CN109082451A - 采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
针对现有技术中在工业化生产纤维寡糖方面所存在的效率低、得率低、成本高等问题，本发明提供了采用基于纤维小体的新型酶制剂的纤维寡糖制备方法。所述制备方法包括原料预处理、酶制剂制备、酶解和后处理等步骤。与现有的利用木质纤维素生产纤维寡糖的技术相比，本发明所述的方法降低了由于酶的高价格所带来的生产成本；同时具有原料来源广泛且廉价的优势，从而为产业化的推进提供了技术支持。此外，本发明所述的方法，还解决了采用纤维小体及其生产菌株制备纤维寡糖所存在的(1)纤维小体的活力受到纤维二糖的严重反馈抑制以及(2)酶解后的寡糖提纯的技术问题。更重要的是，与现有技术相比，本发明所述的方法具有更高的纤维寡糖得率和转化率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料制备纤维寡糖的方 法。
背景技术
低聚糖(oligosaccharide)又称寡糖。为两个或两个以上(一般指2-10个)单糖单位以糖 苷键相连形成的糖分子。纤维寡糖(cellulooligosaccharide)是一种同源性的功能性低聚糖， 由10个以下葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的寡糖，是纤维素降解过程中的产物。由 于人体胃肠道内没有可以降解β-1,4糖苷键的消化酶，纤维寡糖不被消化吸收而直接进入大肠 内为双歧杆菌所利用，因此纤维寡糖可作为功能性食品或食品添加剂，用于肠道调节。纤维 寡糖还带有一定的甜味，可以作为食品的调味料，其适合用作糖尿病患者的甜味剂(如纤维 二糖)。另外，纤维寡糖还可以应用于制药工业和化妆品工业，因此具有广阔的应用前景和市 场需求量。
目前制备纤维寡糖主要包括天然原料中提取、化学法和生物法。化学法主要为酸水解法， 由于酸水解无专一性,产品中的糖类较复杂，不易得到特定聚合度的纤维低聚糖。而且化学合 成法反应复杂、步骤繁琐，不适于工业化规模生产。生物酶法反应通常是在温和的条件下进 行的，不需要某些复杂的步骤，且有可能得到高选择性糖类。现有的基于木质纤维素原料的 纤维寡糖生物酶法制备技术主要采用来源于真菌的游离复合酶制剂对木质纤维素底物中的纤 维素成分进行水解而获得纤维寡糖，如：
专利CN201511005042公开了一种纤维寡糖的生产工艺，将含纤维素的生物质，放入选择 性植物糖苷键高能爆碎机中爆碎然后加水提取得到提取液，向提取液中加入定向纤维素内切 酶酶解得到酶解液，酶解液依次经过脱色、超滤、离子交换脱盐和纳滤得到精制液，对精制 液进行浓缩或干燥得到纤维寡糖糖浆或纤维寡糖固体粉。酶解采用的是木霉等真菌来源的游 离纤维素酶酶制剂。
专利CN201610498363公开了一种纤维寡糖的制造方法，将纤维原料经过持续性的蒸汽 爆破和降解处理，获得纤维寡糖产物，所采用降解处理主要为酶解，酶解采用的是木霉等真 菌来源的游离纤维素酶酶制剂。
专利CN201610057567公开了一种纤维素定向二段水解制备纤维寡糖的方法，通过低β-葡 萄糖苷酶的纤维素酶水解低聚木糖生产废渣，得到含有纤维寡糖的液相，通过固液分离方法 并提纯得到纤维寡糖。酶解采用的是木霉等真菌来源的游离纤维素酶酶制剂，通过尽可能的 降低β-葡萄糖苷酶的活力减少纤维寡糖到葡萄糖的转化，提高寡糖得率。
专利CN200580025354公开了一种生产纤维寡糖的方法，采用纤维素酶水解水不溶性天 然纤维素类物质的方法，获得纤维寡糖，采用的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力与结晶性纤维 素分解活性尽可能降低，提高纤维寡糖的得率。
上述现有技术采用的真菌来源的酶制剂的策略存在效率和成本上的不足，纤维素酶制剂 的需要在单独的反应器中通过微生物发酵制备，且制备的工艺与纤维素水解条件不同，生产 步骤繁琐复杂，人力物力需求和设备投入等成本显著增加。现有较为高效的酶制剂都需要从 国外进口，且关键技术被国外发达国家垄断。不仅如此，来源于真菌的复合酶制剂通常都存 在β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的存在一方面减少纤维寡糖对酶制剂的反馈抑制作用，促进 水解反应的进行，另一方面又会使产生的纤维寡糖都进一步水解成葡萄糖单糖，从而降低纤 维寡糖的得率，因此控制复合酶制剂中β-葡萄糖苷酶的比例是主要的技术优化方法。然而， 酶的分离和复配成本高昂。
纤维小体是与真菌来源酶制剂相对应的一种纤维素降解催化体系。已知纤维小体是热纤 梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的 纤维素降解体系之一。热纤梭菌等产纤维小体微生物所合成的β-葡萄糖苷酶是胞内酶，胞外 的纤维小体不具有β-葡萄糖苷酶活力，不能将纤维二糖转化为葡萄糖，因此，纤维小体及其 生产菌株有可能作为新型酶制剂用于纤维寡糖的有效制备。然而，纤维小体的活力受到纤维 二糖的严重反馈抑制，因此得到的纤维二糖及其他纤维寡糖浓度太低，另一方面，热纤梭菌 等产纤维小体微生物的培养需要丰富的培养基，使得纤维寡糖提纯成本过高，因此，现有技 术都不具有经济性。
发明内容
针对现有技术中在工业化生产纤维寡糖方面所存在的效率低、得率低、成本高等问题， 本发明提供了采用基于纤维小体的新型酶制剂的纤维寡糖制备工艺，不但降低了生产成本， 而且提高了纤维寡糖的得率。
本发明的技术方案：采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：对木质纤维素原料进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原 料，其中纤维素组分含量不小于70％。所述两段式预处理为：一段反应去除木质素，二段反 应去除半纤维素；或者一段反应去除半纤维素，二段反应去除木质素。所述的木质纤维素原 料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。其中， 所述的去除木质素的反应为磺化反应；所述的去除半纤维素的反应是蒸汽爆破或水热法。
(2)酶制剂制备：将活化的产纤维小体微生物菌株以1-10％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中，在34-65℃的温度条件培养至对数中期，离心 收集固体沉淀，作为酶制剂。按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固液重量 体积比为1:20-1:200。将产纤维小体微生物培养到对数中期后，再收集菌体作为酶制剂，这是 本发明的关键点：由于在对数中期时，纤维小体仍然附着在细胞表面，可以作为全细胞酶制 剂参与酶解催化反应；此时通过离心去除培养基，有利于酶解后的寡糖提纯，从而解决了纤 维小体及其生产菌株在纤维寡糖制备中所存在的纤维寡糖提纯成本过高的问题。
所述的产纤维小体微生物菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、 解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。所述纤维小体为由厌氧细 菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。
所述的发酵培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙 0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆2-8g/L、柠檬酸三钠2g/L、 pH 6.5-7.5。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:3-1:25，向预处理后的木质纤维素原料中添加无菌缓 冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，在34-65℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转 的方式、0.5-5rpm转速条件下酶解2小时-7天，以实现体系的混合均匀和提高传质效率，从 而获得酶解液。
