CN105483108B - 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用 - Google Patents

一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105483108B
CN105483108B CN201610064913.9A CN201610064913A CN105483108B CN 105483108 B CN105483108 B CN 105483108B CN 201610064913 A CN201610064913 A CN 201610064913A CN 105483108 B CN105483108 B CN 105483108B
Authority
CN
China
Prior art keywords
arabinose
ribulose
arabinose isomerase
isomerase
genetic engineering
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610064913.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105483108A (zh
Inventor
徐虹
刘超
徐铮
王笑
李莎
冯小海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN201610064913.9A priority Critical patent/CN105483108B/zh
Publication of CN105483108A publication Critical patent/CN105483108A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105483108B publication Critical patent/CN105483108B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种L‑阿拉伯糖异构酶及其在L‑核酮糖生产中的应用，本发明还公开了编码上述L‑阿拉伯糖异构酶的基因序列SEQ ID NO：1，以及包含了上述L‑阿拉伯糖异构酶的基因工程菌及其构建方法以及上述L‑阿拉伯糖异构酶和其基因工程菌在生产L‑核酮糖中的应用。该L‑阿拉伯糖异构酶在温度20～70℃、pH 5.0～10.0之间对L‑阿拉伯糖有着较高的催化效率，且低浓度的Mn2+和Co2+等离子的存在可大幅提升该酶的活力和热稳定性。在最适催化条件下，该酶对L‑阿拉伯糖的转化率可达95％以上，该L‑阿拉伯糖异构酶对于L‑核酮糖的生物法生产具有十分重要的意义和经济价值。

