JP6972123B2 - 酵素法を使用するレバウディオサイドｎを調製するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製するための方法に関し、特に、レバウディオサイドＮの生物学的調製方法に関する。
甘味剤は、飲料及び菓子などの食品の製造に広く使用される食品添加剤の一種である。甘味剤は、食品の製造中に添加されてもよく、又は、家庭用ベーキングにおいてスクロースの代用物として適切に希釈して使用されてもよい。甘味剤としては、天然甘味剤及び人工甘味剤が挙げられ、前者はスクロース、高フルクトースコーンシロップ、ハチミツなどを含み、後者はアスパルテーム、サッカリンなどを含む。ステビオサイドは、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）植物から抽出された天然甘味剤の一種であり、食品及び飲料に広く使用されている。ステビア・レバウディアナの抽出物は、レバウディオサイドを含む複数のステビオサイドを含有し、天然に抽出されたステビオサイドは、バッチごとの組成の差が大きく、その後精製する必要がある。
ステビア・レバウディアナの葉におけるレバウディオサイドＮの比は、１．５％未満である。従来の抽出方法により高純度のレバウディオサイドＮを得ることは非常に困難であり、このことは、レバウディオサイドＮの徹底的な調査を制限し、その商業的用途を妨げる。
本発明によって解決される技術的課題は、従来技術における欠陥を克服し、酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法を提供することである。本方法によれば、高純度レバウディオサイドＮ製品は、短い生産サイクルにおいて低コストで調製され得る。
本発明では、上記技術的問題を解決するために、以下の技術的解決策が採用される。
酵素法を用いてレバウディオサイドＮを調製するための方法が提供される。本方法は、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＡを基質として使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させてレバウディオサイドＮを生成することを含む。
酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製するための方法が更に提供される。本方法は、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＪを基質として使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させてレバウディオサイドＮを生成することを含む。
好ましくは、グリコシルドナーは、グルコース系ドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、グルコース系ドナーが、ＵＤＰ−グルコース又はスクロース、スクロース合成酵素及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システム（２００７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８１，２５６２〜２５６６）であり、ラムノシルドナーはＵＤＰ−ラムノースである。グルコース系ドナーは、好ましくはスクロース、スクロース合成酵素、及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムである。ＵＤＰグルコースの価格は高い。したがって、ＵＤＰ−グルコース再生システムの使用は、コストを大幅に低減することができる。
好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（すなわち、ウリジン二リン酸グルカノトランスフェラーゼ、略してＵＧＴと称され、当該技術分野において既知である）は、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）由来のＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む。
好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２つの工程で反応系に添加し、ＵＧＴ−Ｂが第１の工程で添加され、ＵＧＴ−Ａが第２の工程で添加される。ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも６０％の同一性を有し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列４に対して少なくとも６０％の同一性を有する。
より好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列４に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列４に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
また更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列４に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
いくつかの特定の実施形態では、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２と絶対的に同一であり、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列４と絶対的に同一である。
好ましくは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２と少なくとも６０％の同一性を有する。
より好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの特定の実施形態では、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に列挙される配列２と絶対的に同一である。
本発明によると、この反応は、水性系で４〜５０℃の温度及びｐＨ値５．０〜９．０で行われる。好ましくは、反応は、水相系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ値７．５〜８．５で行われる。
より好ましくは、反応はリン酸緩衝液中で実施される。
より好ましくは、反応系は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ組換え細胞及び細胞透過性化剤を含む。更に、細胞透過性化剤はトルエンであり、トルエンは、反応系中で１〜３％の体積比濃度を有する。
より好ましくは、反応に使用される全ての出発物質を反応容器に添加し、均一に混合し、設定温度で配置し、十分な反応のために撹拌する。反応が完了すると、使用要件を満たすレバウディオサイドＮ製品は、精製によって得られ得る。特定の精製方法は、樹脂分離を含む後処理である。この精製方法によれば、純度９５％のレバウディオサイドＮ生成物を得ることができる。
好ましくは、組換え細胞は、微生物細胞である。より好ましくは、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である。
本発明の特定の態様によれば、第１の工程における反応基質はレバウディオサイドＡであり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、オライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂであり、オライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列４に対して少なくとも８０％の同一性を有し、第２の工程における反応基質は、第１の工程からの反応生成物レバウディオサイドＪを含有する反応溶液であり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼはステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
