JP2014524247A - ステビオール配糖体の組換え生産 - Google Patents

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Abstract

ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする組換え遺伝子を発現するように操作された、組換え微生物、植物、および植物細胞が開示される。かかる微生物、植物、および植物細胞は、例えばレバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＤなどの、食品および栄養補助食品における天然の甘味料として用いることができるステビオール配糖体を生産することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月８日に出願された米国特許出願第61/521,084号、２０１１年８月８日に出願された米国特許出願第61/521,203号、２０１１年８月８日に出願された米国特許出願第61/521,051号、２０１１年８月１５日に出願された米国特許出願61/523,487号、２０１１年１２月７日に出願された米国特許出願61/567,929号、および２０１２年２月２７日に出願された米国特許出願61/603,639号の優先権を主張し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、ステビオール配糖体の組換え生産に関する。特に本開示は、レバウジオシドＤなどのステビオール配糖体の、組換え微生物、植物、または植物細胞などの組換え宿主による生産に関する。本開示はまた、ステビオール配糖体を含有する組成物を提供する。本開示はまた、スクアレン経路のテルペノイド前駆体生合成の調節による、テルペノイドを生産するためのツールおよび方法に関する。
甘味料は、食品、飲料、または菓子産業において最も一般的に使用される成分として知られている。甘味料は、生産時に最終食品中に組み入れるか、または単独で使用することができ、適切に希釈した場合は卓上甘味料として、または家庭でのベーキングにおける砂糖の代替品となる。甘味料には、ショ糖、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜などの天然甘味料、ならびにアスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなどの人工甘味料が含まれる。ステビア抽出物は、多年生低木のStevia rebaudianaから分離して抽出することができる天然甘味料である。ステビアは、ステビア抽出物の商業生産のために、南米やアジアで一般に栽培されている。様々な程度に精製されたステビア抽出物は、食品もしくはブレンド中の高甘味度甘味料として、または単独で卓上甘味料として、商業的に使用されている。
ステビア植物の抽出物は、甘味に寄与するレバウジオシドおよび他のステビオール配糖体を含有するが、ただし各配糖体の量は、多くの場合異なる製造バッチごとに異なる。既存の市販製品の大部分はレバウジオシドＡであり、より少ない量のレバウジオシドＣ、Ｄ、およびＦ等の他の配糖体を含む。ステビア抽出物はまた、異臭に寄与する植物由来の化合物などの不純物を含有し得る。これらの異臭は、食品系または選択の用途に応じて、多かれ少なかれ問題となり得る。潜在的な不純物としては、顔料、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパツレノール（spathulenol）および他のセスキテルペン、ラブダンジテルペン、モノテルペン、デカン酸、８，１１，１４−エイコサトリエン酸、２−メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スティグマステロール、β−シトステロール、α−およびβ−アミリン、ルペオール、β−酢酸アミリン、五環性トリテルペン、センタウレイジン、ケルセチン、エピ−α−カジノール、カリオフィレンおよびその誘導体、β−ピネン、β−シトステロール、およびジベレリンが挙げられる。
概要
本明細書で提供されるのは、微生物、植物、または植物細胞などの組換え宿主であって、その発現がステビオール配糖体、例えばレバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、またはズルコシドＡなどの生産をもたらすところの１または２以上の生合成遺伝子を含む、前記組換え宿主である。特に、本明細書に記載のウリジン５’−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼであるＥＵＧＴｌ１は、単独で、または１もしくは２以上の他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅなどと組み合わせて、組換え宿主中でのまたはin vitroの系を用いた、レバウジオシドＤの生産および蓄積を可能とする。本明細書に記載されるように、ＥＵＧＴｌ１は、強力な１，２−１９−Ｏ−グルコースのグリコシル化活性を有し、これはレバウジオシドＤ生産の重要なステップである。
典型的には、ステビオシドおよびレバウジオシドＡは、商業的に生産されるステビア抽出物中の主な化合物である。ステビオシドは、レバウジオシドＡよりも苦味が強く甘味が少ないことが報告されている。ステビア抽出物の組成は、植物が成長する土壌や気候に応じてロット毎に変化し得る。ソースとなる植物、気候条件、および抽出プロセスに応じて、市販製剤におけるレバウジオシドＡの量は、総ステビオール配糖体含量の２０〜９７％で変動することが報告されている。他のステビオール配糖体は、ステビア抽出物中に様々な量で存在する。例えば、レバウジオシドＢは典型的には１〜２％未満で存在し、一方レバウジオシドＣは７〜１５％の高いレベルで存在することができる。レバウジオシドＤは、典型的には総ステビオール配糖体の２％以下のレベルで存在し、レバウジオシドＦは、典型的には３．５％以下の組成で存在する。マイナーなステビオール配糖体の量は、ステビア抽出物の風味特性に影響を与える。さらに、レバウジオシドＤおよび他の高グリコシル化ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡより高品質の甘味料であると考えられている。したがって、本明細書に記載の組換え宿主および方法は、例えば、多くの高効力の甘味料よりも優れた機能的および感覚的特性のノンカロリー甘味料として用いるための、増加量のレバウジオシドＤを有するステビオール配糖体組成物を生産するために特に有用である。
一側面において、本文書は、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主を特徴とする。
本文書はまた、第２糖部分をルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移する能力を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主を特徴とする。本文書はまた、第２糖部分をステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移する能力を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主を特徴とする。
別の側面において、本文書はまた、第２糖部分を、ルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’とルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’とに転移する能力を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主を特徴とする。
本文書はまた、レバウジオシドＤを生産するために第２糖部分をレバウジオシドＡの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移する能力を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主を特徴とし、ここでポリペプチドの触媒反応速度は、反応が対応する条件下で行われた場合、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する９１Ｄ２ｅポリペプチドより、少なくとも２０倍速い（例えば２５倍または３０倍速い）。
