)已于2010年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010210，中国典型培养物保藏中心的地址为中国武汉武汉大学。
本发明所述假单胞交替菌DHQ25的培养基的组成可为蛋白胨13～13.5g/L，酵母粉4～4.5g/L，葡萄糖0.05～0.15g/L，NaCl 20～30g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L，CaCl2·2H2O0.4～0.6g/L，KCl 0.03～0.09g/L，K2HPO40.04～0.06g/L，KH2PO40.04～0.06g/L，Fe2(SO4)30.0015～0.0025g/L，用蒸馏水定容至1L。
本发明所述假单胞交替菌DHQ25的培养基的组成最好为蛋白胨13.24g/L，酵母粉4.31g/L，葡萄糖0.1g/L，NaCl 25g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，KCl 0.06g/L，K2HPO40.05g/L，KH2PO40.05g/L，Fe2(SO4)30.002g/L，用蒸馏水定容至1L。
本发明所述假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法如下：
1)PB设计实验：挑取假单胞交替菌DHQ25的单菌落于海洋细菌液体培养基中活化和培养后，接种于起始液体培养基中，再摇床培养，测定菌浓(OD600)，求出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程；
在步骤1)中，所述活化和培养的条件可为：20～30℃，120～200r/min培养8～12h；所述起始液体培养基的组成可为：蛋白胨3g、酵母粉1g、葡萄糖0.1g、NaCl 25g、MgSO4.7H2O0.2g、CaCl2.2H2O 0.5g、KCl 0.06g、K2HPO40.05g、KH2PO40.05g、Fe2(SO4)30.002g，蒸馏水定容至1L；所述摇床培养的时间可为16～24h；所述求出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程，可将测定的菌浓(OD600)取平均值，再利用软件分析得出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程Y(OD600)＝110144+0.166×蛋白胨(g/L)+0.1045×酵母粉(g/L)。
2)最速上升实验：设计最速上升实验的培养基成分，其中的非主要影响因子水平不变而改变一次方程中的显著因素水平值，并设计步长，进行上升实验，通过实验逐步逼近菌浓的最高值；
在步骤2)中，所述设计步长，其中蛋白胨实际步长为1g/L，酵母粉为0.315g/L；所述菌浓的最高值是假单胞交替菌DHQ25菌浓的最高值可达1.985。
3)中心组合设计：菌株活化及培养方法与步骤1)相同，以最速上升实验中的最高点为中心点，测定菌浓，得响应面和拟合的二次方程，最后得最优配方。
在步骤3)中，所述测定菌浓时，可采用中心试验次数为5，星号臂长为1.414进行实验；所述拟合的二次方程为Y(OD600)＝1.97280+0.01653×蛋白胨+0.01361×酵母粉-0.05930×(蛋白胨)2-0.04030×(酵母粉)2。
本发明以2216E培养基(一种常用的培养海洋细菌的简单复合培养基)为基础，考察了培养基组成和浓度等对假单胞交替菌DHQ25摇瓶生长状况的影响，并结合使用PB设计法及响应曲面法(response surface methodology，RSM)对培养基组分及浓度进行了优化，给出一种适合高密度培养假单胞交替菌DHQ25的复合型培养基。
首先，考虑到陈海水成分不明确，且批次间存在不明差异，因此本发明选用蒸馏水作为培养基配制用水，成分设计上以2216E为基础培养基，利用PB设计法考察了因子(X1)蛋白胨、(X2)酵母粉、(X3)葡萄糖、(X4)NaCl、(X5)MgSO4.7H2O、(X6)CaCl2.2H2O、(X7)KCl、(X8)K2HPO4、(X9)KH2PO4、(X10)Fe2(SO4)3对菌株DHQ25生长浓度(OD600)的影响，以筛选主要影响因子。
其次，本发明利用最速上升实验在非主要影响因子水平不变的情况下通过主要影响因子水平按规范步伐上升来逼近主要影响因子最优量的曲面，目的是为了使后续响应面优化法的顺利进行。
最后，本发明采用响应曲面法中的中心组合设计拟合主要影响因子对响应值Y(OD600)的响应面回归方程，以确定最优培养基水平值。
由于培养基优化是一项量大且复杂的工作，在本发明中首先选择几种复合营养源，即那些既可以作为碳源又可作氮源的营养物质(如蛋白胨、酵母粉等)，然后在它们的基础上添加不同微量成分，考察各成分对杀藻菌的生长及产活性物质的影响。具体的是以2216E为基础培养基(无碳源、氮源)，以3g/L蛋白胨，1g/L酵母粉，0.1g/L葡萄糖为复合营养源，其余组分含量基本同于基础培养基，利用PB设计表配制培养基，以菌浓OD600作为考察指标，并于摇瓶培养24h后测定菌浓。结果表明，蛋白胨及酵母粉对菌体生长浓度的影响相对其他因子显著，选为主要影响因子。随后根据回归的线性模型在3g/L蛋白胨及1g/L酵母粉的基础上进行最速上升实验，结合菌浓考察增多的量是否对杀藻菌存在促进作用，发现试验范围内的最优点应该在蛋白胨13g/L，酵母粉4.15g/L附近。最后利用响应面设计法中的中心组合设计进行实验。各个实验均利用Minitab软件(Montgomery D C.Design and analysis of experiments[M].New York：John Wiley & Sons，1991：35-40.)对实验值进行回归分析，最终建立回归模型。
