CN103757074B - 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 - Google Patents
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Abstract
<b>本发明涉及一种酶法制备瑞鲍迪甙</b><b>M</b><b>的方法，该方法以瑞鲍迪甙</b><b>A</b><b>或瑞鲍迪甙</b><b>D</b><b>为底物，使底物在蔗糖、</b><b>UDP</b><b>的存在下，在</b><b>UDP-</b><b>葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的混合物或含有</b><b>UDP-</b><b>葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙</b><b>M</b><b>，反应在温度</b><b>20</b><b>℃</b><b>~60</b><b>℃以及</b><b>pH5.0~9.0</b><b>的水相体系中进行。本发明提供的酶法制备瑞鲍迪甙</b><b>M</b><b>的方法具有重要的应用价值。与已有从甜菊叶中提取瑞鲍迪甙</b><b>M</b><b>的技术相比，本发明方法生产周期显著缩短，产能提高，成本较低，且可提供纯度更高的产品，因而能更经济的用于食品饮料业。</b>
Description
技术领域
本发明涉及一种瑞鲍迪甙M的制备方法，特别涉及一种瑞鲍迪甙M的生物制备方法。
背景技术
糖的替代物可以分为四类，它们对人体健康的影响各不相同。第一类是果汁、蜂蜜及枫树糖浆等天然甜味剂，这些甜味剂的热量及碳水化合物的含量与蔗糖相似。第二类是人工甜味剂，如阿斯巴甜及糖精等，无热量，被认为是无营养的甜味剂。第三类是糖醇，如木糖醇及山梨醇等，主要来自蔬菜及水果。第四类是从天然植物中提取的甜味物质，如从甜菊中提取的甜菊糖。人工甜味剂，糖醇和提取甜味剂的甜度均比蔗糖高很多倍，有的能达到数百倍，所以添加量相对蔗糖可以大量的减少。
甜菊是一种具有重要经济价值的作物，甜菊叶片中含有很高含量的甜菊糖。目前已经在甜菊中鉴定出来100多种化合物，最为人们熟知的就是甜菊糖，特别是甜菊糖苷和瑞鲍迪甙A(J.Agric.FoodChem.,2012,60,886-895)。最近一种新型的甜菊糖在一株甜菊杂交株Morita中被发现（2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209）。
申请号为201310353500.9的专利公开了瑞鲍迪甙M的生物制备方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和/或含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M。但是该专利中的工艺不够优化，转化率最高仅为80%左右，且纯度仅为95%，底物浓度较低，生产成本较高，不适合产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法可以较低的成本生产出更高纯度的瑞鲍迪甙M产品。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在蔗糖、UDP的存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶（AtSUS1）的混合物或含有UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M，所述反应在温度20℃～60℃以及pH5.0～9.0的水相体系中进行，在反应体系中，所述的瑞鲍迪甙A的浓度大于等于10g/L，所述的瑞鲍迪甙D的浓度大于等于15g/L，所述反应结束后，反应液经离心后，将上清液经大孔吸附树脂分离即得瑞鲍迪甙M粗品溶液，将所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中结晶，即得纯度大于98%的所述瑞鲍迪甙M产品。
优选地，在起始反应体系中，所述的瑞鲍迪甙A的浓度为10～30g/L，所述的瑞鲍迪甙D的浓度为15～50g/L。
优选地，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B。
优选地，使所述反应在温度35℃～45℃以及pH6.5～8.5的水相体系中进行。
优选地，采用含有UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组细胞来进行所述催化，所述反应的体系中还含有体积比浓度为1%～3%的甲苯或其它细胞通透剂。
优选地，所述的UDP-葡萄糖基转移酶和所述的蔗糖合成酶的重量比为1：0.2～0.4。
优选地，所述的方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，用所述的水相体系定容，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。
优选地，所述的重组细胞为微生物细胞。
更优选地，所述的微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
优选地，所述的底物为瑞鲍迪甙A，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的混合物，所述来自甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。
更优选地，所述混合物中，来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的重量比为3～5：1。
优选地，所述的底物为瑞鲍迪甙D，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A，所述甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。
优选地，所述的反应液在所述的离心前，先在50～60℃下加热并超声处理50～70分钟。
