CN105177084B - 一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法 - Google Patents

Abstract

本法发明公布了一种利用菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，所述生产高品质低聚果糖的酶解工艺包括最优的菊芋添加量，pH，缓冲液浓度，酶的添加量，温度，搅拌速度和反应时间。所形成的酶解工艺可以实现低聚果糖占总糖含量达95.78％以上的高效生产过程。本发明所述使用的菊粉酶是一种新型的菊粉酶突变体，具有较高的酶活，30m³体系下发酵液酶活达60000U/mL，可显著提高菊粉酶的生产效率，降低生产成本。本发明形成的低聚果糖的酶解工艺是一种新工艺，采用该工艺制备低聚果糖可以大大降低操作难度，节约经济成本。

Description

一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法

技术领域：

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种菊粉酶发酵生产低聚果糖的方法。

背景技术：

低聚果糖(Fructooligosaccharides)，简称FOS，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖,分子式为:G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。它是由β-D-果糖基通过β-2,1糖苷键连接而成的直链低聚糖。目前，工业上生产低聚果糖的两种方法，酶法转化蔗糖合成的蔗果低聚糖和由菊粉部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功能基本一样。都具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。所以低聚果糖的工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。

菊粉(Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经β-2,1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构，聚合度通常在2～60，分子量为3000～5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准菊粉为新资源食品。

目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之一。利用重组DNA技术菊粉酶基因酵母菌进行克隆和表达，实现菊粉酶的高效表达。目前国内江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖所用的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。因此，菊粉酶制剂国产化对于低聚果糖的生产和应用显得非常重要。

酶法转化蔗糖工业化大规模合成的蔗果低聚糖，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量≤55％～60％(干基)，且工艺复杂、生产成本高。而本专利所涉及到的菊粉酶，可高效水解菊粉长链为低聚糖，还不增加单糖副产物，低聚果糖含量高达95.78％以上，工艺简单，是一种生产低聚果糖的新工艺。

发明内容：

本发明解决上述问题所采用的技术方案是，以新鲜菊芋为原料，灭酶打浆后浸提2-8h，收集清液，清液经碱处理、除杂并脱色后作为反应原液，调节pH 3.8～7.9，按每Kg菊芋添加菊粉酶650000～2000000U，控制温度在20～80℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～12h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品；

所述菊粉酶氨基酸序列如核苷酸序列表SEQ ID No.5所示。

所述菊粉酶是一种通过基因工程手段获得的酶活性显著提高的菊粉酶突变体，所述突变体是以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板逆转录扩增出菊粉酶基因，经密码子优化后，继而利用易错PCR等体外分子定向进化技术，对菊粉酶基因inuI进行分子改良，并对获得的突变位点进行定点突变组合而得。目前报道的文献中，未有采用此方法来提高菊粉酶酶活。

本发明的有益效果如下：

1、上述生产高品质低聚果糖的酶解工艺包括最优的菊芋添加量，pH，缓冲液浓度，酶的添加量，温度，搅拌速度和反应时间。所形成的酶解工艺可以实现低聚果糖占总糖含量达95.78％以上的高效生产过程。本发明形成的低聚果糖的酶解工艺是一种新工艺，采用该工艺制备低聚果糖可以大大降低操作难度，节约经济成本。

2、本发明所述使用的菊粉酶具有较高的酶活，30m³体系下发酵液酶活达60000～65000U/mL，可显著提高菊粉酶的生产效率，降低生产成本。

附图说明：

图1不同Mn²⁺浓度下的易错PCR；

其中，M-GeneRuler 1kb DNA Ladder；1-对照；2-7：分别为不同Mn²⁺浓度下(0.05mmol/L,0.1mmol/L,0.15mmol/L,0.2mmol/L,0.25mmol/L,0.3mmol/L)的PCR产物

