RU2737118C2 - Способ получения ребаудиозида n с применением ферментативного способа - Google Patents
Способ получения ребаудиозида n с применением ферментативного способа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737118C2 RU2737118C2 RU2019112909A RU2019112909A RU2737118C2 RU 2737118 C2 RU2737118 C2 RU 2737118C2 RU 2019112909 A RU2019112909 A RU 2019112909A RU 2019112909 A RU2019112909 A RU 2019112909A RU 2737118 C2 RU2737118 C2 RU 2737118C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ugt
- udp
- rebaudioside
- glycosyltransferase
- reaction
- Prior art date
Links
- 229930188195 rebaudioside Natural products 0.000 title claims abstract description 40
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- HINSNOJRHFIMKB-DJDMUFINSA-N [(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl] (1R,4S,5R,9S,10R,13S)-13-[(2S,3R,4S,5R,6R)-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,4-bis[[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy]oxan-2-yl]oxy-5,9-dimethyl-14-methylidenetetracyclo[11.2.1.01,10.04,9]hexadecane-5-carboxylate Chemical compound [H][C@@]1(O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]2OC(=O)[C@]2(C)CCC[C@@]3(C)[C@]4([H])CC[C@@]5(C[C@]4(CC5=C)CC[C@]23[H])O[C@]2([H])O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O[C@]3([H])O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)[C@H]2O[C@]2([H])O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O HINSNOJRHFIMKB-DJDMUFINSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 claims abstract description 10
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 claims abstract description 10
- HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N entered according to Sigma 01432 Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 51
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 claims description 22
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 claims description 13
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 claims description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 claims description 9
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000386 donor Substances 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 5
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 2
- DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N UDP-beta-L-rhamnose Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical group P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 11
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 101000630755 Arabidopsis thaliana Sucrose synthase 1 Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N Stevioside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 229940013618 stevioside Drugs 0.000 description 3
- OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N stevioside Natural products CC1(CCCC2(C)C3(C)CCC4(CC3(CCC12C)CC4=C)OC5OC(CO)C(O)C(O)C5OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C(=O)OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O OHHNJQXIOPOJSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 235000021096 natural sweeteners Nutrition 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/08—Dextran
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01017—Glucuronosyltransferase (2.4.1.17)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа, включающий использование ребаудиозида А или ребаудиозида J в качестве субстрата и получение субстрата в присутствии донора гликозила в реакции в условиях катализа UDP-гликозилтрансферазой и/или содержащими UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантными клетками. Способ позволяет получить ребаудиозид N высокой чистоты с низкой стоимостью в течение короткого производственного цикла. 11 з.п. ф-лы, 8 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа и, в частности, относится к биологическому способу получения ребаудиозида N.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Подсластители представляют собой вид пищевых добавок, широко применяемых в производстве пищевых продуктов, таких как напитки и кондитерские изделия. Подсластители можно добавлять либо в процессе производства пищевых продуктов, либо использовать после соответствующего разбавления в качестве заменителей сахарозы в домашней выпечке. Подсластители включают натуральные подсластители и искусственные подсластители, в состав которых входит сахароза, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, мед и т.п.; последние включают аспартам, сахарин и т.п. Стевиозид представляет собой натуральный подсластитель, экстрагированный из растения Stevia rebaudiana, и в настоящее время широко используется в пищевых продуктах и напитках. Экстракты Stevia rebaudiana содержат множество стевиозидов, включая ребаудиозид, и экстрагированные естественным путем стевиозиды имеют существенные различия по составу между разными партиями и требуют последующей очистки.
Доля ребаудиозида N в листьях Stevia rebaudiana составляет менее 1,5%. Получить ребаудиозид N высокой чистоты с помощью традиционных способов экстракции крайне сложно, что ограничивает углубленное исследование ребаудиозида N и затрудняет его коммерческое применение.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача, которую предстоит решить с помощью настоящего изобретения, состоит в устранении недостатков предшествующего уровня техники и в разработке способа получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа. В соответствии с этим способом можно получить продукты ребаудиозида N высокой чистоты с низкой стоимостью в течение короткого производственного цикла.
Для решения описанной выше технической задачи в настоящем изобретении использовано следующее техническое решение.
Предложен способ получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа. Этот способ включает: использование ребаудиозида А в качестве субстрата в присутствии донора гликозила, реакцию в условиях катализа содержащей UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантной клеткой и/или полученной из них UDP-гликозилтрансферазой с образованием ребаудиозида N.
