CN107208084B

CN107208084B - D-塔格糖的酶促合成

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Publication number: CN107208084B
Application number: CN201680003822.2A
Authority: CN
Inventors: D·J·维歇莱茨基; Y·H·P·张
Original assignee: Bright Moss LLC
Current assignee: Bright Moss limited liability company
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2036-09-30
Also published as: CA3000412C; AU2016329090A1; US11034988B2; CL2018000848A1; CN108374031A; US20190017083A1; KR101981020B1; IL258460B; CA3000412A1; EP3322803B1; EP3322803A4; JP2019150026A; PT3322803T; JP6560441B2; ZA201802847B; IL258460A; CO2018004442A2; MX2019005728A; SG10202000304UA; PH12018500700A1

Abstract

本公开提供了将糖类酶促转化为塔格糖的方法。本发明还包括用于制备塔格糖的方法，其中该方法包括采用差向异构酶催化将6‑磷酸果糖(F6P)转化为6‑磷酸塔格糖(T6P)，并采用磷酸酶催化将T6P转化为塔格糖。

Description

D-塔格糖的酶促合成

本申请要求2015年10月2日提交的美国申请序列号62/236226的优先权，其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及糖D-塔格糖的制备。更具体地，本发明涉及将糖类(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为D-塔格糖来制备D-塔格糖的方法。

背景技术

D-塔格糖(Tagatose)是一种低热量的天然甜味剂，具有92％的蔗糖甜度，但只有蔗糖38％的卡路里。它是天然存在的单糖己糖，仅少量存在于水果、可可和乳制品中。2003年食品和药品监督管理局(FDA)批准塔格糖为食品添加剂，其指定塔格糖为公认安全使用物质(GRAS)。然而，由于塔格糖售价高，其作为甜味剂的使用受到限制。塔格糖具有无数的健康益处：其是非致龋的；其是低热量的；其具有非常低的血糖指数3；其将葡萄糖的血糖指数降低了20％；其可以降低平均血糖水平；通过提高高密度脂蛋白(HDL)胆固醇，其有助于预防心血管疾病、中风和其他血管疾病；其是经过验证的益生元和抗氧化剂。Lu等人，“Tagatose，a New Antidiabetic and Obesity Control Drug，Diabetes Obes.Metab.10(2)：109-34(2008)”。因此，塔格糖明显地在制药、生物技术、学术、食品、饮料、膳食补充剂和杂货业中具有多种应用。

目前，主要通过乳糖酶水解乳糖或酸解乳糖形成D-葡萄糖和D-半乳糖来制备塔格糖(WO2011150556、CN 103025894、US 5002612、US 6057135和US 8802843)。然后D-半乳糖在碱性条件下由氢氧化钙化学异构化或在pH中性条件下由L-阿拉伯糖异构酶酶促异构化为D-塔格糖。通过过滤和离子交换色谱组合分离最终产物。该过程在几个罐或生物反应器中进行。总之，由于其它糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖和未水解的乳糖)昂贵的分离以及低产率，该方法变差。正在开发几种通过微生物细胞发酵的方法，但是由于它们依赖于昂贵的原料(例如半乳糖醇和D-阿洛酮糖)、产率低和分离昂贵，没有一个被证明是实际的替代方案。

需要开发成本有效的合成途径，用于高产率生产塔格糖，其中该方法的至少一个步骤包括能量有利的化学反应。此外，需要一种塔格糖的生产方法，其中其方法步骤可以在一个罐或生物反应器中进行。还需要可以在相对低浓度的磷酸盐条件下进行塔格糖生产的方法，其中磷酸盐可以循环利用，和/或该方法不需要使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐的来源。还需要塔格糖的生产途径，该途径在任何反应步骤中都不需要使用昂贵的烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD(H))辅酶。

发明内容

本文所述的发明涉及制备塔格糖的方法。在各个方面，该方法包括采用差向异构酶催化将6-磷酸果糖(F6P)转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；和采用磷酸酶催化将T6P转化为塔格糖。本发明还涉及通过本文所述的任何方法制备的塔格糖。

在本发明的一些方面，用于制备塔格糖的方法还包括将6-磷酸葡萄糖(G6P)转化为F6P的步骤，其中该步骤采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化。在其他方面，用于塔格糖合成的方法还包括将1-磷酸葡萄糖(G1P)转化为G6P的步骤，并且该转化步骤采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化。

在各个方面，用于制备塔格糖的方法可以包括采用至少一种酶催化将糖类转化为G1P；采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化将G1P转化为G6P；采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。

在任何方法中使用的糖类可以选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。淀粉或其衍生物可以是直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖或葡萄糖。在本发明的一些方面，用于制备塔格糖的方法包括酶解或酸解淀粉将淀粉转化为淀粉衍生物。在其它方面，淀粉衍生物可以通过酶解淀粉来制备，其由异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或两种或更多种这些酶的组合催化。在某些方面，用于制备塔格糖的方法还可以包括加入4-转葡糖苷酶(4GT)。

在各个方面，用于制备塔格糖的方法可以包括采用至少一种酶催化将果糖转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。在其它实施例中，塔格糖的生产方法包括采用至少一种酶催化将蔗糖转化为果糖；采用至少一种酶催化将果糖转化为F6P；采用差向异构酶催化将F6P转化为6-磷酸塔格糖(T6P)；以及采用磷酸酶催化将生成的T6P转化为塔格糖。

在本发明的其他方面，用于制备塔格糖的方法中使用的G6P可以通过采用至少一种酶催化将葡萄糖转化为G6P来生成。葡萄糖反过来可以通过采用至少一种酶催化将蔗糖转化为葡萄糖来生成。

在本发明的一些方面，用于将F6P转化为T6P的差向异构酶是6-磷酸果糖差向异构酶。6-磷酸果糖差向异构酶可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9或10具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在各个方面，6-磷酸果糖差向异构酶包含与SEQ IDNOS:2、4、6、8或11具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的各个方面，用于将T6P转化为塔格糖的磷酸酶是6-磷酸塔格糖磷酸酶。6-磷酸塔格糖磷酸酶可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NOS:12、14或16具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在本发明的一些方面，6-磷酸塔格糖磷酸酶包含与SEQ IDNOS:13、15或17具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在各个方面，本发明的方法在约40℃至约70℃的温度范围、约5.0至约8.0的pH范围下进行和/或进行约8h至约48h。在一些方面，用于制备塔格糖的方法的步骤在一个生物反应器中进行。在其他方面，这些步骤在串联布置的多个生物反应器中进行。

在本发明的其他方面，用于制备塔格糖的方法的步骤在无ATP、无NAD(H)、约0mM至约150mM的磷酸盐浓度中进行，循环利用磷酸盐，和/或该方法的至少一个步骤包括能量有利的化学反应。

附图说明

这些附图说明了本发明一些实施例的某些方面，而不应当用于限制或限定本发明。

图1是将6-磷酸果糖转化为6-磷酸塔格糖，然后转化为D-塔格糖(塔格糖)的酶促途径的示意图；

图2是将淀粉或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：αGP，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；IA，异淀粉酶；PA，支链淀粉酶；MP，麦芽糖磷酸化酶；PPGK，多磷酸盐葡糖激酶；

图3示出了将纤维素或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径。CDP，纤维糊精磷酸化酶；CBP，纤维二糖磷酸化酶；PPGK，多磷酸盐葡糖激酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；

图4是将果糖转化为塔格糖的酶促途径的示意图。PPFK，多磷酸盐果糖激酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；

图5是将葡萄糖转化为塔格糖的酶促途径的示意图。PPGK，多磷酸盐葡糖激酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；

图6示出了将蔗糖或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径。SP，蔗糖磷酸化酶；PPFK，多磷酸盐果糖激酶；PGM，葡萄糖磷酸变位酶；PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，6-磷酸果糖差向异构酶；T6PP，6-磷酸塔格糖磷酸酶；

图7示出了基于形成的Gibbs能量的中间体之间的反应吉布斯能量，用于将1-磷酸葡萄糖转化为塔格糖。

具体实施方式

本发明提供了用于高产率合成塔格糖同时大大降低产品分离成本和塔格糖生产成本的酶促途径或方法。

本发明涉及用于制备塔格糖的方法，其中该方法包括采用差向异构酶催化将6-磷酸果糖(F6P)转化为6-磷酸塔格糖(T6P)，以及采用磷酸酶(例如，6-磷酸塔格糖磷酸酶，T6PP)催化将生成的T6P转化为塔格糖。该方法概括地在图1中示出。在某些实施例中，催化F6P转化为T6P的差向异构酶是6-磷酸果糖差向异构酶(F6PE)。

将F6P转化为T6P的差向异构酶可用于本发明的方法中。在本发明的一些方面，在该方法中适用于将F6P转化为T6P的差向异构酶包括与SEQ ID NOS：2、4、6、8或11(如下所示)的氨基酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。合适的差向异构酶由多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9或10(如下所示)的核苷酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。

本发明还涉及差向异构酶，其包括与SEQ ID NOS：2、4、6、8或11的氨基酸序列具有至少60％、优选地为至少65％、更优选地至少70％，更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。在其它方面，本发明涉及由多核苷酸编码的差向异构酶，该多核苷酸包括与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9或10的核苷酸序列具有与至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。

