CN105154459A

CN105154459A - 一种新型芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用

Info

Publication number: CN105154459A
Application number: CN201510275231.8A
Authority: CN
Inventors: 廖祥儒; 刘群; 徐君; 孙萌; 蔡宇杰; 管政兵; 王爽; 李韵雅
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明涉及一种高地芽孢杆菌Bacillus？sp.SYBC？hb4中分离获得L-阿拉伯糖异构酶基因L-AI及其克隆表达与应用，属于生物工程领域。本发明从芽孢杆菌Bacillus？sp.SYBC？hb4中分离获得L-AI，构建表达载体pCold？II-ai并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)实现高效表达，所得重组酶该阿拉伯糖异构酶能够利用乳糖酶作用下的工业生产中产生的乳糖精制废水生产D-塔格糖，D-塔格糖是一种新型的低能量的甜味剂，可以减少肥胖症的发生；具有降低血糖的作用，适合于糖尿病人食用；改善肠道菌群，抑制肠道致病菌。D-塔格糖在医药、工业领域都有巨大地应用前景。

Description

一种新型芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用

技术领域

本发明涉及一种L-阿拉伯糖异构酶基因，尤其是一种芽孢杆菌Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-阿拉伯糖异构酶(EC5.3.1.4，L-ArabinoseIsomerase，L-AI)，能转化L-阿拉伯糖成L-核酮糖，也能转化D-半乳糖成D-塔格糖。L-阿拉伯糖异构酶与L-核酮糖激酶和L-核酮糖5-磷酸4-差向异构酶的共同作用，在半纤维素乙醇业中也将有重要的用途。研究发现，L-阿拉伯糖异构酶广泛存在于各种微生物中，如常温微生物。嗜热微生物、嗜酸微生物、甚至一些极端微生物中。但是在天然菌株中所含的基因一般都是单拷贝、酶的产量甚微，因此本发明的第二个目的是提供一种高产L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌及其构建、表达方法，以提高L-阿拉伯糖异构酶的产量，实现其在工业中的广泛运用。

测定L-阿拉伯糖异构酶活力的方法主要是测定单位时间产物的生成量，有报道的L-阿拉伯糖异构酶活力的测定方法主要有两种：

(1)高效液相法。采用高效液相法测定酶反应的产物塔格糖的含量，是一种准确度很高的方法，但是分析成本较高，时间长，在需要大量数据时，这种方法不是很实用。

(2)比色法。比色法测定L-阿拉伯糖异构酶活力主要是根据Dische所介绍的半胱氨酸-咔唑法，根据实际情况稍作改进。与高效液相法相比，比色法更具方便、快速、成本低等优点。

L-阿拉伯糖异构酶可以催化D-半乳糖成D-塔格糖，D-塔格糖是一种功能性的甜味剂，可以减少肥胖症的发生，具有低能量、降低血糖、改善肠道菌群、抗龋齿等功能，并能抑制可卡因等物质对肝细胞的毒害作用。

甜味剂是一类十分重要的食品添加剂，不同的甜味剂具有不同的甜味和功能特性，对产品的色泽、香味、形态、质构、和保存起着极其重要的影响。随着人们的物质生活水平不断提高，由肥胖引起的生理功能障碍的人越来越多，我国2000年糖尿病患者达到1400万。面对这些生理功能失调的人们，只能提供给他们低热量食品，因此开发安全、低热量、低吸收品种甜味剂具有较大的市场优势。目前应用于市场的有低聚糖包括异构化乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、山梨糖、大豆低聚糖等。糖醇类主要有木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇等，这些物质热量低、不刺激胰岛素分泌，缓解糖尿病，可防止肥胖、预防龋齿。

2002年世界甜味剂市场规模达到109.2亿美元，在食品添加剂市场中占有重要地位。国际甜味剂发展趋势，今后五年作为新甜味剂的糖醇和强力替代用甜味剂消费量将增加15％。由于甜味剂的应用相当广泛，食品科学家对它进行了深入的探索，发现并开发新型甜味剂是研究的重点和热点。

塔格糖作为甜味剂具有独特的理化特性和生理功能，其甜度是蔗糖的92％，而产热量只有蔗糖的1/3；不能被空腔内细菌利用，不会引起龋齿；在不同食品系统中中高剂量使用时具有健康促进功能，低剂量使用则具有增加和改善风味的功能；不具有肝抗胰岛素物质反应，抑制糖尿病人血液内葡萄糖浓度；作为医药和医药合成中间体可以用来治疗贫血和血友病，促进哺乳动物生殖和胎儿发育；具有良好的肠道耐受性，而其它单糖醇吃多了会导致肠鸣和腹泻；可以有选择的被肠道内的丁酸和乳酸菌利用；可以单独使用，和其他甜味剂复合使用具有相互促进作用；同时具有良好的理化性质(如耐热、耐酸、耐碱、保湿性好等)。因此适用于焙烤食品、饮料糖果和医药制剂(如糖浆剂、咀嚼片等)中作为天然甜昧剂。