本発明の別の特定の態様によれば、反応基質はレバウディオサイドＪであり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
先行技術と比較して、本発明は、前述の技術的解決策を実施することによって以下の利点を有する。
本発明で提供される酵素法によるレバウディオサイドＮを調製するための方法は、非常に重要な適用価値を有する。この方法によれば、植物よりも微生物がはるかに速く成長するため、生産コストを大幅に低下させることができ、生産サイクルを短縮することができ、製品の競争力を大幅に向上させることができる。また、植物は、ステビオサイドの含有量が少ないが、異なる構造を有する多くのステビオサイドを含有する。したがって、より純粋な製品を抽出することは困難である。ステビア・レバウディアナの葉からレバウディオサイドＮを抽出する従来の技術と比較して、本発明による酵素合成方法は、より高い純度を有する製品を得ることができ、必然的に新規のステビオサイド型レバウディオサイドＮの研究及び適用を促進する。
式Ｉ及び式ＩＩは、レバウディオサイドＪ及びレバウディオサイドＮの構造式である。
本発明は主に、レバウディオサイドＮを合成するための２つの経路を提供する。
本発明で使用されるＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂは、酵素凍結乾燥粉末形態で存在してもよく、又は組換え細胞中に存在してもよい。
ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを得る方法は、以下のとおりである。
組換え大腸菌（又は他の微生物）の発現株は、分子クローニング技術及び遺伝子工学技術によって得られ、次いで組換え大腸菌を発酵させて、ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を得るか、又はＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を組換え細胞から調製する。
本発明に記載の分子クローニング技術及び遺伝子工学技術はどちらも既知のものである。分子クローニング技術についての詳細については、研究室マニュアル、第３版（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００５）を参照することができる。
遺伝子工学技術を用いて構築された本明細書に記載の組換え株の発現工程は、以下のとおりである。
（１）所望の遺伝子断片は（配列表に列挙される配列１及び配列２又は配列３及び配列４に基づいて）遺伝的に合成され、ベクターｐＵＣ５７にライゲーションされ、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位は、それらの２つの末端に装填される。
（２）二重酵素消化及び連結により、遺伝子断片は、遺伝子がＴ７プロモーターの制御下に配置されるように、発現ベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に挿入される。
（３）組換えプラスミドを形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に配置し、標的タンパク質発現をＩＰＴＧにより誘導し、ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株が得られる。
（１）所望の遺伝子断片は（配列表に列挙される配列１及び配列２又は配列３及び配列４に基づいて）遺伝的に合成され、ベクターｐＵＣ５７にライゲーションされ、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位は、それらの２つの末端に装填される。
（２）二重酵素消化及び連結により、遺伝子断片は、遺伝子がＴ７プロモーターの制御下に配置されるように、発現ベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に挿入される。
（３）組換えプラスミドを形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に配置し、標的タンパク質発現をＩＰＴＧにより誘導し、ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株が得られる。
ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞、及びＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末は、以下の工程によってＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を使用することによって調製される：
ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を、１％の割合で４ｍｌの液体ＬＢ培地に接種し、培地を３７℃で一晩振盪させ（速度２００ｒｐｍ）、一晩培養物を１％の接種量で５０ｍｌの液体ＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が０．６〜０．８の範囲に達するまで、３７℃で振盪（速度２００ｒｐｍ）することによって接種し、次いで、濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で振盪して一晩接種する。誘導が完了すると、細胞を遠心分離し（８０００ｒｐｍ及び１０分）、回収し、５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（７．０のｐＨ値を有する）を使用して細胞を再懸濁して組換え細胞を得る。得られた組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕する。粉砕液体を遠心分離する（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を得る。
ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を、１％の割合で４ｍｌの液体ＬＢ培地に接種し、培地を３７℃で一晩振盪させ（速度２００ｒｐｍ）、一晩培養物を１％の接種量で５０ｍｌの液体ＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が０．６〜０．８の範囲に達するまで、３７℃で振盪（速度２００ｒｐｍ）することによって接種し、次いで、濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で振盪して一晩接種する。誘導が完了すると、細胞を遠心分離し（８０００ｒｐｍ及び１０分）、回収し、５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（７．０のｐＨ値を有する）を使用して細胞を再懸濁して組換え細胞を得る。得られた組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕する。粉砕液体を遠心分離する（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を得る。
以下、具体例を参照して本発明を詳細に説明する。
実施例１：ＵＧＴ−Ａを含有する組換え大腸菌細胞の調製
配列表に列挙される配列１及び配列２に従って、ＵＧＴ−Ａ遺伝子断片は遺伝子合成され、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位は、それぞれ２つの末端に装填され、遺伝子断片は、ベクターｐＵＣ５７（Ｓｕｚｈｏｕ ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄにより製造）に連結される。制限的エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを使用してＵＧＴ遺伝子断片を酵素消化し、精製した断片を回収した。断片を、Ｔ４リガーゼを使用してベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に連結させ、したがって断片をＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