Дополнительно предложен способ получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа. Этот способ включает: использование ребаудиозида J в качестве субстрата в присутствии донора гликозила, реакцию в условиях катализа содержащей UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантной клеткой и/или полученной UDP-гликозилтрансферазой с образованием ребаудиозида N.
Донор гликозила предпочтительно включает один или два из донора на основе глюкозы и донора рамнозила; причем донор на основе глюкозы представляет собой UDP-глюкозу или систему регенерации UDP-глюкозы (2007, FEBS Letters, 581, 2562-2566), состоящую из сахарозы, синтазы сахарозы и UDP, а донор рамнозила представляет собой UDP-рамнозу. Донор на основе глюкозы предпочтительно представляет собой систему регенерации UDP-глюкозы, состоящую из сахарозы, синтазы сахарозы и UDP. UDP-глюкоза стоит дорого. Следовательно, использование системы регенерации UDP-глюкозы может значительно снизить затраты.
Предпочтительно UDP-гликозилтрансфераза (то есть уридиндифосфатглюкантрансфеаза, сокращенно именуемая UGT и известная специалистам в данной области) включает один или два из UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa.
Предпочтительно UDP-гликозилтрансфераза включает UGT-А из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa; UDP-гликозилтрансферазу добавляют в реакционную систему в две стадии; при этом на первой стадии добавляют UGT-B, а на второй стадии добавляют UGT-A. Аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью с последовательностью 4, указанной в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью с последовательностью 4, указанной в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с последовательностью 4, указанной в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью 4, указанной в перечне последовательностей.
В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислотная последовательность UGT-А абсолютно идентична последовательности 2, указанной в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B абсолютно идентична последовательности 4, указанной в перечне последовательностей.
Предпочтительно UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana; причем аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-A характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A обладает по меньшей мере 80% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A обладает по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью 2, указанной в перечне последовательностей. В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислотная последовательность UGT-A абсолютно идентична последовательности 2, указанной в перечне последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением реакцию проводят в системе с водной фазой при температуре от 4-50°С и величине рН 5,0-9,0. Предпочтительно реакцию проводят в системе с водной фазой при температуре 35-45°С и величине рН 7,5-8,5.
Более предпочтительно реакцию проводят в фосфатном буферном растворе.
Более предпочтительно реакционная система включает содержащую UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантную клетку и агент для пермеабилизации клетки. Кроме того, агент для пермеабилизации клетки представляет собой толуол; где объемная концентрация толуола в реакционной системе составляет 13%.
Более предпочтительно все сырьевые материалы, используемые для проведения реакции, добавляют в реакционный сосуд, перемешивают до однородного состояния и затем оставляют при заданной температуре при перемешивании для создания достаточных условий для протекания реакции. По завершении реакции продукт ребаудиозид N, удовлетворяющий требованиям к применению, можно получить путем очистки. Конкретный способ очистки представляет собой последующую обработку, включая разделение с помощью смолы. В соответствии с этим способом очистки можно получить продукт ребаудиозид N с чистотой, достигающей 95%.
Рекомбинантная клетка предпочтительно представляет собой клетку микроорганизма. Более предпочтительно микроорганизм представляет собой Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris.
В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения субстратом реакции на первой стадии является ребаудиозид А, а UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-B из Oryza sativa, причем аминокислотная последовательность UGT-B из Oryza sativa характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с последовательностью 4; а на второй стадии субстратом реакции является реакционный раствор, содержащий продукт реакции ребаудиозид J с первой стадии, а UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana, причем аминокислотная последовательность UGT-A из Stevia rebaudiana характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с последовательностью 2.
В соответствии с другим конкретным аспектом настоящего изобретения субстратом реакции является ребаудиозид J, UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana, причем аминокислотная последовательность UGT-A из Stevia rebaudiana характеризуется по меньшей мере 80%-й идентичностью с последовательностью 2.