优选地，所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中结晶的具体步骤为：将所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液通过减压蒸馏浓缩后离心，弃上清液，沉淀加水洗涤后离心，弃上清液，沉淀用体积比浓度为40%～70%的乙醇水溶液悬浮，加热至60～70℃溶解，加水至乙醇水溶液的体积比浓度为20～30%，逐渐冷却至室温，结晶并析出固体后，抽滤并真空干燥。
优选地，反应体系中还含有用于帮助所述的底物溶解的体积比浓度为3%～5%的二甲亚砜。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明提供的酶法制备瑞鲍迪甙M的方法具有重要的应用价值，通过对助溶剂、反应温度及pH的优化及控制，使得转化率和纯度都得到提高，生产成本降低，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例7所得产品的氢核磁谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种酶法合成瑞鲍迪甙M的工艺，原料可以是瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D。
瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D及瑞鲍迪甙M为分别含有四个，五个及六个葡萄糖单位的甜菊糖，三者的结构式分别参见式I、II和III。
本发明提供了两种合成瑞鲍迪甙M的路线：
路线1：
路线2：
在本发明中，原料是经过纯化的。
根据本发明的一个具体方面，原料包含甜菊糖苷底物瑞鲍迪甙A。
根据本发明的另一个具体方面，原料包含甜菊糖苷底物瑞鲍迪甙D。
根据本发明，UDP葡萄糖基转移酶可以以未纯化或纯化后的酶冻干粉形式存在或存在于重组细胞中。
含有UGT-A、UGT-B及AtSUS1（蔗糖合成酶）重组细胞的获得方法如下：
利用分子克隆技术、基因工程技术获得UGT-A、UGT-B及AtSUS1的重组大肠杆菌（或其它微生物菌）表达菌株，然后将重组大肠杆菌发酵，后处理收集重组细胞。
本发明所述的分子克隆技术和基因工程技术均是已知的。分子克隆技术可参见《分子克隆实验指南》第三版（J.沙姆布鲁克著,2005）。
采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达步骤如下：
（1）将UGT-A及AtSUS1基因片段分别亚克隆到pACYC-Duet-1的两个多克隆位点MCS2（NdeI/XhoI）和MCS1(BamHI/HindIII)中，得到质粒pA-UGT-A-SUS1；
（2）将UGT-B基因亚克隆到pET30a的NdeI和BamHI位点间，得到重组质粒pE-UGT-B；
（3）将pA-UGT-A-SUS1和pE-UGT-B先后转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株GQ-ABS。
利用含有UGT的重组大肠杆菌表达菌株制备含有UGT的重组细胞，或者UGT的冻干粉的步骤如下：
以1%比例将重组大肠杆菌表达菌株GQ-ABS接种到4ml液体LB培养基中，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mMIPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得所述重组细胞，或进一步于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得所述冻干粉。
以下结合具体的实施例对本发明作更为详细的描述。
实施例1：制备含UGT-A的重组大肠杆菌细胞
根据序列1及序列2，基因合成UGT-A基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pUC57载体（苏州金唯智生物技术有限公司）。将UGT基因片段用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pET30a对应酶切位点，转化BL21（DE3）菌株，得到重组菌GQ-A。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mMIPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-A的重组细胞用于催化。
实施例2：制备UGT-A冻干粉
将实施例1中制得的UGT-A的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得UGT-A的冻干粉。
实施例3：制备含UGT-B的重组大肠杆菌细胞
根据序列3及序列4，基因合成UGT-B基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pUC57载体（苏州金唯智生物技术有限公司）。将UGT基因片段用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pET30a对应酶切位点，转化BL21（DE3）菌株，得到重组菌GQ-B。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mMIPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-B的重组细胞用于催化。
实施例4：制备UGT-B冻干粉
将实施例3中制得的UGT-B的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得UGT-B的冻干粉。
实施例5：制备含UGT-A及AtSUS1的重组大肠杆菌细胞
将UGT-A和AtSUS1基因片段分别插入pACYC-Duet-1质粒的NdeI/XhoI以及BamHI/HindIII位点，得到质粒pA-UGT-A-SUS1。将该质粒转化BL21（DE3），得到GQ-AS重组菌株。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mMIPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-A及AtSUS1的重组细胞用于催化。