将T6P转化为塔格糖(D-塔格糖)的磷酸酶可以用于本发明的方法中。在本发明的一些方面，可以用于将T6P转化为塔格糖(D-塔格糖)的磷酸酶包括与SEQ ID NOS：12、14或16(如下所示)的氨基酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。塔格糖磷酸酶由多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NOS：13、15或17(如下所示)的核苷酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少95％96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。

本发明还涉及将T6P转化为塔格糖(D-塔格糖)的磷酸酶，其包括与SEQ ID NOS：12、14或16的氨基酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。在各个方面，本发明涉及将T6P转化为塔格糖(D-塔格糖)的磷酸酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包括与SEQ ID NOS：13、15或17的核苷酸序列具有至少60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、最优选地至少95％、甚至最优选地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。

在一些实施例中，根据本发明用于制备塔格糖的方法还包括将6-磷酸葡萄糖(G6P)酶促转化为F6P的步骤，且该步骤采用磷酸葡糖异构酶(PGI)催化。在其它实施例中，用于制备塔格糖的方法还包括将1-磷酸葡萄糖(G1P)转化为G6P的步骤，其中该步骤采用葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化。在另外的实施例中，塔格糖生产方法还包括采用至少一种酶催化将糖类转化为G1P的步骤。

因此，根据本发明用于制备塔格糖的方法可以(例如)包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为1-磷酸葡萄糖(G1P)；(ii)使用葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC5.4.2.2)将G1P转化为G6P；(iii)使用磷酸葡糖异构酶(PGI，EC 5.3.1.9)将G6P转化为F6P；(iv)通过6-磷酸果糖差向异构酶(F6PE)将F6P转化为T6P；和(v)通过6-磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖。该方法的一个实例如图2所示，其中糖类是淀粉。

通常，在所公开的方法中使用的酶单位的比例为1：1：1：1：1(αGP：PGM：PGI：F6PE：T6PP)。为了优化产率，这些比例可以以任意数字的组合进行调整。例如，可以使用3：1：1：1：1的比例使磷酸化中间体的浓度最大化，这将使得下游反应活性提高。相反，可以使用1：1：1：1：3的比例来保持αGP的磷酸盐的稳定供应，这将使得α-1,4-糖苷键的磷酸切割更有效。可以使用例如3：1：1：1：3的酶比例来进一步提高反应速率。因此，可以改变酶的比例，包括下文讨论的其它任选的酶，以提高塔格糖生产的效率。例如，相对于其它酶的量，特定的酶可以以约2×、3×、4×、5×等的量存在。

该方法的重要优点之一是，方法步骤可以在一个生物反应器或反应容器中进行。或者，步骤也可以在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行。

然后，采用T6PP将T6P脱磷酸化生成的磷酸根离子，可以在将糖类转化为G1P的方法步骤中再利用，特别是当所有的方法步骤在单个生物反应器或反应容器中进行时。在所公开的方法中循环利用磷酸盐的能力使得能够使用非化学计量的磷酸盐，其能保持反应磷酸盐的低浓度。这影响了工艺方法的总体途径和总速率，但并未限制各个酶的活性，并且能满足塔格糖制造方法的总效率。

例如，反应磷酸盐浓度可以在约0mM至约300mM的范围，约0mM至约150mM，约1mM至约50mM，优选地约5mM至约50mM，或更优选地约10mM至约50mM。例如，反应磷酸盐浓度可以为约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM或约55mM。

因此，由于低的总磷酸盐，低的磷酸盐浓度使得生产成本降低，因此使除去磷酸盐的成本更低。其还可以防止高浓度游离磷酸盐对T6PP的抑制并且降低磷酸盐污染的可能性。

此外，本文公开的方法可以在不加入ATP作为磷酸盐源，即不含ATP的情况下进行。该方法还可以在不必加入NAD(H)，即不含NAD(H)的情况下进行。其它优点还包括，所公开制备塔格糖的方法的至少一个步骤包括能量有利的化学反应(图7)。

用于将糖类转化为G1P的酶的实例包括α-葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)、麦芽糖磷酸化酶(MP，EC 2.4.1.8)、纤维糊精磷酸化酶(CDP，EC 2.4.1.49)、纤维二糖磷酸化酶(CBP，EC 2.4.1.20)、纤维素磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶(SP，EC 2.4.1.7)及其组合。酶或酶的组合的选择取决于方法中使用的糖类。

用于生产G1P的糖类可以是多糖、寡糖和/或二糖。例如，糖类可以是淀粉、一种或多种淀粉衍生物、纤维素、一种或多种纤维素衍生物、蔗糖、一种或多种蔗糖衍生物或其组合。

淀粉是自然界中使用最广泛的储能化合物，主要储存在植物种子中。天然的淀粉包括直链淀粉和支链淀粉。淀粉衍生物的实例包括直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖、果糖和葡萄糖。纤维素衍生物的实例包括预处理的生物质、再生的无定形纤维素、纤维糊精、纤维二糖、果糖和葡萄糖。蔗糖衍生物包括果糖和葡萄糖。

淀粉衍生物可以通过淀粉的酶解或通过淀粉的酸解来制备。具体来说，淀粉的酶解可以通过水解α-1,6-糖苷键的异淀粉酶(IA，EC.3.2.1.68)、水解α-1,6-糖苷键的支链淀粉酶(PA，EC.3.2.1.41)、催化短麦芽低聚糖的转糖基化并生成更长的麦芽低聚糖的4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC.2.4.1.25)或切割α-1,4-糖苷键的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)来催化或增强。

此外，纤维素衍生物可以通过由纤维素酶混合物、酸或催化纤维素酶解或预处理生物质来制备。

在某些实施例中，用于将糖类转化为G1P的酶包括αGP。在该步骤中，当糖类包括淀粉时，G1P利用淀粉通过αGP生成；当糖类包括可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糖糊精时，G1P利用可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糖糊精通过αGP生成。

当糖类包括麦芽糖并且酶包括麦芽糖磷酸化酶时，G1P利用麦芽糖通过麦芽糖磷酸化酶生成。如果糖类包括蔗糖并且酶包括蔗糖磷酸化酶，G1P利用蔗糖通过蔗糖磷酸化酶生成。

在另一个实施例中，当糖类包括纤维二糖并且酶包括纤维二糖磷酸化酶时，G1P利用纤维二糖通过纤维二糖磷酸化酶生成。

在另外的实施例中，当糖类包括纤维糊精并且酶包括纤维糊精磷酸化酶时，G1P利用纤维糊精通过纤维糊精磷酸化酶生成。

将糖转化为G1P的可替代的实施例中，当糖类包括纤维素并且酶包括纤维素磷酸化酶时，G1P利用纤维素通过纤维素磷酸化酶生成。

根据本发明，塔格糖也可以由果糖制备。该方法的实例如图4所示。例如，该方法包括采用多磷酸盐果糖激酶(PPFK)催化使果糖和多磷酸盐生成F6P；采用F6PE催化将F6P转化为T6P；以及采用T6PP催化将T6P转化为塔格糖。果糖可以，例如通过蔗糖的酶促转化来制备。

在其它实施例中，塔格糖可以由蔗糖制备。这种方法的一个实例如图6所示。该方法提供体外合成途径，合成途径包括以下酶促步骤：采用蔗糖磷酸化酶(SP)催化由蔗糖和游离的磷酸盐生成G1P；采用PGM催化将G1P转化为G6P；采用PGI催化将G6P转化为F6P；采用F6PE催化将F6P转化为T6P；以及采用T6PP催化将T6P转化为塔格糖。

然后，当T6P转化为塔格糖时生成的磷酸盐离子可在将蔗糖转化为G1P的步骤中循环利用。另外，如图6所示，通过由果糖生成F6P，该果糖由SP磷酸切割蔗糖生成，PPFK和多磷酸盐可用于提高塔格糖的产率。

在一些实施例中，用于制备塔格糖的方法包括以下步骤：通过酶解或酸解由多糖和寡糖生成葡萄糖，采用至少一种酶催化将葡萄糖转化为G6P，通过酶解或酸解由多糖和寡糖生成果糖，以及采用至少一种酶催化将果糖转化为G6P。上面列举了多糖和寡糖的实例。

在其它实施例中，G6P通过多磷酸盐葡糖激酶由葡萄糖和多磷酸钠生成。

本公开提供了将糖类，例如淀粉中的多糖和寡糖、纤维素、蔗糖及它们的衍生产物转化为塔格糖的方法。在某些实施例中，提供了人工(非天然)无ATP的酶促途径，使用无细胞酶混合物将淀粉、纤维素、蔗糖及其衍生产物转化为塔格糖。

如上所示，可以使用几种酶来水解淀粉以提高G1P的产率。这样的酶包括异淀粉酶、支链淀粉酶和α-淀粉酶。玉米淀粉含有妨碍αGP作用的许多支链。异淀粉酶可用于使淀粉去支链化，生成线性淀粉糊精。异淀粉酶预处理淀粉可以导致最终产品中较高的F6P浓度。异淀粉酶和支链淀粉酶切割α-1,6-糖苷键，其允许通过α-葡聚糖磷酸化酶更完全的淀粉降解。α-淀粉酶切割α-1,4-糖苷键，因此α-淀粉酶用于将淀粉降解成片段，以更快地转化为塔格糖。