В сравнении с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение имеет следующие преимущества, обусловленные реализацией вышеупомянутого технического решения:
Способ получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа в соответствии с настоящим изобретением имеет очень важное прикладное значение. Так как эти микроорганизмы растут намного быстрее, чем растения, с помощью этого способа можно
значительно снизить производственные затраты, сократить цикл производства и значительно улучшить конкурентоспособность продуктов. Кроме того, растения имеют низкое содержание стевиозида, но содержат большое количество стевиозидов с различными структурами. Поэтому экстрагировать чистые продукты достаточно сложно. По сравнению со стандартной методикой экстракции ребаудиозида N из листьев Stevia rebaudiana способом ферментативного синтеза в соответствии с настоящим изобретением можно получить продукты, обладающие более высокой чистотой, что в конечном счете стимулирует исследования и применение нового типа стевиозида - ребаудиозида N.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Формула I и формула II представляют собой структурные формулы ребаудиозида J и ребаудиозида N.
В настоящем изобретении в основном предложены два способа синтеза ребаудиозида N. Первый путь:
Второй путь:
UGT-A или UGT-B, используемые в настоящем изобретении, могут находиться в форме лиофилизированного порошка фермента или находиться в рекомбинантной клетке.
Способ получения UGT-A или UGT-B описан ниже.
Экспрессионные штаммы рекомбинантных Escherichia coli (или других микроорганизмов) получают методом молекулярного клонирования и методом генной инженерии, а затем рекомбинантную Escherichia coli ферментируют для получения рекомбинантных клеток, содержащих UGT-A или UGT-B; или из рекомбинантных клеток получают лиофилизированный порошок UGT-A или UGT-B.
Оба метода: молекулярного клонирования и генной инженерии, описанные в настоящем изобретении, известны. Для получения дополнительных сведений о методе молекулярного клонирования можно обратиться к руководству Molecular Cloning: A laboratory Manual, third version (by Joseph Sambrook, 2005).
Стадии экспрессии описанного в настоящем документе рекомбинантного штамма, сконструированного методом генной инженерии, описаны ниже.
(1) Требуемые фрагменты генов генетически синтезируют (на основе последовательности 1 и последовательности 2 или последовательности 3 и последовательности 4, указанных в перечне последовательностей) и лигируют в вектор pUC57, нагруженный с двух концов сайтами расщепления ферментов NdeI и BamHI.
(2) Путем двойного ферментативного расщепления и соединения фрагменты гена встраивают в соответствующие сайты ферментативного расщепления экспрессионного вектора рТЕ30а таким образом, чтобы гены были помещены под контроль промотора Т7.
(3) Рекомбинантные плазмиды трансформируют и помещают в Escherichia coli BL21 (DE3) и индуцируют экспрессию целевого белка с помощью ИПТГ, так чтобы получить рекомбинантные экспрессионные штаммы Escherichia coli, содержащие UGT-A или UGT-B. Рекомбинантные клетки, содержащие UGT-A или UGT-B, и лиофилизированный порошок UGT-A или UGT-B получают с использованием содержащих UGT-A или UGT-B рекомбинантных экспрессионных штаммов Escherichia coli с помощью следующих стадий: Рекомбинантные экспрессионные штаммы Escherichia coli, содержащие UGT-A или UGT-B, инокулируют в 4 мл жидкой среды Лурия - Бертани (LB) в доле 1%, и среду встряхивают (с частотой 200 об/мин) при 37°С в течение ночи; выдержанную в течение ночи культуру в количестве инокулята 1% переносят в 50 мл жидкой среды LB и инокулируют путем встряхивания (с частотой 200 об/мин) при 37°С до тех пор, пока значение OD600 не достигнет диапазона от 0,6 до 0,8; а затем добавляют изопропилтиогалактозид (ИПТГ) в концентрации 0,4 ммоль/л и инокулируют в течение ночи путем встряхивания при 20°С. После завершения индукции клетки центрифугируют (8000 об/мин и 10 мин) и собирают, клетки ресуспендируют с использованием 5 мл фосфатного буфера 2 ммоль/л (имеющего величину рН 7,0) для получения рекомбинантных клеток. Полученные рекомбинантные клетки дополнительно обрабатывают на ледяной бане и подвергают разрушению ультразвуком. Жидкость после разрушения клеток центрифугируют (8000 об/мин и 10 мин). После этого супернатант собирают и лиофилизируют в течение 24 ч для получения лиофилизированного порошка.
Настоящее изобретение подробно описано ниже со ссылкой на конкретные примеры.