本明細書に記載の任意の組換え宿主において、ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（例えば９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性）を有することができる。ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を有することができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＧＴ８５Ｃポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドは、配列番号３の残基９、１０、１３、１５、２１、２７、６０、６５、７１、８７、９１、２２０、２４３、２７０、２８９、２９８、３３４、３３６、３５０、３６８、３８９、３９４、３９７、４１８、４２０、４４０、４４１、４４４、および４７１において、１または２以上のアミノ酸置換を含むことができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。ＵＧＴ７６Ｇポリペプチドは、配列番号７の残基２９、７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９， ２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１、および３４６において、１または２以上のアミノ酸置換を含むことができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子（例えば組換え遺伝子）を含むことができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、機能性ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする遺伝子（例えば組換え遺伝子）を含むことができる。ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有することができる。ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、配列番号５の位置２０６、２０７、または３４３において、変異を有することができる。ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはまた、配列番号５の位置２１１および２８６において、変異を有することができる（例えばＬ２１１ＭおよびＶ２８６Ａであり、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂと呼ぶ）。ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、配列番号５、１０、１２、７６、７８、または９５に記載のアミノ酸配列を有することができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、以下の１または２以上を含むことができる：
（ｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）二機能性のコパリル二リン酸合成酵素とカウレン合成酵素とをコードする遺伝子、または、コパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子およびカウレン合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉｉ）カウレン酸化酵素をコードする遺伝子；
（ｉｖ）ステビオール合成酵素をコードする遺伝子。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の遺伝子の各々は、組換え遺伝子であることができる。
本明細書に記載の任意の宿主はさらに、以下の１または２以上を含むことができる：
（ｖ）切断型ＨＭＧ−ＣｏＡをコードする遺伝子；
（ｖｉ）ＣＰＲをコードする遺伝子；
（ｖｉｉ）ラムノース合成酵素をコードする遺伝子；
（ｖｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；
（ｉｘ）ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）の遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子であることができる。
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、配列番号１２１〜１２８に記載のアミノ酸配列の１つと９０％を超える配列同一性を有することができる。コパリル二リン酸合成酵素は、配列番号１２９〜１３１に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができる。カウレン合成酵素は、配列番号１３２〜１３５に記載のアミノ酸配列の１つと９０％を超える配列同一性を有することができる。カウレン酸化酵素は、配列番号１３８〜１４１に記載のアミノ酸配列の１つと９０％を超える配列同一性を有することができる。ステビオール合成酵素は、配列番号１４２〜１４６に記載のアミノ酸配列の１つと９０％を超える配列同一性を有することができる。
いずれの組換え宿主も、各遺伝子が発現される条件下で培養された場合に、少なくとも１種のステビオール配糖体を生産することができる。ステビオール配糖体は、ルブソシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ステビオシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ステビオール−１，３−ビオシド、１，３−ステビオシド、ならびに他のラムノシル化もしくはキシロシル化中間体からなる群から選択することができる。ステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＤ）は、前記条件下で培養された場合、培養培地の少なくとも１ｍｇ／リットルまで（例えば、少なくとも１０ｍｇ／リットル、２０ｍｇ／リットル、１００ｍｇ／リットル、２００ｍｇ／リットル、３００ｍｇ／リットル、４００ｍｇ／リットル、５００ｍｇ／リットル、６００ｍｇ／リットル、または７００ｍｇ／リットル、またはそれ以上）、蓄積することができる。
本文書はまた、ステビオール配糖体の生産方法を特徴とする。方法は、本明細書に記載の任意の宿主を、培養培地中にて遺伝子が発現される条件下で増殖させること；および宿主により生産されたステビオール配糖体を回収すること、を含む。増殖のステップは、１または２以上の遺伝子の発現を誘導することを含むことができる。ステビオール配糖体は、１３−Ｏ−１，２−ジグリコシル化および／または１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ステビオール配糖体（例えば、ステビオシド、ステビオール１，２ビオシド、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＥ）であることができる。例えば、ステビオール配糖体は、レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＥであることができる。ステビオール配糖体のその他の例としては、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、およびズルコシドＡを含むことができる。
本文書はまた、組換え宿主を特徴とする。宿主は、（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１をコードする遺伝子；（ｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２をコードする遺伝子；（ｉｉｉ）ＵＧＴ７６Ｇ１をコードする遺伝子；（ｉｖ）第２糖部分をルブソシドまたはステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移する能力を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子；および（ｖ）任意に、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅをコードする遺伝子、を含み、ここで遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子である。一部の態様において、各遺伝子は組換え遺伝子である。宿主は、遺伝子（例えば、組換え遺伝子）の各々が発現される条件下で培養された場合に、少なくとも１つのステビオール配糖体（例えばレバウジオシドＤ）を生産することができる。宿主はさらに、（ａ）二機能性のコパリル二リン酸合成酵素とカウレン合成酵素とをコードする遺伝子、または、コパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子およびカウレン合成酵素をコードする遺伝子；（ｂ）カウレン酸化酵素をコードする遺伝子；（ｃ）ステビオール合成酵素をコードする遺伝子；（ｄ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子、を含むことができる。
本文書はまた、本明細書に記載の任意の宿主によって生産されるステビオール配糖体組成物を特徴とする。この組成物では、ステビア抽出物と比較して、ステビア植物由来の不純物のレベルが低下している。
さらに別の側面において、本文書は、本明細書に記載の任意の宿主によって生産されるステビオール配糖体組成物を特徴とする。この組成物は、野生型ステビア植物のステビオール配糖体組成物と比較して、レバウジオシドＤが富化されたステビオール配糖体組成物を有する。