图2重组质粒的单酶切(Nco I)验证；

M-GeneRuler 1kb DNA Ladder

图3以重组菌的基因组为模板进行的PCR验证；

其中，M-GeneRuler 1kb DNA Ladder；1-3：三个不同重组菌的PCR验证图

图4.低聚果糖的制备工艺流程图

图5.低聚果糖产品的成分分析

其中，1-果二糖 2-果果三糖 3-蔗果三糖 4-果果四糖 5-蔗果四糖 6-果果五糖7-蔗果五糖。

具体实施方式：

实施例中涉及到的培养基配方(单位为w/v)如下：

(1)LB液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。

(2)PDA培养基：马铃薯200g切小块，煮沸后再煮30min，纱布过滤后定容1L使用。使用时按葡萄糖20g/L，琼脂20g/L加入。

(3)YPD培养基：酵母膏1％,蛋白胨2％,葡萄糖2％，制作平板时加入琼脂粉2％。121℃高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25mg/mL～2.0mg/mL，即YPD-G418平板。

(4)MD培养基：无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂粉2％。

(5)BMGY培养基：酵母膏1％，蛋白胨2％，无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，甘油1％，磷酸钾溶液100mmol/L。

(6)BMMY培养基：酵母膏1％，蛋白胨2％，无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10^-5％，甲醇0.5％，磷酸钾溶液100mmol/L。

(7)BMMYI培养基：BMMY培养基里加2％的菊芋和2％琼脂粉。

(8)BSM培养基：磷酸(85％)2.67％，硫酸钙0.118％，硫酸钾1.82％，硫酸镁0.727％，氢氧化钾0.413％，甘油4％。

实施例1：inuI基因的克隆及密码子优化

重组质粒的构建：采用TRNzol总RNA提取试剂提取黑曲霉NRRL3135的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA，然后分别以第一链cDNA为模板，以引物F1(SEQ ID NO:6)和R1(SEQ ID NO:7)进行PCR扩增出黑曲霉菊粉酶基因inuI。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用EcoR I和Not I进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escherichia coli JM109感受态细胞。筛选阳性转化子，并提取其质粒进行酶切验证。再将酶切验证正确的重组质粒进行测序(序列SEQ ID NO:1)，构建正确的重组质粒命名为pPIC9K-inuI。

密码子优化：以上述构建正确的重组质粒pPIC9K-inuI为基础，通过网站http://www.jcat.de/，优化菊粉酶编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报，2007,13(4)：515-518)，获得密码子优化的编码菊粉酶的新基因inuI’(序列SEQ ID NO:2)，其氨基酸序列与SEQ ID NO:3相同。将inuI’克隆入表达载体pPIC9K的EcoR I、Not I位点中，获得相应的重组表达质粒pHY-inuI’。

实施例2：利用易错PCR方法构建黑曲霉菊粉酶突变文库

在体外利用易错PCR技术向密码子优化的黑曲霉菊粉酶基因inuI’引入核苷酸突变(图1)。易错PCR的反应条件如下：

其中，引物F2(SEQ ID NO:8)和R2(SEQ ID NO:9)序列(5’-3’)分别为：

上游引物F2：CCGGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTTCATAC

下游引物R2：ATAAGAATGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCCGC

PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1.5min，30个循环；72℃10min。

易错PCR扩增产物经DNA纯化回收试剂盒纯化后，用限制性内切酶EcoR I和Not I对其进行酶切，并与经过相应酶切的质粒pPIC9K进行连接，转化至E.coli JM109感受态细胞，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB固体培养基平板上。37℃、200rpm培养12h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得突变质粒,。

将突变质粒经限制性内切酶Sal I线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化液涂布于MD平板上，30℃培养2天，构成突变文库。

按照上述的方法，以突变体基因组为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。

实施例3：高酶活菊粉酶突变体的筛选

用灭菌牙签将MD平板上生长出的His⁺转化子复制到YPD和含有BMMYI平板的相同位置，同时将对照菌GS115/pPIC9K-inuI’(不经过易错PCR，制备过程同实施例2的产物)接种至BMMYI平板上。30℃培养2天，并保存生长好的YPD平板。