Пример 1. Получение рекомбинантных клеток Escherichia coli, содержащих UGT-A
В соответствии с последовательностью 1 и последовательностью 2, указанными в перечне последовательностей, фрагменты гена UGT-A генетически синтезировали, нагружали с двух концов сайтами расщепления ферментов NdeI и BamHI, соответственно, и соединяли фрагменты генов с вектором pUC57 (производства компании Suzhou GENEWIZ Biotechnology Co., Ltd). Фрагменты гена UGT расщепляли ферментами с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI и выделяли очищенные фрагменты. Фрагменты соединяли с соответствующим сайтом ферментативного расщепления вектора рТЕ30а с помощью лигазы Т4, и, таким образом, фрагменты трансформировали в штаммы BL21 (DE3).
Штаммы UGT инокулировали в 4 мл жидкой среды LB в доле 1%, и среду встряхивали (с частотой 200 об/мин) при 37°С в течение ночи; выдержанную в течение ночи культуру в количестве инокулята 1% переносили в 50 мл жидкой среды LB и инкубировали путем встряхивания (с частотой 200 об/мин) при 37°С до тех пор, пока значение OD600 не достигало диапазона от 0,6 до 0,8; а затем добавляли ИПТГ в концентрации 0,4 ммоль/л и проводили инкубацию в течение ночи путем встряхивания при 20°С. После завершения индукции клетки центрифугировали (8000 об/мин и 10 мин) и собирали, клетки ресуспендировали с использованием 5 мл фосфатного буфера 2 ммоль/л (имеющего величину рН 7,0) для получения содержащих UGT-A рекомбинантных клеток.
Пример 2. Получение лиофилизированного порошка UGT-A
Полученные в примере 1 рекомбинантные клетки, содержащие UGT-A, дополнительно обрабатывали на ледяной бане и подвергали разрушению ультразвуком. Жидкость после разрушения клеток центрифугировали (8000 об/мин и 10 мин). После этого супернатант собирали и лиофилизировали в течение 24 ч для получения лиофилизированного порошка UGT-A.
Пример 3. Получение рекомбинантных клеток Escherichia coli, содержащих UGT-B
В соответствии с последовательностью 3 и последовательностью 4, указанными в перечне последовательностей, фрагменты гена UGT-B генетически синтезировали, нагружали с двух концов сайтами расщепления ферментов NdeI и BamHI, соответственно, и соединяли фрагменты генов с вектором pUC57 (производства компании Suzhou GENEWIZ Biotechnology Co., Ltd). Фрагменты гена UGT расщепляли ферментами с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI и выделяли очищенные фрагменты. Фрагменты соединяли с соответствующим сайтом ферментативного расщепления вектора рТЕ30а с помощью лигазы Т4, и, таким образом, фрагменты трансформировали в штаммы BL21 (DE3).
Штаммы UGT инокулировали в 4 мл жидкой среды LB в доле 1%, и среду встряхивали (с частотой 200 об/мин) при 37°С в течение ночи; выдержанную в течение ночи культуру в количестве инокулята 1% переносили в 50 мл жидкой среды LB и инкубировали путем встряхивания (с частотой 200 об/мин) при 37°С до тех пор, пока значение OD600 не достигало диапазона от 0,6 до 0,8; а затем добавляли ИПТГ в концентрации 0,4 ммоль/л и проводили инкубацию в течение ночи путем встряхивания при 20°С. После завершения индукции клетки центрифугировали (8000 об/мин и 10 мин) и собирали, клетки ресуспендировали с использованием 5 мл фосфатного буфера 2 ммоль/л (имеющего величину рН 7,0) для получения содержащих UGT-B рекомбинантных клеток.
Пример 4. Получение лиофилизированного порошка UGT-B
Полученные в примере 3 рекомбинантные клетки, содержащие UGT-B, дополнительно обрабатывали на ледяной бане и подвергали разрушению ультразвуком. Жидкость после разрушения клеток центрифугировали (8000 об/мин и 10 мин). После этого супернатант собирали и лиофилизировали в течение 24 ч для получения лиофилизированного порошка UGT-B.
Пример 5. Синтез ребаудиозида N с использованием ребаудиозида J в качестве субстрата реакции в условиях катализа UDP-гликозилтрансферазой (первый путь)
В данном примере ребаудиозид N был каталитически синтезирован с использованием лиофилизированного порошка UGT-A, полученного способом, описанным в примере 2. В этом примере в качестве донора на основе глюкозы использовали систему регенерации UDP-глюкозы, состоящую из сахарозы, синтазы сахарозы из Arabidopsis thaliana (далее называемой AtSUS1) и UDP.