如图2所示，通过将降解产物麦芽磷磷酸切割成G1P和葡萄糖，麦芽糖磷酸化酶(MP)可用于提高塔格糖的产率。或者，通过将降解产物葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖再利用到更长的麦芽低聚糖中，可以使用4-转葡糖苷酶(4GT)来提高塔格糖的产率，其可被αGP磷酸切割生成G1P。

此外，纤维素是最丰富的生物资源，并且是植物细胞壁的主要成分。非食用木质纤维素生物质包括纤维素、半纤维素和木质素以及其他次要成分。纯纤维素，包括Avicel(微晶纤维素)、再生无定形纤维素、细菌纤维素、滤纸等可以通过一系列处理来制备。部分水解的纤维素底物包括其聚合度大于7的水不溶性纤维糊精、聚合度为3-6的水溶性纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖和果糖。

在某些实施例中，通过一系列步骤可以将纤维素及其衍生产物转化为塔格糖。这种方法的实例如图3所示。该方法提供了包括以下步骤的体外合成途径：分别采用纤维糊精磷酸化酶(CDP)和纤维二糖磷酸化酶(CBP)催化，由纤维糊精和纤维二糖以及游离的磷酸盐生成G1P；采用PGM催化将G1P转化为G6P；采用PGI催化将G6P转化为催化的F6P；采用F6PE催化将F6P转化为T6P；以及采用T6PP催化将T6P转化为塔格糖。在该方法中，通过将纤维糊精和纤维二糖转化为G1P的步骤可以再利用磷酸盐离子。

可以使用几种酶将固体纤维素水解成水溶性纤维糊精和纤维二糖。这些酶包括内切葡聚糖酶和外切纤维素酶，但不包括β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)。

在纤维素水解及G1P生成之前，可以对纤维素和生物质进行预处理以增加它们的反应性并降低纤维素链的聚合度。纤维素和生物质预处理的方法包括稀酸预处理、纤维素溶剂型木质纤维素分级、氨纤维膨胀、氨水浸泡、离子液体处理和部分水解，部分水解通过使用浓酸、包括盐酸、硫酸、磷酸及其组合。

在一些实施例中，在该方法中可以加入多磷酸盐和多磷酸盐葡糖激酶(PPGK)，从而通过将降解产物葡萄糖磷酸化为G6P来增加塔格糖的产率，如图3所示。

在其它实施例中，塔格糖可以由葡萄糖生成。该方法的实例如图5所示。该方法包括采用多磷酸盐葡糖激酶(PPGK)催化从葡萄糖和多磷酸盐生成G6P的步骤；采用PGI催化将G6P转化为F6P；采用F6PE催化将F6P转化为T6P；以及采用T6PP催化将T6P转化为塔格糖。

本领域已知的任何合适的生物缓冲溶液可用于本发明的方法中，例如HEPES、PBS、BIS-TRIS、MOPS、DIPSO、Trizma等。用于所有实施例的反应缓冲溶液可以具有5.0-8.0的pH范围。更优选地，反应缓冲溶液pH可以在约6.0至约7.3的范围。例如，反应缓冲溶液的pH可以为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3。

反应缓冲溶液还可以含有关键的金属阳离子。金属离子的实例包括Mg²⁺和Zn²⁺。

进行工艺步骤的反应温度可以在37-85℃的范围进行。更优选地，步骤可以在约40℃至约70℃的温度范围进行。温度可以是，例如约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃。优选地反应温度为约50℃。

所公开方法的反应时间可以根据需要调整，并且可以在约8h至约48h的范围。例如，反应时间可以是约16h、约18h、约20h、约22h、约24h、约26h、约28h、约30h、约32h、约34h、约36、约38h、约40h、约42h、约44h、约46h或约48h。更优选地，反应时间为约24h。

由于对整个反应非常有利的平衡常数，根据本发明的方法可以实现高产率。例如，图7显示了基于形成的吉布斯能量的中间体之间的反应吉布斯能量，用于将1-磷酸葡萄糖转化为塔格糖。反应吉布斯能量使用http://equilibrator.weizmann.ac.il/.生成。理论上，如果起始材料完全转化为中间体，则可以实现高达99％的产率。

本发明的方法使用低成本的起始材料，并通过降低与原料和产物分离相关的成本来降低生产成本。淀粉、纤维素、蔗糖及它们的衍生物是比，例如乳糖更便宜的原料。当由乳糖生成塔格糖时，葡萄糖和半乳糖以及塔格糖通过色谱分离，这导致更高的生产成本。

此外，根据本发明将T6P转化为塔格糖的步骤是不可逆的磷酸酶反应，无论原料如何。因此，塔格糖以非常高的产率生产，同时有效地最小化随后的产品分离成本。

与基于细胞生产的方法相比，本发明包括无细胞制备塔格糖，由于消除了细胞膜而具有相对高的反应速率，而细胞膜通常会降低底物/产物运输进出速度的细胞。最终产品不含营养丰富的发酵培养基/细胞代谢产物。

实例

材料和方法

化学品

除非另有说明，所有的化学品，包括玉米淀粉、可溶性淀粉、麦芽糖糊精、麦芽糖、葡萄糖、滤纸均为试剂级或更高级，购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)或Fisher Scientific(匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)。限制性酶、T4连接酶和Phusion DNA聚合酶购自New England Biolabs(伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)。寡核苷酸由IntegratedDNA Technologies(科勒尔维尔，艾奥瓦州，美国)或Eurofins MWG Operon(亨茨维尔，阿拉巴马州，美国)合成。用于酶纯化的再生无定形纤维素通过Avicel PH105(FMC BioPolymer，费城，宾夕法尼亚州，美国)的溶解和再生来制备，如Ye等在“Fusion of a family9cellulose-binding module improves catalytic potential of Clostridiumthermocellum cellodextrin phosphorylase on insoluble cellulose.Appl.Microbiol.Biotechnol.2011；92:551-560”中所述。将大肠杆菌Sig10(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)用作DNA操作的宿主细胞，并将大肠杆菌BL21(DE3)(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)用作重组蛋白表达的宿主细胞。含有100mg·L^-1氨苄青霉素或50mg·L^-1卡那霉素的ZYM-5052培养基用于大肠杆菌细胞生长和重组蛋白质表达。来自里氏木霉(Trichoderma reesei)(目录号：C2730)的纤维素酶和支链淀粉酶(目录号：P1067)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)并由Novozymes(富兰克林顿，北卡罗来纳州，美国)制备。麦芽糖磷酸化酶(目录号：M8284)购自Sigma-Aldrich。

重组酶的生产和纯化

在1L锥形瓶中，将带有蛋白质表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在含有100mg·L^-1氨苄青霉素或50mg·L^-1卡那霉素的100mL ZYM-5052培养基中孵育。细胞在37℃生长并以220rpm旋转振荡16-24h。通过离心在12℃收集细胞，并用含有50mM NaCl和5mM MgCl₂(热沉淀和纤维素结合模块)的20mM HEPES(pH7.5)或含有300mM NaCl和5mM咪唑(Ni纯化)的20mM HEPES(pH7.5)洗涤一次。将细胞沉淀重新悬浮在相同的缓冲溶液中并通过超声(Fisher Scientific超声细胞破碎仪500型，打开脉冲5秒，在10秒关闭，以50％振幅共21min)裂解。离心后，纯化上清液中的目标蛋白质。

使用三种方法来纯化各种重组蛋白。通过Profinity IMAC Ni-带电树脂(Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)纯化组氨酸-标记的蛋白。通过高亲和力吸附在大表面再生无定形纤维素上纯化含有纤维素结合模块(CBM)和自切割内含肽的融合蛋白。在70-95℃下热沉淀5-30min用于纯化超热稳定酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白的纯度。

使用的酶及其活性测定

使用来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Uniprot ID G4FEH8)的α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)。50℃下在含有1mM MgCl₂、5mM DTT和30mM麦芽糖糊精的50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.2)中测定活性。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)(Vivaproducts，Inc.，利特尔顿，马萨诸塞州，美国)过滤酶来停止反应。使用补充有25U/mL葡萄糖磷酸变位酶的葡萄糖己糖激酶/G6PDH检测试剂盒(Sigma Aldrich，目录号GAHK20-1KT)检测1-磷酸葡萄糖(G1P)。单位(U)描述为μmol/min。

使用来自Thermococcus kodakaraensis(Uniprot ID Q68BJ6)的葡萄糖磷酸变位酶(PGM)。50℃下在含有5mM MgCl₂和5mM G1P的50mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中测定活性。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用己糖激酶/G6PDH检测试剂盒(Sigma Aldrich，目录号GAHK20-1KT)检测产物6-磷酸葡萄糖(G6P)。

使用来自热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Uniprot ID A3DBX9)和嗜热细菌(Thermus thermophilus)(Uniprot ID Q5SLL6)两种不同来源的磷酸葡糖异构酶(PGI)。50℃下在含有5mM MgCl₂和10mM G6P的50mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中测定活性。采用Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用6-磷酸果糖激酶(F6PK)/丙酮酸脱氢酶(PK)/乳酸脱氢酶(LD)偶联酶检测法检测产物6-磷酸果糖(F6P)，其中340nm处吸光度的降低表明生成了F6P。该200μL反应物含有50mM HEPES(pH7.2)、5mM MgCl₂、10mM G6P、1.5mM ATP、1.5mM磷酸烯醇丙酮酸、200μM NADH、0.1U PGI、5U PK和5U LD。