平板初筛：将突变菌株在BMMYI平板上诱导2～3天。平板上菌落周围的透明圈比对照菌GS115/pPIC9K-inuI’大的菌株为初筛目的突变菌株。

96孔板复筛：向1.8mL/孔(平底)的96孔板中加入300μL BMGY培养基，121℃灭菌20min。向其中接入保藏于YPD平板上的初筛目的菌株(同时接入GS115/pPIC9K-inuI’作对照)，30℃ 200r/min振荡培养至OD₆₀₀为2～6(约16～18h)。离心，弃上清，用900μL BMMY培养基重悬菌体，并加入1％(V/V)甲醇诱导菊粉酶表达。此后每24h补加100μL BMMY培养基和1％(V/V)甲醇，诱导4天。将诱导表达96h的96孔板发酵液3000r/min离心10min，收集上清。根据实施例4的方法测定菊粉酶突变体的K_cat值，K_cat值比对照菌大的菌株为复筛目的菌株。

以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得5株酶活明显提高的菌株，测定菊粉酶核苷酸序列，利用三联体密码子推测菊粉酶的氨基酸序列，菊粉酶突变体的氨基酸取代及K_cat值提高倍数如表1所示。

表1 突变体的测序结果

实施例4：菊粉酶突变体的K_cat值测定

摇瓶发酵：将出发菌株以及各菊粉酶突变体菌株，接种至25mL BMGY培养基中，30℃震荡培养至OD₆₀₀为2～6(约16～20h)，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，每隔24h添加0.5％的甲醇诱导表达，培养3～4天后，收集发酵上清液。

分离纯化：将突变菌株的发酵上清液经过30kDa超滤膜浓缩、DEAE sepharose FF阴离子交换层析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex^TM 200PG凝胶过滤层析后得到纯化的突变菊粉酶活性组分。具体操作参考文献Bo Yuan,et al.Appl MicrobiolBiotechnol.2012,96:1517-1526.

测定方法：菊粉酶活力的测定方法为HPLC法：取酶液1mL加9mL 2％菊芋(购买于sigma-Aldrich公司)溶液，在37℃、pH＝5.0的条件下，反应10min，取反应液0.5mL沸水浴加热10min灭活，用流动相进行适当稀释，用HPLC测定低聚三糖(含果三糖和蔗果三糖)的生成量。查对低聚三糖(含果三糖和蔗果三糖)标准曲线并计算，获得菊粉酶的酶活及动力学参数K_cat。

酶活力单位定义：在37℃、pH＝5.0的条件下，1mL酶液在1h内水解菊芋果聚糖产生1μmol的三糖(含果三糖和蔗果三糖)定义为一个酶活力单位(U)。

实施例5：定点突变组合菊粉酶突变体的基因突变位点

经过多轮易错PCR进行突变文库构建，得到包含有氨基酸突变位点的5个突变菌株(见实施例3)。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对菊粉酶突变株活力的影响，对这些突变位点进行定点突变组合(用TaKaRa公司的MutanBEST Kit进行定点突变)，获得多个菊粉酶突变体。

将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115，以获得菊粉酶的高效分泌表达。以与实施例3相同的方法测定菊粉酶突变体的K_cat值。各突变体酶的组合位点及其K_cat提高的倍数如表2所示。

运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，获得活力提高的菊粉酶突变体。其中，突变体的验证分别见图2和图3。在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Asn42Gly、Thr102Ser、Thr204Ser、Pro338Ala、Ser469Leu以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数K_cat表示，菊粉酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；黑曲霉NRRL3135菊粉酶氨基酸原始序列为：SEQ ID NO:3；黑曲霉NRRL3135菊粉酶氨基酸突变序列为：SEQ IDNO:5，2个突变氨基酸在序列表中用粗体和下划线显示，该突变体对应的核苷酸序列为：SEQID NO:4。

表2 突变体的测序结果及其K_cat提高的倍数

其中，以102位和204位氨基酸发生突变的组合(突变体2-1)K_cat最高，改造效果最好，其氨基酸序列为：SEQ ID NO:5，2个突变氨基酸在序列表中用粗体和下划线显示，该突变体对应的核苷酸序列为：SEQ ID NO:4。

实施例6：菊粉酶突变体2-1生产菌株25L发酵系统发酵工艺和酶的制备工艺的建立

甘油管接种YPD平板，30℃培养40h；单菌落接种于含有30mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5mL上述菌悬液接种二级种子培养基(液体YPD)，500mL三角瓶装液量100mL，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，OD₆₀₀测定为10时，600mL用于发酵罐接种；