1 л фосфатного буфера 0,05 моль/л (имеющего величину рН 8,0), 0,5 г UDP, 1 г ребаудиозида J, 5 г сахарозы, 10 г лиофилизированного порошка UGT-A и 0,5 г лиофилизированного порошка AtSUS1 последовательно добавляли в реакционную систему и смешивали до однородного состояния, а затем полученный в результате раствор помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. После завершения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и добавляли в эквивалентный объем безводного метанола до получения однородной смеси, и полученный в результате раствор центрифугировали с частотой 8000 об/мин в течение 10 мин. После этого супернатант фильтровали с помощью мембранного фильтра и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Agilent eclipse SB С18 4,6 × 150 мм; аналитическая длина волны: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65% : 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; и температура колонки: 30°С). Коэффициент конверсии ребаудиозида J составлял более 90%. В результате очистки путем разделения на силикагелевой смоле, кристаллизации и подобных последующих обработок получили 0,61 г ребаудиозида N, и чистота полученного ребаудиозида N составляла более 95%.
Пример 6. Синтез ребаудиозида N с использованием ребаудиозида А в качестве субстрата реакции в условиях катализа UDP-гликозилтрансферазой (второй путь)
В данном примере ребаудиозид N был каталитически синтезирован с использованием лиофилизированного порошка UGT-A, полученного способом, описанным в примере 2, и лиофилизированного порошка UGT-B, полученного способом, описанным в примере 4.
Реакция на первой стадии: 1 л фосфатного буфера 0,05 моль/л (имеющего величину рН 8,0), 2 г UDP-рамнозила, 1 г ребаудиозида А и 10 г лиофилизированного порошка UGT-B последовательно добавляли в реакционную систему и смешивали до однородного состояния, а затем полученный в результате раствор помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. Реакция на второй стадии: После завершения реакции на первой стадии реакционный раствор кипятили в течение 10 мин, величину рН реакционного раствора доводили до 8,0, добавляли 0,5 г yUDP, 5 г сахарозы, 10 г лиофилизированного порошка UGT-А и 3 г лиофилизированного порошка AtSUSI и смешивали до однородного состояния, а затем полученный в результате раствор помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. После завершения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и добавляли в эквивалентный объем безводного метанола до получения однородной смеси, и полученный в результате раствор центрифугировали с частотой 8000 об/мин в течение 10 мин. После этого супернатант фильтровали с помощью мембранного фильтра и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Agilent eclipse SB C18 4,6 × 150 мм; аналитическая длина волны: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65% : 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; и температура колонки: 30°С). Коэффициент конверсии ребаудиозида А составлял более 90%. В результате очистки путем разделения на силикагелевой смоле, кристаллизации и подобных последующих обработок получили 0,58 г ребаудиозида N, и чистота полученного ребаудиозида N составляла более 95%.
Пример 7. Синтез ребаудиозида N с использованием ребаудиозида J в качестве субстрата реакции в условиях катализа содержащими UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантными клетками
В данном примере ребаудиозид N был каталитически синтезирован с использованием содержащих UGT-А рекомбинантных клеток, полученных способом, описанным в примере 1.
1 л фосфатного буфера 0,05 моль/л (имеющего величину рН 8,0), 0,5 г UDP, 1 г ребаудиозида J, 5 г сахарозы, 40 г содержащих UGT-A цельных клеток и 10 г содержащих AtSUS1 цельных клеток последовательно добавляли в реакционную систему и смешивали до однородного состояния, а затем полученный в результате раствор помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. После завершения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и добавляли в эквивалентный объем безводного метанола до получения однородной смеси, и полученный в результате раствор центрифугировали с частотой 8000 об/мин в течение 10 мин. После этого супернатант фильтровали с помощью мембранного фильтра мембраны и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Agilent eclipse SB C18 4,6 × 150 мм; аналитическая длина волны: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65% : 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; и температура колонки: 30°С). Коэффициент конверсии ребаудиозида J составлял более 90%. В результате очистки путем разделения на силикагелевой смоле, кристаллизации и подобных последующих обработок получили 0,54 г ребаудиозида N, и чистота полученного ребаудиозида N составляла более 95%.