Description

一种L-阿拉伯糖异构酶及其在L-核酮糖生产中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及来自多黏芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa NX-1)的L-阿拉伯糖异构酶及其应用。
背景技术
L-核酮糖是一种自然界中不存在的稀少糖。L-核酮糖的主要价值在于可作为前体合成L-核糖，L-核酮糖在甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase)的作用下可转化为L-核糖，而L-核糖属于极其稀有的单糖，是一种重要的医药中间体，可以合成抗乙肝药物替比夫定(Telbivudine)，具有重要的医学与经济价值，由L-核糖合成的各种L-核糖衍生物，被广泛应用于抗肿瘤和抗病毒领域。
L-阿伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，L-Arabinose Isomerase，L-AI)不仅催化D-半乳糖生成D-塔格糖还能催化L-阿拉伯糖异构化为L-核酮糖，是生物转化生产L-核酮糖最为有效的酶，因此通过L-AI实现L-核酮糖的产业化正成为研究的焦点。多种微生物来源的L-AI被发现，大肠杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌等多种L-阿拉伯糖异构酶生产菌的L-AI编码基因(araA)被克隆和外源表达，然而已发现的L-AI对L-阿拉伯糖的催化效率大多不高。因此对L-阿拉伯糖具有高催化效率的L-阿拉伯糖异构酶在生产L-核酮糖上具有更好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种来自多黏芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa NX-1)的L-阿拉伯糖异构酶氨基酸序列及其核苷酸序列。
本发明还要解决的技术问题是提供包含上述L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌及其构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述L-阿拉伯糖异构酶在制备L-核酮糖中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种L-阿拉伯糖异构酶，所述L-阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该L-阿拉伯糖异构酶来源于多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa NX-1)。
一种L-阿拉伯糖异构酶，所述L-阿拉伯糖异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的基因工程菌也在本发明的保护范围内。
一种催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到质粒中，得到重组质粒；
(2)将重组质粒转化至大肠杆菌中，即得到催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的基因工程菌。
其中，所述的质粒为pET-28a(+)，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
具体的构建方法如下：
(1)利用引物1和引物2扩增SEQ ID NO.1所示的L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列。
引物1：5’-CGGGATCC(BamHI)ATGTCAACAGTAAGTACAAAACAGT-3’；
引物2：5’-ATAAGAATGCGGCCGC(NotI)TTATTTAATTATTACGTATTCCAGG-3’；
PCR扩增体系(25μL)为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP 2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，Ex-Tag聚合酶0.5μL，ddH2O 16μL；
PCR反应程序为：步骤一：94℃预变性2min；步骤二：94℃变性2min；然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；步骤三：72℃终延伸10min
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Not I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a-araA；
(2)将重组质粒pET-28a-araA转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养12～16h得到初步阳性克隆；
(3)分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜，提取质粒，送南京金斯瑞生物技术公司测序，根据测序结果判断具有序列表SEQ ID NO:1的DNA片段的质粒即为重组质粒pET-28a-araA，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
上述L-阿拉伯糖异构酶在制备L-核酮糖中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述L-阿拉伯糖异构酶的纯化方法如下：
将包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因工程菌悬于缓冲液(即100mMpH7.5的PBS缓冲液)中，利用超声波破碎细胞，离心，上清液为粗酶液，粗酶液经0.22μm滤膜过滤后，使用Ni-NTA亲和树脂进行纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，分子量约为55kDa。
利用纯化后的L-阿拉伯糖异构酶催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的方法如下：
以1～500g/L的L-阿拉伯糖为底物，加入L-阿拉伯糖异构酶进行酶转化反应，酶的用量为10～500U，反应温度20～70℃，转化时间1～60h。通过半胱氨酸-咔唑法或高效液相色谱(HPLC法)测定转化液中L-核酮糖的生成量。
优选的方法为：以1～500g/L的L-阿拉伯糖为底物，添加0.05～5mM MnCl2或0.05～5mM CoCl2，加入纯化后的对L-阿拉伯糖具有高催化效率的L-阿拉伯糖异构酶进行酶转化反应，酶的用量为10～500U，反应温度20～70℃，转化时间1～5h。
上述催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的基因工程菌在制备L-核酮糖中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，利用该基因工程菌催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的步骤如下：
(1)活化基因工程菌；
(2)将活化后的基因工程菌在LB培养基中培养，当培养物OD600为0.6～1.0时，加入诱导剂，使基因工程菌产L-阿拉伯糖异构酶，继续培养3～60h，收集菌体；
(3)以步骤(2)得到的菌体为催化剂，加入L-阿拉伯糖异构酶激活剂，催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖。
步骤(3)中，所述L-阿拉伯糖的浓度为1～500g/L，L-阿拉伯糖的浓度优选为500g/L，所述菌体的用量为10～100g/L(以湿菌体计)，所述菌体的用量优选为40g/L；催化时间为1～48h，催化时间优选为12h；催化温度为20～70℃，催化温度优选为40℃。
步骤(3)中，所述的L-阿拉伯糖异构酶激活剂为MnCl2或CoCl2，所述MnCl2的添加量为0.05～5mM，MnCl2添加量优选为1mM；所述CoCl2的添加量为0.05～5mM，CoCl2添加量优选为2mM。
具体的L-阿拉伯糖异构酶的表达方法如下：
将包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3小时，至OD600为0.6～1.0时加入0.05～1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或0.01～20g/L的乳糖，继续诱导表达3～60h后，离心收集菌体。
具体的催化方法如下：
以1～500g/L的L-阿拉伯糖为底物，加入包含L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，基因工程菌的用量为10～100g/L(以湿菌体重量计)，反应温度20～70℃，转化时间1～60h。通过半胱氨酸-咔唑法或高效液相色谱法测定转化液中L-核酮糖的生成量。
优选的催化方法如下：
以1～500g/L的L-阿拉伯糖为底物，添加0.05～5mM MnCl2和0.05～5mM CoCl2，加入含有L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，基因工程菌的用量为40g/L(以湿菌体计)，反应温度20～70℃，转化时间1～12h。
有益效果：
(1)本发明提供的L-阿拉伯糖异构酶，其反应温度为20～70℃，反应pH为5.5～10。该重组酶对L-阿拉伯糖具有较高的酶活。
(2)低浓度Mn2+和Co2+离子的添加可以大幅提高度酶活力和热稳定性，添加0.05～5mM MnCl2，0.05～5mM CoCl2后65℃下酶活力相比于不添加金属离子的对照组提3倍，达到10U/mg(一个单位的重组L-阿拉伯糖异构酶酶活U定义为在50℃，pH 7.5的条件下每分钟生成1μmolL-核酮糖所需的酶量)；此外，50℃热处理6h酶活力存留90％以上。
(3)该L-阿拉伯糖异构酶在最适催化条件下，对L-阿拉伯糖的转化率可达75％以上，对于L-核酮糖的工业化生产具有广泛的应用前景和与经济价值。
附图说明
图1为重组质粒pET-28a-araA的构建示意图。
图2为对L-阿拉伯糖具有高催化效率的重组L-阿拉伯糖异构酶的SDS-PAGE电泳图。左侧泳道为标准蛋白分子量，自上向下的条带分别为(kDa)：116.0，66.2，45.0，35.0，18.4，14.4，右侧泳道为目的蛋白。
图3PPAI催化制备L-核酮糖的曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa NX-1)基因组DNA的提取。
用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的多黏芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa NX-1)的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2：L-阿拉伯糖异构酶编码基因(araA)的克隆和重组菌构建。
2.1araA基因的PCR扩增
根据GeneBank上已报道多黏芽孢杆菌L-AI基因的序列，运用Vector NTI软件设计引物Primer 1和Primer 2，引物序列为：
引物1：5’-CGGGATCC(BamHI)ATGTCAACAGTAAGTACAAAACAGT-3’；
引物2：5’-ATAAGAATGCGGCCGC(NotI)TTATTTAATTATTACGTATTCCAGG-3’；
以实施例1获得的多黏芽孢杆菌的基因组DNA为模板，扩增多黏芽孢杆菌基因片段。
PCR扩增体系(25μL)为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP 2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，Ex-Tag聚合酶0.5μL，ddH2O 16μL；