试验表明，假单胞交替菌DHQ25能够分泌胞外蛋白类活性物质，以间接方式对宿主藻类起抑制甚至杀灭作用。
所述假单胞交替菌DHQ25分离自长江口及其毗邻海域，具备海洋细菌的特征同时，假单胞交替菌DHQ25生长较快，但生长密度不够高，菌株分泌的胞外蛋白类抑藻活性物质的量较少，不利于后续分离工作的进行。基于这一不足，培养基成分优化以提高胞外产物量及杀藻效果是有必要的。而培养基是人为提供给菌体生长、繁殖和合成产物之用，为使菌体生长达到高密度势必要设计一种含有必须成分的平衡性营养培养基。2216E培养基作为分离、培养海洋细菌的传统培养基在实践中具有重要作用，但是不可否认的是不同的细菌有不同的营养需求，寻找这种特殊的营养需求对突破优化瓶颈具有显著效用。故急需对该杀藻菌培养基进行优化，从而促进杀藻物质的产生和杀藻剂的研制。
本发明所述假单胞交替菌DHQ25的培养基用于提高假单胞交替菌DHQ25的细胞密度和杀藻物质产量。
附图说明
图1为本发明实施例优化后假单胞交替菌DHQ25的生长曲线及相应杀藻率。在图1中，横坐标为时间/h，左纵坐标为菌浓，右纵坐标为杀藻率(％)；○为菌浓，■为杀藻率。
图2为本发明实施例高倍镜下正常塔玛亚历山大藻。
图3为本发明实施例高倍镜下假单胞交替菌DHQ25的溶藻过程。在图3中，A：2h，B：4h，C：6h，D：8h，E：12h，F：16h。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但不用于限制本发明的范围。
1.菌种、藻种与培养基
菌种：假单胞交替菌DHQ25来源于厦门大学资源与环境微生物研究所于2003年赤潮973项目MC2003-2航次从长江口及其毗邻海域海水样品中分离并筛选到的，是一株具有杀藻作用的弧菌属γ-Proteobacteria类群。依靠分泌胞外蛋白类物质杀灭有毒赤潮藻塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense，简称A.T.。
藻种：塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense无菌株，藻种系由暨南大学水生生物研究所提供，经本实验室无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养液为f/2培养液，置于室内三角瓶中培养，温度为20±1℃，光照条件为12h光照；12h黑暗。
初始培养基(2216E)：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g(固体培养基)，pH7.6-7.8，陈海水定容到1L。
2.实验方法：
2.1PB设计实验：挑取假单胞交替菌DHQ25的单菌落于海洋细菌液体培养基中活化，在20～30℃、120～200r/min培养8～12h，按比例接种于经设计的优化起始液体培养基中，摇床培养16～24h，测定菌浓(OD600)，取平均值利用软件分析，若分析得出模型及包含显著因素，根据拟合的线性方程进行2.2实验；若模型不成立或未寻找到显著因素，更改初始培养基成分比例再进行PB实验。
2.2最速上升实验：菌株活化培养方法如2.1，培养基成分中的非主要影响因子水平不变而改变显著因素水平值，并设计合理步长来逐步逼近菌浓的最高值，并确保最高值前后的菌浓都比该最高值小。
2.3中心组合设计：这是响应面法中的一种方法。菌株活化及培养方法如2.1，以最速上升实验中的最高点为中心点，选择合适的设计表进行实验，测定菌浓并用软件分析，若分析得出凹面响应面，则可拟合方程，寻求最优配方；若得出其他不规则如马鞍型曲面等，无法寻找最高点，则重新进行实验。
3.测定方法
浊度测定法：取适当原液或是稀释的菌体发酵液，以空培养基做对照，在波长600nm下测定光密度(OD)值。
杀藻率：取发酵培养后的无细胞滤液，添加入测试藻类中，作用12-24h后用卢戈氏液固定，在光学显微镜下计数。
杀藻率(％)＝(NC-NT)/NC×100，式中NC表示对照组中的活细胞数，NT表示实验组中的活细胞数。
实施例1 PB设计
本次PB设计的(X1)蛋白胨、(X2)酵母粉、(X3)葡萄糖、(X4)NaCl、(X5)MgSO4.7H2O、(X6)CaCl2.2H2O、(X7)KCl、(X8)K2HPO4、(X9)KH2PO4、(X10)Fe2(SO4)3所选因子及其初始水平见表1。其中，-1代表低水平，+1代表高水平，响应值Y为菌浓(OD600)。PB设计表及实验结果见表2，对此结果利用软件进行的方差分析如表3所示，(X1)蛋白胨及(X2)酵母粉为主要影响因素，它们均在0.05水平上显著，且显著性顺序：蛋白胨＞酵母粉。其余因素不显著，故在后续实验中浓度值控制在中心点(见表1)作为恒量，重点考察蛋白胨与酵母粉对响应值的影响效果。
