CN101265460A - 一株重组l-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法 - Google Patents
一株重组l-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以DNA重组技术构建高表达的L－阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，并涉及利用该基因工程菌所产的L－阿拉伯糖异构酶合成塔格糖的方法。本发明公开了高效表达L－阿拉伯糖异构酶的基因工程菌、以该工程菌所产的L－阿拉伯糖异构酶作为酶源，由D－半乳糖催化合成D－塔格糖。利用本发明的方法，具有简单，高效，周期短等特点，其固定化L－阿拉伯糖异构酶能反复利用十次以上，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及以DNA重组技术构建一株高表达L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)的基因工程菌，并利用该工程菌所产的L-阿拉伯糖异构酶转化塔格糖(D-tagatose)的方法。
背景技术
塔格糖为果糖的同分异构体，广泛存在于自然界中，许多食品(如灭菌牛乳、超高温灭菌乳、乳粉、热可可、各种干酪、某些品种的酸乳、婴儿配方食品)以及某些植物、药物中都存在有一定量的塔格糖。
纯净的塔格糖为白色无水晶体物质，无臭，熔点134℃，玻璃化温度15℃。其水溶性很好，溶于水后还会引起沸点升高和冰点降低，但并不吸热，因此不会产生清凉的口感。塔格糖的甜度为蔗糖的92％，是一种很好的填充型甜味剂。其甜味特性与蔗糖相似，无任何不良异味或后味。
塔格糖在机体内的吸收率较低，不会引起机体血糖水平的明显变化，很适合糖尿病人食用。研究显示，塔格糖并不会引起健康受试者和II型糖尿病患者空腹血糖和胰岛素水平的明显变化，并可明显抑制糖尿病患者因摄入葡萄糖所引起的血糖升高，但对其胰岛素敏感性并无明显作用。另据专利报道，塔格糖可缓解改善糖尿病的症状，抑制各种并发症的发生。塔格糖进入结肠，被其中微生物菌群所选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌的生长，起到明显的改善肠道菌群的作用，是一种很好的益生素(prebiotic)。同时，塔格糖发酵还产生大量有益的短链脂肪酸(short chain fat acid，SCFA)。研究显示，塔格糖并不会降低牙斑的pH值，而不会引起龋齿。大量安全毒理学试验显示，塔格糖安全无毒。2001年4月11日，美国FDA批准塔格糖作为GRAS(generally regarded as safe公认为安全的)用于食品。后来，澳大利亚和新西兰也批准了塔格糖在食品中的应用。
塔格糖的生产，一般以半乳糖为原料，通过化学方法、发酵法或酶法进行异构化反应而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到。
其中，半乳糖在碱土金属催化下，可以方便的转化塔格糖，转化率约在70％以上(Beadle J.R.et al.，WO92-12263，1992)。然后经酸中和，纯化得到塔格糖晶体，产率可达到47.6％。但是本法的异构化过程中，除了生成塔格糖外，还容易形成山梨糖、甘露糖，果糖等杂质，而这些杂质极难与塔格糖分离，需反复结晶才能去除。
发酵法生产塔格糖一般采用乳酸菌，如Lactobacillus plantarum，Lactobacilluspentose，在适宜的培养中发酵12h以上，对半乳糖也有一定的转化(潘蓓蕾等，CN1948500A，2007)。但是本法存在发酵周期长，产物浓度低，转化率小等缺点，不宜工业化生产。
酶法转化塔格糖又分为以半乳糖为原料和以半乳糖醇为原料的方法。采用L-阿拉伯糖异构酶可以很方便的将半乳糖转化塔格糖，所用的酶一般均为重组的基因工程酶。如专利文献WO 00-68397公开了大肠杆菌JM105/pTC101，以10％的半乳糖为底物，反应168小时，塔格糖的转化率可达30％左右。文献报道了一种将定点诱变的来自于Geobacillus stearothermophilus的L-阿拉伯糖异构酶重组到大肠杆菌中，并得到大量表达，以10mmol/L的半乳糖在60℃度反应10h，最高转化率可达40％(Kim H.J.，et al.，Journal of Applied Microbiology，2006，101，：213-221)。以半乳糖醇为原料，以Mycobacterium smegmatis或Klebsiellapneumoniae中所产的半乳糖醇脱氢酶为催化剂也可以生产塔格糖(Izumori K.，etal.，Journal of Fermentaion Technology，1988，15：105-108；Shimonish T.，et al.，Journal of Fermentation Technology，1995，79：620-622)。但是，半乳糖醇本身就比塔格糖价格贵得多，也不太适合于塔格糖的生产。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种重组L-阿拉伯糖异构酶的工程菌。
本发明需要解决的技术问题之二是公开一种用重组L-阿拉伯糖异构酶的工程菌生产的L-阿拉伯糖异构酶的方法。
本发明所要解决的技术问题之三是公开一种用酶法转化半乳糖为D-塔格糖的方法，以克服目前工艺的缺陷，以便适用于工业化生产。
本发明的构思是这样的：
正常大肠杆菌并不向培养基中分泌L-阿拉伯糖异构酶，菌体所含的L-阿拉伯糖异构酶活性也极低，不太适用于D-塔格糖的生物转化。本发明采用分子生物学手段提高大肠杆菌L-阿拉伯糖异构酶的产量及活性，这是酶法转化半乳糖为D-塔格糖的重要步骤。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一株重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coliBL21/pET-araA。