所述的无菌缓冲液为：20-100mM乙酸钠或柠檬酸钠，pH 5.5-6.0；所述酶制剂的添加量 为：每升缓冲液中添加10mL-5L发酵培养基制备得到的酶制剂。
(4)后处理：将步骤(3)得到的酶解液离心进行固液分离，将上清液提纯，然后采用乙醇进行沉淀；沉淀物用水重新溶解后，脱盐获得粗制纤维寡糖；进一步纯化处理，获得精制纤维寡糖。
优选的是，步骤(2)所述的热纤梭菌是具有经过改造的纤维素外切酶的热纤梭菌(如实 施例3和4所述)；所述的温度条件为55-60℃；所述转动方式为容器的整体滚动翻转。
优选的是，步骤(3)所述的无菌缓冲液中还包括1-10mM CaCl2和1-5mM DTT；所述固液重量体积比为1:5-1:15。
优选的是，所述步骤(4)具体为：将酶解液离心进行固液分离，上清液进行脱色、蒸发 浓缩、过滤，收集滤液使用乙醇进行沉淀，沉淀物用水重新溶解后，过离子交换树脂进行脱 盐，获得粗制纤维寡糖；进一步采用孔径为200-1000Da的聚砜纳滤膜进行纳滤，获得精制纤 维寡糖。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了采用基于纤维小体的新型酶制剂的纤维寡糖制备工艺，与现有的利用 木质纤维素生产纤维寡糖的技术相比，降低了由于酶的高价格所带来的生产成本；同时具有 原料来源广泛且廉价的优势，从而为产业化的推进提供了技术支持。
(2)本发明所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，通过控制酶制剂中纤维素外切 酶的表达，有效控制纤维寡糖的聚合度，同时提高了产品浓度，解决了纤维小体的活力受到 纤维二糖的严重反馈抑制的技术问题。
(3)本发明所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，利用纤维小体附着在细胞表面 的特性，通过离心将培养基置换成酶解缓冲液，有利于酶解后的寡糖提纯，显著降低了提纯 成本。
(4)本发明所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，木质纤维素原料中纤维素转化 率可达70％，聚合度2-5的纤维寡糖总得率达到426mg/g木质纤维素原料。与现有技术相比， 具有更高的纤维寡糖得率和转化率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶的敲除
通过无缝克隆，将tdk表达盒(包含gapDH基因的启动子)以及pyrF表达盒(包含pyrF 自身启动子)克隆到质粒pHK(Mohr,G.,Hong,W.,Zhang,J.,Cui,G.-Z.,Yang,Y.,Cui,Q.,et al. (2013)A targetron system for gene targeting in thermophiles and itsapplication in Clostridium thermocellum,PLoS One 8:e69032.)的抗生素基因cat的下游，并通过引物的设计，在tdk与 pyrF表达盒之间增加NheI和XbaI酶切位点，在pyrF下游添加EagI和MluI酶切位点，用于 同源臂片段的克隆，从而构建得到pHK-HR质粒。
选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶Cel48S(基因组CP002416.1中3228088-3230229 核酸序列编码)靶向敲除基因。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据 库中序列号为CP002416.1)中3227584到3228084核酸序列，下游同源臂HR-down为DSM1313 基因组中3230320到3230820核酸序列，中间同源臂HR-short为DSM1313基因组中3227784 到3228084核酸序列。敲除质粒不包含目标基因。将构建好的质粒转化到pyrF缺失的 DSM1313突变株中，并按照三步筛选方法获得Cel48S敲除菌株ΔCel48S。具体步骤为：
1)将同源重组质粒pHK-HR转化进入底盘菌株ΔpyrF，利用含甲砜氯霉素的GS-2半固 体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L,MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L,MOPS钠盐10g/L,酵母提取物6.0g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,pH 7.4)平 板进行筛选，以获得质粒转化子。
2)获得的转化子在MJ液体培养基(KH2PO4 1.5g/L,K2HPO4·3H2O 3.8g/L,尿素2.1g/L, MgCl2·6H2O 1.0g/L,CaCl2·2H2O 150mg/L,FeSO4·6H2O 1.25mg/L,半胱氨酸盐酸1.0g/L, MOPS钠盐10g/L,纤维二糖5.0g/L，二水柠檬酸三钠3.0g/L,刃天青0.1mg/L,盐酸吡哆 胺2mg/L,生物素0.2mg/L,对氨基苯甲酸0.4mg/L，维生素B12 0.2_mg/L，pH 7.4)中转接 三代后，涂布含10μg/mL 5-氟脱氧尿苷(FUDR)的MJ半固体培养基进行第一次同源重组 筛选。在这一步骤中，由于Tdk可以将FUDR转化为对细胞有毒的F-dUMP，同时底盘细胞在MJ培养基中必须依靠质粒上的pyrF基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。 根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此 时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。
3)经第一次同源重组后获得的重组子先在GS-2液体培养基中传代3次，并用相同的培 养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/mL 5-氟乳清酸(FOA)的GS-2半固体培养基 进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，PyrF的反向筛选作用会促使上 游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrF表达框从基因组中去除。第二次同源重组 后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除。
实施例2：热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶的敲除
与实施例1不同的是，选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶Cel9K(由基因组CP002416.1中2113813-2111293核酸序列编码)靶向敲除基因。上游同源臂HR-up为热纤梭菌DSM1313基因组(NCBI数据库中序列号为CP002416.1)中2110625到2111125核酸序列， 下游同源臂HR-down为DSM1313基因组中2113814到2114314核酸序列，中间同源臂 HR-short为DSM1313基因组中2110825到2111125核酸序列。敲除质粒不包含目标基因。将 构建好的质粒转化到pyrF缺失的DSM1313突变株中，并按照三步筛选方法获得Cel9K敲除 菌株ΔCel9K。
实施例3：热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶的改造
与实施例1不同的是，敲除质粒包含目标基因Cel9-48(由基因组CP001393.1中1968724 至1973904核酸序列编码)。将构建好的质粒转化到pyrF缺失的DSM1313突变株中，并按 照三步筛选方法获得Cel9-48替换Cel48S的菌株ΔCel48S::Cel9-48。
实施例4：热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶的改造
与实施例2不同的是，敲除质粒包含目标基因Cel9-48(由基因组CP001393.1中1968724 至1973904核酸序列编码)。将构建好的质粒转化到pyrF缺失的DSM1313突变株中，并按 照三步筛选方法获得Cel9-48替换Cel9K的菌株ΔCel9K::Cel9-48。