さらに別の側面において、本文書は、ステビオール配糖体組成物の生産方法を特徴とする。方法は、本明細書に記載の宿主を、培養培地中にて各遺伝子が発現される条件下で増殖させること；および宿主（例えば微生物）により生産されたステビオール配糖体組成物を回収すること、を含む。組成物は、野生型ステビア植物のステビオール配糖体組成物と比較して、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、またはズルコシドＡが富化されている。宿主（例えば微生物）により生産されたステビオール配糖体組成物では、ステビア抽出物と比較して、ステビア植物由来の不純物のレベルが低下している。
本文書はまた、第２糖部分をステビオール配糖体における１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’または１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移するための方法を特徴とする。方法は、ステビオール配糖体を、本明細書に記載のＥＵＧＴ１１ポリペプチドまたは本明細書に記載のＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド（例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ）およびＵＤＰ−糖と、第２糖部分をステビオール配糖体に転移するための好適な反応条件下で、接触させせることを含む。ステビオール配糖体はルブソシドであることができ、ここで第２糖部分はグルコースであり、ステビオシドは第２グルコース部分の転移の際に生産される。ステビオール配糖体はステビオシドであることができ、ここで第２糖部分はグルコースであり、レバウジオシドＥは、第２グルコース部分の転移の際に生産される。ステビオール配糖体はレバウジオシドＡであることができ、レバウジオシドＤは、第２グルコース部分の転移の際に生産される。
本明細書に開示されるように、改良された下流のステビオール配糖体経路の別の態様において、材料および方法がショ糖合成酵素の組換え産生のために提供され、宿主におけるＵＤＰ−グルコース生産の増加のための材料および方法が、特にin vivoでのＵＤＰ−グルコースの利用可能性を増加させるために、細胞におけるグリコシル化反応を促進する目的で、および、細胞におけるＵＤＰ濃度を低下させる方法が提供される。
本文書はまた、ショ糖トランスポーターおよびショ糖合成酵素をコードする１または２以上の外因性核酸を含む組換え宿主を提供し、ここで、グルコシルトランスフェラーゼを有する１または２以上の外因性核酸の発現は、宿主におけるＵＤＰ−グルコースレベルの上昇をもたらす。任意に、１または２以上の外因性核酸は、ＳＵＳ１配列を含む。任意に、ＳＵＳ１配列は、Coffea arabicaからのものであるか、またはCoffea arabicaのＳＵＳ１配列によりコードされるショ糖合成酵素の機能性ホモログをコードするが、しかし本明細書に記載のように、Arabidopsis thalianaまたはStevia rebaudianaのＳＵＳも同様に用いることができる。本発明の組換え宿主において、１または２以上の外因性核酸は、配列番号１８０に記載の配列、またはこれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含むことができ、および任意に、１または２以上の外因性核酸は、ＳＵＣ１配列を含む。一態様において、ＳＵＣ１配列はArabidopsis thalianaからのものであるか、またはＳＵＣ１配列は、Arabidopsis thalianaのＳＵＣ１配列によりコードされるショ糖トランスポーターの機能性ホモログをコードする。組換え宿主において、１または２以上の外因性核酸は、配列番号１７９に記載の配列、またはこれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含むことができる。組換え宿主は、１または２以上の外因性核酸を欠く対応する宿主と比較して、外部ショ糖を分解する能力が低下している。
組換え宿主は、微生物、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母菌であってよい。代替的に、微生物は、Escherichia coliである。代替的態様において、組換え宿主は、植物または植物細胞である。
本発明はまた、細胞内でＵＤＰ−グルコースのレベルを上昇させ、ＵＤＰのレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、細胞内で、ショ糖を含む培地中、組換えショ糖合成酵素配列および組換えショ糖トランスポーター配列を発現させることを含み、ここで前記細胞はショ糖の分解を欠いている。
本発明はさらに、細胞内で、ショ糖を含む培地中、組換えショ糖合成酵素配列および組換えショ糖トランスポーター配列を発現させることを含む、細胞内でのグリコシル化反応を促進する方法を提供し、ここで発現により、細胞内でのＵＤＰレベルの低下および細胞内でのＵＤＰ−グルコースレベルの上昇がもたらされて、細胞内でのグリコシル化が増加する。
ＵＤＰ−グルコースのレベルを上昇させるかまたはグリコシル化を促進するためのいずれかの方法において、細胞はバニリングルコシドを生産することができて、細胞によるバニリングルコシド生産の増加がもたらされるか、または、ステビオールグルコシドを生産することができて、細胞によるステビオールグルコシド生産の増加がもたらされる。任意に、ＳＵＳ１配列は、A. thaliana、S. rebaudiana、もしくはCoffea arabicaのＳＵＳ１配列であるか（例えば図１７、配列番号１７５〜１７７を参照）、または、A. thaliana、S. rebaudiana、もしくはCoffea arabicaのＳＵＳ１配列によりコードされるショ糖合成酵素の機能性ホモログをコードする配列である。組換えショ糖合成酵素は任意に、配列番号１８０に記載の配列またはこれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで任意に、組換えショ糖トランスポーター配列はＳＵＣ１配列であるか、またはここで任意に、ＳＵＣ１配列はArabidopsis thalianaのＳＵＣ１配列であるかまたはArabidopsis thalianaのＳＵＣ１配列によりコードされるショ糖トランスポーターの機能性ホモログをコードする配列であるか、またはここで任意に、組換えショ糖トランスポーター配列は、配列番号１７９に記載の配列またはこれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。いずれの方法においても、宿主は、微生物、例えば任意にSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母菌であってよい。または宿主はEscherichia coliであってよい。または宿主は、植物細胞であってよい。
本明細書でさらに提供されるのは、その発現がジテルペノイドの生産をもたらす１または２以上の生合成遺伝子を含む、微生物などの組換え宿主である。かかる遺伝子には、ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）（EC 5.5.1.13）をコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン合成酵素をコードする遺伝子、ｅｎｔ−カウレン酸化酵素をコードする遺伝子、またはステビオール合成酵素をコードする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子である。宿主はまた、植物細胞であることができる。ステビア植物におけるこれらの遺伝子（単数または複数）の発現は、植物におけるステビオール配糖レベルの上昇をもたらすことができる。一部の態様において、組換え宿主はさらに、葉緑体輸送ペプチド配列を欠くＣＤＰＳポリペプチド（EC 5.5.1.13 ）をコードする組換え遺伝子の複数コピーを含む。ＣＤＰＳポリペプチドは、図１４に示す切断型ＣＤＰＳアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有することができる。宿主はさらに、ＫＡＨポリペプチド、例えば図１２に示すＫＡＨアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するＫＡＨポリペプチドをコードする組換え遺伝子の複数コピーを含むことができる。宿主はさらに、次の１または２以上：（ｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子；（ｉｉ）ｅｎｔ−カウレン酸化酵素をコードする遺伝子；および（ｉｉｉ）ｅｎｔ−カウレン合成酵素をコードする遺伝子、を含むことができる。宿主はさらに、次の１または２以上：（ｉｖ）切断型ＨＭＧ−ＣｏＡをコードする遺伝子；（ｖ）ＣＰＲをコードする遺伝子；（ｖｉ）ラムノース合成酵素をコードする遺伝子；（ｖｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；および（ｖｉｉｉ）ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、を含むことができる。