Пример 8. Синтез ребаудиозида N с использованием ребаудиозида А в качестве субстрата реакции в условиях катализа содержащими UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантными клетками
Реакция на первой стадии: 1 л фосфатного буфера 0,05 моль/л (имеющего величину рН 8,0), 2 г UDP-рамнозила, 1 г ребаудиозида А и 40 г содержащих UGT-B цельных клеток последовательно добавляли в реакционную систему и смешивали до однородного состояния, затем помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. Реакция на второй стадии: После завершения реакции на первой стадии реакционный раствор кипятили в течение 10 мин, величину рН реакционного раствора доводили до 8,0, добавляли 0,5 г UDP, 5 г сахарозы, 40 г содержащих UGT-A цельных клеток и 10 г содержащих AtSUSI цельных клеток и смешивали до однородного состояния, а затем полученный в результате раствор помещали на водяную баню при 40°С, перемешивали с частотой 300 об/мин и подвергали взаимодействию в течение 24 ч. После завершения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и добавляли в эквивалентный объем безводного метанола до получения однородной смеси, и полученный в результате раствор центрифугировали с частотой 8000 об/мин в течение 10 мин. После этого супернатант фильтровали с помощью мембранного фильтра и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Agilent eclipse SB C18 4,6 × 150 мм; аналитическая длина волны: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65% : 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; и температура колонки: 30°С). Коэффициент конверсии ребаудиозида А составлял более 90%. В результате очистки путем разделения на силикагелевой смоле, кристаллизации и подобных последующих обработок получили 0,53 г ребаудиозида N, и чистота полученного ребаудиозида N составляла более 95%.
Приведенные выше примеры предназначены только для описания технических концепций и характеристик настоящего изобретения, чтобы специалист в данной области смог лучше понять описание настоящего изобретения и реализовать на практике настоящее изобретение. Однако эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем защиты настоящего изобретения. Различные эквивалентные вариации или изменения, сделанные без отступления от сущности и духа настоящего изобретения, считаются входящими в объем защиты настоящего изобретения.
Claims (15)
1. Способ получения ребаудиозида N с применением ферментативного способа, включающий:
a) реакцию ребаудиозида J в реакционной системе с донором гликозила в присутствии i) рекомбинантных клеток, содержащих UDP-гликозилтрансферазу; или ii) UDP-гликозилтрансферазы, полученной из рекомбинантных клеток, при этом UDP-гликозилтрансфераза в i) или ii) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или
b) реакцию ребаудиозида А в реакционной системе с донором гликозила и донором рамнозила в присутствии i) рекомбинантных клеток, содержащих UDP-гликозилтрансферазу; или ii) UDP-гликозилтрансферазы, полученной из рекомбинантных клеток, при этом UDP-гликозилтрансфераза в i) или ii) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и при этом реакционная система дополнительно содержит UDP-гликозилтрансферазу, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и
при этом донор гликозила в а) или b) представляет собой UDP-глюкозу или систему регенерации UDP-глюкозы.
2. Способ по п. 1, в котором система регенерации UDP-глюкозы содержит сахарозу, синтазу сахарозы и UDP, и при этом донор рамнозила представляет собой UDP-рамнозу.
3. Способ по п. 1, в котором UDP-гликозилтрансфераза включает одну из или обе UGT-А из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa.
4. Способ по п. 1, в котором UDP-гликозилтрансфераза содержит UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa; при этом на первой стадии добавляют UGT-B, а на второй стадии добавляют UGT-A.
5. Способ по п. 1, в котором реакционная система содержит водную фазу системы при температуре 35-45°С и величине рН от 7,5 до 8,5.
6. Способ по п. 5, в котором водная фаза системы представляет собой фосфатный буферный раствор.
7. Способ по п. 5, в котором реакционная система дополнительно содержит агент для пермеабилизации клетки.
8. Способ по п. 7, в котором агент для пермеабилизации клетки представляет собой толуол; и где объемная концентрация толуола составляет 1-3%.
9. Способ по п. 1, в котором рекомбинантная клетка представляет собой клетку микроорганизма.
10. Способ по п. 9, в котором клетка микроорганизма представляет собой одно из Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris.
11. Способ по п. 1, который дополнительно включает очищение ребаудиозида N путем разделения с помощью смолы.