实施例5：采用木质纤维素制备纤维寡糖
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为77％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将活化的热纤梭菌DSM1313以8％接种量接入含有预处理后的木质 纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计 算，固液重量体积比为1:200。在60℃的温度条件下培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
所述的发酵培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙 0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆2-8g/L、柠檬酸三钠2g/L、 pH 6.5-7.5。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:6.5，向1kg预处理后的木质纤维素原料中添加6.5L 无菌缓冲液。然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 1L酶制剂。在55℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解3 天，以实现体系的混合均匀和提高传质效率，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM 乙酸钠，pH 5.5。
(4)后处理：将酶解液离心进行固液分离，上清液采用食品级活性炭进行脱色，蒸发浓 缩，滤出浓缩液中的絮凝物，收集滤液使用乙醇进行沉淀，沉淀物用水重新溶解后，过离子 交换树脂进行脱盐，获得纤维寡糖粗品。进一步采用孔径为200-1000Da的聚砜纳滤膜进行纳 滤可获得精制液。
实施例6：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：同实施例5。
(2)酶制剂制备：将实施例1改造的热纤梭菌活化，然后以8％接种量接入含有预处理 后的木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素 的重量计算，固液重量体积比为1:100。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体 沉淀，作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:6.5，向1kg预处理后的木质纤维素原料中添加6.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 1L酶制剂。在58℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解3 天，获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：20mM乙酸钠，1mM CaCl2和5mM DTT，pH 6.0。
(4)后处理：同实施例5。
实施例7：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：同实施例5。
(2)酶制剂制备：将实施例2改造的热纤梭菌活化，以8％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:80。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:6.5，向1kg预处理后的木质纤维素原料中添加6.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 1L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解3 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：100mM乙酸钠，10mM CaCl2和1mM DTT， pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例8：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为77％。所述两段式预处理为：一段反应采用水热法去除半纤维素，二段反应 采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将实施例3改造的热纤梭菌活化，以8％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:120。在58℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:6.5，向1kg预处理后的木质纤维素原料中添加6.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 1L酶制剂。在58℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解3 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，10mM CaCl2和5mM DTT， pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例9：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为76％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例4改造的热纤梭菌活化，以8％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:120。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:11，向100kg预处理后的木质纤维素原料中添加1100L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 5L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、4rpm转速条件下酶解3 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，10mM CaCl2和5mM DTT， pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例10：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对玉米秸秆进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其 中纤维素组分含量为74％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段 反应采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例3改造的热纤梭菌活化，以10％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:180。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:3，向0.1kg预处理后的木质纤维素原料中添加0.3L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 0.01L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、2rpm转速条件下酶解 7天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，10mM CaCl2和5mM DTT， pH6.0。