例えば、２または３以上の外因性ＣＰＲが存在することができる。１または２以上のかかる遺伝子の発現は、誘導性であり得る。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の遺伝子の少なくとも１つは組換え遺伝子であることができ、いくつかの場合においては、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の各遺伝子は、組換え遺伝子である。ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素は、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができる；カウレン酸化酵素は、配列番号１３８に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができる；ＣＰＲは、配列番号１６８に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができる；ＣＰＲは、配列番号１７０に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができ、およびカウレン合成酵素は、配列番号１５６に記載のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有することができる。
一側面において、本文書は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが配列番号５の位置２１１および２８６に置換を含んでいる前記核酸を特徴とする。例えば、ポリペプチドは、位置２１１にメチオニンを、位置２８６にアラニンを含むことができる。
一側面において、本文書は、図１２Ｃ（配列番号１６４）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を特徴とする。ポリペプチドは、図１２Ｃに記載のアミノ酸配列を有することができる。
別の側面において、本文書は、図１２Ｃ（配列番号１６４）に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有するポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結した調節領域を含む、核酸コンストラクトを特徴とする。ポリペプチドは、図１２Ｃに記載のアミノ酸配列を有することができる。
本文書また、図１２Ｃに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有するＫＡＨポリペプチドをコードする組換え遺伝子（例えば組換え遺伝子の複数コピー）を含む組換え宿主を特徴とする。ポリペプチドは、図１２Ｃに記載のアミノ酸配列を有することができる。宿主は、酵母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiae）またはEscherichia coliなどの微生物であることができる。宿主は、植物または植物細胞（例えば、ステビア、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella）、またはタバコ植物または植物細胞）であることができる。ステビア植物または植物細胞は、Stevia rebaudianaの植物または植物細胞である。組換え宿主は、各遺伝子が発現される条件下で培養された場合に、ステビオールを生産することができる。組換え宿主はさらに、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子；ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする遺伝子；および／またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子を含むことができる。かかる宿主は、各遺伝子が発現される条件下で培養された場合に、少なくとも１種のステビオール配糖体を生産することができる。ステビオール配糖体は、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、および／またはズルコシドＡであることができる。組換え宿主はさらに、次の１種または２種以上を含むことができる：デオキシキシルロース５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）をコードする遺伝子；Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）をコードする遺伝子；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール合成酵素（ＣＭＳ）をコードする遺伝子；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）をコードする遺伝子；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸合成酵素（ＭＣＳ）をコードする遺伝子；１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＨＤＳ）をコードする遺伝子；および１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元成酵素（ＨＤＲ）をコードする遺伝子。組換え宿主はさらに、次の１種または２種以上を含むことができる：アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子；切断型ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子；メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；ホスホメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子；およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子。別の側面において、本文書は、ｅｎｔ−カウレン酸化酵素（EC 4.2.3.19）をコードする遺伝子；および／またはジベレリン２０−酸化酵素（EC 1.14.11.12）をコードする遺伝子をさらに含む組換え宿主を特徴とする。かかる宿主は、各遺伝子が発現される条件下で培養された場合に、ジベレリンＧＡ３を生産する。
本文書また、図１３に記載のS. rebaudianaのＣＰＲアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性）を有するＣＰＲポリペプチドをコードする単離された核酸を特徴とする。一部の態様において、ポリペプチドは、図１３に記載のS. rebaudianaのＣＰＲアミノ酸配列（配列番号１６９および１７０）を有する。
本明細書に記載の宿主のいずれにおいても、１または２以上の遺伝子の発現が誘導可能である。
本明細書に記載の宿主のいずれにおいても、内因性ホスファターゼをコードする１または２以上の遺伝子は、内因性ホスファターゼ活性が低下するように削除または破壊することができる。例えば、酵母遺伝子ＤＰＰ１および／またはＬＰＰ１を破壊または削除して、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）のファルネソールへの分解が低減され、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）のゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）への分解が低減されるようにすることができる。
別の態様において、本明細書に記載されるように、ＥＲＧ９を以下に規定するように修飾することができて、その結果スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）の生産の減少および、テルペノイド前駆体の蓄積がもたらされる。前駆体は、培養培地中に分泌されても分泌されなくてもよく、ひいてはテルペノイド前駆体を所望のテルペノイドに代謝することができる酵素に対する基質として用いることができる。
したがって、本発明の主要な側面は、核酸配列を含む細胞であって、前記核酸が、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的であり、かつこれとヘアピン二次構造要素を形成する、少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、および
式中、Ｘ３は任意であり、もし存在する場合は、Ｘ２とＸ４の間のヘアピンループの形成に関与する不対ヌクレオチドを含み、および
式中、Ｘ１およびＸ５は、独立しておよび任意に、１または２以上のヌクレオチドを含み、および、