利用重组DNA技术构建L-阿拉伯糖异构酶表达载体，并转化至大肠杆菌，得到高效表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。
L-阿拉伯糖异构酶基因序列来源不受限制，只要能由D-半乳糖催化生成D-塔格糖均可以，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、珠状嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)等。本发一个优选的实施例中L-阿拉伯糖异构酶基因序列来自于大肠杆菌、人工合成或者通过PCR克隆之。
构建L-阿拉伯糖异构酶基因的重组载体也不受限制，只要能高效表达L-阿拉伯糖异构酶即可，如常用的商用质粒pUC18、pUC19、pBV220、pBR322、pET系列等。本发明一个优选的实施例中所使用的质粒为pET28a(购自Novagen公司)，此质粒可在大肠杆菌中稳定存在，且在IPTG或乳糖诱导下可大量表达L-阿拉伯糖异构酶。
一种用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，包括步骤(a)培养所说的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA，并(b)从培养液中回收所说的L-阿拉伯糖异构酶。
微生物培养所需的培养基一般应包括碳源、氮源、无机盐等。所说的碳源可为葡萄糖、果糖、糊精、蔗糖等，所说的氮源可为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆水解液、尿素等，所说的无机盐可为氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、磷酸盐等。
优选的用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，其中培养大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA的培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g，酵母粉3g和氯化钠10g，50μg/ml卡那霉素，加水至一升，用2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.0，对于固体培养基只须再入20g琼脂即可。
更优选的用重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，其中培养大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA的培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g，酵母粉3g和氯化钠10g，50μg/ml卡那霉素，加水至一升，用2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.0；在有氧条件下培养5-16h，pH控制在5-9之间，培养温度为20-45℃之间。优选的培养条件为发酵8-12h，pH为6-8，培养温度为30-37℃，诱导剂为乳糖。
本发明一个优选的实施例在培养和诱导L-阿拉伯糖异构酶的条件如下：37℃振荡培养3h，加入8mg/mL乳糖作为诱导剂，继续培养5h。
其中步(b)包括离心培养物收集菌体，直接用于酶转化或者经破碎后用酶液用于酶转化或者用常规的固定化技术制备固定化酶用于酶转化。
本发明用重组L-阿拉伯糖异构酶由D-半乳糖生产D-塔格糖的方法包括步骤(A)用上述制备的L-阿拉伯糖异构酶：湿菌体、菌体破碎液或者固定化酶在D-半乳糖的浓度为1％-20％、反应温度为20-60℃、反应时间12-72h转化半乳糖为D-塔格糖，和(B)从反应液中回收D-塔格糖。
本发明所使用的阿拉伯糖异构酶可以完整的重组菌湿菌体，也可以菌体破碎后的粗酶液，或将此粗酶液固定化包埋后使用。所有的固定化载体可以为海藻酸钙，卡拉胶，明胶，果胶钙等。本发明所有的固定化载体为海藻酸钙。
本发明所使用的D-半乳糖可以商用的产品，或由乳糖在乳糖酶催化水解为葡萄糖和半乳糖后，再分离出D-半乳糖，以降低成本。
优选的用重组L-阿拉伯糖异构酶由D-半乳糖生产D-塔格糖的方法将培养所得的菌体超声波破碎后无须进一步纯化直接作为酶源，或用海藻酸钙固定化后作为酶源，控制D-半乳糖的浓度为1％-20％之间，反应温度为20-60℃，反应时间在12-72h之间。
所说的(B)回收D-塔格糖的方法为反应完成后，加热至70℃使酶失活，离心去除不溶物，将液体依次经过阴阳离子交换树脂去除其中的盐份，浓缩至含塔格糖60％以上的糖浆，再加入三倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，低温静置，析出沉淀，过滤，用少量的无水乙醇洗涤后，于50℃真空干燥，即得到D-塔格糖的晶体。
D-塔格糖和D-半乳糖的分析：采用高效液相色谱法，以示差检测器分析。C18氨基柱，流动相为80％的乙腈水溶液，流速2mL/min，柱温35℃。
附图说明
图1粗酶液催化合成D-塔格糖的时间变化曲线
图2固定化粗酶液催化反合成D-塔格糖的反应批次
本发明提供了重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA和用该菌种制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，用本发明的菌种和制备L-阿拉伯糖异构酶的方法可以高产L-阿拉伯糖异构酶。用本发明制备D-塔格糖的方法可以高转化率地转化半乳糖为D-塔格糖，在本发明的具体实施例中，半乳糖的转化率达到60％以上，高于WO 00-68397 30％的转化率，也高于Kim 40％的转化率。
在本发明的另一个具体实施例中，固定化的L-阿拉伯糖异构酶可以反复使用10次以上。
