JP2019532650A

JP2019532650A - 酵素法を使用することによりレバウディオサイドｃを調製するための方法

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Publication number: JP2019532650A
Application number: JP2019521117A
Authority: JP
Inventors: 軍華陶; 国慶李; 文霞王; 雷雷鄭; 春磊朱; 暁亮梁; 車翹陳
Original assignee: ペプシコ・インク
Priority date: 2016-10-21
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2019-11-14
Also published as: RU2736155C1; WO2018072203A1; US11976312B2; AU2016427120A8; CA3041150A1; EP3530746A4; CN110199029B; AU2016427120B2; CN110199029A; CN117051063A; AU2016427120A1; US20220220525A1; EP3530746A1; MX2019004629A; US11312985B2; US20190367960A1

Abstract

酵素法を用いてレバウディオサイドＣを調製する方法であって、基質としてルブソシド又はズルコシドＡを使用し、グリコシルドナーの存在下での基質を作製することを含み、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ含有組換え細胞及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下で反応させてレバウディオサイドＣを生成することを含む、酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製する方法が提供される。

Description

本発明は、レバウディオサイドＣを調製するための方法に関し、具体的には、レバウディオサイドＣを調製するための生物学的方法に関する。

甘味剤は、食品、飲料、及びキャンディーの製造における広範な用途を有する食品添加剤の部類である。これらは食品生産プロセスで添加されてもよく、あるいは、家庭用ベーキングでスクロースの代用物として適切に希釈して使用されてもよい。甘味剤としては、天然甘味剤、例えば、スクロース、高果糖コーンシロップ、ハチミツなど、及び人工甘味剤、例えば、アスパルテーム、サッカリンなどが挙げられる。ステビオサイドは、植物ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）かから抽出された天然甘味剤の部類であり、今日、食品及び飲料に広く使用されている。ステビア・レバウディアナの抽出物は、レバウディオサイドを含む様々なステビオサイドを含有する。天然に抽出されたステビオサイドは、異なるバッチにわたって組成が広く異なり、その後の精製を必要とする。

レバウディオサイドＣを製造する従来の方法では、レバウディオサイドＣはステビア・レバウディアナの葉から抽出することによって得ることができる。例えば、米国特許第８５０１２６１号に開示されているように、８７．６％の純度の製品の約１１１ｇが、１０ｋｇのステビア・レバウディアナの葉から抽出することによって得ることができる。ステビア・レバウディアナの葉に見られるレバウディオサイドＣの割合は比較的低い（総乾燥重量の約１０％）ため、レバウディオサイドＣの生産コストは、レバウディオサイドＡ（総乾燥重量の約６０％）よりも比較的高い。更に、限定された収率のため、レバウディオサイドＣの商業用途が妨げられる。

本発明によって解決される技術的課題は、先行技術の欠陥を克服することである。本発明は、酵素法を使用して、レバウディオサイドＣを調製するための方法を提供することによって達成する。このような方法では、高純度のレバウディオサイドＣ製品は、低コストかつより短い生産サイクルで製造することができる。

本発明では、上記技術的課題を解決するために、以下の技術的解決策が採用される。

酵素法を使用することによりレバウディオサイドＣを調製するための方法。本方法では、ズルコシドＣを基質として使用し、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される。

酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法。本方法では、ルブソシドは基質として使用され、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞及び／又はそれから調製されるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって生成される。

好ましくは、グリコシルドナーは、グルコシルドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、グルコシルドナーは、スクロース、スクロース合成酵素及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システム２００７、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，５８１，２５６２〜２５６６であり、ラムノシルドナーはＵＤＰ−ラムノースである。本明細書では、スクロース、スクロース合成酵素、及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムが好ましい。ＵＤＰ−グルコースの価格はより高い。ＵＤＰ−グルコース再生システムを使用することにより、コストを大幅に削減することができる。

好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（すなわち、ウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、略してＵＧＴは既知である）は、ステビア・レバウディアナからのＵＧＴ−Ａ、及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む。

好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致する。

より好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致する。

更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致する。

更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致する。

１つの特定の態様によれば、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表中の配列２と完全に一致する。

好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂを含み、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２つの工程で反応系に添加し、ＵＧＴ−Ｂを第１の工程でまず添加し、次いでＵＧＴ−Ａを第２の工程で添加する。

好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列４と少なくとも６０％一致する。

より好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列４と少なくとも７０％一致する。

更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列４と少なくとも８０％一致する。

更に、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致し、及び／又はＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は、配列表に示される配列４と少なくとも９０％一致する。