使用来自嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)(Uniprot ID B5YBD7)的6-磷酸果糖差向异构酶(F6PE)。50℃下在含有5mM MgCl₂和10mM F6P的50mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中测定活性。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用6-磷酸塔格糖磷酸酶检测产物6-磷酸塔格糖(T6P)，并检测游离磷酸盐的释放。为了检测游离磷酸盐的释放，将500μL含有0.1M乙酸锌和2mM钼酸铵的溶液(pH 5)加入到50μL反应物中。将其混合然后加入125μL5％抗坏血酸(pH 5)。将溶液混合，然后在30℃孵育20min。读取850nm处的吸光度以检测游离磷酸盐的释放。

来自嗜热链球菌UNI-1(Anaerolinea thermophila UNI-1)(Uniprot ID：E8N0N6)的嗜热F6PE

核苷酸序列(SEQ ID NO.：1)

ATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTGGATATGGTCACCGCGCAGAAACAGGGCATGGCGCGGGGTATCCCATCCATTTGTTCGGCACATCCGGTGGTGCTGAGTGCCGCCTGCCATCTTGCCCGCCGGAGCGGCGCGCCCCTGCTCATCGAAACCACCTGCAATCAGGTCAACCACCAAGGTGGGTACAGCGGCATGACCCCCGCCGATTTTGTCCGCTTTCTGCGCGAAATTCTGGAACGGGAAGGTATTCCCCCGCAACAGGTCATCCTGGGCGGGGATCACCTGGGTCCTTACCCCTGGCGGAAAGAGCCTGCCGAAACCGCCATAGCACAAGCGCTGGAAATGGTGCGGGCATACGTGCAGGCAGGCTACACCAAAATTCATCTGGACGCTTCCATGCCCTGCGCCGATGACGACCCCGAGCGTCCCCTGCCGCTGGAGCGCATAGCCCGACGGGCGGCGCAGTTGTGCGCCGCCGCCGAAGCCGCCGCGGGAGCGGTTCAGCCGGTGTACGTAATTGGCAGTGAGGTGCCCCCGCCCGGCGGCGCGCAGGGTCAGGAGGCAAGACTTCACGTCACCACTCCGCAGGAAGCCCAAGCCGCGCTGGATGCCTTTCGGGAAGCCTTTCTGCAGGCAGGCTTGACTCCCGTTTGGGAGCGGGTCATTGCGCTGGTAGTCCAGCCGGGGGTGGAGTTTGGCGTGGACAGCATTCACGCCTATCAGCGCGAAGCCGCCCGCCCGCTGAAGACCTTCATCGAGGGCGTGCCCGGCATGGTGTATGAAGCCCACTCGACCGATTACCAGACCCGTGCCTCCCTGCGTGCGCTGGTGGAAGACCACTTTTCCATTCTCAAGGTTGGTCCGGCACTAACCTTTGCCTACCGCGAAGCCGTGTTCGCCCTGGAACACATCGAACGGGAAATATTGGGCAGGCAGGATATGCCTCTCTCCCGCCTGAGTGAAGTCCTCGACGAGGTGATGCTGAACGATCCACGCCACTGGCAGGGATACTTTGCCGGCGCTCCCGCCGAACAGGCGCTGGCGCGCCGCTACAGTTTCAGCGACCGCATTCGCTATTACTGGCACCATCCCGCCGCGCAGGAAGCCGTGCGGAGACTGCTCGCCAACCTGATCGAAACCCCGCCGCCGCTGAGTTTGCTCAGCCAGTACCTGCCGCGCGAGTATGAGATGGTGCGCGCGGGGGAAATCTCCAGCCACCCGCAGGACCTGATTCGGGCACATATCCAGCACACGCTGGAAGATTACGCTGCGGCGTGCGGGTAA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：2)

MFGSPAPLLDMVTAQKQGMARGIPSICSAHPVVLSAACHLARRSGAPLLIETTCNQVNHQGGYSGMTPADFVRFLREILEREGIPPQQVILGGDHLGPYPWRKEPAETAIAQALEMVRAYVQAGYTKIHLDASMPCADDDPERPLPLERIARRAAQLCAAAEAAAGAVQPVYVIGSEVPPPGGAQGQEARLHVTTPQEAQAALDAFREAFLQAGLTPVWERVIALVVQPGVEFGVDSIHAYQREAARPLKTFIEGVPGMVYEAHSTDYQTRASLRALVEDHFSILKVGPALTFAYREAVFALEHIEREILGRQDMPLSRLSEVLDEVMLNDPRHWQGYFAGAPAEQALARRYSFSDRIRYYWHHPAAQEAVRRLLANLIETPPPLSLLSQYLPREYEMVRAGEISSHPQDLIRAHIQHTLEDYAAACG

来自Caldicellulosiruptor kronotskyensis(Uniprot ID：E4SEH3)的嗜热F6PE

核苷酸序列(SEQ ID NO.：3)

ATGAGTCCTCAAAATCCATTGATTGGTTTATTTAAGAATAGAGAAAAAGAGTTTAAGGGTATTATTTCAGTTTGTTCTTCAAATGAAATAGTCTTAGAAGCAGTTTTAAAAAGAATGAAAGATACAAACCTACCAATTATTATTGAAGCCACAGCGAACCAGGTAAATCAATTTGGCGGGTATTCTGGGTTGACACCGTCTCAGTTCAAAGAACGAGTTATAAAAATTGCTCAAAAAGTTGATTTTCCACTTGAGAGAATAATTCTTGGTGGGGACCATCTTGGACCATTTGTGTGGCGTGACCAGGAACCAGAAATTGCTATTGGAGTATGCTAAGCAAATGATAAAAGAATACATAAAAGCAGGTTTTACCAAAATTCACATCGACACGAGTATGCCTTTAAAAGGGGAGAACAGCATAGATGATGAAATAATTGCTAAAAGAACTGCTGTGCTCTGCAGGATTGCGGAGGAGTGTTTTGAGAAGATTTCTATAAACAATCCCTATATTACAAGGCCAGTTTATGTGATAGGAGCTGATGTGCCACCTCCCGGCGGAGAGTCTTCTATTTGTCAAACAATTACTACTAAAGATGAATTAGAAAGAAGTTTAGAATATTTCAAAGAAGCATTTAAAAAGGAAGGAATTGAGCATGTATTCGATTATGTAGTTGCTGTTGTTGCAAATTTTGGAGTTGAATTTGGGAGCGATGAAATTGTTGATTTTGATATGGAAAAAGTAAAGCCGCTAAAAGAACTTTTGGCAAAGTACAATATAGTATTTGAAGGCCATTCTACAGATTATCAAACAAAAGAAAACTTAAAAAGAATGGTCGAATGTGGTATTGCAATTTTAAAGGTTGGTCCTGCTCTAACATTTACATTGCGCGAAGCGTTAGTAGCACTTAGTCATATTGAAGAAGAAATTTATAGCAATGAAAAGGAGAAACTGTCAAGATTTAGAGAAGTTTTATTGAATACTATGCTAACATGCAAAGATCACTGGAGTAAATATTTTGATGAGAATGATAAGTTAATTAAGTCAAAGCTCCTATATAGCTATCTTGACAGATGGAGATACTATTTTGAAAACGAGAGTGTGAAAAGTGCTGTTTATTCTCTTATTGGAAATTTAGAGAATGTTAAAATTCCACCTTGGCTTGTAAGTCAGTATTTTCCTTCTCAGTACCAAAAGATGAGAAAAAAAGATTTAAAAAACGGTGCTGCCGACCTAATATTGGATAAAATAGGGGAAGTCATTGACCATTATGTTTATGCGGTAAAAGAATAA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：4)

MSPQNPLIGLFKNREKEFKGIISVCSSNEIVLEAVLKRMKDTNLPIIIEATANQVNQFGGYSGLTPSQFKERVIKIAQKVDFPLERIILGGDHLGPFVWRDQEPEIAMEYAKQMIKEYIKAGFTKIHIDTSMPLKGENSIDDEIIAKRTAVLCRIAEECFEKISINNPYITRPVYVIGADVPPPGGESSICQTITTKDELERSLEYFKEAFKKEGIEHVFDYVVAVVANFGVEFGSDEIVDFDMEKVKPLKELLAKYNIVFEGHSTDYQTKENLKRMVECGIAILKVGPALTFTLREALVALSHIEEEIYSNEKEKLSRFREVLLNTMLTCKDHWSKYFDENDKLIKSKLLYSYLDRWRYYFENESVKSAVYSLIGNLENVKIPPWLVSQYFPSQYQKMRKKDLKNGAADLILDKIGEVIDHYVYAVKE

来自Caldilinea aerophila(Uniprot ID：I0I507)的嗜热F6PE

核苷酸序列(SEQ ID NO：5)

ATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGACTGATCGAGCTGCGTGAACGAGAACAGATCCATCTCACGCTGCTGGCCGTCTGTCCCAACTCGGCGGCGGTGCTGGAGGCAGCGGTGAAGGTCGCCGCGCGCTGCCACACGCCGATGCTCTTCGCTGCCACGCTCAATCAAGTCGATCGCGACGGCGGCTACACCGGTTGGACGCCTGCGCAATTCGTCGCCGAGATGCGTCGCTATGCCGTCCGCTATGGCTGCACCACCCCGCTCTATCCTTGCCTGGATCACGGCGGGCCGTGGCTCAAAGATCGCCATGCACAGGAAAAGCTACCGCTCGACCAGGCGATGCATGAGGTCAAGCTGAGCCTCACCGCCTGTCTGGAGGCCGGCTACGCGCTGCTGCACATCGACCCCACGGTCGATCGCACGCTCCCGCCCGGAGAAGCGCCGCTCGTGCCGATCGTCGTCGAGCGCACGGTCGAGCTGATCGAACATGCCGAACAGGAGCGACAGCGGCTGAACCTGCCGGCGGTCGCCTATGAAGTCGGCACCGAAGAAGTACATGGCGGGCTGGTGAATTTCGACAATTTTGTCGCCTTCTTGGATTTGCTCAAGGCAAGGCTTGAACAACGTGCCCTGATGCACGCCTGGCCCGCCTTCGTGGTGGCGCAGGTCGGCACTGACCTGCATACAACGTATTTTGACCCCAGTGCGGCGCAACGGCTGACTGAGATCGTGCGCCCTACCGGTGCACTGTTGAAGGGGCACTACACCGACTGGGTCGAAAATCCCGCCGACTATCCGAGGGTAGGCATGGGAGGCGCCAACGTTGGTCCAGAGTTTACGGCGGCCGAGTTCGAGGCGCTGGAAGCGCTGGAACGGCGGGAACAACGGCTGTGCGCCAACCGGAAATTGCAGCCCGCCTGTTTTTTGGCTGCACTGGAAGAGGCAGTAGTCGCTTCAGATCGTTGGCGGAAGTGGCTCCAGCCCGATGAGATCGGCAAGCCCTTTGCAGAATTAACGCCCGCACGCCGGCGCTGGCTCGTGCAGACCGGGGCACGCTACGTCTGGACTGCGCCGAAAGTTATCGCCGCACGCGAACAGCTCTATGCGCACCTCTCCCTTGTGCAGGCGGATCCACATGCCTACGTGGTAGAGTCAGTCGCCCGGTCAATCGAGCGCTATATCGATGCCTTCAACTTATACGACGCCGCTACATTGCTTGGATGA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：6)

MSTLRHIILRLIELREREQIHLTLLAVCPNSAAVLEAAVKVAARCHTPMLFAATLNQVDRDGGYTGWTPAQFVAEMRYAVRYGCTTPLYPCLDHGGPWLKDRHAQEKLPLDQAMHEVKLSLTACLEAGYALLHIDPTVDRTLPPGEAPLVPIVVERTVELIEHAEQERQRLNLPAVAYEVGTEEVHGGLVNFDNFVAFLDLLKARLEQRALMHAWPAFVVAQVGTDLHTTTYFDPSAAQRLTEIVRPTGALLKGHYTDWVENPADYPRVGMGGANVGPEFTAAEFEALEALERREQRLCANRKLQPACFLAALEEAVVASDRWRKWLQPDEIGKPFAELTPARRRWLVQTGARYVWTAPKVIAAREQLYAHLSLVQADPHAYVVESVARSIERYIDAFNLYDAATLLG

来自Caldithrix abyssi(Uniprot ID：H1XRG1)的嗜热F6PE

核苷酸序列(SEQ ID NO.：7)

ATGAGTCTGCATCCTTTAAATAAATTAATCGAGCGACACAAAAAAGGAACGCCGGTCGGTATTTATTCCGTCTGTTCGGCCAATCCCTTTGTTTTGAAAGCGGCCATGCTACAGGCGCAAAAGGATCAGTCTTTGCTACTTATTGAGGCCACTTCCAACCAGGTAGATCAATTCGGCGGTTACACCGGCATGCGGCCCGAAGATTTTAAAACAATGACGCTTGAACTGGCAGCCGAAAACAATTACGATCCACAGGGATTAATCCTGGGCGGCGACCATCTGGGGCCCAACCGCTGGACAAAACTGAGCGCCTCCCGGGCCATGGACTACGCCAGAGAGCAGATTGCCGCTTATGTTAAAGCCGGCTTTTCCAAAATCCACTTAGACGCCACCATGCCCTTGCAAAACGATGCCACAGATTCCGCCGGCCGCCTTCCAGTCGAAACAATCGCTCAACGTACCGCAGAATTATGCGCCGTGGCCGAACAAACTTACCGGCAGAGCGACCAACTCTTTCCGCCGCCTGTTTACATTGTCGGCAGCGACGTGCCCATCCCGGGCGGCGCGCAAGAAGCGCTGAACCAGATCCATATTACGGAGGTAAAAGAGGTTCAACAGACCATTGATCACGTGCGGCGGGCCTTTGAAAAAAACGGCCTGGAAGCGGCTTACGAAAGAGTTTGCGCCGTTGTCGTGCAGCCAGGCGTTGAATTCGCCGATCAAATCGTTTTTGAATACGCTCCCGACAGAGCGGCGGCCTTAAAAGATTTTATTGAAAGCCATTCGCAGCTGGTTTATGAAGCGCACTCTACTGATTACCAGACCGCACCTCTTTTGCGCCAGATGGTAAAAGATCACTTTGCCATTTTAAAGGTCGGGCCTGCGCTCACCTTTGCCCTGCGCGAAGCCATTTTTGCTCTGGCCTTTATGGAAAAAGAGCTTTTGCCATTGCACAGAGCGCTCAAACCTTCTGCCATTCTGGAAACGCTGGACCAAACGATGGACAAAAACCCTGCTTACTGGCAAAAGCATTACGGCGGAACAAAGGAAGAAGTACGCTTTGCGCAGCGGTTTAGCCTGAGCGACCGCATTCGTTACTACTGGCCGTTTCCAAAGGTTCAAAAGGCCCTGCGCCAATTGCTAAAAAACTTGCAACAAATTTCCATTCCTCTAACTTTGGTAAGCCAGTTCATGCCAGAGGAATACCAACGTATTCGCCAAGGAACGTTAACCAACGATCCGCAGGCGCTGATTTTGAACAAAATTCAAAGCGTATTAAAGCAATACGCGGAGGCGACGCAAATTCAAAACTCTTTGACATTCACGCAAAATCAAAATTCATTAGCAATGGAGCGACTATGA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：8)

MSLHPLNKLIERHKKGTPVGIYSVCSANPFVLKAAMLQAQKDQSLLLIEATSNQVDQFGGYTGMRPEDFKTMTLELAAENNYDPQGLILGGDHLGPNRWTKLSASRAMDYAREQIAAYVKAGFSKIHLDATMPLQNDATDSAGRLPVETIAQRTAELCAVAEQTYRQSDQLFPPPVYIVGSDVPIPGGAQEALNQIHITEVKEVQQTIDHVRRAFEKNGLEAAYERVCAVVVQPGVEFADQIVFEYAPDRAAALKDFIESHSQLVYEAHSTDYQTAPLLRQMVKDHFAILKVGPALTFALREAIFALAFMEKELLPLHRALKPSAILETLDQTMDKNPAYWQKHYGGTKEEVRFAQRFSLSDRIRYYWPFPKVQKALRQLLKNLQQISIPLTLVSQFMPEEYQRIRQGTLTNDPQALILNKIQSVLKQYAEATQIQNSLTFTQNQNSLAMERL

来自Dictyglomus thermophilum(Uniprot ID：B5YBD7)的嗜热F6PE

核苷酸序列(SEQ ID NO.：9)

ATGTGGCTTAGTAAAGATTATTTGAGAAAAAAGGGAGTTTATTCTATATGTAGCTCTAATCCATATGTGATTGAGGCAAGTGTTGAATTTGCTAAGGAGAAGAATGATTATATTTTAATTGAGGCGACACCTCATCAGATAAACCAGTTTGGTGGATATTCAGGTATGACTCCCGAAGATTTTAAAAACTTTGTAATGGGAATAATAAAAGAAAAGGGAATAGAAGAGGATAGGGTGATTCTTGGAGGGGACCATTTAGGCCCTCTCCCTTGGCAAGATGAACCTTCTTCTTCTGCAATGAAAAAGGCAAAAGACCTTATAAGGGCCTTTGTGGAGAGTGGTTATAAGAAGATACACCTTGATTGTAGTATGTCTCTTTCTGATGATCCTGTAGTGCTCTCTCCCGAGAAGATAGCAGAAAGGGAGAGGGAACTTCTTGAGGTTGCAGAAGAGACTGCTAGAAAGTACAATTTTCAGCCTGTGTATGTGGTGGGAACTGATGTACCGGTAGCTGGAGGAGGCGAAGAGGAAGGTATTACCTCAGTGGAGGATTTTAGAGTAGCAATCTCCTCTTTAAAAAAATATTTTGAGGATGTTCCAAGGATATGGGATAGGATAATTGGTTTTGTAATAATGCTTGGTATAGGTTTTAATTATGAAAAAGTGTTTGAGTATGACAGGATTAAGGTGAGAAAAATTTTAGAGGAGGTAAAGAAAGAGAATCTTTTTGTTGAAGGTCACTCTACTGACTATCAGACAAAACGTGCATTGAGAGATATGGTAGAGGATGGAGTAAGAATTCTTAAGGTTGGTCCTGCTTTAACAGCAAGTTTTAGAAGGGGAGTATTTTTATTAAGTAGCATTGAGGATGAGCTTATATCGGAAGATAAAAGGTCTAATATTAAGAAAGTTGTGCTTGAGACTATGTTAAAAGATGATAAATATTGGAGAAAGTATTATAAGGATTCAGAAAGATTAGAATTAGATATTTGGTACAACTTACTTGATAGGATTAGATATTATTGGGAATATAAAGAGATAAAAATAGCTTAAATAGGCTTTTGAAAATTTTTCGGAAGGGGTTGATATTAGATACATCTATCAATATTTTTATGATTCGTATTTTAAAGTAAGAGAAGGAAAAATAAGAAATGATCCAAGGGAGCTAATAAAGAATGAAATAAAGAAGGTCTTGGAGGACTATCACTATGCTGTAAACTTATAA