PCR反应程序为：步骤一：94℃预变性2min；步骤二：94℃变性2min；然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；步骤三：72℃终延伸10min。将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于Takara公司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌DH5α。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。将测得全长序列在GenBank数据库中进行分析，并借助Vector NTI软件确定其中的完整阅读框(ORF)。
2.2araA基因的表达
利用pET-28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应
经纯化后的PCR产物，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的酶进行酶切反应。本实验中，所用的酶是BamH I和Not I。酶切体系为PCR产物或质粒溶液50μL，BamH I 3μL，Not I 3μL，10×缓冲液5μL，BSA5μL，ddH2O 34μL，总体积100μL。
由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(不足30bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接后获得重组质粒pET-28a-araA，其主要结构如图1所示。
2.2.2质粒制备与转化
质粒抽提采用质粒提取试剂盒，参照生产商的说明书进行操作。质粒转化细胞使用氯化钙法。
2.2.3重组质粒pET-28a-araA的转化
(1)取0.1-1μg重组质粒pET-araA D混匀于200μL感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上1-3min。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。
(4)取200μL菌体涂布于选择性LB固体培养基表面。37℃培养12-16h至单菌落出现。
2.2.4重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用BamH I和Not I对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pET-28a-araA，含此重组质粒pET-28a-araA的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌BL21(DE3)-AI。测序结果显示插入片段含有一个长1425bp的开放阅读框架。
实施例3：L-阿拉伯糖异构酶的诱导表达。
将重组大肠杆菌BL21(DE3)-AI接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到装有100mLLB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养2～3h，至OD600约为0.6～1.0时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mM)，或者添加1g/L乳糖进行诱导，然后继续诱导表达6h后，离心收集菌体。
实施例4：重组L-阿拉伯糖异构酶的纯化。
获得的重组大肠杆菌BL21(DE3)-AI的菌体悬于PBS缓冲液(pH 7.0)中，用生理盐水清洗两次，使用超声波破碎仪破碎细胞(400W，30min)，12000rpm离心10min，所得上清液为可溶性目标蛋白(粗酶液)。粗酶液经0.22μm滤膜过滤后，将样品加至Ni-NTA亲和树脂中，控制流速在15mL/h左右，用10倍柱床体积Wash-Buffer(500mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑)冲洗，最后用10倍柱床体积Elution-Buffer(500mM NaCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑)洗脱并收集目标蛋白，将目的蛋白溶液4℃下于PBS缓冲液(pH 7.0)中过夜透析。纯化后的目的蛋白酶活力达到10U/mg(添加1mM MnCl2和2mM CoCl2)，经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组L-阿拉伯糖异构酶蛋白的分子量约为55kDa。
实施例5：重组L-阿拉伯糖异构酶热稳定性实验。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶50μL(20mg/mL)于40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和75℃不同温度水浴中处理1～3h，然后加入到50μL含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-阿拉伯糖至终浓度100mM，在最适反应温度下水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量，测得结果见表1。
表1 温度对L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响
实施例6：重组L-阿拉伯糖异构酶的pH稳定性实验。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶50μL(20mg/mL)于90μL pH分别为5.5、6.0、6.5、7.5、8.0、9.0和10.0条件下中室温处理0～12h，然后加入到50μL含有50mM Tris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，添加L-阿拉伯糖至终浓度100mM，最适温度下水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。测得结果见表2。
表2 pH对L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响
实施例7：EDTA和Cu2+对重组L-阿拉伯糖异构酶酶活影响实验。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶50μL(20mg/mL)然后加入到50μL含有50mMTris-盐酸冲液(pH 7.5)的反应体系中，分别向酶液中添加1mM和10mM EDTA和Cu2+，添加L-阿拉伯糖至终浓度100mM，最适温度下水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。测得结果见表3(计未经处理酶的酶活为100％)。
表3 EDTA和Cu2+对L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响
实施例8：Mn2+和Co2+离子对重组L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶50μL(20mg/mL)然后加入到50μL含有50mMTris-HCl冲液(pH 7.5)的反应体系中，分别向酶液加入0～5mM MnCl2和CoCl2,添加L-阿拉伯糖至终浓度100mM，最适温度下水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。测得结果见表4(计未经处理的酶的酶活为100％)。
表4 Mn2+和Co2+离子对L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响
实施例9：重组L-阿拉伯糖异构酶的应用I。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，溶解于50mMTris-HCl冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶于体系中，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为8.5g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-阿拉伯糖的转化率达到85％。
实施例10：重组L-阿拉伯糖异构酶的应用II。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，溶解于50mMTris-HCl冲液的反应体系中(pH 7.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶于体系中，并添加MnCl2(终浓度1mM)和CoCl2(终浓度2mM)，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖的生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为9.5g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到95％，转换率曲线如图3。
实施例10：重组L-阿拉伯糖异构酶的应用III。
酶转化反应的总体积为10mL，以500g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，溶解于6M硼酸盐缓冲液的反应体系中(pH 9.7)，取1mg实施例4纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶于体系中，并添加MnCl2(终浓度1mM)和CoCl2(终浓度2mM)，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为450g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到90％。
实施例11：产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的应用I。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，悬浮于50mMTris-盐酸缓冲液的反应体系中(pH 7.5)冲液的反应体系中(pH 7.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为60g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到60％。
实施例12：产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的应用II。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，悬浮于50mMTris-盐酸冲液的反应体系中(pH 7.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，并添加MnCl2(终浓度1mM)和CoCl2(终浓度2mM)，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法或HPLC法测定L-核酮糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为72g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到72％。
实施例13：产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的应用III。
转化反应的总体积为100mL，以500g/L L-阿拉伯糖作为转化底物，溶解于6M硼酸盐缓冲液的反应体系中(pH 9.7)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，并添加MnCl2(终浓度1mM)和CoCl2(终浓度2mM)，最适温度下反应4h，通过半胱氨酸-咔唑法测定L-核酮糖生成量。经测定，转化液中L-核酮糖浓度为435g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物L-核酮糖的转化率达到87％。