本発明によると、反応は、４〜５０℃の温度及び５．０〜９．０のｐＨを有する水性系で実施することができる。好ましくは、反応は、水性系で３４℃〜４５℃の温度及びｐＨ７．５〜８．５で行われる。

より好ましくは、反応はリン酸緩衝溶液中で実施される。

より好ましくは、反応系は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び細胞透過性剤を含有する組換え細胞を含む。また、細胞透過性剤はトルエンであり、反応系中のトルエンの体積比濃度は１〜３％である。

より好ましくは、反応に使用される全ての原材料を反応ケトルに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する。反応が完了した後、精製により生成物レバウディオサイドＣを得ることができる。特定の精製方法は、樹脂分離を含む後処理である。この精製方法によれば、純度９５％以下のレバウディオサイドＣを得ることができる。

好ましくは、組換え細胞は、微生物細胞である。より好ましくは、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である。

本発明の１つの特定の態様によれば、第１工程反応において、基質はルブソシドであり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、オライザ・サティバ）由来のＵＧＴ−Ｂであり、ミノ酸配列は、配列４と少なくとも８０％である。第２工程反応では、基質は、第１工程反応において生成物ズルコシドＡ含有する反応溶液であり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼはオライザ・サティバステビア・レバウディアナＧ由来のＵＧＴ−Ａであり、由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列２と少なくとも８０％と一致する。

本発明の別の態様によれば、基質はズルコシドＡであり、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼはステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は、配列２と少なくとも８０％一致する。

先行技術と比較して、本発明は、前述の技術的解決策を実施することによって以下の利点を有する。

本発明で提供される酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法は、重要な適用価値を有する。植物よりも微生物の増殖速度がはるかに速いため、本発明により提供される方法を採用することにより、生産コストを大幅に削減することができ、生産サイクルを短縮することができ、製品の競合性が大幅に向上される。また、植物におけるステビオサイドの含有量が低く、構造が異なる多くのステビオサイドが存在するため、純粋な製品を抽出することは非常に困難である。本発明に提供される酵素法を使用した方法を採用することにより、ステビア・レバウディアナの葉からレバウディオサイドＣを抽出する既存の方法と比較して、高純度の生成物を抽出することができる。従って、製品は、飲料などの食品産業においてより経済的に適用され得る。更に、レバウディオサイドＣの適用範囲は更に拡大される。

ルブソシド、ズルコシドＡ及びレバウディオサイドＣの構造式については、それぞれ式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩを参照する。

本発明は、レバウディオサイドＣを合成するための２つの経路を提供する。

本発明で使用されるＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂは、凍結乾燥酵素粉末の形態で、又は組換え細胞中に存在し得る。

ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを得る方法は、以下のとおりである。

ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂの組換え大腸菌（又はその微生物）発現株は、分子クローニング技術及び遺伝子工学技術を利用することによって得られ、次いで、組換え大腸菌を発酵させて、ＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂ、又は組換え細胞により調製されたＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を含有する組換え細胞を得る。

本明細書に記載される分子クローニング技術及び遺伝子工学技術は、別途記載のない限り既知のものである。分子クローニング技術については、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ）（ｂｙＳａｍｂｒｏｏｋ，２００５）を参照する。

遺伝子工学技術を採用することによって構築される本明細書の組換え株の発現工程は、以下のとおりである。
（１）（配列表に示される配列１及び２によるか、又は配列３及び４に従って）、必要な遺伝子断片を遺伝子合成し、ベクターｐＵＣ５７に連結し、両端に制限酵素消化部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを添加する。
（２）各遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ３０ａの対応する制限酵素消化部位に二重酵素消化及び連結により挿入し、各遺伝子をプロモーターＴ７の制御下に配置する。
（３）組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、標的タンパク質の発現を、ＩＰＴＧを使用して誘導し、ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂの組換え大腸菌発現株を得る。

ＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂ、又はＵＧＴ−Ａ若しくはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を含有する組換え細胞は、ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を利用することによって調製される。

ＵＧＴ−Ａ又はＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現株を、１％の割合によって４ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩振盪培養を実施し、一晩静置した培養物を、１％の接種量に従って５０ｍｌの液体ＬＢ培養培地に移し、３７℃（２００ｒｐｍ）でＯＤ６００値が０．６〜０．８に達するまで浸透培養を実施し、０．４ｍＭの最終濃度のＭＩＰＴＧを添加し振盪培養を２０℃で一晩行う。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの／２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して組換え細胞を得、細胞を氷浴中で更に超音波的に破壊し、破壊液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得る。

