JP2019532650A5

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Publication number: JP2019532650A5
Application number: JP2019521117A
Authority: JP
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2020-11-26

Description

甘味剤は、食品、例えば、飲料、及びキャンディーの製造における広範な用途を有する食品添加剤の部類である。これらは食品生産プロセスで添加されてもよく、あるいは、家庭用ベーキングでスクロースの代用物として適切に希釈して使用されてもよい。甘味剤としては、天然甘味剤、例えば、スクロース、高果糖コーンシロップ、ハチミツなど、及び人工甘味剤、例えば、アスパルテーム、サッカリンなどが挙げられる。ステビオサイドは、植物ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）かから抽出された天然甘味剤の部類であり、今日、食品及び飲料に広く使用されている。ステビア・レバウディアナの抽出物は、レバウディオサイドを含む様々なステビオサイドを含有する。天然に抽出されたステビオサイドは、異なるバッチにわたって組成が広く異なり、その後の精製を必要とする。

レバウディオサイドＣを製造する従来の方法では、レバウディオサイドＣはステビア・レバウディアナの葉から抽出することによって得ることができる。例えば、米国特許第８５０１２６１号に開示されているように、８７．６％の純度の製品の約１１１ｇが、１０ｋｇのステビア・レバウディアナの葉から抽出することによって得ることができる。ステビア・レバウディアナの葉に見られるレバウディオサイドＣの割合は比較的低い（総乾燥重量の約１０％）ため、レバウディオサイドＣの従来の抽出方法でのコストは、レバウディオサイドＡ（総乾燥重量の約６０％）よりも比較的高い。更に、限定された収率のため、レバウディオサイドＣの商業用途が妨げられる。

酵素法を使用することによりレバウディオサイドＣを調製するための方法。本方法では、ズルコシドＡを基質として使用し、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される。

より好ましくは、反応系は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び細胞透過剤を含有する組換え細胞を含む。また、細胞透過剤はトルエンであり、反応系中のトルエンの体積比濃度は１〜３％である。

より好ましくは、反応に使用される全ての原材料をリアクターに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する。反応が完了した後、精製により生成物レバウディオサイドＣを得ることができる。特定の精製方法は、樹脂分離を含む後処理である。この精製方法によれば、９５％に達する高純度のレバウディオサイドＣを得ることができる。

本発明の１つの特定の態様によれば、第１工程反応において、基質はルブソシドであり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、オライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂであり、アミノ酸配列は、配列４と少なくとも８０％一致する。第２工程反応では、基質は、第１工程反応において生成物ズルコシドＡ含有する反応溶液であり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼはオライザ・サティバステビア・レバウディアナＧ由来のＵＧＴ−Ａであり、由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列２と少なくとも８０％一致する。

本発明で提供される酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法は、重要な適用価値を有する。植物よりも微生物の増殖速度がはるかに速いため、本発明により提供される方法を採用することにより、生産コストを大幅に削減することができ、生産サイクルを短縮することができ、製品の競合性が大幅に向上される。また、植物におけるステビオサイドの含有量が低く、構造が異なる多くのステビオサイドが存在するため、純粋な製品を抽出することは非常に困難である。本発明に提供される酵素法を使用した方法を採用することにより、ステビア・レバウディアナの葉からレバウディオサイドＣを抽出する既存の方法と比較して、高純度の生成物を得ることができる。従って、製品は、飲料などの食品産業においてより経済的に適用され得る。更に、レバウディオサイドＣの適用範囲は更に拡大される。

ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂの組換え大腸菌（又はその他の微生物）発現株は、分子クローニング技術及び遺伝子工学技術を利用することによって得られ、次いで、組換え大腸菌を発酵させて、ＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂ、又は組換え細胞により調製されたＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を含有する組換え細胞を得る。

ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を、１％の割合によって４ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩振盪培養を実施し、一晩静置した培養物を、１％の接種量に従って５０ｍｌの液体ＬＢ培養培地に移し、３７℃（２００ｒｐｍ）でＯＤ６００値が０．６〜０．８に達するまで浸透培養を実施し、０．４ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧを添加し振盪培養を２０℃で一晩行う。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの／２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して組換え細胞を得、細胞を氷浴中で更に超音波的に破壊し、破壊液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得る。

実施例１：ＵＧＴ−Ａを含有する組換え大腸菌細胞の調製
配列表に示される配列１及び２に従って、ＵＧＴ−Ａ遺伝子断片を遺伝子合成し、両端にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる制限酵素消化部位を加え、ベクターｐＵＣ５７（ＳＵＺＨＯＵＧＥＮＥＷＩＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＣＯ．，ＬＴＤ．により製造）に連結した。ＵＧＴ遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、精製断片を回収し、Ｔ４リガーゼを加えて断片を対応する制限酵素消化部位ｐＥＴ３０ａに連結し、それをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。

１％の振盪培養比に従って４ｍｌの液体ＬＢ培地にＵＧＴ株を接種し、振盪培養を３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩実施し、一晩静置した培養物を、接種量１％に従って液体ＬＢ培地５０ｍｌに移し、ＯＤ_６００値が０．６〜０．８，に達するまで３７℃（２００ｒｐｍ）で振盪培養を行い、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、振盪培養を２０℃で一晩行った。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、触媒作用のＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を得た。

実施例３：ＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌細胞の調製
配列３及び４に従って、ＵＧＴ−Ｂを含有する遺伝子断片を遺伝子合成し、両端に制限酵素消化部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを加え、ベクターｐＵＣ５７（ＳＵＺＨＯＵＧＥＮＥＷＩＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＣＯ．，ＬＴＤ．により製造）に連結させた。ＵＧＴ遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、精製断片を回収し、Ｔ４リガーゼを加えて断片を対応する制限酵素消化部位ｐＥＴ３０ａに連結し、それをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。

１％の比に従って４ｍｌの液体ＬＢ培地にＵＧＴ株を接種し、３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩振盪培養し、一晩静置した培養物を、１％の接種量に従って、５０ｍｌの液体ＬＢ培養培地に移し、ＯＤ_６００値が０．６〜０．８に達するまで３７℃（２００ｒｐｍ）で振盪培養を行い、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、振盪培養を２０℃で一晩行った。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、触媒作用のＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を得た。

実施例６：基質としてルブソシドを使用することによる、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒下でのレバウディオサイドＣの合成（経路２）
この実施例では、実施例２の方法に従って調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末及び実施例４の方法に従って調製されたＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を使用してレバウディオサイドＣの合成を触媒した。

実施例７：基質としてズルコシドＡを使用することによるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒下でのレバウディオサイドＣの合成
この実施例では、実施例１の方法に従って調製したＵＧＴ−Ａを含む組換え細胞を使用して、レバウディオサイドＣの合成を触媒した。

１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰ、８ｇのズルコシドＡ、５０ｇのスクロース、２０ｍｌのトルエン、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１２ｇのＡｔＳＵＳｌ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌して１６時間反応させた。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、遠心分離し、上清に等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間実施し、上清を、フィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を実施した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＳＢ−Ｃ１８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ズルコシドＡの変換率は９０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．５ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

実施例８：基質としてルブソシドを使用することによる、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒下でのレバウディオサイドＣの合成
第１工程反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、４．５ｇのＵＤＰラムノース、６．５ｇのルブソシド、２０ｍｌのトルエン、及び４０ｇのＵＧＴ−Ｂ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。第２工程反応：第１工程反応後、反応溶液を１０分間沸騰させ、ｐＨ値を８．０に調節し、２ｇのＵＤＰ、５０ｇのスクロース、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１２ｇのＡｔＳＵＳ１全細胞を添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、遠心分離し、上清に等体積の無水メタノールを加えて、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間実施し、上清を、フィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を実施した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＳＢ−Ｃ１８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ルブソシドの変換率は９０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．０ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

上述の実施例は、単に、本発明の技術的概念及び特徴の説明のためのものである。目的は、当業者が本発明を理解し、それを適宜実施することを可能にするだけであり、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の趣旨及び本質に従ってなされるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. 酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、前記方法では、ズルコシドＡが基質として使用され、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の触媒作用下での反応によって産生される、方法。
２. 酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、前記方法において、ルブソシドが基質として使用され、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の触媒作用下での反応によって産生される、方法。
３. 前記グリコシルドナーが、グルコシルドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、前記グルコシルドナーは、ＵＤＰ−グルコース又はスクロース、スクロース合成酵素、及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムであり、前記ラムノシルドナーはＵＤＰ−ラムノースである、項１又は２に記載の方法。
４. 前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）からのＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む、項１又は２に記載の方法。
５. 前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致する、項１に記載の方法。
６. 前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致する、項５に記載の方法。
７. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致する、項６に記載の方法。
８. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致する、項７に記載の方法。
９. 前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びはオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂであり、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２工程で前記反応系に添加し、前記ＵＧＴ−Ｂをまず第１工程で添加し、次いで、前記ＵＧＴ−Ａを第２工程で添加する、項２に記載の方法。
１０. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも６０％一致する、項９に記載の方法。
１１. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも７０％一致する、項１０に記載の方法。
１２. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも８０％一致する、項１１に記載の方法。
１３. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも９０％一致する、項１２に記載の方法。
１４. 前記反応が、水性系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ７．５〜８．５で行われる、項１又は２に記載の方法。
１５. 前記反応がリン酸緩衝溶液中で実施される、項１４に記載の方法。
１６. 記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び細胞透過性剤を含有する組換え細胞を含む、項１４に記載の方法。
１７. 前記細胞透過性剤がトルエンであり、前記反応系中のトルエンの体積比濃度が１〜３％である、項１６に記載の方法。
１８. 前記反応に使用される全ての原材料が、反応容器に添加されて均一に混合され、次いで、撹拌しながら反応のための設定温度に置かれる、項１４に記載の方法。
１９. 前記組換え細胞が微生物細胞である、項１又は２に記載の方法。
２０. 前記微生物が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、項１８に記載の方法。

Claims

酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、ズルコシドＡとグリコシルドナーを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下での反応系で反応させることを含み、該反応系が体積濃度で１〜３％のトルエンを含む、方法。
酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、ルブソシドとグリコシルドナー及びラムノシルドナーを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下での反応系で反応させることを含み、該反応系が体積濃度で１〜３％のトルエンを含む、方法。
グリコシルドナーがＵＤＰ−グルコース又はスクロース、スクロース合成酵素、及びＵＤＰを含むＵＤＰ−グルコース再生システムであり、ラムノシルドナーがＵＤＰ−ラムノースである、請求項１又は２に記載の方法。
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）からのＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂの一方又は両方を含む、請求項１又は２に記載の方法。
ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列番号２と少なくとも９０％同一である、請求項４に記載の方法。
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、ＵＧＴ−Ｂをまず第１工程で添加し、次いで、ＵＧＴ−Ａを第２工程で添加する、請求項２に記載の方法。
ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に示される配列番号２と少なくとも９０％同一である及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列表に示される配列番号４と少なくとも９０％同一である、請求項４に記載の方法。
反応が、水性系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ７．５〜８．５で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
反応がリン酸緩衝溶液中で実施される、請求項８に記載の方法。
組換え細胞が微生物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
微生物が、大腸菌、出芽酵母又はピチア・パストリスである、請求項１０に記載の方法。