式中、前記オープンリーディングフレームは、発現すると、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）またはその生物学的活性断片と少なくとも約７０％の同一性を有するポリペプチド配列をコードし、前記断片は、前記スクアレン合成酵素と、少なくとも１００個のアミノ酸のオーバーラップの範囲内で少なくとも７０％の配列同一性を有する、
前記細胞に関する。
本発明の細胞は、工業的に興味深いテルペノイドの収量を高めるのに有用である。したがって、本発明の別の側面は、細胞培養物において、スクアレン経路を介して合成されるテルペノイド化合物を生産するための方法に関し、該方法は、次のステップを含む：
（ａ）本明細書上記で定義した細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること、
（ｃ）テルペノイド生成物の化合物を回収すること。
本明細書上記で定義した遺伝子操作されたコンストラクトを含む細胞を提供することによって、テルペノイド前駆体の蓄積が増強される（例えば図２０を参照）。
したがって、別の側面において、本発明は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からなる群から選択されるテルペノイド前駆体に由来するテルペノイドを生産するための方法に関し、前記方法は、以下を含む：
（ａ）前記前駆体を、スクアレン合成酵素経路の酵素と接触させること、
（ｂ）テルペノイド生成物を回収すること。
本発明は、少なくとも部分的に、リボソームのＲＮＡへの結合を立体的に妨げることによって操作されてもよく、こうしてスクアレン合成酵素の翻訳を低減する。したがって本発明の一態様は、機能性スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）の翻訳速度を低減するための方法に関し、前記方法は以下を含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること。
同様に、本発明の別の側面は、本発明は、ファルネシル−ｐｐのスクアレンへの転換を低減するための方法に関し、前記方法は以下を含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること。
図２０に示すように、ＥＲＧ９のノックダウンは、スクアレン合成酵素への前駆体の増加をもたらす。したがって一側面において、本発明は、ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸からなる群から選択される化合物の蓄積を増強するための方法に関し、該方法は、次のステップを含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること。
一態様において、本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）および、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から調製することができる他のテルペノイドの生産に関する。
本発明のこの態様において、上記のスクアレン合成酵素（ＳＱＳ）の生産の減少は、ＦＰＰをゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換する、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）の活性の増加と組み合わせることができ、ＧＧＰＰの生産の増加をもたらす。
したがって、一態様において、本発明は核酸配列を含む微生物細胞に関し、前記核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書に定義された通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結された、ＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含む。
さらに、本文書は、ステビオールまたはステビオール配糖体を生産するための方法に関し、ここで該方法は、上記の微生物細胞の任意の１つの使用を含む。
本明細書に記載の全ての宿主は、微生物（例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母、またはEscherichia coli）、または植物もしくは植物細胞（Stevia rebaudianaなどのステビア、Physcomitrella、またはタバコ植物または植物細胞）であることができる。
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書に記載の他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみであり、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。出願人は、特許法における標準的な慣行に従って、「含む」、「本質的に〜からなる」、または「〜からなる」の移行句を使用して、任意の開示された発明を代替的に請求する権利を留保する。
図１は、様々なステビオール配糖体の化学構造の図である。 図２Ａは、ステビオール配糖体の、ステビオールからの生合成のための代表的な経路を示す図である。 図２Ｂは、ステビオール配糖体の、ステビオールからの生合成のための代表的な経路を示す図である。 図２Ｃは、ステビオール配糖体の、ステビオールからの生合成のための代表的な経路を示す図である。 図２Ｄは、ステビオール配糖体の、ステビオールからの生合成のための代表的な経路を示す図である。 図３は、ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅによる１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化反応の概略図である。数字は、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）クロマトグラムからの、反応の基質または生成物の平均シグナル強度である。 図４は、in vivoでの転写または翻訳ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５）（左パネル）またはＥＵＧＴ１１（配列番号１５２）（右パネル）を用いた、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）からのレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）の生産を表す、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。ＬＣ−ＭＳは、ステビオール＋５グルコース（例えばＲｅｂＤ）、ステビオール＋４グルコース（例えばＲｅｂＡ）などに対応する特定の質量を検出するように設定した。各「レーン」は、最大のピークに従ってスケーリングする。
図５は、ルブソシドのステビオシドおよび化合物「２」および「３」（ＲｅｂＥ）への、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（左パネル）およびＥＵＧＴ１１（右パネル）による変換を示す、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。 図６は、ＥＵＧＴ１１（配列番号１５２、最上段のライン）のアミノ酸配列と、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５、最下段のライン）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 図７は、ＥＵＧＴ１１（配列番号１５２）のアミノ酸配列、ＥＵＧＴ１１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５３）、および酵母での発現のためにコドン最適化されたＥＵＧＴ１１をコードすヌクレオチド配列（配列番号１５４）を示す図である。 図８は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとＵＧＴ８５Ｈ２およびＵＧＴ７１Ｇ１の二次構造予測のアラインメントを示す図である。二次構造予測は、３種類のＵＧＴのアミノ酸配列を、ワールドワイドウェブcbs.dtu.dk/services/NetSurfP/のNetSurfP ver. 1.1 - Protein Surface Accessibility and Secondary Structure Predictionsに供することにより行った。これにより、タンパク質中のαへリックス、βシートおよびコイルの存在と位置を予測した。これらは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅについて示されるように、その後に標識した。例えば、最初のＮ末端βシートをＮβ１標識した。ｙ軸は予測の確実性を表し、これが高いほどより確実であり、ｘ軸はアミノ酸位置を示す。これらのＵＧＴの間の一次配列の同一性は非常に低いが、二次構造は非常に高い保存の程度を示す。