(4)后处理：同实施例5。
实施例11：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为76％。所述两段式预处理为：一段反应采用水热法去除半纤维素，二段反应 采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将实施例4改造的热纤梭菌活化，以10％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:100。在65℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:5，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加1.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、0.5rpm转速条件下酶解 2天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例12：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对灌木枝条进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其 中纤维素组分含量为71％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段 反应采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例3改造的热纤梭菌活化，以10％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:100。在55℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:5，向0.5kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解5 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例13：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对木片进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为80％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例4改造的热纤梭菌活化，以10％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:30。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:100，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加4.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 3L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、4rpm转速条件下酶解2.5 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例14：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对稻草进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为70％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例3改造的热纤梭菌活化，以5％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:100。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:5，向0.5kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 4L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、4rpm转速条件下酶解7 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例15：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对废纸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为76％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用水热法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将实施例4改造的热纤梭菌活化，以1％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:70。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:20，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加4.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 5L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、2rpm转速条件下酶解2h， 从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例16：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对玉米芯进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中 纤维素组分含量为72％。所述两段式预处理为：一段反应采用汽爆法去除半纤维素，二段反 应采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将实施例4改造的热纤梭菌活化，以3％接种量接入含有预处理后的 木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重 量计算，固液重量体积比为1:20。在60℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀， 作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:25，向0.1kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 5L酶制剂。在60℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、1rpm转速条件下酶解12h， 从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM乙酸钠，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例17：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对灌木枝条进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其 中纤维素组分含量为72％。所述两段式预处理为：一段反应采用汽爆法去除半纤维素，二段 反应采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将活化的黄色溶纤梭菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素 原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固 液重量体积比为1:200。