Claims (2)

1.催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的基因工程菌在制备L-核酮糖中的应用，其特征在于，利用该基因工程菌催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的步骤如下：
(1) 活化基因工程菌；
(2) 将活化后的基因工程菌在LB培养基中培养，当培养物OD600为0.6~1.0时，加入诱导剂，使基因工程菌产L-阿拉伯糖异构酶，继续培养3~60 h，收集菌体，所述的诱导剂为0.05～1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）或0.1～20 g/L的乳糖；
(3) 以步骤(2)得到的菌体为生物催化剂，催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖；
步骤（1）中，所述基因工程菌的构建方法如下：
(1a) 将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到质粒中，得到重组质粒；
(2a) 将重组质粒转化至大肠杆菌中，即得到催化L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的基因工程菌；
所述的质粒为pET-28a(+)，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；
步骤(3)中，向反应体系中加入L-阿拉伯糖异构酶激活剂，所述的L-阿拉伯糖异构酶激活剂为MnCl2或CoCl2，所述MnCl2的添加量为0.05~5 mmol/L，所述CoCl2的添加量为0.05～5mmol/L。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述L-阿拉伯糖的浓度为1~500 g/L，所述菌体的用量以湿重计为10～100 g/L，催化时间为1～72 h，催化温度为20～70℃。
CN201610064913.9A 2016-01-29 2016-01-29 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用 Active CN105483108B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610064913.9A CN105483108B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610064913.9A CN105483108B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105483108A CN105483108A (zh) 2016-04-13
CN105483108B true CN105483108B (zh) 2019-07-09