図９は、ＵＧＴ９１Ｄ１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 図１０は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの二重アミノ酸置換変異体の活性の棒グラフである。黒い棒は、ステビオシドの生産を表し、白い棒は、１，２−ビオシドの生産を表す。 図１１は、ステビオール配糖体の生合成のためのＵＤＰ−グルコースの再生の概略図である。ＳＵＳ＝ショ糖合成酵素、ステビオール＝ステビオールまたはステビオール配糖体基質、ＵＧＴ＝ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ。 図１２Ａは、Stevia rebaudianaＫＡＨをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６３）を示す図であり、これは本明細書においてＳｒＫＡＨｅ１と呼ぶ。 図１２Ｂは、酵母での発現のためにコドン最適化された、Stevia rebaudianaＫＡＨｅ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６５）を示す図である。 図１２Ｃは、Stevia rebaudianaＫＡＨｅ１のアミノ酸配列（配列番号１６４）を示す図である。
図１３Ａは、S. cerevisiae（ＮＣＰ１遺伝子によりコードされる）（配列番号１６６）から、A. thaliana（ＡＴＲ１およびＡＴＲ２によりコードされる）（配列番号１４８および１６８）から、およびS. rebaudiana（ＣＰＲ７およびＣＰＲ８によりコードされる）（配列番号１６９および１７０）からのＣＰＲポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。 図１３Ｂは、酵母での発現のためにコドン最適化されたＡＴＲ１ヌクレオチド配列（アクセッション番号CAA23011）（配列番号１７１）；酵母での発現のためにコドン最適化されたＡＴＲ２ヌクレオチド配列（配列番号１７２）；Stevia rebaudianaのＣＰＲ７ヌクレオチド配列（配列番号１７３）；およびStevia rebaudianaのＣＰＲ８ヌクレオチド配列（配列番号１７４）を示す図である。 図１４Ａは、Zea maysからのＣＤＰＳポリペプチド（配列番号１５８）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５７）を示す図である。太字と下線の配列は、葉緑体輸送配列をコードする配列を除去するために削除することができる。 図１４Ｂは、Zea maysからのＣＤＰＳポリペプチド（配列番号１５８）をコードするアミノ酸配列（配列番号１５８）を示す図である。太字と下線の配列は、葉緑体輸送配列をコードする配列を除去するために削除することができる。
図１５Ａは、Gibberella fujikuroiからの二機能性ＣＤＰＳ−ＫＳポリペプチド（配列番号１６２）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１６１）を示す図である。 図１５Ｂは、Gibberella fujikuroiからの二機能性ＣＤＰＳ−ＫＳポリペプチド（配列番号１６２）をコードするアミノ酸配列を示す図である。 図１６は、S. cerevisiaeの２つの株である、強化されたＥＦＳＣ１９７２（Ｔ２で示す）およびArabidopsis thalianaのカウレン合成酵素（ＫＳ−５）の過剰発現を有する強化されたＥＦＳＣ１９７２（Ｔ７で示す、四角）の、増殖のグラフを示す図である。ｙ軸上の数字は、細胞培養物のＯＤ６００値であり、ｘ軸上の数字は、３０℃における完全合成ベースの培地中での増殖の時間を表す。 図１７は、A. thaliana、S. rebaudiana（contig10573 selection_ORF S11Eより、Ｓ１１をグルタミン酸（Ｅ）へ変化させる変異を太字の小文字で示す）、およびコーヒー（Coffea arabica）ショ糖合成酵素をコードする核酸配列を示す図である（それぞれ配列番号１７５、１７６、および１７７）。
図１８は、ＥＵＧＴ１１または空のプラスミド（「空」）で形質転換された、透過化処理したS. cerevisiaeにおけるｒｅｂＤ生産の棒グラフを示す図である。細胞は、対数増殖期まで増殖させ、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、続いてTriton X-100（ＰＢＳ中０．３％または０．５％）にて３０℃で３０分間処理した。透過化処理後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１００μＭのＲｅｂＡおよび３００μＭのＵＤＰ−グルコースを含有する反応ミックス中に再懸濁した。反応は、３０℃で２０時間進行させた。 図１９Ａは、A. thalianaＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７２Ｅ２のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１７８）。 図１９Ｂは、A. thaliana由来のショ糖トランスポーターＳＵＣ１のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１７９）。 図１９Ｃは、コーヒー由来のショ糖合成酵素のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１８０）。 図２０は、酵母におけるイソプレノイド経路の概略図であり、ＥＲＧ９の位置を示す 図２１は、Saccharomyces cerevisiaeＣｙｃ１プロモーター（配列番号１８５）およびSaccharomyces cerevisiaeＫｅｘ２プロモーター（配列番号１８６）のヌクレオチド配列を示す図である。
図２２は、それぞれがＥＲＧ９プロモーターまたはＥＲＧ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端内のゲノム配列の一部と相同な２つの領域、ＨＲ１およびＨＲ２を含む、ＰＣＲ産物の概略図である。また、ＰＣＲ産物上には、Ｃｒｅリコンビナーゼによるその後の切除用の２つのＬｏｘ部位（Ｌ）の間に埋め込むことができる、抗生物質マーカーＮａｔＲが存在する。ＰＣＲ産物はさらに、野生型ＳｃＫｅｘ２、野生型ＳｃＣｙｃ１のいずれか等のプロモーターを含むことができ、該プロモーターはさらに、ヘアピン（配列番号１８１〜１８４）等の異種インサートをその３’末端に含むことができる（図２３参照）。 図２３は、翻訳開始部位（矢印）のすぐ上流にヘアピンステムループを有するプロモーターおよびＯＲＦの概略図、ならびに、野生型S. cerevisiae ＣＹＣ１プロモーター配列の一部とＥＲＧ９ ＯＰＲの初めのＡＴＧであって、異種インサートを含まないもの（配列番号１８７）、および４つの異なる異種インサート（配列番号１８８〜１９１）を有するものの、アラインメントを示す図である。７５％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターと続いて配列番号１８４を含むコンストラクト（配列番号１９１）を示す；５０％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターと続いて配列番号１８３を含むコンストラクト（配列番号１９０）を示す；２０％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターと続いて配列番号１８２を含むコンストラクト（配列番号１８９）を示す；５％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターと続いて配列番号１８１を含むコンストラクト（配列番号１８８）を示す。
図２４は、宿主ゲノムのＥＲＧ９遺伝子の前に挿入された異なるプロモーターコンストラクトを有する酵母株において生産された、アモルファジエンを示す棒グラフである。ＣＴＲＬ−ＡＤＳは、修飾なしの対照株を示す；ＥＲＧ９−ＣＹＣ１−１００％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターを含み、インサートなしのコンストラクトを示す；ＥＲＧ９−ＣＹＣ１−５０％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターに続いて配列番号１８３を含むコンストラクトを示す（配列番号１９０）；ＥＲＧ９−ＣＹＣ１−２０％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターに続いて配列番号１８２を含むコンストラクトを示す（配列番号１８９）；ＥＲＧ９−ＣＹＣ１−５％は、ＳｃＣｙｃ１プロモーターに続いて配列番号１８１を含むコンストラクトを示す（配列番号１８８）；ＥＲＧ９−ＫＥＸ２−１００％は、ＳｃＫｅｘ２プロモーターを含むコンストラクトを示す。 図２５は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Candida albicans、Saccharomyces cerevisiae、Homo sapiens、Mus musculus、およびRattus norvegicusからのスクアレン合成酵素ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１９２〜２０２）、ならびにAspergilus nidulansおよびS. cerevisiaeからのゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）のアミノ酸配列（配列番号２０３および１６７）を示す図である。 図２６は、ＥＲＧ９−ＣＹＣ１−５％株およびＥＲＧ９−ＫＥＸ２株における７２時間後のゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）の蓄積を示す棒グラフである。 図２７は、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＥＵＧＴ１１によるＲｅｂＦ生産のための、ルブソシドのキシロシル化中間体への変換を示す代表的なクロマトグラフの図である。 様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