配列表に列挙される配列１及び配列２に従って、ＵＧＴ−Ａ遺伝子断片は遺伝子合成され、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位は、それぞれ２つの末端に装填され、遺伝子断片は、ベクターｐＵＣ５７（Ｓｕｚｈｏｕ ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄにより製造）に連結される。制限的エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを使用してＵＧＴ遺伝子断片を酵素消化し、精製した断片を回収した。断片を、Ｔ４リガーゼを使用してベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に連結させ、したがって断片をＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
ＵＧＴ株を１％の割合で４ｍｌの液体ＬＢ培地に接種し、培地を３７℃で一晩振盪した（速度２００ｒｐｍ）。一晩培養物を１％の接種量で５０ｍｌの液体ＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が０．６〜０．８の範囲に達するまで、３７℃で振盪（速度２００ｒｐｍ）して接種し、次いで、濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で振盪して一晩接種を行った。誘導が完了したら、細胞を遠心分離し（８０００ｒｐｍ及び１０分）、回収し、細胞を５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（７．０のｐＨ値を有する）を使用して再懸濁し、ＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を得た。
実施例２：ＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末の調製
実施例１で調製したＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕した。粉砕液体を遠心分離した（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を得た。
実施例１で調製したＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕した。粉砕液体を遠心分離した（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を得た。
実施例３：ＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌細胞の調製
配列３及び配列４に従い、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝子合成し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位をそれぞれ２つの末端に装填し、遺伝子断片をベクターｐＵＣ５７（Ｓｕｚｈｏｕ ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）に連結させた。制限的エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを使用してＵＧＴ遺伝子断片を酵素消化し、精製した断片を回収した。断片を、Ｔ４リガーゼを使用してベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に連結させ、したがって断片をＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
配列３及び配列４に従い、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝子合成し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素消化部位をそれぞれ２つの末端に装填し、遺伝子断片をベクターｐＵＣ５７（Ｓｕｚｈｏｕ ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）に連結させた。制限的エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを使用してＵＧＴ遺伝子断片を酵素消化し、精製した断片を回収した。断片を、Ｔ４リガーゼを使用してベクターｐＴＥ３０ａの対応する酵素消化部位に連結させ、したがって断片をＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
ＵＧＴ株を１％の割合で４ｍｌの液体ＬＢ培地に接種し、培地を３７℃で一晩振盪し（速度２００ｒｐｍ）、一晩培養物を１％の接種量で５０ｍｌの液体ＬＢ培地に移し、ＯＤ６００値が０．６〜０．８の範囲に達するまで、３７℃で振盪（速度２００ｒｐｍ）することによって接種し、次いで、濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で振盪することによって一晩接種を行った。誘導が完了すると、細胞を遠心分離し（８０００ｒｐｍ及び１０分）、回収し、５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（７．０のｐＨ値を有する）を使用して細胞を再懸濁して、触媒作用のＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を得た。
実施例４：ＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末の調製
実施例３で調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕した。粉砕液体を遠心分離した（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。
実施例３で調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を氷浴で更に処理し、超音波破砕した。粉砕液体を遠心分離した（８０００ｒｐｍ及び１０分）。その後、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。
実施例５：ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下でレバウディオサイドＪを反応基質として使用することによるレバウディオサイドＮの合成（経路１）。
この実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例２の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末を使用することによって触媒的に合成された。この実施例では、スクロース、スクロース合成酵素（以下、ＡｔＳＵＳ１と称する）及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムを、グルコース系ドナーとして使用した。
この実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例２の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末を使用することによって触媒的に合成された。この実施例では、スクロース、スクロース合成酵素（以下、ＡｔＳＵＳ１と称する）及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムを、グルコース系ドナーとして使用した。