12. Способ по п. 11, в котором ребаудиозид N, очищенный путем разделения с помощью смолы, характеризуется чистотой более чем 95%.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2016/102948 WO2018072213A1 (zh) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙n的方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019112909A3 RU2019112909A3 (ru) | 2020-11-23 |
| RU2019112909A RU2019112909A (ru) | 2020-11-23 |
| RU2737118C2 true RU2737118C2 (ru) | 2020-11-24 |
Family
ID=62018053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019112909A RU2737118C2 (ru) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | Способ получения ребаудиозида n с применением ферментативного способа |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11352653B2 (ru) |
| EP (1) | EP3530745A4 (ru) |
| JP (1) | JP6972123B2 (ru) |
| CN (2) | CN109890973B (ru) |
| AU (1) | AU2016427130B2 (ru) |
| BR (1) | BR112019008048A2 (ru) |
| CA (1) | CA3041152A1 (ru) |
| MX (1) | MX2019004628A (ru) |
| RU (1) | RU2737118C2 (ru) |
| WO (1) | WO2018072213A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112019007882A2 (pt) | 2016-10-21 | 2019-07-02 | Pepsico Inc | método para preparar rebaudiosídeo j com o uso de método enzimático |
| AU2016427120B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-08-18 | Pepsico, Inc. | Method for preparing rebaudioside C using enzymatic method |
| MX2020012557A (es) * | 2018-06-08 | 2021-03-25 | Purecircle Usa Inc | Glicósidos de esteviol de alta pureza. |
| BR112021019470A2 (pt) * | 2019-03-29 | 2021-11-30 | Conagen Inc | Produção biossintética de udp-ramnose |
| EP4086237A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-09 | Hypex Bio Explosives Technology AB | Composition for forming a hydrogen peroxide based emulsion explosive |
| KR102628374B1 (ko) * | 2021-10-19 | 2024-01-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 당전이효소 및 이의 용도 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013176738A1 (en) * | 2012-05-22 | 2013-11-28 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
| US20140357588A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
| WO2016028899A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-02-25 | The Coca-Cola Company | Methods for preparing rebaudioside i and uses |
| RU2596190C2 (ru) * | 2009-10-15 | 2016-08-27 | ПЬЮСЁРКЛ ЭсДиЭн БиЭйчДи | Ребаудиозид d высокой степени чистоты и его применение |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2918593A1 (en) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Cargill, Incorporated | Method of producing purified rebaudioside a compositions using solvent/antisolvent crystallization |
| CN101225424B (zh) | 2007-09-13 | 2013-05-29 | 天津药物研究院 | 环黄芪醇的单葡萄糖苷、其制备方法、药物组合物和应用 |
| KR20200000478A (ko) | 2008-10-03 | 2020-01-02 | 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 신규 스테비올 배당체 |
| SG10201709458QA (en) | 2010-06-02 | 2017-12-28 | Evolva Inc | Recombinant production of steviol glycosides |
| US8962698B2 (en) | 2011-01-28 | 2015-02-24 | Tate & Lyle Ingredients Americas Llc | Rebaudioside-mogroside V blends |
| SG10201606565XA (en) | 2011-08-08 | 2016-10-28 | Evolva Sa | Recombinant production of steviol glycosides |
| CN103031283B (zh) | 2011-10-08 | 2015-07-08 | 成都华高瑞甜科技有限公司 | 甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法 |
| CN103159808B (zh) * | 2011-12-09 | 2017-03-29 | 上海泓博智源医药股份有限公司 | 一种制备天然甜味剂的工艺方法 |
| DK3009010T3 (da) | 2011-12-19 | 2020-05-11 | Purecircle Sdn Bhd | Fremgangsmåder til oprensning af steviolglycosider |
| CA2862980A1 (en) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Dsm Ip Assets B.V. | Diterpene production |
| WO2014086890A1 (en) | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Evolva Sa | Steviol glycoside compositions sensory properties |
| CN103088041B (zh) | 2013-01-29 | 2015-01-07 | 江南大学 | 一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用 |
| US9957540B2 (en) | 2013-02-06 | 2018-05-01 | Evolva Sa | Methods for improved production of Rebaudioside D and Rebaudioside M |
| US9717267B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-08-01 | The Coca-Cola Company | Beverages containing rare sugars |