発明の詳細な説明
本文書は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、またはズルコシドＡなどのステビオール配糖体の生合成に有用なポリペプチドを発現する、植物細胞、植物、または微生物などの組換え宿主を開発できるという発見に基づくものである。本明細書に記載の組換え宿主は、レバウジオシドＤの生産に特に有用である。かかる宿主は、ステビオール配糖体の生産に適するウリジン５’−ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ類の１または２以上を、発現することができる。様々な微生物のシャーシ内でのこれら生合成ポリペプチドの発現は、ステビオール配糖体を、例えば、糖、グリセロール、ＣＯ２、Ｈ２および太陽光などのエネルギー源および炭素源から、一貫した再現可能な方法で生産することを可能にする。組換え宿主により生産される各ステビオール配糖体の割合は、予め選択された生合成酵素を宿主に組み込み、それらを適切なレベルで発現させることによって調整可能であり、一貫した味プロファイルの甘味料組成物を生産することができる。さらに、組換え宿主により生産されるステビオール配糖体の濃度は、ステビア植物において生産されるステビオール配糖体のレベルよりも高いことが予想され、これは下流での精製の効率を向上させる。かかる甘味料組成物には、ステビア抽出物中に存在する不純物の量と比べて、ほとんどあるいは全く、植物ベースの不純物が含まれていない。
遺伝子の少なくとも１つは組換え遺伝子であり、特定の組換え遺伝子（単数または複数）は、使用のために選択される種または株に依存する。追加の遺伝子または生合成モジュールを含有させて、ステビオール配糖体の収量を増加させ、そのエネルギー源および炭素源がステビオールおよびその配糖体に変換される効率を改善し、および／または細胞培養物または植物からの生産性を向上することができる。かかる追加の生合成モジュールには、テルペノイド前駆体、イソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸の合成に関与する遺伝子が含まれる。追加の生合成モジュールには、テルペン合成酵素およびテルペンシクラーゼ遺伝子、例えばゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびコパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子が含まれる；これらの遺伝子は、内因性遺伝子または組み換え遺伝子であってよい。
１．ステビオールおよびステビオール配糖体生合成ポリペプチド
Ａ．ステビオール生合成ポリペプチド
ステビア抽出物中に見出されるいくつかの化合物の化学構造を、ジテルペンステビオールおよび様々なステビオール配糖体を含んで図１に示す。ＣＡＳ番号は以下の表Ａに示す。また、Harriet Wallin, Food Agric. Org. (2007)により作成されたSteviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFAも参照のこと。
微生物等の宿主における特定の遺伝子の発現は、その宿主にステビオール配糖体を合成する能力を付与することが発見された。以下でより詳細に説明されるように、かかる遺伝子の１または２以上は、宿主中に天然に存在し得る。しかしながら典型的には、かかる遺伝子の１または２以上は、それらを天然に有しない宿主中に形質転換された、組換え遺伝子である。
ステビオールを生産するための生化学的経路には、ゲラニルゲラニル二リン酸の形成、（−）コパリル二リン酸への環化、続いて酸化および水酸化によるステビオールの形成が関与する。したがって、組換え微生物におけるゲラニルゲラニル二リン酸のステビオールへの変換には、カウレン合成酵素（ＫＳ）をコードする遺伝子、カウレン酸化酵素（ＫＯ）をコードする遺伝子、およびステビオール合成酵素（ＫＡＨ）をコードする遺伝子の発現が関与する。ステビオール合成酵素はまた、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼとしても知られている。
好適なＫＳポリペプチドが知られている。例えば、好適なＫＳ酵素には、Stevia rebaudiana、Zea mays、Populus trichocarpa、およびArabidopsis thalianaによって作られたものが含まれる。表１および配列番号１３２〜１３５および１５６を参照。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０〜４７および１５５に記載されている。配列番号４０〜４３に記載のヌクレオチド配列は、酵母での発現のために修飾され、一方、配列番号４４〜４７に記載のヌクレオチド配列は、ＫＳポリペプチドが同定されたソースとなる生物からのものである。
好適なＫＯポリペプチドが知られている。例えば、好適なＫＯ酵素には、Stevia rebaudiana、Arabidopsis thaliana、Gibberella fujikoroiおよびTrametes versicolorによって作られたものが含まれる。表２および配列番号１３８〜１４１を参照。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２〜５９に記載されている。配列番号５２〜５９に記載のヌクレオチド配列を、酵母での発現のために修飾した。配列番号５６〜５９に記載のヌクレオチド配列は、ＫＯポリペプチドが同定されたソースとなる生物からのものである。
好適なＫＡＨポリペプチドが知られている。例えば、好適なＫＡＨ酵素には、Stevia rebaudiana、Arabidopsis thaliana、Vitis viniferaおよびMedicago trunculataによって作られたものが含まれる。表３および配列番号１４２〜１４６；米国特許公開第2008-0271205号；米国特許公開第2008-0064063号およびGenbankアクセッション番号gi 189098312を参照。Arabidopsis thalianaからのステビオール合成酵素は、ＣＹＰ７１４Ａ２として分類される。これらのＫＡＨ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６０〜６９に記載されている。配列番号６０〜６４に記載のヌクレオチド配列は、酵母での発現のために修飾され、一方、ポリペプチドが同定されたソースとなる生物からのヌクレオチド配列は、配列番号６５〜６９に記載されている。
さらに、本明細書中で同定されたStevia rebaudianaからのＫＡＨポリペプチドは、組換え宿主で特に有用である。S. rebaudiana ＫＡＨ（ＳｒＫＡＨｅ１）（配列番号１６４）をコードするヌクレオチド（配列番号１６３）を、図１２Ａに示す。酵母での発現のためにコドン最適化されたS. rebaudiana ＫＡＨをコードするヌクレオチド（配列番号１６５）を、図１２Ｂに示す。S. rebaudiana ＫＡＨのアミノ酸配列を、図１２Ｃに示す。S. rebaudiana ＫＡＨは、S. cerevisiaeにおいて発現された場合に、Yamaguchiら（米国特許公開第2008/0271205 A1号）に記載のArabidopsis thalianaのｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼと比較して、顕著に高いステビオール合成酵素活性を示す。図１２Ｃに示すS. rebaudiana ＫＡＨポリペプチドは、米国特許公開第2008/0271205号からのＫＡＨと２０％未満の同一性を、および米国特許公開第2008/0064063号からのＫＡＨと３５％未満の同一性を有する。