表1水平与因子的实际浓度的对应关系
表2PB试验设计及结果
表3PB设计方差分析表
表4确定方向的第一批因子实验
表5一阶模型的方差分析表
为了探索并确定蛋白胨与酵母粉双因子的爬坡方向，进行含有五个中心点22析因设计实验，中心点的重复用来估计实验误差，其他成分浓度固定在中心点。22全因子设计的数据见表4，表5对一阶模型实验进行方差分析，从中可看出线性回归的F检测是显著的，交互作用不显著，同时失拟系数不显著说明该模型能很好地拟合实验数据。
拟合的一阶模型：Y(OD600)＝110144+0.166×蛋白胨(g/L)+0.1045×酵母粉(g/L)
故此，选择蛋白胨及酵母粉作为主要影响因子按拟合的一阶模型：
Y(OD600)＝110144+0.166×蛋白胨(g/L)+0.1045×酵母粉(g/L)
进行后续的最速上升实验。
实施例2最速上升实验设计
由拟合的一阶模型可知蛋白胨与酵母粉的系数都是正的，说明它们的量增加将有利于菌体浓度增加，所以要沿最速上升路径移动，就要沿蛋白胨与酵母粉均增大的方向进行爬坡实验。实验设计与结果见表6，设计中规定蛋白胨规范变量基本步长λ1＝1，则酵母粉规范变量的基本步长λ2及其它们与蛋白胨和酵母粉实际步长Δξ1，Δξ2的换算如下：
λ2＝(0.1045/0.166)×λ1＝0.63 Δξ1＝λ1×1＝1 Δξ2＝λ2×0.5＝0.315
从表6可以看出蛋白胨与酵母粉的浓度分别增加到第10点的13g/L与4.15g/L的过程中，响应值一直是在升高的，之后响应值在减少，这表明试验范围内的最优点很可能在该点附近。
表6最速上升实验设计表及结果
实施例3响应面设计
根据最速上升实验结果，以原点+10ξ为中心点，最速上升实验中的两倍步长作为中心组合设计步长，选择中心试验次数为5，星号臂长为1.414，除了酵母粉与蛋白胨的量变化，其他因素固定在中心点进行实验。中心组合设计及结果如表7所示。
表7中心组合设计
表7的前9组实验其实是带有五个中心点的22实验，对此进行的方差分析(表8)可知，一次项和交互作用都非显著，说明一阶模型已不合适，纯二次项显著，试验结果已接近最优点，结合表7的后4组实验构成带有4个轴向点的5水平中心组合设计。中心组合设计的方差分析见表9，从表中可以看出拟合不足不显著，回归显著，可以证明此二阶模型近似于真实曲面。
Minitab软件拟合的二次方程为：
Y(OD600)＝1.97280+0.01653×蛋白胨+0.01361×酵母粉-0.05930×(蛋白胨)2-0.04030×(酵母粉)2
回归的相关系数R2为86.3％，可能由于交互作用不显著省去该项，使得该系数小于90％，但是也说明在考察范围内大部分实验数据(86.3％)能用该模型解释。
表8带有5个中心点的22设计的方差分析表
表9二阶模型的方差分析
根据软件分析寻找最高点，该假单胞交替菌DHQ25的的最佳培养基配方(g/L)为：蛋白胨13.24，酵母粉4.31，葡萄糖0.1，NaCl 25，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.5，KCl 0.06，K2HPO40.05，KH2PO40.05，Fe2(SO4)30.002，用蒸馏水定容至1L。
实施例4验证试验
从响应曲面图及回归的方程可看出，该模型存在极值，且为最大值。根据软件估计的极值，转换到未编码值蛋白胨＝13.24g/L，酵母粉＝4.31g/L。再从方程中任取两点进行模型验证实验，结果见表10。
表10中心组合实验验证结果
验证结果最高点的菌浓平均可达到1.984，与预测值比较表明，该模型能够较好地预测假单胞交替菌DHQ25的发酵菌浓，数值的出入可能是由于菌种活化过程中存在的偏差所致，但总的来说，回归方程在考察浓度范围内能够进行有效预估。
Claims (10)
1.假单胞交替菌DHQ25的培养基，其特征在于所述假单胞交替菌DHQ25已于2010年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010210；
所述假单胞交替菌DHQ25的培养基的组成为蛋白胨13～13.5g/L，酵母粉4～4.5g/L，葡萄糖0.05～0.15g/L，NaCl 20～30g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L，CaCl2·2H2O 0.4～0.6g/L，KCl 0.03～0.09g/L，K2HPO4 0.04～0.06g/L，KH2PO40.04～0.06g/L，Fe2(SO4)30.0015～0.0025g/L，用蒸馏水定容至1L。
2.如权利要求1所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基，其特征在于其组成为蛋白胨13.24g/L，酵母粉4.31g/L，葡萄糖0.1g/L，NaCl 25g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，KCl 0.06g/L，K2HPO40.05g/L，KH2PO40.05g/L，Fe2(SO4)30.002g/L，用蒸馏水定容至1L。
3.如权利要求1所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)PB设计实验：挑取假单胞交替菌DHQ25的单菌落于海洋细菌液体培养基中活化和培养后，接种于起始液体培养基中，再摇床培养，测定菌浓OD600，求出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程；
2)最速上升实验：设计最速上升实验的培养基成分，其中的非主要影响因子水平不变而改变一次方程中的显著因素水平值，并设计步长，进行上升实验，通过实验逐步逼近菌浓的最高值；
3)中心组合设计：菌株活化及培养方法与步骤1)相同，以最速上升实验中的最高点为中心点，测定菌浓，得响应面和拟合的二次方程，最后得最优配方。
4.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述活化和培养的条件为：20～30℃，120～200r/min培养8～12h。
5.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述起始液体培养基的组成为：蛋白胨3g、酵母粉1g、葡萄糖0.1g、NaCl 25g、MgSO4.7H2O 0.2g、CaCl2.2H2O 0.5g、KCl 0.06g、K2HPO40.05g、KH2PO40.05g、Fe2(SO4)30.002g，蒸馏水定容至1L。
6.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇床培养的时间为16～24h。
7.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述求出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程，是将测定的菌浓OD600取平均值，再利用软件分析得出显著因素蛋白胨与酵母粉及拟合的一次方程Y(OD600)＝1.10144+0.166×蛋白胨(g/L)+0.1045×酵母粉(g/L)。
8.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述设计步长，其中蛋白胨实际步长为1g/L，酵母粉为0.315g/L。
9.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述菌浓的最高值是假单胞交替菌DHQ25菌浓的最高值。
10.如权利要求3所述的假单胞交替菌DHQ25的培养基的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述测定菌浓时，是采用中心试验次数为5，星号臂长为1.414进行实验；所述拟合的二次方程为Y(OD600)＝1.97280+0.01653×蛋白胨+0.01361×酵母粉-0.05930×(蛋白胨)2-0.04030×(酵母粉)2。
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| CN101457214A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-06-17 | 中国石油大学(北京) | 一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法 |
| CN101481665A (zh) * | 2008-12-30 | 2009-07-15 | 浙江工业大学 | 生物催化法制备2,2-二甲基环丙甲酰胺及其菌株 |
-
2010
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101481665A (zh) * | 2008-12-30 | 2009-07-15 | 浙江工业大学 | 生物催化法制备2,2-二甲基环丙甲酰胺及其菌株 |
| CN101457214A (zh) * | 2009-01-09 | 2009-06-17 | 中国石油大学(北京) | 一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 贺魏等: "恶臭假单胞菌S1产胞内海藻糖合成酶发酵培养基的优化", 《生物加工过程》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967647A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-07-21 | 大连市水产技术推广总站 | 一种叶氏假交替单胞菌及其应用方法 |
| CN106967647B (zh) * | 2017-05-03 | 2020-06-30 | 大连市现代农业生产发展服务中心 | 一种叶氏假交替单胞菌及其应用方法 |
Also Published As
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|---|---|
| CN102140428B (zh) | 2012-11-14 |
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