实施例6：制备含UGT-A，UGT-B及AtSUS1的重组大肠杆菌细胞
根据序列3及序列4，基因合成UGT-B基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pUC57载体（苏州金唯智生物技术有限公司）。将UGT基因片段用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pET30a对应酶切位点，转化GQ-AS菌株，得到重组菌GQ-ABS。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mMIPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-A、UGT-B及AtSUS1的重组细胞用于催化。
实施例7：以瑞鲍迪甙D为底物酶法合成瑞鲍迪甙M
在反应体系中依次加入0.224gUDP，34.2g蔗糖，1.6g瑞鲍迪甙D，UGT-A冻干粉1g，AtSUS1冻干粉0.4g，4ml二甲亚砜及0.05mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）至终体积100ml，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取200μl反应液加入800μl无水甲醇混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水=68%﹕32%；流速：1.0mL/min；柱温：30℃）。瑞鲍迪甙D的转化率为90%以上。反应结束后，100ml反应液加300ml去离子水，55℃加热1小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品A。离心后沉淀加100ml水，55℃加热0.5小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品B。将样品A及样品B混合后得到样品C，将样品C用大孔吸附树脂（AB-8）分离。先用水冲洗4个柱体积，再用70%乙醇洗脱3.5个柱体积，得到瑞鲍迪甙M粗品溶液。将上述粗品溶液减压蒸馏（40-50℃）至溶液剩余约10mL，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加4mL水洗涤，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀用50%乙醇水溶液悬浮，加热至65℃溶解，加入等体积的水至乙醇浓度为25%。逐渐冷却至室温，析出固体后，抽滤并真空干燥，得到瑞鲍迪甙M1.12g，纯度大于99%。
实施例8：以瑞鲍迪甙A为底物酶法合成瑞鲍迪甙M
在反应体系中依次加入0.18gUDP，41.04g蔗糖，1g瑞鲍迪甙A，UGT-A、UGT-B以及AtSUS1冻干粉分别2g、0.5g和0.5g，4ml二甲亚砜及0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）至终体积100ml混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取200μl反应液加入800μl无水甲醇混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水=68%﹕32%；流速：1.0mL/min；柱温：30℃）。瑞鲍迪甙A的转化率为90%以上。反应结束后，100ml反应液加300ml去离子水，55℃加热1小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品A。离心后沉淀加100ml水，55℃加热0.5小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品B。将样品A及样品B混合后得到样品C，将样品C用大孔吸附树脂（AB-8）分离。先用水冲洗4个柱体积，再用70%乙醇洗脱3.5个柱体积，得到瑞鲍迪甙M粗品溶液。将上述粗品溶液减压蒸馏（40-50℃）至溶液剩余约10mL，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加4mL水洗涤，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀用50%乙醇水溶液悬浮，加热至65℃溶解，加入等体积的水至乙醇浓度为25%。逐渐冷却至室温，析出固体后，抽滤并真空干燥，得到瑞鲍迪甙M0.69g，纯度大于99%。
实施例9：以瑞鲍迪甙D为底物全细胞合成瑞鲍迪甙M
实施例中使用的GQ-AS重组细胞为同时含有UGT-A和AtSUS1的重组菌。
在反应体系中依次加入0.045gUDP，10.26g蔗糖，2mL甲苯，0.2g瑞鲍迪甙D，含有GQ-AS重组细胞10g，4ml二甲亚砜及0.05mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）至终体积100ml，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应7h。反应结束后，取200μl反应液加入800μl无水甲醇混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水=68%﹕32%；流速：1.0mL/min；柱温：30℃）。瑞鲍迪甙D的转化率为90%以上。反应结束后，100ml反应液加300ml去离子水，55℃加热1小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品A。离心后沉淀加100ml水，55℃加热0.5小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品B。将样品A及样品B混合后得到样品C，将样品C用大孔吸附树脂（AB-8）分离。先用水冲洗4个柱体积，再用70%乙醇洗脱3.5个柱体积，得到瑞鲍迪甙M粗品溶液。将上述粗品溶液减压蒸馏（40-50℃）至溶液剩余约10mL，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加4mL水洗涤，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀用50%乙醇水溶液悬浮，加热至65℃溶解，加入等体积的水至乙醇浓度为25%。逐渐冷却至室温，析出固体后，抽滤并真空干燥，得到瑞鲍迪甙M0.14g，纯度大于99%。