| CN103397064B (zh) | 2013-08-14 | 2015-04-15 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| WO2015023928A1 (en) * | 2013-08-15 | 2015-02-19 | Cargill, Incorporated | Sweetener and sweetened compositions incorporating rebaudoside n |
| EP3063286B1 (en) | 2013-11-01 | 2018-12-05 | Conagen Inc. | Recombinant production of steviol glycosides |
| SG2013092820A (en) | 2013-12-16 | 2015-07-30 | Ngee Ann Polytechnic | Xylose isomerase genes for xylose-fermenting yeast construction |
| CN103757074B (zh) * | 2014-01-16 | 2015-12-02 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| CN106471128A (zh) | 2014-01-28 | 2017-03-01 | 百事可乐公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| US9522929B2 (en) | 2014-05-05 | 2016-12-20 | Conagen Inc. | Non-caloric sweetener |
| EP3201211B1 (en) | 2014-10-03 | 2021-09-29 | Conagen Inc. | Non-caloric sweeteners and methods for synthesizing |
| SG11201705606PA (en) * | 2015-01-30 | 2017-08-30 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
| BR112017025705B1 (pt) | 2015-05-29 | 2022-05-10 | Cargill, Incorporated | Método de liberação de glicosídeos de esteviol de uma célula hospedeira |
| CN105200098A (zh) | 2015-06-30 | 2015-12-30 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| WO2017031424A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Pepsico, Inc. | Preparation of rebaudioside m in a single reaction vessel |
| BR112019007882A2 (pt) | 2016-10-21 | 2019-07-02 | Pepsico Inc | método para preparar rebaudiosídeo j com o uso de método enzimático |
| AU2016427120B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-08-18 | Pepsico, Inc. | Method for preparing rebaudioside C using enzymatic method |
-
2016
- 2016-10-21 CN CN201680089986.1A patent/CN109890973B/zh active Active
- 2016-10-21 EP EP16919469.3A patent/EP3530745A4/en active Pending
- 2016-10-21 RU RU2019112909A patent/RU2737118C2/ru active
- 2016-10-21 AU AU2016427130A patent/AU2016427130B2/en active Active
- 2016-10-21 MX MX2019004628A patent/MX2019004628A/es unknown
- 2016-10-21 BR BR112019008048A patent/BR112019008048A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-10-21 CA CA3041152A patent/CA3041152A1/en active Pending
- 2016-10-21 WO PCT/CN2016/102948 patent/WO2018072213A1/zh unknown
- 2016-10-21 US US16/343,335 patent/US11352653B2/en active Active
- 2016-10-21 CN CN202310412340.4A patent/CN116515929A/zh active Pending
- 2016-10-21 JP JP2019520995A patent/JP6972123B2/ja active Active
-
2022
- 2022-05-16 US US17/663,631 patent/US11976313B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2596190C2 (ru) * | 2009-10-15 | 2016-08-27 | ПЬЮСЁРКЛ ЭсДиЭн БиЭйчДи | Ребаудиозид d высокой степени чистоты и его применение |
| WO2013176738A1 (en) * | 2012-05-22 | 2013-11-28 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
| US20140357588A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
| WO2016028899A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-02-25 | The Coca-Cola Company | Methods for preparing rebaudioside i and uses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2016427130B2 (en) | 2022-08-18 |
| AU2016427130A1 (en) | 2019-05-30 |
| RU2019112909A3 (ru) | 2020-11-23 |
| CN109890973B (zh) | 2023-05-23 |
| WO2018072213A1 (zh) | 2018-04-26 |
| CN109890973A (zh) | 2019-06-14 |
| US11976313B2 (en) | 2024-05-07 |
| CA3041152A1 (en) | 2018-04-26 |
| RU2019112909A (ru) | 2020-11-23 |
| MX2019004628A (es) | 2019-06-06 |
| US20220275415A1 (en) | 2022-09-01 |
| JP2019531083A (ja) | 2019-10-31 |
| EP3530745A1 (en) | 2019-08-28 |
| CN116515929A (zh) | 2023-08-01 |
| US11352653B2 (en) | 2022-06-07 |
| JP6972123B2 (ja) | 2021-11-24 |
| BR112019008048A2 (pt) | 2019-07-02 |
| EP3530745A4 (en) | 2020-07-22 |
| US20210214761A1 (en) | 2021-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10428364B2 (en) | Enzymatic method for preparing rebaudioside M | |
| RU2737118C2 (ru) | Способ получения ребаудиозида n с применением ферментативного способа | |
| US11952604B2 (en) | Enzymatic method for preparing Rebaudioside J | |
| US11976312B2 (en) | Enzymatic method for preparing Rebaudioside C | |
| JP2019532650A5 (ru) | ||
| JP7210626B2 (ja) | 酵素的方法を使用してレバウディオサイドｊを調製するための方法 |