在65℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制 剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:10，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在65℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解12h， 从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM柠檬酸钠，10mM CaCl2和5mM DTT，pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例18：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对废纸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为80％。所述两段式预处理为：一段反应采用汽爆法去除半纤维素，二段反应 采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将活化的嗜纤维梭菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素原 料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固液 重量体积比为1:200。在37℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:15，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加3.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加2L酶制剂。在37℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解4.5 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM柠檬酸钠，10mM CaCl2和5mM DTT， pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例19：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对废纸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为80％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用汽爆法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将活化的解纤维梭菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素原 料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固液 重量体积比为1:200。在34℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:20，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加4.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 5L酶制剂。在34℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解5 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM柠檬酸钠，pH 6.0。
(4)后处理：同实施例5。
实施例20：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为73％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用汽爆法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将活化的解纤维醋弧菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素 原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固 液重量体积比为1:200。在37℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制 剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:25，向0.1kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在37℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解7 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：100mM柠檬酸钠，10mM CaCl2和1mM DTT，pH 5.5。
(4)后处理：同实施例5。
实施例21：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为73％。所述两段式预处理为：一段反应采用磺化反应去除木质素，二段反应 采用汽爆法去除半纤维素。
(2)酶制剂制备：将活化的溶纤维假拟杆菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维 素原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算， 固液重量体积比为1:200。在42℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶 制剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:25，向0.1kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.5L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在42℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解6 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：20mM柠檬酸钠，1mM CaCl2和5mM DTT， pH5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例22：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为76％。所述两段式预处理为：一段反应采用水热法去除半纤维素。一段反应 采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将活化的白色瘤胃球菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素 原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固 液重量体积比为1:200。在37℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制 剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:10，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加2L酶制剂。在37℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解7 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM柠檬酸钠，pH 5.6。