密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.：10)

ATGTGGCTGAGCAAGGACTACCTGCGTAAGAAGGGCGTTTACAGCATTTGCAGCAGCAACCCGTATGTTATTGAAGCGAGCGTGGAGTTCGCGAAGGAGAAAAACGATTACATCCTGATTGAAGCGACCCCGCACCAGATCAACCAATTTGGTGGCTATAGCGGCATGACCCCGGAGGACTTCAAGAACTTTGTTATGGGCATCATTAAGGAAAAAGGTATCGAGGAAGACCGTGTGATTCTGGGTGGCGATCACCTGGGTCCGCTGCCGTGGCAGGATGAGCCGAGCAGCAGCGCGATGAAGAAAGCGAAAGACCTGATCCGTGCGTTCGTTGAAAGCGGTTACAAGAAAATTCACCTGGATTGCAGCATGAGCCTGAGCGACGATCCGGTGGTTCTGAGCCCGGAGAAGATCGCGGAACGTGAGCGTGAACTGCTGGAAGTTGCGGAGGAAACCGCGCGTAAATACAACTTTCAACCGGTGTATGTGGTGGGTACCGATGTTCCGGTTGCGGGTGGCGGTGAGGAAGAGGGTATCACCAGCGTGGAGGACTTCCGTGTTGCGATTAGCAGCCTGAAGAAATACTTTGAAGACGTTCCGCGTATTTGGGATCGTATCATTGGTTTCGTGATCATGCTGGGCATTGGTTTCAACTACGAGAAGGTGTTTGAATATGATCGTATCAAAGTGCGTAAAATTCTGGAAGAGGTTAAGAAAGAGAACCTGTTTGTGGAAGGCCACAGCACCGACTATCAGACCAAGCGTGCGCTGCGTGACATGGTGGAGGATGGCGTTCGTATCCTGAAAGTGGGTCCGGCGCTGACCGCGAGCTTCCGTCGTGGTGTGTTTCTGCTGAGCAGCATCGAGGACGAACTGATTAGCGAGGATAAACGTAGCAACATTAAGAAAGTGGTTCTGGAAACCATGCTGAAGGACGATAAATACTGGCGTAAGTACTATAAAGACAGCGAGCGTCTGGAACTGGATATCTGGTACAACCTGCTGGACCGTATTCGTTACTACTGGGAGTACAAGGAAATCAAGATTGCGCTGAACCGTCTGTTCGAGAACTTTAGCGAAGGCGTTGATATCCGTTACATCTACCAATACTTCTACGACAGCTACTTCAAAGTGCGTGAGGGTAAAATCCGTAACGACCCGCGTGAACTGATTAAGAACGAGATTAAGAAAGTGCTGGAAGACTACCATTATGCGGTGAACCTGTAA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：11)

MWLSKDYLRKKGVYSICSSNPYVIEASVEFAKEKNDYILIEATPHQINQFGGYSGMTPEDFKNFVMGIIKEKGIEEDRVILGGDHLGPLPWQDEPSSSAMKKAKDLTRAFVESGYKKIHLDCSMSLSDDPVVLSPEKIAERERELLEVAEETARKYNFQPVYVVGTDVPVAGGGEEEGITSVEDFRVAISSLKKYFEDVPRIWDRIIGFVIMLGIGFNYEKVFEYDRIKVRKTLEEVKKENLFVEGHSTDYQTKRALRDMVEDGVRILKVGPALTASFRRGVFLLSSIEDELISEDKRSNIKKVVLETMLKDDKYWRKYYKDSERLELDIWYNLLDRIRYYWEYKEIKIALNRLFENFSEGVDIRYIYQYFYDSYFKVREGKIRNDPRELIKNEIKKVLEDYHYAVNL

使用来自Archaeoglobus fugidis(Uniprot ID O29805)的6-磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)。50℃下在含有5mM MgCl₂和10mM T6P的50mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中测定活性。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。通过检测如F6PE所述的游离磷酸盐的释放来检测塔过糖的生成。

来自Archaeoglobus fugidis(Uniprot ID：029805)的嗜热T6PP

核苷酸序列(SEQ ID NO.：12)

ATGTTCAAACCAAAGGCCATCGCAGTTGACATAGATGGCACCCTCACCGACAGAAAGAGGGCTCTGAACTGCAGGGCTGTTGAAGCTCTCCGCAAGGTAAAAATTCCCGTGATTTTGGCCACTGGTAACATATCTTGTTTTGCGAGGGCTGCAGCAAAGCTGATTGGAGTCTCAGACGTGGTAATCTGCGAGAATGGGGGCGTGGTGAGGTTCGAGTACGATGGGGAGGATATTGTTTTAGGAGATAAAGAGAAATGCGTTGAGGCTGTGAGGGTGCTTGAGAAACACTATGAGGTTGAGCTGCTGGACTTCGAATACAGGAAGTCGGAAGTGTGCATGAGGAGGAGCTTTGACATCAACGAGGCGAGAAAGCTCATTGAGGGGATGGGGGTTAAGCTTGTGGATTCAGGCTTTGCCTACCACATTATGGATGCTGATGTTAGCAAGGGAAAAGCTTTGAAGTTCGTTGCCGAGAGGCTTGGTATCAGTTCAGCGGAGTTTGCAGTTATCGGCGACTCAGAGAACGACATAGACATGTTCAGAGTTGCTGGATTCGGAATTGCTGTTGCCAATGCCGATGAGAGGCTGAAGGAGTATGCTGATTTAGTTACGCCATCACCAGACGGCGAGGGGGTTGTTGAGGCTTTGCAGTTTCTGGGATTGTTGCGGTGA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：13)

MFKPKAIAVDIDGTLTDRKRALNCRAVEALRKVKIPVILATGNISCFARAAAKLIGVSDVVICENGGVVRFEYDGEDIVLGDKEKCVEAVRVLEKHYEVELLDFEYRKSEVCMRSFDINEARKLIEGMGVKLVDSGFAYHIMDADVSKGKALKFVAERLGISSAEFAVIGDSENDIDMFRVAGFGIAVANADERLKEYADLVTPSPDGEGVVEALQFLGLLR

来自Archaeoglobus profundus(Uniprot ID D2RHV2_ARCPA)的T6PP

核苷酸序列(SEQ ID NO.：14)

GTGTTCAAGGCTTTGGTAGTTGATATAGACGGAACTTTGACGGATAAGAAGAGGGCAATAAACTGCAGAGCGGTCGAAGCACTTAGAAAACTAAAGATTCCTGTTGTCTTGGCAACCGGAAACATTTCATGCTTTGCAAGGGCTGTAGCTAAGATTATAGGTGTTTCCGATATTGTAATAGCTGAGAACGGAGGTGTTGTCAGATTCAGCTACGACGGAGAGGACATAGTTCTGGGGGATAGAAGTAAATGCTTAAGAGCTTTGGAGACACTTAGAAAACGCTTCAAAGTAGAGCTTCTCGACAACGAATATAGGAAGTCTGAGGTCTGCATGAGGAGGAACTTCCCTATAGAGGAAGCTAGAAAGATACTGCCAAAAGATGTTAGAATAGTCGATACAGGCTTCGCATACCACATAATCGATGCAAATGTCAGCAAGGGGAAGGCTTTGATGTTCATAGCCGATAAGCTTGGCTTGGACGTTAAGGATTTCATTGCGATAGGTGATTCCGAAAACGACATTGAAATGTTGGAAGTTGCAGGTTTTGGCGTTGCAGTTGCGAATGCGGATGAAAAGCTTAAGGAGGTAGCGGATTTGGTCACATCGAAGCCTAATGGAGACGGAGTTGTCGAAGCTCTTGAGTTCTTGGGACTCATTTAG

氨基酸序列(SEQ ID NO.：15)

MFKALVVDIDGTLTDKKRAINCRAVEALRKLKIPVVLATGNISCFARAVAKIIGVSDIVIAENGGVRFSYDGEDIVLGDRSKCLRALETLRKRFKVELLDNEYRKSEVCMRRNFPIEEARKILPKDVRIVDTGFAYHIIDANVSKGKALMFIADKLGLDVKDFIAIGDSENDIEMLEVAGFGVAVANADEKLKEVADLVTSKPNGDGVVEALEFLGLI