实施例10：以瑞鲍迪甙A为底物全细胞合成瑞鲍迪甙M
实施例中使用的GQ-ABS重组细胞为同时含有UGT-A、UGT-B和AtSUS1的重组菌。
在反应体系中依次加入0.045gUDP，10.26g蔗糖，2mL甲苯，0.2g瑞鲍迪甙A，同时含有GQ-ABS重组细胞10g，4ml二甲亚砜及0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）至终体积100ml，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应7h。反应结束后，取200μl反应液加入800μl无水甲醇混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水=68%﹕32%；流速：1.0mL/min；柱温：30℃）。瑞鲍迪甙A的转化率为40%以上。反应结束后，100ml反应液加300ml去离子水，55℃加热1小时并超声处理，6,700转/分钟离心30分钟，上清液为样品A。离心后沉淀加100ml水，55℃加热0.5小时并超声处理，6700转/分钟离心30分钟，上清液为样品B。将样品A及样品B混合后得到样品C，将样品C用大孔吸附树脂（AB-8）分离。先用水冲洗4个柱体积，再用70%乙醇洗脱3.5个柱体积，得到瑞鲍迪甙M粗品溶液。将上述粗品溶液减压蒸馏（40-50℃）至溶液剩余约10mL，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加4mL水洗涤，9,900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀用50%乙醇水溶液悬浮，加热至65℃溶解，加入等体积的水至乙醇浓度为25%。逐渐冷却至室温，析出固体后，抽滤并真空干燥，得到瑞鲍迪甙M0.05g，纯度大于99%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在蔗糖、UDP的存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的混合物或含有UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M，所述反应在温度20℃~60℃以及pH5.0~9.0的水相体系中进行，其特征在于：在反应体系中，所述的瑞鲍迪甙A的浓度大于等于10g/L，所述的瑞鲍迪甙D的浓度大于等于15g/L，所述反应结束后，反应液经离心后，将上清液经大孔吸附树脂分离即得瑞鲍迪甙M粗品溶液，将所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中结晶，即得纯度大于98%的所述瑞鲍迪甙M产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在起始反应体系中，所述的瑞鲍迪甙A的浓度为10~30g/L，所述的瑞鲍迪甙D的浓度为15~50g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使所述反应在温度35℃~45℃以及pH6.5~8.5的水相体系中进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用含有UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组细胞来进行所述催化，所述反应的体系中还含有体积比浓度为1%~3%的甲苯或其它细胞通透剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的UDP-葡萄糖基转移酶和所述的蔗糖合成酶的重量比为1：0.2~0.4。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，用所述的水相体系定容，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组细胞为微生物细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
10.根据权利要求1至9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于：所述的底物为瑞鲍迪甙A，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的混合物，所述来自甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述混合物中，来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的重量比为3~5：1。
12.根据权利要求1至9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于：所述的底物为瑞鲍迪甙D，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A，所述甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反应液在所述的离心前，先在50~60℃下加热并超声处理50~70分钟。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中结晶的具体步骤为：将所述的瑞鲍迪甙M粗品溶液通过减压蒸馏浓缩后离心，弃上清液，沉淀加水洗涤后离心，弃上清液，沉淀用体积比浓度为40%~70%的乙醇水溶液悬浮，加热至60~70℃溶解，加水至乙醇水溶液的体积比浓度为20~30%，逐渐冷却至室温，结晶并析出固体后，抽滤并真空干燥。
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