１Ｌの０．０５モル／Ｌのリン酸緩衝液（８．０のｐＨ値を有する）、０．５ｇのＵＤＰ、１ｇのレバウディオサイドＪ、５ｇのスクロース、１０ｇのＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末、及び０．５ｇのＡｔＳＵＳ１凍結乾燥粉末を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで得られた溶液を４０℃の水浴に入れた。３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間反応させた。反応が完了したら、５００μｌの反応溶液を採取し、均一な混合物のために等体積の非水性メタノールに添加し、得られた溶液を８０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その後、上清をフィルター膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによって試験した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ；試験波長：２１０ｎｍ；移動相：ギ酸の０．１％溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＪの変換率は９０％超であった。シリカゲル−樹脂分離、結晶化などの後処理による精製によって０．６１ｇのレバウディオサイドＮを得、得られたレバウディオサイドＮの純度は９５％超であった。
実施例６：ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下でレバウディオサイドＡを反応基質として使用することによるレバウディオサイドＮの合成（経路２）
この実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例２の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末及び実施例４の方法によって調製されたＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を使用することによって触媒的に合成された。
この実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例２の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末及び実施例４の方法によって調製されたＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を使用することによって触媒的に合成された。
第１の工程における反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（８．０のｐＨ値を有する）、２ｇのＵＤＰラムノシル、１ｇのレバウディオサイドＡ、及び１０ｇのＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで、得られた溶液を４０℃の水浴中に置き、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間反応させた。第２の工程における反応：第１工程で反応が完了したら、反応溶液を１０分間沸騰させ、反応溶液のｐＨ値を８．０に調節し、０．５ｇのＵＤＰ、５ｇのスクロース、１０ｇのＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末、及び３ｇのＡｔＳＵＳＩ凍結乾燥粉末を加え、均一に混合し、次いで得られた溶液を４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍの速度で撹拌した。２４時間から反応させた。反応が完了したら、５００μｌの反応溶液を採取し、均一な混合物について等体積の非水性メタノールに添加し、得られた溶液を８０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その後、上清をフィルター膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによって試験した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ；試験波長：２１０ｎｍ；移動相：ギ酸の０．１％溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は９０％超であった。シリカゲル−樹脂分離、結晶化などの後処理による精製によって０．５８ｇのレバウディオサイドＮを得、得られたレバウディオサイドＮの純度は９５％超であった。
実施例７：ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒作用下でレバウディオサイドＪを反応基質として使用することによるレバウディオサイドＮの合成
本実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例１の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を使用することによって触媒的に合成された。
本実施例では、レバウディオサイドＮは、実施例１の方法によって調製されたＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を使用することによって触媒的に合成された。
１Ｌの０．０５モル／Ｌのリン酸緩衝液（８．０のｐＨ値を有する）、０．５ｇのＵＤＰ、１ｇのレバウディオサイドＪ、５ｇのスクロース、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１０ｇのＡｔＳＵＳ１全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで得られた溶液を４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間反応させた。反応が完了したら、５００μｌの反応溶液を採取し、均一な混合物のために等体積の非水性メタノールに添加し、得られた溶液を８０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その後、上清をフィルター膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによって試験した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ；試験波長：２１０ｎｍ；移動相：ギ酸の０．１％溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＪの変換率は９０％超であった。シリカゲル−樹脂分離、結晶化などの後処理による精製によって０．５４ｇのレバウディオサイドＮを得、得られたレバウディオサイドＮの純度は９５％超であった。
実施例８：ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒作用下でレバウディオサイドＡを反応基質として使用することによるレバウディオサイドＮの合成
第１の工程における反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（８．０のｐＨ値を有する）、２ｇのＵＤＰラムノシル、１ｇのレバウディオサイドＡ、及び４０ｇのＵＧＴ−Ｂ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合した後、４０℃の水浴中に置き、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間反応させた。第２の工程における反応：第１の工程で反応が完了したら、反応溶液を１０分間沸騰させ、反応溶液のｐＨ値を８．０，に調整し、０．５ｇのＵＤＰ、５ｇのスクロース、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１０ｇのＡｔＳＵＳＩ全細胞を加え、均一に混合し、次いで、得られた溶液を４０℃の水浴中に置き、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間から反応させた。反応完了後、５００μｌの反応溶液を採取し、均一な混合物のために等体積の非水性メタノールに添加し、得られた溶液を８０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その後、上清をフィルター膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによって試験した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ；試験波長：２１０ｎｍ；移動相：ギ酸の０．１％溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は９０％超であった。シリカゲル−樹脂分離、結晶化などの後処理による精製によって０．５３ｇのレバウディオサイドＮを得、得られたレバウディオサイドＮの純度は９５％超であった。