2000年美国食品与药物管理局(FDA)已正式批准塔格糖作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；JECFA第57次会议批准塔格糖作为食品添加剂，推荐ADI值0-80mg/kg；欧盟也于去年批准塔格糖在欧洲上市；目前塔格糖在美国已被大量用于健康饮料以及酸奶、果汁等产品中作为白糖的代用品。塔格糖产品目前已获得美国、澳大利亚、日本、韩国等食品卫生部门批准使用，在我国仍未获得批准使用。

在我国对稀少糖的研究主要集中在赤藓糖醇、木糖醇等成熟的产品，而对阿洛糖、阿洛酮糖、塔格糖的研究几乎为空白。因此紧跟世界食品工业的发展，在我国开展上述稀少糖的研究，开发拥有自主产权的生产技术显得尤为重要。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新的芽孢杆菌Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶L-AI，其特征在于其核苷酸序列如以下1)或2)所示：

1)其核苷酸序列所示核苷酸序列；

2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列。

本专利以2015年1月7日保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCM2015018的Bacillussp.SYBChb4的高地芽孢杆菌为发酵菌株。

所述基因编码的蛋白质及含有所述基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明保护的范围。

本发明的第二个目地是提供一种高产L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌及其构建、表达方法。

所述高产L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌的构建方法为选取大肠杆菌冷诱导表达载体pColdII，构建重组表达载体pColdII-ai，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主进行表达，具体步骤如下：

(1)提取芽孢杆菌Bacillussp.SYBChb4的总基因DNA，以其为模版，利用引物h1和h2通过PCR扩增得到1446bp的L-阿拉伯糖异构酶L-AI；

(2)设计引物h3和h4，利用PCR向Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入EcoRI和XbaI限制酶切位点(下划线显示)；

(3)选取大肠杆菌冷诱导表达载体pColdII，构建重组表达载体pColdII-ai，将重组表达质粒pColdII-ai转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化了并测序验证；

所述Bacillussp.SYBChb4是从实验室保存蜂蜜中筛选出的，现保存于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，于2015年1月7日保藏，编号为CCTCCNO：M2015018，命名为Bacillussp.SYBChb4。

所述PCR引物h1：5’-ATGTTAACAAGTCAGAAG-3’，h2：5’-TCACAGTAGAATGCATTTC-3’h3：5’-GCCGGAATTCATGTTAACAAGTCAGAAG-3’，h4：5’-GCCGTCTAGATCACAGTAGAATGCATTTC-3’。

所述重组菌生产L-阿拉伯糖异构酶的步骤为：利用IPTG对重组菌产L-阿拉伯糖异构酶进行诱导表达，诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性L-阿拉伯糖异构酶，咪唑洗脱浓度为500mM；所述诱导表达条件为将含重组表达质粒pColdII-ai的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃、200rpm条件下培养至OD600＝0.4，随后转入15℃培养至加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm；培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取液5g/L、氯化钠10g/L，pH7.4。

本发明首次从Bacillussp.SYBChb4中分离、鉴定了L-阿拉伯糖异构酶基因，由于Bacillussp.SYBChb4野生菌株的L-阿拉伯糖异构酶蛋白只表达于芽孢壁上而不分泌到胞外，且表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用大肠杆菌重组表达系统生产L-阿拉伯糖异构酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求，本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)成功高可溶性表达获得了Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶蛋白，并对表达的L-阿拉伯糖异构酶进行了纯化。

本发明的第三个目的在于提供上述重组L-阿拉伯糖异构酶在工业中精制乳糖废水中的利用。

所述重组菌产L-阿拉伯糖异构酶酶活测定方法为：用pH6.8浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液溶解D-半乳糖作为酶反应底物。取0.5ml酶反应底物加入0.5ml粗酶液，于37℃反应1h后加入9倍体积的稀盐酸(0.1mol/LHcl)终止反应。将上述溶液稀释10倍作为反应液；取上述反应液1ml，加入0.2ml半胱氨酸盐酸盐，6ml硫酸溶液，混匀加入0.2ml咔唑酒精溶液，混匀，37℃10min，水浴10min，以蒸馏水作为空白对照，在560am波长下测定其OD值。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进行。引物合成与质粒测序由上海桑尼公司完成。

实施例1：PCR扩增Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶基因L-AI、蛋白质序列功能区预测

应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillussp.SYBChb4菌体基因组总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。根据全基因测序设计上下游引物：h1(SEQIDNO：3，5’-ATGTTAACAAGTCAGAAG-3’)与h2(SEQIDNO：4，5’-TCACAGTAGAATGCATTTC-3’)，应用PCR方法，以上述Bacillussp.SYBChb4基因组为模板，以上述h1和h2为特异性引物，扩增出Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶基因全长编码框序列(1446bp)(如图1所示)。PCR反应条件为：以基因组DNA为模板，在50μL反应体系中，加入10×ExTaqBuffer5μL、25mMMgCl₂2μL、2.5MmdNTP混合物4μL、的20μM上下游引物各1μL、ExTaq酶(Takara公司)1μL及DNA模板1μL、补水至50μL。PCR循环参数为：94℃预变性5min，再进行30个循环(98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，最后于72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用割胶回收试剂盒回收1446bp的DNA条带，置4℃保存。将所得序列提交http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTp/，在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要序列数据库进行相似性搜索分析，表明该L-阿拉伯糖异构酶基因的序列相似性低于98％，推导氨基酸序列相似性低于97％。其基因具有SEQIDNO.1序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2。