以下结合具体实施方式进一步说明本发明，基因工程操作如PCR、重组载体构建、感受态细胞制备、转化、酶切等未有特定说明，均按照本领域技术人员公知的技术如按照《分子克隆实验指南》(第三版)(萨姆布鲁克等，科学出版社，2002)或者试剂盒厂家推荐的方法进行。
具体实施方式：
实施例1
重组大肠杆菌的构建按《分子克隆实验指南》(第三版)(萨姆布鲁克等，科学出版社，2002)所述进行。根据Genebank公布的大肠杆菌中的araA基因序列(Genebank编号947511)，设计引物如下：
5’引物(Seq ID No.1)：5’-CCCATGGGCATGACGATTTTTG(Ncol)
3’引物(Seq ID No.2)：5’-GGGTTCGAATTAGCGACGAAAC(HindIII)
以大肠杆菌JM109的染色体DNA为模板做PCR：95℃ 5min，30×(95℃40s，62℃ 40s，72℃ 1min)，72℃ 10min。PCR产物和pET-28a载体经限制性酶NcoI和HindIII内切并用T4DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
转化子涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上，挑选长出的单菌落，抽取质粒，经酶切测序，证实重组质粒中外源基因序列与Genebank中发表的相应序列完全相同。将此重组菌命名为E.coli BL21/pET-araA。
实施例2
从斜面上刮取一环E.coli BL21/pET-araA接种于含卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养16小时。吸取1mL菌液接种于装有30mL LB+卡那霉素培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养3h，加入8mg/mL乳糖作为诱导剂，继续培养5h，10000RPM离心收集微生物细胞。
将上述湿菌体约0.2g加入30mL含D-半乳糖(50g/L)的溶液中，37℃振荡反应24h，取样分析，约得到2.5g/L D-塔格糖。而含有空载体的大肠杆菌的反应液中未检到D-塔格糖。
实施例3
湿菌体制备方法如同实施例2。约0.2g湿菌体溶于10mL生理盐水中，超声波破碎细胞壁，得到粗酶液。加入20mLD-半乳糖溶液，使终浓度为100g/L。在37℃振荡反应24h，每隔4h取样分析D-塔格糖的量，结果如图1。16h后，D-塔格糖的量稳定在60.2g/L。
实施例3
L-阿拉伯糖异构酶粗酶液的制备如实施例2。
将此酶液约10mL与等体积的5％(w/w)的海藻酸钠溶液混合，然后滴入1％(w/w)的氯化钙溶液中，搅拌均匀，置冰箱中过夜，滤出海藻酸钙小球备用。
将上述固定化L-阿拉伯糖异构酶约20g加入20mL 100g/L的D-半乳糖溶液，于37℃振荡反应24h，取样分析D-塔格糖的量，反应结束后，固定化颗粒取出，重复上述反应，结果见图2。固定化L-阿拉伯糖异构酶可以反应10次以上，转化率均在50％以上。
序列表
<110>上海斯贝生物科技有限公司
<120>一株重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cccatgggca tgacgatttt tg 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gggttcgaat tagcgacgaa ac 22
Claims (7)
1.一株重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA。
2.用权利要求2的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，包括步骤(a)培养所说的大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA，并(b)从培养液中回收所说的L-阿拉伯糖异构酶。
3.根据权利要求2的制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于，其中培养大肠杆菌E.coli BL21/pET-araA的培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g，酵母粉3g和氯化钠10g，50μg/ml卡那霉素，加水至一升，用2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.0；在有氧条件下培养5-16h，pH控制在5-9之间，培养温度为20-45℃之间。
4.根据权利要求3的制备L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于，37℃振荡培养3h，加入8mg/mL乳糖作为诱导剂，继续培养5h。
5.一种用重组L-阿拉伯糖异构酶由D-半乳糖生产D-塔格糖的方法包括步骤(A)用上述制备的L-阿拉伯糖异构酶：湿菌体、菌体破碎液或者固定化酶在D-半乳糖的浓度为1％-20％、反应温度为20-60℃、反应时间12-72h转化半乳糖为D-塔格糖，和(B)从反应液中回收D-塔格糖。
6.根据权利要求5生产D-塔格糖的方法，其特征在于，菌体超声波破碎后直接作为酶源，或用海藻酸钙固定化后作为酶源，控制D-半乳糖的浓度为1％-20％之间，反应温度为20-60℃，反应时间在12-72h。
7.根据权利要求5或6的生产D-塔格糖的方法，其特征在于，所说的(B)回收D-塔格糖的方法为反应完成后，加热至70℃使酶失活，离心去除不溶物，将液体依次经过阴阳离子交换树脂去除其中的盐份，浓缩至含塔格糖60％以上的糖浆，再加入三倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，低温静置，析出沉淀，过滤，用少量的无水乙醇洗涤后，于50℃真空干燥，即得到D-塔格糖的晶体。
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