发酵罐准备：按照11L初始装液量配制发酵培养基(BSM)，氨水调节pH至5.0,搅拌充分后，121℃ 30min灭菌。同时准备补料瓶等。并配制50％甘油5.5L用于补料。

接种：接种时，将600mL种子悬液和131.59mL微量元素PTM1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，pH维持5.0。DO维持20％以上。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。

补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速度为5.0mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，DO快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。

诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mL微量元素PTM1母液)。初始流加速率为2.6mL/min。当DO低于20％时停止流加。待甲醇耗尽，DO快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至5.8mL/min。2h后流加甲醇速率提高至10.0mL/min。诱导96h后发酵结束，发酵结束后，发酵液酶活水平达到60000U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液，添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型菊粉酶成品。

实施例7：30m³体系下菊粉酶的制备

将实施例6的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，DO会快速上升，随即进入补料生长阶段。

实施例8：一种使用菊粉酶生产低聚果糖的方法

15吨新鲜菊芋经洗涤、切片，然后用85℃热水烫漂灭酶，干燥得菊芋干片。菊芋干片粉碎成粉末浸泡1h后打浆，然后60℃水浴浸提3h，板框过滤收集清液。所得清液即为粗菊芋提取液。将提取液经碱处理除杂并脱色，用于后续酶解过程，工艺流程图见图1。

将上述制备的菊芋浸提液调节pH 4.5，按每Kg菊芋添加实施例7所述菊粉酶2000000U，控制温度在30℃，搅拌速度在100r/min的条件下反应5h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品，产品成分分析图谱见图2。低聚果糖占总糖的比例为96.68％。

实施例9：一种使用菊粉酶生产低聚果糖的方法

15吨新鲜菊芋经洗涤、切片，然后用90℃的热水烫漂灭酶，干燥得菊芋干片。菊芋干片粉碎成粉末浸泡2h后打浆，然后40℃水浴浸提6h，板框过滤收集清液。所得清液即为粗菊芋提取液。将提取液经碱处理除杂并脱色，用于后续酶解过程，工艺流程图见图4。

将上述制备的菊芋浸提液调节pH 6.0，按每Kg菊芋添加实施例7所述菊粉酶700000U，控制温度在30℃，搅拌速度在150r/min的条件下反应10h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品，产品成分分析图谱见图5。低聚果糖占总糖的比例为98.77％。

Claims (4)

1.一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，其特征在于，具体如下：以新鲜菊芋为原料，灭酶打浆后浸提2-8h，收集清液，清液经碱处理、除杂并脱色后作为反应原液，调节pH4.5～6.0，按每Kg菊芋添加菊粉酶650000～2000000U，控制温度在30℃，搅拌速度在50～200r/min的条件下反应4～12h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品；

在37℃、pH＝5.0的条件下，1mL酶液在1h内水解菊芋果聚糖产生1μmol的三糖定义为一个酶活力单位U，其中三糖含果三糖和蔗果三糖；

所述菊粉酶氨基酸序列如核苷酸序列表SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述的一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述菊粉酶的编码基因如核苷酸序列表SEQ ID No.4所示。

3.如权利要求2所述的一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述菊粉酶的发酵液酶活力为60000-65000U/mL。

4.如权利要求1所述的一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法，其特征在于，鲜菊芋经洗涤、切片，然后用90℃的热水烫漂灭酶，干燥得菊芋干片；菊芋干片粉碎成粉末浸泡2h后打浆，然后40℃水浴浸提6h，板框过滤收集清液；所得清液即为粗菊芋浸提液；将提取液经碱处理除杂并脱色；将上述制备的菊芋浸提液调节pH 6.0，按每Kg菊芋添加菊粉酶700000U，控制温度在30℃，搅拌速度在150r/min的条件下反应10h，当低聚果糖最大聚合度降低到5时，停止反应，将水解物进行浓缩，干燥即为低聚果糖产品，产物中低聚果糖占总糖的比例为98.77％。