第１の工程における反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（８．０のｐＨ値を有する）、２ｇのＵＤＰラムノシル、１ｇのレバウディオサイドＡ、及び４０ｇのＵＧＴ−Ｂ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合した後、４０℃の水浴中に置き、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間反応させた。第２の工程における反応：第１の工程で反応が完了したら、反応溶液を１０分間沸騰させ、反応溶液のｐＨ値を８．０，に調整し、０．５ｇのＵＤＰ、５ｇのスクロース、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１０ｇのＡｔＳＵＳＩ全細胞を加え、均一に混合し、次いで、得られた溶液を４０℃の水浴中に置き、３００ｒｐｍの速度で撹拌し、２４時間から反応させた。反応完了後、５００μｌの反応溶液を採取し、均一な混合物のために等体積の非水性メタノールに添加し、得られた溶液を８０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。その後、上清をフィルター膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによって試験した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｃｌｉｐｓｅ ＳＢ−Ｃ１８ ４．６×１５０ｍｍ；試験波長：２１０ｎｍ；移動相：ギ酸の０．１％溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍｌ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は９０％超であった。シリカゲル−樹脂分離、結晶化などの後処理による精製によって０．５３ｇのレバウディオサイドＮを得、得られたレバウディオサイドＮの純度は９５％超であった。
上記の実施例は、当業者が本発明の開示をより良く理解し、本発明を実施するように、本発明の技術的概念及び特性を説明することを単に意図したものである。しかしながら、これらの実施例は、本発明の保護範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本発明の趣旨及び本質から逸脱することなくなされるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. 酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法であって、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＡを基質として使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させて、前記レバウディオサイドＮを生成することを含む、方法。
２. 酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法であって、グリコシルドナーの存在下でレバウディオサイドＪを使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させて、前記レバウディオサイドＮを生成することを含む、方法。
３. 前記グリコシルドナーが、グルコース系ドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、前記グルコース系ドナーが、スクロース、スクロース合成酵素及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース又はＵＤＰ−グルコース再生システムであり、前記ラムノシルドナーがＵＤＰ−ラムノースである、項１又は２に記載の方法。
４. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）由来のＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む、項１又は２に記載の方法。
５. 前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２つの工程で前記反応系に添加し、前記ＵＧＴ−Ｂが前記第１の工程で添加され、前記ＵＧＴ−Ａが前記第２の工程で添加される、項１に記載の方法。
６. 前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも６０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも６０％の同一性を有する、項５に記載の方法。
７. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも７０％の同一性を有する、項６に記載の方法。
８. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項７に記載の方法。
９. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項８に記載の方法。
１０. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に列挙される配列２と少なくとも６０％の同一性を有する、項２に記載の方法。
１１. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、項１０に記載の方法。
１２. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項１１に記載の方法。
１３. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項１２に記載の方法。
１４. 前記反応が、水相系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ値７．５〜８．５で行われる、項１又は２に記載の方法。
１５. 前記反応がリン酸緩衝液中で実施される、項１４に記載の方法。
１６. 前記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ組換え細胞及び細胞透過性化剤を含む、項１４に記載の方法。
１７. 前記細胞透過性化剤がトルエンであり、前記トルエンが、前記反応系中に１〜３％の体積比濃度を有する、項１６に記載の方法。
１８. 前記反応に使用される全ての前記出発物質が、反応容器に添加され、均一に混合され、設定温度で配置され、十分な反応のために撹拌される、項１４に記載の方法。
１９. 前記組換え細胞が微生物細胞である、項１又は２に記載の方法。
２０. 前記微生物が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、項１９に記載の方法。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. 酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法であって、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＡを基質として使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させて、前記レバウディオサイドＮを生成することを含む、方法。
