JP7210626B2 - 酵素的方法を使用してレバウディオサイドjを調製するための方法 - Google Patents
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Description
UGT-Bの組み換え大腸菌(又は他の微生物)発現株は、分子クローニング技法及び遺伝子工学技法を利用することによって得られる。次いで、組み換え大腸菌を発酵させて、UGT-Bを含有する組み換え細胞を得るか、又は上記組み換え細胞由来のUGT-Bの凍結乾燥粉末を調製し、取得する。
(1)(配列表に示される配列1及び配列2に従って)必要な遺伝子断片を遺伝的に合成し、pUC57ベクターにライゲーションする一方で、2つの末端にNdeI及びBamHI酵素切断部位をそれぞれ付加する。
(2)各遺伝子断片を、発現ベクターpET30aの対応する酵素切断部位に二重消化及びライゲーションにより挿入し、それにより各遺伝子を、T7プロモーターの制御下で配置する。
(3)組み換えプラスミドを、大腸菌BL21(DE3)に形質転換する。標的タンパク質の発現は、IPTGを利用することによって誘導され、次いでUGT-Bの組み換え大腸菌の発現株が得られる。
UGT-Bを含有する組み換え大腸菌発現株を、1%の割合に従って4mLの液体LB培地に接種する。振盪培養を、37℃で(200rpmで)一晩実行する。一晩培養した物質を採取し、1%の割合に従って50mLのLB液体培地に接種する。OD600値が0.6~0.8に達するまで、振盪培養を、37℃で(200rpmで)一晩実行する。次いで、0.4mMの最終濃度を有するIPTGを、一晩の振盪培養にわたって20℃で添加する。誘導が完了した後、細胞を遠心分離(8,000rpm、10分)によって回収する。次いで、細胞を5mLの2mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)で再懸濁して、組み換え細胞を得る。次いで、細胞を氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離する(8,000rpm、10分)。また上清を回収し、凍結乾燥粉末を得るために24時間凍結乾燥させる。
配列3及び配列4に従って、UGT-B遺伝子断片を遺伝的に合成し、一方で2つの末端にNdeI及びBamHI酵素切断部位をそれぞれ付加し、pUC57ベクター(Suzhou Genewiz Biotech.Co.,Ltd.製)にライゲーションした。UGT遺伝子セグメントを、制限エンドヌクレアーゼNdel及びBamHIで酵素消化した後、セグメントを回収し、精製した。BL21(DE3)株を形質転換するために、T4リガーゼを付加して、セグメントをpET30aの対応する酵素切断部位にライゲーションした。
実施例1で調製したUGT-Bを含有する組み換え細胞を、氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離した(8,000rpm、10分)。また上澄みを回収し、24時間凍結乾燥して、UGT-Bの凍結乾燥粉末を得た。
この実施例では、実施例2の方法に従って調製したUGT-Bの凍結乾燥粉末を、レバウディオサイドJの触媒作用及び合成に使用した。
この実施例では、実施例1の方法に従って調製したUGT-Bを含有する組み換え細胞を、レバウディオサイドJの触媒作用及び合成に使用した。
1. 酵素的方法を使用してレバウディオサイドJを調製するための方法であって、前記方法において、レバウディオサイドAが、基質として使用され、グリコシル供与体の存在下で、レバウディオサイドJが、UDP-グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞及び/又はそこから調製されたUDP-グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される、方法。
Claims (11)
- 酵素的方法を使用してレバウディオサイドJを調製するための方法であって、i)UGT-Bまたはii)UGT-Bを含む含有する組み換え細胞の存在下、反応系においてレバウディオサイドAとグリコシル供与体を反応させて、レバウディオサイドJを産生することを含み、ここで、グリコシル供与体がラムノシル供与体であり、そしてUGT-Bのアミノ酸配列が配列番号2と少なくとも90%同一性を有するものである、方法。
- ラムノシル供与体がUDP-ラムノースである、請求項1に記載の方法。
- UGT-BがOryza sativa由来である、請求項1に記載の方法。
- 反応系が35~45℃の温度及び7.5~8.5のpHの水相系を含む、請求項1に記載の方法。
- 水相系がリン酸緩衝液である、請求項4に記載の方法。
- 反応系が細胞透過剤をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 細胞透過剤がトルエンであり、トルエンの体積比濃度が1~3%である、請求項6に記載の方法。
- 組み換え細胞が微生物の細胞である、請求項1に記載の方法。
- 微生物が大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)又はピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項8に記載の方法。
- レバウディオサイドJを樹脂単離により精製することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 樹脂単離により精製したレバウディオサイドJが95%を超える純度を有する、請求項10に記載の方法。
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