来自Archaeoglobus vebeficus(Uniprot ID F2KMK2_ARCVS)的T6PP

核苷酸序列(SEQ ID NO.：16)

ATGCTCCGTCCAAAGGGTCTCGCCATTGACATCGACGGAACCATAACATACAGGAATCGAAGCCTGAACTGTAAGGCCGTTGAAGCTCTCAGGAAGGTAAAAATCCCTGTAGTTCTTGCAACTGGCAACATATCCTGTTTCGCAAGAACTGCTGCAAAGCTTATAGGCGTCTCAGACATTGTTATATGCGAAAATGGAGGTATTGTTCGATTCAGCTACGATGGCGACGACATAGTGCTTGGGGACATAAGCAAATGCCTTAAAGCGGCTGAAATTCTCAAAGAGTACTTTGAAATCGAATTCCTTGACGCTGAGTACAGGAAGTCGGAGGTCTGTCTTCGCAGAAACTTTCCTATTGAAGAGGCGAGGAAAATTCTTCACGATGCAAAGCTTGATGTTAAAATCGTCGATTCAGGTTTTGCGTACCACATAATGGATGCGAAGGTCAGCAAAGGAAGGGCTCTTGAGTACATAGCTGATGAACTTGGTATAAGTCCGAAGGAGTTCGCTGCAATTGGTGATTCTGAGAACGACATAGACCTGATTAAGGCTGCCGGCCTCGGTATTGCCGTTGGAGATGCTGACTTAAAGCTCAAAATGGAGGCCGACGTGGTAGTCTCGAAGAAGAATGGCGATGGAGTTGTTGAAGCACTTGAGCTTCTGGGCTTAATTTAA

氨基酸序列(SEQ ID NO.：17)

MLRPKGLAIDIDGTITYRNRSLNCKAVEALRKVKIPVVLATGNISCFARTAAKLIGVSDIVICENGGIVRFSYDGDDIVLGDISKCLKAAEILKEYFEIEFLDAEYRKSEVCLRRNFPIEEARKILHDAKLDVKIVDSGFAYHIMDAKVSKGRALEYIADELGISPKEFAAIGDSENDIDLIKAAGLGIAVGDADLKLKMEADVVVSKKNGDGVVEALELLGLI

Ye等人在“Spontaneous high-yield production ofhydrogen from cellulosicmaterials and water catalyzed by enzyme cocktails，ChemSusChem 2009；2：149-152”中描述了来自C.thermocellum的重组纤维糊精磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶。如上所述测定其活性。

Liao等人在“One-step purification and immobilization of thermophilicpolyphosphate glucokinase from Thermobiffda fusca YX：glucose-6-phosphategeneration without ATP.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012；93：1109-1117”中描述了来自Thermobifida fusca YX的重组多磷酸盐葡糖激酶。如上所述测定其活性。

Cheng等人在“Doubling power output of starch biobattery treated by themost thermostable isoamylase from an archaeon Sulfolobus tokodaii.ScientificReports 2015；5：13184”中描述了来自Sulfolobus tokodaii的重组异淀粉酶。如上所述测定其活性。

Jeon等人在“4-α-Glucanotransferase from the Hyperthermophilic ArchaeonThermococcus Litoralis.Eur.J.Biochem.1997；248：171-178”中描述了来自Thermococcus litoralis的重组4-α-葡聚糖转移酶。如上所述测定其活性。

使用来自Caldithrix abyssi(Uniprot H1XT50)的蔗糖磷酸化酶。在含有10mM蔗糖和12mM有机磷酸盐的50mM HEPES缓冲溶液(pH7.5)中测定其活性。使用补充有25U/mL葡萄糖磷酸变位酶和α-葡聚糖磷酸化酶的葡萄糖己糖激酶/G6PDH检测试剂盒，检测1-磷酸葡萄糖(G1P)。

在以下每个实例中，根据需要可以增加或减少使用的酶单位以调节反应时间。例如，如果想在8h而不是24h进行实例9，酶的单位将增加约3倍。相反，如果想要在48h而不是24h进行实例9，则酶单位可以减少约2倍。这些实施例说明了可以如何使用酶单位的量来增加或减少反应时间，同时保持恒定的生产率。

实例1

为了验证采用淀粉酶促生物合成6-磷酸果糖的技术可行性，重组表达了三种酶：来自T.maritima(Uniprot ID G4FEH8)的α-葡聚糖磷酸化酶、来自Thermococcuskodakaraensis(Uniprot ID Q68BJ6)的葡萄糖磷酸变位酶以及来自Clostridiumthermocellum(Uniprot ID A3DBX9)的磷酸异构酶。重组蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中过度表达并如上所述纯化。

将含有10g/L可溶性淀粉、50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.5mMZnCl₂、0.01UαGP、0.01U PGM和0.01U PGI的0.20mL反应混合物在50℃孵育24h。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用6-磷酸果糖激酶(F6PK)/丙酮酸脱氢酶(PK)/乳酸脱氢酶(LD)偶联酶检测法检测产物6-磷酸果糖(F6P)，其中在340nm处吸光度的降低表明生成了如上所述的F6P。24h后F6P的最终浓度为3.6g/L。

实例2

在40-80℃进行与实例1(除反应温度外)相同的试验。发现在40℃反应40h后，10g/L可溶性淀粉生成0.9g/L F6P，在80℃反应40h后，10g/L可溶性淀粉生成3.6g/L F6P。这些结果表明，提高这一组酶的反应温度会增加F6P的产量，但太高的温度可能会损害一些酶的活性。

实例3

发现在80℃，αGP：PGM：PGI的酶比率约为1：1：1导致F6P快速生成。注意，如果反应时间足够长，则酶比率对最终F6P浓度的影响不会太大。然而，酶比率影响反应速率和系统中使用的酶的总成本。

实例4

将含有10g/L麦芽糖糊精、50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.5mMZnCl₂、0.01UαGP、0.01U PGM和0.01U PGI的0.20mL反应混合物在50℃孵育24h。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用6-磷酸果糖激酶(F6PK)/丙酮酸脱氢酶(PK)/乳酸脱氢酶(LD)偶联酶检测法检测产物6-磷酸果糖(F6P)，其中在340nm处吸光度的降低表明生成了如上所述的F6P。24h后F6P的最终浓度为3.6g/L。

实例5

为了测试由Avicel生成了F6P，使用Sigma的纤维素酶在50℃水解纤维素。为了从商业的纤维素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，将10滤纸单位/mL的纤维素酶与10g/LAvicel混合10分钟。4℃离心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。将与纤维素酶结合的Avicel重悬于柠檬酸盐缓冲溶液(pH 4.8)中，在50℃水解3天，该纤维素酶含有内切葡聚糖酶和外切纤维素酶。在含有10mM磷酸盐、5mM MgCl₂和0.5mM ZnCl₂的100mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中，将纤维素水解产物与5U/mL纤维糊精磷酸化酶、5U/mL纤维二糖磷酸化酶、5U/mLαGP、5U/mL PGM和5U/mL PGI混合。反应在60℃进行72h，发现高浓度的F6P(少量葡萄糖而无纤维二糖)。使用上述的偶联酶检测法检测F6P。使用如上所述的己糖激酶/G6PDH检测试剂盒检测葡萄糖。

实例6

为了提高由Avicel生成F6P的产量，用浓磷酸预处理Avicel以生成无定形纤维素(RAC)，如Zhang等人在“A transition from cellulose swelling to cellulosedissolution by o-phosphoric acid:evidence from enzymatic hydrolysis andsupramolecular structure.Biomacromolecules 2006；7：644-648)”中所述。为了从商业的纤维素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，将10滤纸单位/mL的纤维素酶与10g/L的RAC混合5分钟。4℃离心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。将与纤维素酶结合的RAC重新悬浮于柠檬酸盐缓冲溶液(pH4.8)中，在50℃水解12小时，该纤维素酶含有内切葡聚糖酶和外切纤维素酶。在含有10mM磷酸盐、5mM MgCl₂和0.5mM ZnCl₂的100mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中，将RAC水解产物与5U/mL纤维糊精磷酸化酶、5U/mL纤维二糖磷酸化酶、5U/mLαGP、5U/mL PGM和5U mL PGI混合。反应在60℃进行72小时。获得高浓度的F6P和葡萄糖，因为没有添加酶将葡萄糖转化为F6P。使用上述的偶联酶检测法检测F6P。使用如上所述的己糖激酶/G6PDH检测试剂盒检测葡萄糖。

实例7

为了进一步提高由RAC生成F6P的产量，加入多磷酸盐葡糖激酶和多磷酸盐。为了从商业的纤维素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，将10滤纸单位/mL的纤维素酶与10g/L的RAC混合5分钟。4℃离心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。将与纤维素酶结合的RAC重悬于柠檬酸盐缓冲溶液(pH 4.8)中在50℃水解，该纤维素酶含有内切葡聚糖酶和外切纤维素酶，并在柠檬酸盐缓冲溶液(pH 4.8)中孵育以在50℃水解12h。在含有50mM多磷酸盐、10mM磷酸盐、5mM MgCl₂和0.5mM ZnCl₂的100mM HEPES缓冲溶液(pH7.2)中，将RAC水解产物与5U/mL多磷酸盐葡糖激酶、5U/mL纤维糊精磷酸化酶、5U/mL纤维二糖磷酸化酶、5U/mLαGP、5U/mLPGM和5U/mL PGI混合。反应在50℃进行72h。发现高浓度的F6P及少量葡萄糖存在。使用上述的偶联酶检测法检测F6P。使用如上所述的己糖激酶/G6PDH检测试剂盒检测葡萄糖。