(4)后处理：同实施例5。
实施例23：采用木质纤维素制备纤维寡糖
与实施例5不同的是，
(1)原料预处理：对麦秸进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤 维素组分含量为76％。所述两段式预处理为：一段反应采用水热法去除半纤维素。一段反应 采用磺化反应去除木质素。
(2)酶制剂制备：将活化的黄化瘤胃球菌以8％接种量接入含有预处理后的木质纤维素 原料和发酵培养基的厌氧反应器中；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固 液重量体积比为1:200。在40℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制 剂。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:10，向0.2kg预处理后的木质纤维素原料中添加2.0L 无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加 2L酶制剂。在40℃、厌氧条件下采用容器的整体滚动翻转的方式、5rpm转速条件下酶解7 天，从而获得酶解液。所述的无菌缓冲液为：50mM柠檬酸钠，pH 5.6。
(4)后处理：同实施例5。
表1.实施例5-23采用木质纤维素制备纤维寡糖的结果列表
| 实施例 | 纤维素转化率 | 纤维寡糖总得率mg/g |
| 实施例5 | 17.00％ | 114.8 |
| 实施例6 | 11.20％ | 75.6 |
| 实施例7 | 18.00％ | 121.5 |
| 实施例8 | 61.70％ | 416.5 |
| 实施例9 | 52.00％ | 342.7 |
| 实施例10 | 30.30％ | 194.8 |
| 实施例11 | 42.10％ | 277.4 |
| 实施例12 | 70.00％ | 426.3 |
| 实施例13 | 50.80％ | 356.1 |
| 实施例14 | 65.80％ | 394.8 |
| 实施例15 | 23.20％ | 153.4 |
| 实施例16 | 23.00％ | 142.6 |
| 实施例17 | 16.80％ | 104.2 |
| 实施例18 | 13.30％ | 93.6 |
| 实施例19 | 10.20％ | 71.9 |
| 实施例20 | 12.00％ | 76.4 |
| 实施例21 | 12.50％ | 79.6 |
| 实施例22 | 15.30％ | 100.8 |
| 实施例23 | 16.10％ | 106.1 |
由表1可知，实施例5-23中采用木质纤维素制备纤维寡糖的方法，所得纤维素转化率为 10.2-70％，纤维寡糖总得率为71.9-426.3mg/g。
其中，实施例5采用的是未经改造的热纤梭菌DSM1313，实施例17-实施例23采用的是 未经改造的其他产纤维小体菌株；所得纤维素转化率为10.2-17.0％，纤维寡糖总得率为 71.9-114.8mg/g。与现有的利用木质纤维素生产纤维寡糖的技术相比，降低了由于酶的高价格 所带来的生产成本；同时具有原料来源广泛且廉价的优势，从而为产业化的推进提供了技术 支持。
实施例6-7采用的是实施例1-2改造的热纤梭菌(敲除了特定纤维素外切酶的热纤梭菌)， 所得纤维素转化率为11.2％和18.0％，纤维寡糖总得率为75.6mg/g和121.5mg/g。由此可知， 仅仅敲除特定纤维素酶，虽然可以一定程度上解除纤维二糖对纤维小体的反馈抑制作用，但 同时也造成纤维素酶的缺失，从而造成纤维素降解能力下降，因此并没有明显提高纤维素转 化率和纤维寡糖总得率。实施例8-16则采用的实施例3-4改造的热纤梭菌(在实施例1-2敲 除的基础上进行改造的热纤梭菌，引入了外源的纤维素酶)。所得纤维素转化率为23-70.0％， 纤维寡糖总得率为142.6-426.3mg/g。与未经改造的热纤梭菌相比，纤维素转化率最高提高了 3倍；纤维寡糖总得率提高了2倍。说明，本发明通过控制酶制剂中纤维素外切酶的表达， 有效控制纤维寡糖的聚合度，同时提高了产品浓度，解决了纤维小体的活力受到纤维二糖的 严重反馈抑制的技术问题。
Claims (10)
1.采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料预处理：对木质纤维素原料进行两段式预处理，得到预处理后的木质纤维素原料，其中纤维素组分含量不小于70％；所述两段式预处理分别去除木质素和半纤维素；
(2)酶制剂制备：将活化的产纤维小体微生物菌株以1-10％接种量接入含有预处理后的木质纤维素原料和发酵培养基的厌氧反应器中，在34-65℃的温度条件培养至对数中期，离心收集固体沉淀，作为酶制剂；按预处理后的木质纤维素原料中纤维素的重量计算，固液重量体积比为1:20-1:200。
(3)酶解：按照固液重量体积比1:3-1:25，向预处理后的木质纤维素原料中添加无菌缓冲液；然后添加步骤(2)制备的酶制剂，在34-65℃、厌氧条件、0.5-5rpm转速条件下酶解2小时-7天，得到酶解液。
(4)后处理：将步骤(3)得到的酶解液离心进行固液分离，将上清液提纯，然后采用乙醇进行沉淀；沉淀物用水重新溶解后，脱盐获得粗制纤维寡糖；进一步纯化处理，获得精制纤维寡糖。
2.根据权利要求1采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(2)所述的产纤维小体微生物菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。
3.根据权利要求2采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(2)所述的热纤梭菌是具有经过改造的纤维素外切酶的热纤梭菌。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(2)所述的发酵培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆2-8g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：所述的温度条件为55-60℃；所述转动方式为容器的整体滚动翻转。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)所述的两段式预处理为：一段反应去除木质素，二段反应去除半纤维素；或者一段反应去除半纤维素，二段反应去除木质素；所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求6所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)所述的两段式预处理为：所述的去除木质素的反应为磺化反应；所述的去除半纤维素的反应是蒸汽爆破或水热法。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述的无菌缓冲液为：20-100mM乙酸钠或柠檬酸钠，pH 5.5-6.0；所述酶制剂的添加量为：每升缓冲液中添加10mL-5L发酵培养基制备得到的酶制剂。
9.根据权利要求8所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：所述无菌缓冲液中还包括1-10mM CaCl2和1-5mM DTT；步骤(3)中所述固液重量体积比为1:5-1:15。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的采用木质纤维素生产纤维寡糖的方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为：将酶解液离心进行固液分离，上清液进行脱色、蒸发浓缩、过滤，收集滤液使用乙醇进行沉淀，沉淀物用水重新溶解后，过离子交换树脂进行脱盐，获得粗制纤维寡糖；进一步采用孔径为200-1000Da的聚砜纳滤膜进行纳滤，获得精制纤维寡糖。
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