２. 酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法であって、グリコシルドナーの存在下でレバウディオサイドＪを使用し、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又は調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させて、前記レバウディオサイドＮを生成することを含む、方法。
３. 前記グリコシルドナーが、グルコース系ドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、前記グルコース系ドナーが、スクロース、スクロース合成酵素及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース又はＵＤＰ−グルコース再生システムであり、前記ラムノシルドナーがＵＤＰ−ラムノースである、項１又は２に記載の方法。
４. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）由来のＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む、項１又は２に記載の方法。
５. 前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２つの工程で前記反応系に添加し、前記ＵＧＴ−Ｂが前記第１の工程で添加され、前記ＵＧＴ−Ａが前記第２の工程で添加される、項１に記載の方法。
６. 前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に列挙される配列２に対して少なくとも６０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも６０％の同一性を有する、項５に記載の方法。
７. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも７０％の同一性を有する、項６に記載の方法。
８. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項７に記載の方法。
９. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列４に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項８に記載の方法。
１０. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に列挙される配列２と少なくとも６０％の同一性を有する、項２に記載の方法。
１１. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、項１０に記載の方法。
１２. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項１１に記載の方法。
１３. 前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に列挙される配列２に対して少なくとも９０％の同一性を有する、項１２に記載の方法。
１４. 前記反応が、水相系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ値７．５〜８．５で行われる、項１又は２に記載の方法。
１５. 前記反応がリン酸緩衝液中で実施される、項１４に記載の方法。
１６. 前記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ組換え細胞及び細胞透過性化剤を含む、項１４に記載の方法。
１７. 前記細胞透過性化剤がトルエンであり、前記トルエンが、前記反応系中に１〜３％の体積比濃度を有する、項１６に記載の方法。
１８. 前記反応に使用される全ての前記出発物質が、反応容器に添加され、均一に混合され、設定温度で配置され、十分な反応のために撹拌される、項１４に記載の方法。
１９. 前記組換え細胞が微生物細胞である、項１又は２に記載の方法。
２０. 前記微生物が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、項１９に記載の方法。
Claims (12)
- 酵素法を使用してレバウディオサイドＮを調製する方法であって、
ａ）レバウディオサイドＡを、グリコシルドナーおよびラムノシルドナーならびにｉ）ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞またはii）組換え細胞から調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが存在する反応系で反応させることを含み、ここで、ｉ）またはii）の何れかにおけるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、該反応系が配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをさらに含むか、または
ｂ）レバウディオサイドＪを、グリコシルドナーおよびｉ）ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞またはii）組換え細胞から調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが存在する反応系で反応させることを含み、ここで、ｉ）またはii）の何れかにおけるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、
ａ）およびｂ）におけるグリコシルドナーがＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−グルコース再生システムである、方法。 - グルコース再生システムが、スクロース、スクロース合成酵素及びＵＤＰを含み、ラムノシルドナーがＵＤＰ−ラムノースである、請求項１に記載の方法。
- ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）由来のＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む、請求項１に記載の方法。
- ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、ＵＧＴ−Ｂが第１の工程で添加され、ＵＧＴ−Ａが前記第２の工程で添加される、請求項１に記載の方法。
- 反応系が、３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ値７．５〜８．５の水相系を含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 水相系がリン酸緩衝液である、請求項５に記載の方法。
- 反応系が細胞透過性化剤をさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 細胞透過性化剤がトルエンであり、トルエンが、１〜３％の体積濃度を有する、請求項７に記載の方法。
- 前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記微生物細胞が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、請求項９に記載の方法。
- レバウディオサイドＮを樹脂分離により精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 樹脂分離により精製したレバウディオサイドＮが９５％を超える純度を有する、請求項１１に記載の方法。
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