Family

ID=55670382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610064913.9A Active CN105483108B (zh) 2016-01-29 2016-01-29 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105483108B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684761B (zh) * 2019-10-18 2022-11-29 南京工业大学 一种l-核糖异构酶及其在生物法制备l-核糖中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101265460A (zh) * 2008-05-13 2008-09-17 上海斯贝生物科技有限公司 一株重组l-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法
CN101845429A (zh) * 2010-04-21 2010-09-29 南京工业大学 一种耐高温l-阿拉伯糖异构酶及其应用
CN103555646A (zh) * 2013-10-29 2014-02-05 南京工业大学 一种共表达l-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN105154459A (zh) * 2015-05-25 2015-12-16 江南大学 一种新型芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101265460A (zh) * 2008-05-13 2008-09-17 上海斯贝生物科技有限公司 一株重组l-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法
CN101845429A (zh) * 2010-04-21 2010-09-29 南京工业大学 一种耐高温l-阿拉伯糖异构酶及其应用
CN103555646A (zh) * 2013-10-29 2014-02-05 南京工业大学 一种共表达l-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN105154459A (zh) * 2015-05-25 2015-12-16 江南大学 一种新型芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L-Ribose Production from L-Arabinose by Using Purified L-Arabinose Isomerase and Mannose-6-Phosphate Isomerase from Geobacillus thermodenitrificans;Soo-Jin Yeom等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20091130;第75卷(第21期);第6941-6943页
L-Ribulose production by an Escherichia coli harboring L-arabinose isomerase from Bacillus licheniformis;Ye-Wang Zhang等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20100522;第87卷(第6期);第1993-1999页
L-Ribulose production from L-arabinose by an L-arabinose isomerase mutant from Geobacillus thermodenitrificans;Soo-Jin Yeom等;《Biotechnol Lett》;20080530;第30卷(第10期);第1789-1793页
微生物来源的L-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景;程丽芳等;《微生物学通报》;20081020;第35卷(第10期);第1626-1632页
登录号：WP_025678176.1;佚名;《Genbank》;20140605;第1-474位
蜡状芽孢杆菌 CZ 阿拉伯糖异构酶的基因克隆表达及催化生产 L-核酮糖的研究;乔玮;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150515(第5期);A006-42

Also Published As

Publication number Publication date
CN105483108A (zh) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106119268B (zh) 一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法
CN109486794B (zh) 一种酶活提高的甲壳素酶突变体
CN101663389A (zh) 敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用
CN107815446B (zh) 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法
CN113088528B (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用
CN108753669A (zh) 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用
CN106754610A (zh) 表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用
CN103642743A (zh) 一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法
CN107916283A (zh) 一种烟酰胺的生产工艺
CN108018275A (zh) 一种极端耐热木聚糖酶1vbr的突变体xynr及其用途
CN110157653A (zh) 一种高产环磷酸腺苷的重组大肠杆菌及其在合成环磷酸腺苷上的应用
CN105385700A (zh) 一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用
CN103103206A (zh) 一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用
CN105483108B (zh) 一种l-阿拉伯糖异构酶及其在l-核酮糖生产中的应用
CN106190934A (zh) 一种生产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建
CN113444709A (zh) 一种κ-卡拉胶酶突变体及其应用
CN116334041B (zh) 一种鼠李糖苷酶突变体及其应用
CN108913737A (zh) 使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法
CN108018274A (zh) 一种极端耐热木聚糖酶1vbr的突变体xynh及其用途
CN112553183A (zh) 一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用
CN105779425A (zh) 一种l-核糖异构酶及其在生物法制备l-核糖中的应用
CN104561065A (zh) 一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌及其应用
CN106434611A (zh) 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法
CN107446903B (zh) 一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因
CN113481186B (zh) 一种GH18几丁质酶ChiA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant