RU2736155C1 - Способ получения ребаудиозида c с применением ферментативного способа - Google Patents
Способ получения ребаудиозида c с применением ферментативного способа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2736155C1 RU2736155C1 RU2019113355A RU2019113355A RU2736155C1 RU 2736155 C1 RU2736155 C1 RU 2736155C1 RU 2019113355 A RU2019113355 A RU 2019113355A RU 2019113355 A RU2019113355 A RU 2019113355A RU 2736155 C1 RU2736155 C1 RU 2736155C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ugt
- udp
- reaction
- rebaudioside
- recombinant cells
- Prior art date
Links
- QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N rebaudioside c Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]1(CC[C@H]2[C@@]3(C)[C@@H]([C@](CCC3)(C)C(=O)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC3)C(=C)C[C@]23C1 QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- 239000001776 FEMA 4720 Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 13
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- CANAPGLEBDTCAF-NTIPNFSCSA-N Dulcoside A Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@]23C(C[C@]4(C2)[C@H]([C@@]2(C)[C@@H]([C@](CCC2)(C)C(=O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)CC4)CC3)=C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O CANAPGLEBDTCAF-NTIPNFSCSA-N 0.000 claims abstract description 11
- CANAPGLEBDTCAF-QHSHOEHESA-N Dulcoside A Natural products C[C@@H]1O[C@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]2O[C@]34CC[C@H]5[C@]6(C)CCC[C@](C)([C@H]6CC[C@@]5(CC3=C)C4)C(=O)O[C@@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]7O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O CANAPGLEBDTCAF-QHSHOEHESA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000000386 donor Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 50
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Natural products CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 claims description 15
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 claims description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 claims description 9
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical group P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 5
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N UDP-beta-L-rhamnose Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 DRDCJEIZVLVWNC-SLBWPEPYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 10
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 9
- YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N Rubusoside Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YWPVROCHNBYFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000630755 Arabidopsis thaliana Sucrose synthase 1 Proteins 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 101710204244 Processive diacylglycerol beta-glucosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 235000021096 natural sweeteners Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186291 Dulcoside Natural products 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 description 1
- 239000008122 artificial sweetener Substances 0.000 description 1
- 235000021311 artificial sweeteners Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N entered according to Sigma 01432 Natural products C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(=O)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HELXLJCILKEWJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229930188195 rebaudioside Natural products 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 description 1
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения ребаудиозида C с применением ферментативного способа, включающий использование рубузозида или дулькозида А в качестве субстрата и получение продукта в присутствии донора гликозила и/или донора рамнозила, реакцию в условиях катализа с применением содержащих UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантных клеток и/или полученной из них UDP-гликозилтрансферазы. Изобретение позволяет получить ребаудиозид C высокой чистоты с меньшими затратами и более коротким циклом производства. 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения ребаудиозида С и, в частности, относится к биологическому способу получения ребаудиозида С.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Подсластители представляют собой класс пищевых добавок, которые широко применяют в производстве продуктов питания, таких как напитки и кондитерские изделия. Их можно добавлять в процессе производства продуктов питания или, в альтернативном варианте осуществления, можно использовать при соответствующем разбавлении в качестве заменителя сахарозы в домашней выпечке. Подсластители включают натуральные подсластители, например сахарозу, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, мед и т.п., и искусственные подсластители, например, аспартам, сахарин и т.п. Стевиозиды представляют собой класс натуральных подсластителей, экстрагируемых из растения Stevia rebaudiana, и в настоящее время их широко используют в продуктах питания и напитках. Экстракт Stevia rebaudiana содержит разнообразные стевиозиды, включая ребаудиозид. Экстрагируемые естественным путем стевиозиды имеют существенные различия по составу между разными партиями и требуют последующей очистки.
В обычном способе получения ребаудиозида С ребаудиозид С экстрагируют из листьев Stevia rebaudiana. Например, как описано в патенте США US 8,501,261, приблизительно 111 г продукта с чистотой 87,6% можно получить путем экстракции из 10 кг листьев Stevia rebaudiana. Поскольку процентная доля ребаудиозида С в листьях Stevia rebaudiana относительно низка (приблизительно 10% от общей массы вещества в сухом состоянии), стоимость традиционного производства ребаудиозида С относительно выше, чем стоимость производства ребаудиозида А (приблизительно 60% от общей массы вещества в сухом состоянии). Кроме того, из-за ограниченного выхода коммерческое применение ребаудиозида С затруднительно.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача, которую предстоит решить с помощью настоящего изобретения, состоит в устранении недостатков предшествующего уровня техники. В настоящем изобретении это достигается путем разработки способа получения ребаудиозида С с применением ферментативного способа. При таком способе продукт ребаудиозид С высокой чистоты может быть получен с меньшими затратами и более коротким циклом производства.
Для решения описанной выше технической задачи в настоящем изобретении использовано следующее техническое решение.
Способ получения ребаудиозида С с применением ферментативного способа. В этом способе в качестве субстрата используют дулькозид С; и ребаудиозид С получают в присутствии донора гликозила посредством реакции в условиях катализа с применением содержащих UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантных клеток и/или полученной из них UDP-гликозилтрансферазы.
Способ получения ребаудиозида С с применением ферментативного способа. В этом способе в качестве субстрата используют рубузозид; и ребаудиозид С получают в присутствии донора гликозила посредством реакции в условиях катализа с применением содержащих UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантных клеток и/или полученной из них UDP-гликозилтрансферазы.
Донор гликозила предпочтительно включает один или два из донора глюкозила и донора рамнозила, причем донор глюкозила представляет собой UDP-глюкозу или систему регенерации UDP-глюкозы (2007, FEBS Letters, 581, 2562-2566), состоящую из сахарозы, синтазы сахарозы и UDP, а донор рамнозила представляет собой UDP-рамнозу. В настоящем документе предпочтительной является система регенерации UDP-глюкозы, состоящая из сахарозы, синтазы сахарозы и UDP. UDP-глюкоза стоит дорого. Эту стоимость можно значительно снизить за счет использования системы регенерации UDP-глюкозы.
Предпочтительно UDP-глюкозилтрансфераза (т.е. уридиндифосфатглюкозилтрансфераза, сокращенно UGT, которая известна в технике) включает один или два из UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-В из Oryza sativa.
Предпочтительно UDP-глюкозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana, а аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 60% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 70% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-B из Oryza sativa по меньшей мере на 90% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей.
В соответствии с одним конкретным аспектом аминокислотная последовательность UGT-A полностью соответствует последовательности 2 в перечне последовательностей.
Предпочтительно UDP-глюкозилтрансфераза включает UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa; UDP-гликозилтрансферазу добавляют в реакционную систему в две стадии: сначала на первой стадии добавляют UGT-B, а затем на второй стадии добавляют UGT-A.
Аминокислотная последовательность UGT-A предпочтительно по меньшей мере на 60% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B по меньшей мере на 60% соответствует последовательности 4, как показано в перечне последовательностей.
Более предпочтительно аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 70% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B по меньшей мере на 70% соответствует последовательности 4, как показано в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 4, как показано в перечне последовательностей.
Кроме того, аминокислотная последовательность UGT-A по меньшей мере на 90% соответствует последовательности 2, как показано в перечне последовательностей; и/или аминокислотная последовательность UGT-B по меньшей мере на 90% соответствует последовательности 4, как показано в перечне последовательностей.
В соответствии с настоящим изобретением реакцию можно проводить в водной системе при температуре 4-50°С и при рН 5,0-9,0. Предпочтительно реакцию проводят в водной системе при температуре 34-45°С и при рН 7,5-8,5.
Более предпочтительно реакцию проводят в фосфатном буферном растворе.
Более предпочтительно реакционная система включает рекомбинантные клетки, содержащие UDP-гликозилтрансферазу и агент, проникающий в клетку. Кроме того, агент, проникающий в клетку, представляет собой толуол и объемная концентрация толуола в реакционной системе составляет 1-3%.
Более предпочтительно все исходные материалы, используемые для реакции, добавляют в реактор для однородного смешивания и затем доводят температуру до заданного значения и проводят реакцию при перемешивании. После завершения реакции продукт ребаудиозид С можно получить путем очистки. Конкретный способ очистки представляет собой последующую обработку, включая разделение на смолах. В соответствии с данным способом очистки можно получить продукт ребаудиозид С с чистотой до 95%.
Рекомбинантные клетки предпочтительно представляют собой клетки микроорганизма. Более предпочтительно микроорганизм представляет собой Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris.
В соответствии с одним конкретным аспектом настоящего изобретения на первой стадии реакции субстрат представляет собой рубузозид, UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-B из Oryza sativa, а последовательность аминокислот из UGT-B из Oryza sativa по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 4. На второй стадии реакции субстрат представляет собой реакционный раствор, содержащий продукт дулькозид А, полученный на первой стадии реакции, UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana, а последовательность аминокислот UGT-А из Stevia rebaudiana по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 2.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения субстрат представляет собой дулькозид А, UDP-гликозилтрансфераза представляет собой UGT-A из Stevia rebaudiana, а последовательность аминокислот UGT-A из Stevia rebaudiana по меньшей мере на 80% соответствует последовательности 2.
В сравнении с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение в результате применения вышеописанного технического решения обладает следующими преимуществами.
Предложенный в настоящем изобретении способ получения ребаудиозида С с применением ферментативного способа имеет важное прикладное значение. Поскольку скорость роста микроорганизмов значительно выше, чем скорость роста растений, путем применения предложенного в настоящем изобретении способа можно значительно снизить производственные затраты, сократить производственный цикл и значительно улучшить конкурентоспособность продукта. Кроме того, поскольку содержание стевиозидов в растениях невелико и существует много стевиозидов с различными структурами, экстрагировать чистые продукты очень сложно. По сравнению с существующими способами экстракции ребаудиозида С из листьев Stevia rebaudiana путем применения способа с использованием предложенного в настоящем изобретении ферментативного способа можно обеспечить продукты более высокой чистоты. Таким образом, продукты могут быть более экономично использованы в пищевой промышленности, например в производстве напитков. Кроме того, объем применения ребаудиозида С будет дополнительно расширен.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Структурные формулы рубузозида, дулькозида А и ребаудиозида С соответственно представлены формулами I, II и III.
В настоящем изобретении в основном предложены два пути синтеза ребаудиозида С.
Первый путь:
Второй путь:
UGT-A или UGT-B, применяемые в настоящем изобретении, могут существовать в форме порошка лиофилизированного фермента или в рекомбинантных клетках.
Способ получения UGT-A или UGT-B описан ниже.
Рекомбинантный штамм Escherichia coli (или другой микроорганизм) для экспрессии UGT-A или UGT-B получают с использованием методов молекулярного клонирования и генной инженерии; затем рекомбинантную Escherichia coli ферментируют для получения рекомбинантных клеток, содержащих UGT-A или UGT-B, или получают лиофилизированный порошок UGT-A или UGT-B из рекомбинантных клеток.
Метод молекулярного клонирования и метод генной инженерии, описанные в настоящем документе, являются известными, если не указано иное. Метод молекулярного клонирования см. в руководстве Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition) (J. Sambrook, 2005).
Стадии экспрессии описанного в настоящем документе рекомбинантного штамма, сконструированного методом генной инженерии, описаны ниже.
(1) (В соответствии с последовательностями 1 и 2, как показано в перечне последовательностей, или в соответствии с последовательностями 3 и 4) необходимые фрагменты генов генетически синтезируют, соединяют с вектором pUC57 и присоединяют сайты расщепления рестрикционных ферментов NdeI и BamHI с обоих концов;
(2) Каждый фрагмент гена встраивают в сайт соответствующего рестрикционного фермента экспрессионного вектора рЕТ30а посредством двойного ферментативного расщепления и соединения так, чтобы каждый ген помещался под контроль промотора Т7;
(3) Рекомбинантные плазмиды трансформируют в Escherichia coli BL21 (DE3) и индуцируют экспрессию целевого белка с помощью ИПТГ для получения рекомбинантного штамма Escherichia coli для экспрессии UGT-A или UGT-B.
Рекомбинантные клетки, содержащие UGT-A или UGT-B, или лиофилизированный порошок UGT-A или UGT-B получают с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli для экспрессии, содержащего UGT-A или UGT-B.
Рекомбинантный штамм Escherichia coli для экспрессии, содержащий UGT-A или UGT-B, инокулируют в 4 мл жидкой культуральной среды Лурия - Бертани (LB) в соответствии с долей 1%, проводят культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) в течение одной ночи, выдержанную в течение одной ночи культуру переносят в 50 мл жидкой культуральной среды LB в соответствии с количеством инокулята 1%, проводят культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) до достижения значения OD600 0,6-0,8, добавляют ИПТГ в конечной концентрации 0,4 ммоль/л и проводят культивирование при встряхивании при 20°С в течение одной ночи. После индукции клетки собирают центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин), клетки ресуспендируют в 5 мл фосфатного буферного раствора 2 ммоль/л (рН 7,0) для выделения рекомбинантных клеток, клетки дополнительно разрушают ультразвуком на ледяной бане, жидкость, содержащую разрушенные клетки, центрифугируют (8000 об/мин, 10 мин), и супернатант собирают и лиофилизируют в течение 24 ч с выделением лиофилизированного порошка.
Настоящее изобретение будет дополнительно подробно описано ниже на конкретных примерах.
Пример 1. Получение рекомбинантных клеток Escherichia coli. содержащих UGT-A
В соответствии с последовательностями 1 и 2, как показано в перечне последовательностей, генные фрагменты, содержащие UGT-A, генетически синтезировали, присоединяли сайты рестрикционных ферментов NdeI и BamHI с обоих концов и соединяли с вектором pUC57 (производства компании SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO., LTD). Генные фрагменты UGT расщепляли с применением рестрикционных ферментов NdeI и BamHI, очищенные фрагменты восстанавливали и добавляли лигазу Т4 для соединения фрагментов с сайтами соответствующих рестрикционных ферментов рЕТ30а с целью ее трансформации в штамм BL21 (DE3).
Содержащий UGT штамм инокулировали в 4 мл жидкой культуральной среды LB в соответствии с долей 1%, проводили культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) в течение одной ночи, выдержанную в течение одной ночи культуру переносили в 50 мл жидкой культуральной среды LB в соответствии с количеством инокулята 1%, проводили культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) до достижения значения OD600 0,6-0,8, добавляли ИПТГ в конечной концентрации 0,4 ммоль/л и проводили культивирование при встряхивании при 20°С в течение одной ночи. После индукции клетки собирали центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин), и клетки ресуспендировали в 5 мл фосфатного буферного раствора 2 ммоль/л (рН 7,0) для выделения содержащих UGT-A рекомбинантных клеток для катализа.
Пример 2. Получение лиофилизированного порошка UGT-A
Содержащие UGT-A рекомбинантные клетки, полученные в примере 1, подвергали ультразвуковой обработке на ледяной бане, содержащую разрушенные клетки жидкость центрифугировали (8000 об/мин, 10 мин), и супернатант собирали и лиофилизировали в течение 24 ч с выделением лиофилизированного порошка UGT-A.
Пример 3. Получение рекомбинантных клеток Escherichia coli, содержащих UGT-B
В соответствии с последовательностями 3 и 4 генные фрагменты, содержащие UGT-В, генетически синтезировали, присоединяли сайты расщепления рестрикционных ферментов NdeI и BamHI с обоих концов и соединяли с вектором pUC57 (производства компании SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO., LTD). Генные фрагменты UGT расщепляли с применением рестрикционных ферментов NdeI и BamHI, очищенные фрагменты восстанавливали и добавляли лигазу Т4 для соединения фрагментов с сайтами соответствующих рестрикционных ферментов рЕТ30а с целью ее трансформации в штамм BL21 (DE3).
Штамм UGT, инокулировали в 4 мл жидкой культуральной среды Лурия-Бертани (LB) в соответствии с долей 1%, проводили культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) в течение одной ночи, выдержанную в течение одной ночи культуру переносили в 50 мл жидкой культуральной среды LB в соответствии с количеством инокулята 1%, проводили культивирование при встряхивании при 37°С (200 об/мин) до достижения значения OD600 0,6-0,8, добавляли ИПТГ в конечной концентрации 0,4 ммоль/л и проводили культивирование при встряхивании при 20°С в течение одной ночи. После индукции клетки собирали центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин), и клетки ресуспендировали в 5 мл фосфатного буферного раствора 2 ммоль/л (рН 7,0) для выделения содержащих UGT-B рекомбинантных клеток для катализа.
Пример 4. Получение лиофилизированного порошка из UGT-B
Содержащие UGT-B рекомбинантные клетки, полученные в примере 3, подвергали ультразвуковой обработке на ледяной бане, содержащую разрушенные клетки жидкость центрифугировали (8000 об/мин, 10 мин), и супернатант собирали и лиофилизировали в течение 24 ч с выделением лиофилизированного порошка UGT-B.
Пример 5. Синтез ребаудиозида С в условиях катализа UDP-гликозилтрансферазой с использованием дулькозида А в качестве субстрата (путь 1)
В данном примере для катализа синтеза ребаудиозида С использовали лиофилизированный порошок UGT-A, полученный в соответствии со способом, описанным в примере 2. В этом примере в качестве донора глюкозила использовали систему регенерации UDP-глюкозы, состоящую из сахарозы, синтазы сахарозы из Arabidopsis thaliana (далее именуемой AtSUS1) и UDP.
В реакционную систему последовательно добавляли 1 л фосфатного буферного раствора 0,05 моль/л (рН 8,0), 2 г UDP и 8 г дулькозида А, 50 г сахарозы, 10 г лиофилизированного порошка UGT-A и 3 г лиофилизированного порошка AtSUS1 и смешивали до однородного состояния, после чего смесь помещали на водяную баню при 40°С на 16 ч и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин. После проведения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и смешивали до однородного состояния с безводным метанолом равного объема, проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 мин, пропускали супернатант через фильтрующую мембрану, после чего проводили детектирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Aglient eclipse SB-C18 4,6*150 мм; длина волны детектирования: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65% : 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; температура колонки: 30°С). Степень конверсии дулькозида А составила более 90%. После очистки супернатанта последующей обработкой, такой как разделение на силикагелевой смоле и кристаллизация, получили 5,6 г ребаудиозида С с чистотой более 90%.
Пример 6. Синтез ребаудиозида С в условиях катализа UDP-гликозилтрансферазой с использованием рубузозида в качестве субстрата (путь 2)
В данном примере для катализа синтеза ребаудиозида С использовали лиофилизированный порошок UGT-A, полученный в соответствии со способом, описанным в примере 2, и лиофилизированный порошок UGT-B, полученный в соответствии со способом, описанным в примере 4.
Первая стадия реакции: 1 л фосфатного буферного раствора 0,05 моль/л (рН 8,0), 4,5 г UDP-рамнозы, 6,5 г рубузозида и 10 г лиофилизированного порошка UGT-B последовательно добавляли в реакционную систему, смешивали до однородного состояния, а затем помещали на водяную баню при 40°С и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин в течение 16 ч. Вторая стадия реакции: после первой стадии реакции реакционный раствор кипятили в течение 10 мин, доводили рН до 8,0, добавляли 2 г UDP, 50 г сахарозы, 10 г лиофилизированного порошка UGT-A и 3 г лиофилизированного порошка AtSUS1, смешивали до однородного состояния, а затем помещали на водяную баню при 40°С и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин в течение 16 ч. После проведения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и смешивали до однородного состояния с безводным метанолом равного объема, проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 мин, пропускали супернатант через фильтрующую мембрану, после чего проводили детектирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Aglient eclipse Cl8 4,6×150 мм; длина волны детектирования: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65%: 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; температура колонки: 30°С). Степень конверсии рубузозида составила более 90%. После очистки супернатанта последующей обработкой, такой как разделение на силикагелевой смоле и кристаллизация, получили 5,2 г ребаудиозида С с чистотой более 90%.
Пример 7. Синтез ребаудиозида С в условиях катализа рекомбинантными клетками, содержащими UDP-гликозилтрансферазу, с использованием дулькозида А в качестве субстрата
В данном примере для катализа синтеза ребаудиозида С использовали содержащие UGT-A рекомбинантные клетки, полученные в соответствии со способом примера 1.
1 л фосфатного буферного раствора 0,05 моль/л (рН 8,0), 2 г UDP, 8 г дулькозида А, 50 г сахарозы, 20 мл толуола, 40 г цельных клеток UGT-A и 12 г цельных клеток AtSUS1 последовательно добавляли в реакционную систему, смешивали до однородного состояния, а затем помещали на водяную баню при 40°С и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин в течение 16 ч. После проведения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и центрифугировали, добавляли супернатант и смешивали до однородного состояния с безводным метанолом равного объема, проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 мин, пропускали супернатант через мембрану фильтра, после чего проводили детектирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Aglient eclipse SB-C18 4,6×150 мм; длина волны детектирования: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65%: 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; температура колонки: 30°С). Степень конверсии дулькозида А составила более 90%. После очистки супернатанта последующей обработкой, такой как разделение на силикагелевой смоле и кристаллизация, получили 5,5 г ребаудиозида С с чистотой более 90%.
Пример 8. Синтез ребаудиозида С в условиях катализа содержащими UDP-гликозилтрансферазу рекомбинантными клетками с использованием рубузозида в качестве субстрата
Первая стадия реакции: 1 л фосфатного буферного раствора 0,05 моль/л (рН 8,0), 4,5 г UDP-рамнозы, 6,5 г рубузозида, 20 мл толуола и 40 г цельных клеток UGT-A последовательно добавляли в реакционную систему, смешивали до однородного состояния, а затем помещали на водяную баню при 40°С и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин в течение 16 ч. Вторая стадия реакции: после первой стадии реакции реакционный раствор кипятили в течение 10 мин, доводили рН до 8,0, добавляли 2 г UDP, 50 г сахарозы, 40 г цельных клеток UGT-A и 12 г цельных клеток AtSUS1, смешивали до однородного состояния, а затем помещали на водяную баню при 40°С и проводили реакцию при перемешивании с частотой 300 об/мин в течение 16 ч. После проведения реакции отбирали 500 мкл реакционного раствора и центрифугировали, добавляли супернатант и смешивали до однородного состояния с безводным метанолом равного объема, проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 мин, пропускали супернатант через мембрану фильтра, после чего проводили детектирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия хроматографирования: хроматографическая колонка: Aglient eclipse SB-C18 4,6×150 мм; длина волны детектирования: 210 нм; подвижная фаза: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты : ацетонитрил = 65%: 35%; объемный расход: 1,0 мл/мин; температура колонки: 30°С). Степень конверсии рубузозида составила более 90%. После очистки супернатанта последующей обработкой, такой как разделение на силикагелевой смоле и кристаллизация, получили 5,0 г ребаудиозида С с чистотой более 90%.
Описанные выше примеры приведены только для иллюстрации технической концепции и признаков настоящего изобретения. Их цель состоит только в том, чтобы дать возможность специалистам в данной области понять суть настоящего изобретения и реализовать его соответствующим образом, эти примеры не ограничивают объем настоящего изобретения; любые эквивалентные вариации или модификации, производные от сущности настоящего изобретения, входят в объем защиты настоящего изобретения.
Claims (12)
1. Способ получения ребаудиозида C, включающий:
а) реакцию дулькозида А с донором гликозила в реакционной системе в присутствии i) рекомбинантных клеток, содержащих UDP-гликозилтрансферазу; или ii) UDP-гликозилтрансферазу, приготовленную из рекомбинантных клеток, при этом UDP-гликозилтрансфераза в i) или ii) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или
b) реакцию рубузозида с донором гликозила и донором рамнозила в реакционной системе в присутствии i) рекомбинантных клеток, содержащих UDP-гликозилтрансферазу; или ii) UDP-гликозилтрансферазу, приготовленную из рекомбинантных клеток, при этом UDP-гликозилтрансфераза в i) или ii) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и при этом реакционная система дополнительно содержит UDP-гликозилтрансферазу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и при этом донор гликозила в a) и b) представляет собой UDP-глюкозу или систему регенерации UDP-глюкозы.
2. Способ по п. 1, в котором система регенерации UDP-глюкозы содержит сахарозу, синтазу сахарозы и UDP и при этом донор рамнозила представляет собой UDP-рамнозу.
3. Способ по п. 1, в котором UDP-гликозилтрансфераза содержит один из или оба UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa.
4. Способ по п. 1, в котором UDP-гликозилтрансфераза включает UGT-A из Stevia rebaudiana и UGT-B из Oryza sativa; и при этом UGT-B добавляют на первой стадии, а UGT-A добавляют на второй стадии.
5. Способ по п. 1, в котором реакционная система содержит водную фазу системы с температурой 35–45 °C и pH 7,5–8,5.
6. Способ по п. 5, в котором водная фаза системы представляет собой фосфатный буферной раствор.
7. Способ по п. 5, в котором реакционная система дополнительно содержит агент, проникающий в клетку.
8. Способ по п. 7, в котором агент, проникающий в клетку, представляет собой толуол и при этом объемная концентрация толуола составляет 1–3%.
9. Способ по п. 1, в котором рекомбинантные клетки представляют собой клетки микроорганизма.
10. Способ по п. 9, в котором клетки микроорганизма представляют собой Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2016/102910 WO2018072203A1 (zh) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙c的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2736155C1 true RU2736155C1 (ru) | 2020-11-12 |
Family
ID=62018093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019113355A RU2736155C1 (ru) | 2016-10-21 | 2016-10-21 | Способ получения ребаудиозида c с применением ферментативного способа |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11312985B2 (ru) |
| EP (1) | EP3530746A4 (ru) |
| JP (1) | JP2019532650A (ru) |
| CN (2) | CN117051063A (ru) |
| AU (1) | AU2016427120B2 (ru) |
| CA (1) | CA3041150A1 (ru) |
| MX (1) | MX2019004629A (ru) |
| RU (1) | RU2736155C1 (ru) |
| WO (1) | WO2018072203A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112019007882A2 (pt) | 2016-10-21 | 2019-07-02 | Pepsico Inc | método para preparar rebaudiosídeo j com o uso de método enzimático |
| CN109890973B (zh) | 2016-10-21 | 2023-05-23 | 百事可乐公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙n的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011153378A1 (en) * | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Abunda Nutrition, Inc. | Recombinant Production of Steviol Glycosides |
| WO2013022989A2 (en) * | 2011-08-08 | 2013-02-14 | Evolva Sa | Recombinant production of steviol glycosides |
| WO2014086890A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Evolva Sa | Steviol glycoside compositions sensory properties |
| US20140357588A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
| US9243273B2 (en) * | 2012-05-22 | 2016-01-26 | Purecircle Sdn Bhd | Method for making rebaudioside X |
| RU2596190C2 (ru) * | 2009-10-15 | 2016-08-27 | ПЬЮСЁРКЛ ЭсДиЭн БиЭйчДи | Ребаудиозид d высокой степени чистоты и его применение |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2918593A1 (en) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Cargill, Incorporated | Method of producing purified rebaudioside a compositions using solvent/antisolvent crystallization |
| CN101225424B (zh) | 2007-09-13 | 2013-05-29 | 天津药物研究院 | 环黄芪醇的单葡萄糖苷、其制备方法、药物组合物和应用 |
| KR20200000478A (ko) | 2008-10-03 | 2020-01-02 | 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 | 신규 스테비올 배당체 |
| US8501261B2 (en) | 2010-05-21 | 2013-08-06 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity Rebaudioside C and process for purification of the same |
| AU2015261617C1 (en) | 2010-06-02 | 2019-01-31 | Minnesota Specialty Yeast Llc | Recombinant production of steviol glycosides |
| US8962698B2 (en) | 2011-01-28 | 2015-02-24 | Tate & Lyle Ingredients Americas Llc | Rebaudioside-mogroside V blends |
| CN103031283B (zh) | 2011-10-08 | 2015-07-08 | 成都华高瑞甜科技有限公司 | 甜叶菊酶vi及莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的方法 |
| DK3009010T3 (da) | 2011-12-19 | 2020-05-11 | Purecircle Sdn Bhd | Fremgangsmåder til oprensning af steviolglycosider |
| CA2862980A1 (en) | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Dsm Ip Assets B.V. | Diterpene production |
| CN103088041B (zh) | 2013-01-29 | 2015-01-07 | 江南大学 | 一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用 |
| US9957540B2 (en) | 2013-02-06 | 2018-05-01 | Evolva Sa | Methods for improved production of Rebaudioside D and Rebaudioside M |
| CN103397064B (zh) | 2013-08-14 | 2015-04-15 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| SG2013092820A (en) | 2013-12-16 | 2015-07-30 | Ngee Ann Polytechnic | Xylose isomerase genes for xylose-fermenting yeast construction |
| CN103757074B (zh) * | 2014-01-16 | 2015-12-02 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| CN106471128A (zh) | 2014-01-28 | 2017-03-01 | 百事可乐公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| US20170275666A1 (en) | 2014-08-19 | 2017-09-28 | The Coca-Cola Company | Methods for Preparing Rebaudioside I and Uses |
| BR112017025705B1 (pt) | 2015-05-29 | 2022-05-10 | Cargill, Incorporated | Método de liberação de glicosídeos de esteviol de uma célula hospedeira |
| CN105200098A (zh) | 2015-06-30 | 2015-12-30 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 |
| WO2017031424A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Pepsico, Inc. | Preparation of rebaudioside m in a single reaction vessel |
| CN109890973B (zh) | 2016-10-21 | 2023-05-23 | 百事可乐公司 | 一种酶法制备瑞鲍迪甙n的方法 |
| BR112019007882A2 (pt) | 2016-10-21 | 2019-07-02 | Pepsico Inc | método para preparar rebaudiosídeo j com o uso de método enzimático |
-
2016
- 2016-10-21 AU AU2016427120A patent/AU2016427120B2/en active Active
- 2016-10-21 EP EP16919508.8A patent/EP3530746A4/en active Pending
- 2016-10-21 CN CN202311021375.1A patent/CN117051063A/zh active Pending
- 2016-10-21 JP JP2019521117A patent/JP2019532650A/ja not_active Withdrawn
- 2016-10-21 RU RU2019113355A patent/RU2736155C1/ru active
- 2016-10-21 US US16/343,339 patent/US11312985B2/en active Active
- 2016-10-21 CN CN201680089981.9A patent/CN110199029B/zh active Active
- 2016-10-21 CA CA3041150A patent/CA3041150A1/en active Pending
- 2016-10-21 WO PCT/CN2016/102910 patent/WO2018072203A1/zh unknown
- 2016-10-21 MX MX2019004629A patent/MX2019004629A/es unknown
-
2022
- 2022-03-30 US US17/657,307 patent/US11976312B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2596190C2 (ru) * | 2009-10-15 | 2016-08-27 | ПЬЮСЁРКЛ ЭсДиЭн БиЭйчДи | Ребаудиозид d высокой степени чистоты и его применение |
| WO2011153378A1 (en) * | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Abunda Nutrition, Inc. | Recombinant Production of Steviol Glycosides |
| WO2013022989A2 (en) * | 2011-08-08 | 2013-02-14 | Evolva Sa | Recombinant production of steviol glycosides |
| US9243273B2 (en) * | 2012-05-22 | 2016-01-26 | Purecircle Sdn Bhd | Method for making rebaudioside X |
| WO2014086890A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Evolva Sa | Steviol glycoside compositions sensory properties |
| US20140357588A1 (en) * | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Purecircle Sdn Bhd | High-purity steviol glycosides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019532650A (ja) | 2019-11-14 |
| WO2018072203A1 (zh) | 2018-04-26 |
| AU2016427120A8 (en) | 2019-06-06 |
| CN110199029A (zh) | 2019-09-03 |
| CN117051063A (zh) | 2023-11-14 |
| US20190367960A1 (en) | 2019-12-05 |
| AU2016427120A1 (en) | 2019-05-30 |
| CA3041150A1 (en) | 2018-04-26 |
| MX2019004629A (es) | 2019-06-06 |
| US11312985B2 (en) | 2022-04-26 |
| CN110199029B (zh) | 2023-09-05 |
| AU2016427120B2 (en) | 2022-08-18 |
| EP3530746A4 (en) | 2020-06-24 |
| US11976312B2 (en) | 2024-05-07 |
| EP3530746A1 (en) | 2019-08-28 |
| US20220220525A1 (en) | 2022-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10428364B2 (en) | Enzymatic method for preparing rebaudioside M | |
| KR102115640B1 (ko) | 효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드 m을 제조하기 위한 방법 | |
| RU2737118C2 (ru) | Способ получения ребаудиозида n с применением ферментативного способа | |
| US11952604B2 (en) | Enzymatic method for preparing Rebaudioside J | |
| US11976312B2 (en) | Enzymatic method for preparing Rebaudioside C | |
| JP2019532650A5 (ru) | ||
| JP7210626B2 (ja) | 酵素的方法を使用してレバウディオサイドｊを調製するための方法 |