本発明は、特定の実施例と共により詳細に以下に記載される。

実施例１：ＵＧＴ−Ａを含有する組換え出芽酵母細胞の調製
配列表に示される配列１及び２に従って、ＵＧＴ−Ａを含有する遺伝子断片を遺伝子合成し、両端に制限酵素消化部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを加え、ベクターｐＵＣ５７（ＳＵＺＨＯＵＧＥＮＥＷＩＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＣＯ．，ＬＴＤ．により製造）に連結した。ＵＧＴ遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、精製断片を回収し、Ｔ４リガーゼを加えて断片を対応する制限酵素消化部位ｐＥＴ３０ａに連結し、それをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。

１％の振盪培養比に従って４ｍｌの液体ＬＢ培地にＵＧＴ株を接種し、振盪培養を３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩実施し、一晩静置した培養物を、接種量１％に従って液体ＬＢ培地５０ｍｌに移し、ＯＤ_６００値が０．６〜０．８，に達するまで３７℃（２００ｒｐｍ）で振盪培養を行い、最終濃度０．４ｍＭのＭＩＰＴＧを添加し、振盪培養を２０℃で一晩行った。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、触媒作用のＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を得た。

実施例２：ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末の調製
実施例１で調製したＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞を氷浴中で超音波破壊し、破壊液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を得た。

実施例３：ＵＧＴ−Ｂを含有する組換え出芽酵母細胞の調製
配列３及び４に従って、ＵＧＴ−Ｂを含有する遺伝子断片を遺伝子合成し、両端に制限酵素消化部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを加え、ベクターｐＵＣ５７（ＳＵＺＨＯＵＧＥＮＥＷＩＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＣＯ．，ＬＴＤ．により製造）に連結させた。ＵＧＴ遺伝子断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、精製断片を回収し、Ｔ４リガーゼを加えて断片を対応する制限酵素消化部位ｐＥＴ３０ａに連結し、それをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。

１％の比に従って４ｍｌの液体ＬＢ培地にＵＧＴ株を接種し、３７℃（２００ｒｐｍ）で一晩振盪培養し、一晩静置した培養物を、１％の接種量に従って、５０ｍｌの液体ＬＢ培養培地に移し、ＯＤ_６００値が０．６〜０．８に達するまで３７℃（２００ｒｐｍ）で振盪培養を行い、最終濃度０．４ｍＭのＭＩＰＴＧを添加し、振盪培養を２０℃で一晩行った。誘導後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、細胞を５ｍｌの２ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、触媒作用のＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を得た。

実施例４：凍結乾燥ＵＧＴ−Ｂ粉末の調製
実施例３で調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を氷浴中で超音波破壊し、破壊液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。

実施例５：基質としてズルコシドＡを使用することによるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒下でのレバウディオサイドＣの合成（経路１）
この実施例では、実施例２の方法に従って調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末を使用して、レバウディオサイドＣの合成を触媒した。この実施例では、スクロース、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）から得たスクロース合成酵素（以下、ＡｔＳＵＳ１と称する）及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムをグルコシルドナーとして使用した。

反応系では、１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰ、及び８ｇのズルコシドＡ、５０ｇのスクロース、１０ｇのＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末、及び３ｇのＡｔＳＵＳ１凍結乾燥粉末を連続的に添加し、均一に混合した後、４０℃の水浴中に混合物を１６時間入れ、反応のために３００ｒｐｍで撹拌した。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、等量の無水メタノールと均一に混合し、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間行い、上清をフィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を行った（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＳＢ−Ｃ１８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ズルコシドＡの変換率は９０％超であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．６ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

実施例６：基質としてルブソシドを使用することによる、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒下でのレバウディオサイドＣの合成（経路２）
この実施例では、実施例２の方法に従って調製されたＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末及び実施例４の方法に従って調製されたＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を使用してレバウディオサイドＣの合成を触媒した。

第１工程反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、４．５ｇのＵＤＰラムノース、６．５ｇのルブソシド、及び１０ｇのＵＧＴ−Ｂ凍結乾燥粉末を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。第２工程反応：第１工程反応後、反応溶液を１０分間沸騰させ、ｐＨ値を８．０に調節し、２ｇのＵＤＰ、５０ｇのスクロース、１０ｇのＵＧＴ−Ａ凍結乾燥粉末、及び３ｇのＡｔＳＵＳ１凍結乾燥粉末を添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、等量の無水メタノールと均一に混合し、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間行った。上清を、フィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を行った（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＣｌ８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ルブソシドの変換率は９０％超であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．２ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

実施例７：基質としてズルコシドＡを使用することによるＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒下でのレバウディオサイドＣの合成
この実施例では、実施例１の方法に従って調製したＵＧＴ−Ａを含む組換え細胞を使用して、レバウディオサイドＣの合成を触媒した。

１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰ、５０ｇのズルコシドＡ、５０ｇのスクロース、２００ｍｌのトルエン、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１２ｇのＡｔＳＵＳｌ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌して１６時間反応させた。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、遠心分離し、上清を加え、等体積の無水メタノールと均一に混合し、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間実施し、上清を、フィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を実施した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＳＢ−Ｃ１８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ズルコシドの変換率は９０％超であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．５ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

実施例８：基質としてルブソシドを使用することによる、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞の触媒下でのレバウディオサイドＣの合成
第１工程反応：１Ｌの０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、４．５ｇのＵＤＰラムノース、６．５ｇのルブソシド、２０ｍｌのトルエン、及び４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。第２工程反応：第１工程反応後、反応溶液を１０分間沸騰させ、ｐＨ値を８．０に調節し、２ｇのＵＤＰ、５０ｇのスクロース、４０ｇのＵＧＴ−Ａ全細胞、及び１２ｇのＡｔＳＵＳ１全細胞を添加し、均一に混合し、次いで４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌を行って１６時間反応させた。反応後、５００μｌの反応溶液を採取し、遠心分離し、上清を加え、等しい体積の無水メタノールと均一に混合し、８，０００ｒｐｍでの遠心分離を１０分間実施し、上清を、フィルター膜を通過させた後、高速液体クロマトグラフィーを使用することによって検出を実施した（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：ＡｇｌｉｅｎｔｅｃｌｉｐｓｅＳＢ−Ｃ１８４．６^＊１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：０．１％ギ酸水溶液：アセトニトリル＝６５％：３５％；流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）。ルブソシドの変換率は９０％超であった。シリカゲル樹脂による分離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、５．０ｇのレバウディオサイドＣを得、純度は９０％超であった。

上述の実施例は、単に、本発明の技術的概念及び特徴の説明のためのものである。目的は、当業者が本発明を理解し、それを適宜実施することを可能にするだけであり、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の趣旨及び本質に従ってなされるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。

Claims

酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、前記方法では、ズルコシドＣが基質として使用され、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の触媒作用下での反応によって産生される、方法。
酵素法を使用してレバウディオサイドＣを調製するための方法であって、前記方法において、ルブソシドが基質として使用され、グリコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＣは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はそれから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の触媒作用下での反応によって産生される、方法。
前記グリコシルドナーが、グルコシルドナー及びラムノシルドナーのうちの１つ又は２つを含み、前記グルコシルドナーは、ＵＤＰ−グルコース又はスクロース、スクロース合成酵素、及びＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生システムであり、前記ラムノシルドナーはＵＤＰ−ラムノースである、請求項１又は２に記載の方法。
前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）からのＵＧＴ−Ａ及びオライザ・サティバ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂのうちの１つ又は２つを含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致する、請求項１に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致する、請求項５に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致する、請求項６に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致する、請求項７に記載の方法。
前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びはオライザ・サティバ由来のＵＧＴ−Ｂであり、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、２工程で前記反応系に添加し、前記ＵＧＴ−Ｂをまず第１工程で添加し、次いで、前記ＵＧＴ−Ａを第２工程で添加する、請求項２に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも６０％一致する、請求項９に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも７０％一致する、請求項１０に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも８０％一致する、請求項１１に記載の方法。
前記ＵＧＴ−Ａの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致し、及び／又は前記ＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、前記配列表に示される配列４と少なくとも９０％一致する、請求項１２に記載の方法。
前記反応が、水性系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ７．５〜８．５で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
前記反応がリン酸緩衝溶液中で実施される、請求項１４に記載の方法。
記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ及び細胞透過性剤を含有する組換え細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
前記細胞透過性剤がトルエンであり、前記反応系中のトルエンの体積比濃度が１〜３％である、請求項１６に記載の方法。
前記反応に使用される全ての原材料が、反応ケトルに添加されて均一に混合され、次いで、撹拌しながら反応のための設定温度に置かれる、請求項１４に記載の方法。
前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
前記微生物が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、請求項１８に記載の方法。