实施列2：Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌重组表达、纯化

由于Bacillussp.SYBChb4野生菌株的L-阿拉伯糖异构酶蛋白L-AI只表达于芽孢外壁上而不分泌到胞外，且表达水平一般很低，远远达不到工业化应用要求，因此选用大肠杆菌重组表达系统生产L-阿拉伯糖异构酶能大幅提高其产量，使更易达到工业化应用要求。设计引物h3：(SEQIDNO：5，5’-GCCGGAATTCATGTTAACAAGTCAGAAG-3’)和h4：(SEQIDNO：6，5’-GCCGTCTAGATCACAGTAGAATGCATTTC-3’)，利用PCR将Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶的DNA编码框5’和3’两侧分别引入EcoRI和XbaI限制性酶切位点(下划线显示)，通过双酶切，分子连接等基因操作将L-阿拉伯糖异构酶基因插入到商业化表达质粒pColdII(TaKaRa公司)，构建重组质粒pColdII-ai。随后将pColdII-ai转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子，随后利用IPTG进行重组L-阿拉伯糖异构酶的诱导表达。

连接反应操作如下：将经过酶切处理的L-阿拉伯糖异构酶基因片段和质粒pColdII按照3∶1的体系混匀，在含有T4DNA连接酶，T4DNA连接酶buffer的反应体系中过夜连接，温度维持在16℃。取20μL连接产物转化至100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后混匀，冰浴30min，然后42℃热激90s，再冰浴5min，加入880μL的LB培养基用于感受态细胞的复苏。细胞培养液放置在37℃，200rpm的摇床中培养40min后，取75μL涂布于Amp抗性平板上，37℃培养8～12h后，对长出的单菌落进行验证，并进一步测序验证基因序列是否正确。

培养基成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。pH7.4。诱导表达条件为：将重组表达质粒pColdII-ai转化大肠杆菌BL21(DE3)。含重组质粒的工程菌在37℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.4，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm。收集菌体，SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量～54.5kD一致。在此条件下，重组L-阿拉伯糖异构酶的表达量大大超过Bacillussp.SYB℃hb4自身的L-阿拉伯糖异构酶的产量，大部分为可溶性状态。

诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性L-阿拉伯糖异构酶，咪唑洗脱浓度为500nM。纯化后的产物以D-半乳糖为底物测取酶活，以上实验结果充分说明已成功重组表达、纯化获得可溶性L-阿拉伯糖异构酶。

实施例3：重组菌株的发酵实验

如实施例2构建的重组大肠杆菌进行摇瓶培养。在Amp抗性平板上挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中。培养基配方见实施例2说明。于37℃、200rpm培养约12h，待菌体长到对数期时，按2％的接种量接入到50ml的发酵培养基中(乳糖精制废水稀释10倍)，在台式摇床中于37℃、200rpm培养约24h。

实施例4：塔格糖定量检测

利用高效液相色谱法(HPLC)可定性和定量检测各洗脱样品的D-塔格糖和D-半乳糖。HPLC条件：色谱柱：Sugarparkl6.5mm×30mm；流动相：纯水；检测器：Waters2410示差折光检测器；柱温：85℃；流速：0.4mL/min；进样量：10μL。

附图说明

图1.PCR扩增的Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶基因L-AI。

图2.质粒pColdII-ai双酶切验证结果。

图3.Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌重组表达、纯化图。泳道M-1-2为SDS-PAGE图谱；M：蛋白质分子量标准；1：诱导组；2：经Ni+柱亲和层析法纯化得到的可溶性L-阿拉伯糖异构酶。

图4.重组大肠杆菌的生长曲线

图5.重组质粒pColdII-ai图谱。

Claims

1.一种新型芽孢杆菌Bacillussp.SYBChb4L-阿拉伯糖异构酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下1)或2)所示。

1)其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示核苷酸序列

2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基的取代、缺失、突变或插入而成且编码有活性的L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述基因的基因工程菌。

4.含有权利要求1所述基因的表达载体或克隆载体。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，优选重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主进行表达。

6.权利要求5所述生产L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，选取大肠杆菌冷诱导表达pColdII，构建重组表达载体pColdII-ai，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主进行表达。

7.权利要求5所述生产L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌生产L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于，利用IPTG对重组菌产L-阿拉伯糖异构酶进行冷诱导表达，诱导表达后，超声破碎菌体，用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性L-阿拉伯糖异构酶，咪唑洗脱浓度为500mM；所述诱导条件为将含重组表达质粒pColdII-ai的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.4，随后转入15℃培养至加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm；培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.4。

8.权利要求1所述基因在精制乳糖废水中的应用。