实例8

为了验证由F6P生成了塔格糖，在含有5mM MgCl₂的50mM HEPES缓冲溶液(pH 7.2)中，将2g/L F6P与1U/ml 6-磷酸果糖差向异构酶(F6PE)和1U/ml 6-磷酸塔格糖磷酸酶(T6PP)混合。将反应在50℃孵育16h。使用Agilent Hi-Plex H柱和折光率检测器，通过HPLC(Agilent1100系列)观察到F6P 100％转化为塔格糖。样品在5mL H₂SO₄中以0.6mL/min运行。

实例9

为了验证由麦芽糖糊精生成了塔格糖，将含有20g/L麦芽糖糊精、50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.05UαGP、0.05U PGM、0.05U PGI、0.05U F6PE和0.05U T6PP的0.20mL反应混合物在50℃孵育24小时。通过Vivaspin 2浓缩器(10000MWCO)过滤酶来停止反应。使用具有折光率检测器和Agilent Hi-Plex H柱的Agilent 1100系列HPLC检测和定量塔格糖。流动相为5mM H₂SO₄，以0.6mL/min运行。得到9.2g/L的塔格糖产量。这相当于理论产量的92％，这是由于不含酶(如异淀粉酶或4-转葡糖苷酶)的麦芽糖糊精降解的限制。使用各种浓度的塔格糖的标准来量化我们的产量。

实例10

将含有200g/L麦芽糖糊精、10mM乙酸盐缓冲溶液(pH5.5)、5mM MgCl₂和0.1g/L异淀粉酶的反应混合物在80℃孵育24小时。将其用于生成其他的反应混合物，该反应混合物含有20g/L异淀粉酶处理的麦芽糖糊精、50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.05UαGP、0.05U PGM、0.05U PGI、0.05U F6PE和0.05U T6PP，在50℃孵育24小时。如实例9定量生成的塔格糖。通过异淀粉酶预处理麦芽糖糊精，塔格糖的产量提高至16g/L。这相当于理论产量的80％。

实例11

为了进一步提高由麦芽糖糊精生成塔格糖的产量，将0.05U 4-转葡糖苷酶(4GT)加入实例9所述的反应中。

将含有20g/L异淀粉酶处理的麦芽糖糊精(参见实例9)、50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.05UαGP、0.05U PGM、0.05U PGI、0.05U F6PE、0.05U T6PP和0.05U 4GT的0.2mL反应混合物在50℃孵育24h。如实例9定量塔格糖的生产量。通过向IA处理的麦芽糖糊精中加入4GT，塔格糖的产量提高至17.7g/L。这相当于理论产量的88.5％。

实例12

为了确定磷酸盐缓冲溶液(PBS)的浓度范围，将含有50g/L麦芽糖糊精、(6.25mM、12.5mM、25mM、37.5mM或50mM)pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、0.1UαGP、0.1UPGM、0.1UPGI、0.1U F6PE和0.1U T6PP的0.20mL反应混合物在50℃孵育6h。短期内确保反应未能完全，因此可以清楚地看到效率的差异。如实例9定量塔格糖的生产量。对于含有6.25mM、12.5mM、25mM、37.5mM或50mM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液的反应，分别获得4.5g/L、5.1g/L、5.6g/L、4.8g/L或4.9g/L的塔格糖(表1)。这些结果表明，浓度为25mM的pH7.2PBS对于这些特定的反应条件是理想的。重点注意的是，由于磷酸盐循环利用，即使使用6.25mM pH7.2的PBS也会实现明显降低。这表明即使在工业水平的体积产量(例如，200-300g/L麦芽糖糊精)，所公开的磷酸盐循环利用方法也能够降低磷酸盐水平。

表1

pH7.2的PBS的浓度(mM)	塔格糖g/L
		6.25	4.5
12.5	5.1
		25	5.6
37.5	4.8
		50	4.9

实例13

为了确定级联反应的pH范围，将含有50g/L麦芽糖糊精、50mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3)、5mM MgCl₂、0.02UαGP、0.02U PGM、0.02U PGI、0.02U F6PE和0.02U T6PP的20mL反应混合物在50℃孵育16h。降低单位以确保反应未能完全，因此可以清楚地看到效率的差异。如实例8定量塔格糖的产量。对于含有50mM pH 6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3磷酸盐缓冲溶液的反应，分别获得4.0g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.1g/L、4.4g/L、4.1g/L、3.8g/L或4.0g/L的塔格糖(表2)。这些结果表明，对于这些特定的反应条件，pH 6.8是理想的，尽管该体系可以在宽的pH范围内反应。

表2

PBS的pH	塔格糖g/L
		6.0	4.0
6.2	4.1
		6.4	4.2
6.6	4.1
		6.8	4.4
7.0	4.1
		7.2	3.8
7.3	4.0

实例14

为了研究放大，将含有50g/L异淀粉酶处理的麦芽糖糊精(参见实例9)、50mMpH7.2磷酸盐缓冲溶液、5mM MgCl₂、10UαGP、10U PGM、10U PGI、10U F6PE和10U T6PP的20mL反应混合物在50℃孵育24小时。如实例8定量塔格糖的生产量。对20mL规模和50g/L麦芽糖糊精，塔格糖的产量为37.6g/L。这相当于理论产量的75％。这些结果表明，放大到更大的反应体积不会导致产量的显著降低。

实例15

为了进一步提高由麦芽糖糊精生成塔格糖的产量，将0.05U麦芽糖磷酸化酶加入到实例9所述的反应中。

实例16

为了进一步提高由麦芽糖糊精生成塔格糖的产量，将0.05U多磷酸盐葡糖激酶和75mM多磷酸盐加入到实例9所述的反应中。

实例17

为了从果糖生成塔格糖，将含有10g/L果糖、50mM pH7.0的Tris缓冲溶液、75mM多磷酸盐、5mM MgCl₂、0.05U果糖多磷酸盐激酶、0.05U F6PE和0.05U T6PP的反应混合物在50℃孵育24h。如实例9定量塔格糖的生产量。

实例18

为了从葡萄糖生成塔格糖，将含有10g/L葡萄糖、50mM pH7.0的Tris缓冲溶液、75mM多磷酸盐、5mM MgCl₂、0.05U葡萄糖多磷酸盐激酶、0.05U PGI、0.05U F6PE和0.05UT6PP的反应混合物在50℃孵育24h。如实例9定量塔格糖的生产量。

实例19

为了从蔗糖生成塔格糖，将含有10g/L蔗糖、50mM pH7.0的磷酸盐缓冲溶液、5mMMgCl₂、0.05U蔗糖磷酸化酶、0.05U PGM、0.05U PGI、0.05U F6PE和0.05U T6PP的反应混合物在50℃孵育24h。如实例9定量塔格糖的生产量。

实例20

为了进一步提高从蔗糖生成塔格糖的产量，将75mM多磷酸盐和0.05多磷酸盐果糖激酶加入到实例15的反应混合物中。如实例9定量塔格糖的生产量。

Claims

1.一种制备塔格糖的酶促方法，所述方法包括如下步骤：

(i)采用6-磷酸果糖差向异构酶催化，将6-磷酸果糖转化为6-磷酸塔格糖；和

(ii)采用6-磷酸塔格糖磷酸酶催化，将生成的6-磷酸塔格糖转化为塔格糖；

其中，所述步骤(i)-(ii)在一个反应容器中进行。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括将6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖的步骤，其中该步骤采用磷酸葡糖异构酶催化。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括将1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的步骤，其中该步骤采用葡萄糖磷酸变位酶催化。

4.根据权利要求3所述的方法，还包括将糖类转化为1-磷酸葡萄糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化，其中所述糖类选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。

5.根据权利要求4所述的方法，其中至少一种酶选自由α-葡聚糖磷酸化酶、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和纤维素磷酸化酶组成的组。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述糖类是淀粉或其衍生物，所述淀粉或其衍生物选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖和葡萄糖组成的组。

7.根据权利要求4或6所述的方法，还包括将淀粉转化为淀粉衍生物的步骤，其中所述淀粉衍生物通过淀粉的酶解或通过淀粉的酸解来制备。

8.根据权利要求6所述的方法，其中在该方法步骤中加入4-转葡糖苷酶。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述淀粉衍生物通过异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或它们的组合催化淀粉酶解来制备。

10.根据权利要求1所述的方法，还包括：

将果糖转化为6-磷酸果糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化。

11.根据权利要求1所述的方法，还包括：

将蔗糖转化为果糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化。

12.根据权利要求2所述的方法，还包括：

将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化。

13.根据权利要求2所述的方法，还包括：

将蔗糖转化为葡萄糖的步骤，其中该步骤采用至少一种酶催化。