一部の態様において、組換え微生物は、ＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。かかる微生物はまた、典型的にはシトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有するが、これは、ＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの特定の組み合わせが、外因性ＣＰＲポリペプチドの発現を必要とするためである。特に、植物起源のＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの活性は、外因性ＣＰＲポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことによって、顕著に高めることができる。適切なＣＰＲポリペプチドが知られている。例えば、適切なＣＰＲ酵素としては、Stevia rebaudiana およびArabidopsis thalianaにより作られたものが含まれる。例えば、表４および配列番号１４７および１４８を参照。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７０、７１、７３、および７４に記載されている。配列番号７０〜７２に記載のヌクレオチド配列は、酵母での発現のために修飾した。ポリペプチドが同定されたソースとなる生物からのヌクレオチド配列は、配列番号７３〜７５に記載されている。
例えば、ＳｒＫＡＨｅ１によってコードされるステビオール合成酵素は、遺伝子ＮＣＰ１（ＹＨＲ０４２Ｗ）によってコードされるS. cerevisiaeのＣＰＲにより活性化される。ＳｒＫＡＨｅ１によってコードされるステビオール合成酵素のより良い活性化は、遺伝子ＡＴＲ２によりコードされるArabidopsis thalianaＣＰＲまたは遺伝子ＣＰＲ８によってコードされるS. rebaudiana ＣＰＲが共発現されている場合に、観察される。図１３Ａは、S. cerevisiae、A. thaliana（ＡＴＲ１およびＡＴＲ２遺伝子由来）およびS. rebaudianaのＣＰＲポリペプチド（ＣＰＲ７およびＣＰＲ８遺伝子由来）のアミノ酸配列を含む（配列番号１６６〜１７０）。図１３Ｂは、A. thalianaおよびS. cerevisiaeＣＰＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む（配列番号１７１〜１７４）。
例えば、酵母遺伝子ＤＰＰ１および／または酵母遺伝子ＬＰＰ１は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）のファルネソールへの分解を低減し、かつゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）への分解を低減するように、破壊または削除することができる。代替的に、ホスファターゼをコードする内因性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーエレメントは、それらがコードするタンパク質の発現が改変されるように変更することができる。相同組換えを用いて、内因性遺伝子を破壊することができる。例えば「遺伝子置換」ベクターは、選択マーカー遺伝子を含むような方法で構成することができる。選択マーカー遺伝子は、５’および３’末端両方において十分な長さの遺伝子の部分に動作可能に連結して、相同組換えを媒介することができる。選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質耐性を与え、または色の変化をもたらす、任意の数の遺伝子のいずれかとすることができる。遺伝子置換ベクターの直鎖化ＤＮＡ断片は次に、当技術分野で周知の方法を用いて細胞に導入される（下記参照）。ゲノムへの直鎖状断片の組込みおよび遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定することができ、例えば、サザンブロット分析によって確認することができる。選択におけるその使用に続いて、選択マーカーは、例えば、Cre-loxPシステム（例えばGossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173および米国特許公開第20060014264号を参照）により、宿主細胞のゲノムから除去することができる。代替的に、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の一部を含むような方法で構築することができ、ここで該一部は、任意の内因性遺伝子のプロモーター配列を欠いており、遺伝子のコード配列をコードしないか、またはその不活性断片をコードする部分である。「不活性断片」は、遺伝子の完全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の、例えば約１０％未満（例えば約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。遺伝子のかかる部分は、既知のプロモーター配列が遺伝子配列に動作可能に連結されず、ただし停止コドンおよび転写終結配列が、遺伝子配列の一部に動作可能に連結されるような様式で、ベクターに挿入される。このベクターは、遺伝子配列の一部において続いて直鎖化され、細胞に形質転換することができる。単一の相同組換えの方法により、この直鎖化ベクターは次に、遺伝子の内因性対応物に組み込まれる。
組換え微生物におけるこれらの遺伝子の発現により、ゲラニルゲラニル二リン酸のステビオールへの変換がもたらされる。
Ｂ．ステビオール配糖体生合成ポリペプチド
本明細書に記載の組換え宿主は、ステビオールをステビオール配糖体に変換することができる。かかる宿主（例えば微生物）は、１種または２種以上の、ＵＧＴとしても知られているＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子も含む。ＵＧＴは、活性化ヌクレオチド糖から、この場合はステビオールまたはステビオール誘導体の−ＯＨまたは−ＣＯＯＨ部分である受容体部分に、単糖ユニットを転移する。ＵＧＴは、配列相同性に基づいて、ファミリーおよびサブファミリーに分類されている。Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001)。
Ｂ．１ ルブソシド生合成ポリペプチド
ルブソシドの生合成には、ステビオールの１３−ＯＨおよび１９−ＣＯＯＨのグリコシル化が関与する。図２Ａを参照のこと。微生物などの組換え宿主における、ステビオールのルブソシドへの変換は、グルコース単位をステビオールの１３−ＯＨまたは１９−ＣＯＯＨにそれぞれ転移する、ＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７４Ｇ１をコードする遺伝子の発現により、達成することができる。
好適なＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グリコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能する。機能性ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドはまた、ステビオールとステビオール−１９−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼの反応を、触媒することができる。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グリコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能する。機能性ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドはまた、ステビオールとステビオール−１３−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用する、またはウリジン二リン酸グルコース以外の受容体からの糖部分を転移する、グリコシルトランスフェラーゼの反応を、触媒することができる。
機能性ＵＧＴ７４Ｇ１および機能性ＵＧＴ８５Ｃ２を発現する組換え微生物は、ステビオールが培地中の原料として使用されている場合、ルブソシドおよび両方のステビオールモノシド（すなわち、ステビオール１３−Ｏ−モノグルコシドおよびステビオール１９−Ｏ−モノグルコシド）を作ることができる。このような遺伝子の１または２以上は、宿主中に天然に存在してもよい。しかし典型的には、かかる遺伝子は、天然にそれらを有していない宿主（例えば、微生物）中に形質転換された組換え遺伝子である。
本明細書で用いる場合、組換え宿主という用語は、少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によってそのゲノムが増強されているところの宿主を指すことを意図する。かかるＤＮＡ配列としては、限定はされないが、天然には存在しない遺伝子、通常はＲＮＡに転写されないかまたはタンパク質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、および非組換え宿主中に導入することが望まれるその他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含む。典型的には、本明細書に記載の組換え宿主のゲノムは、１または２以上の組換え遺伝子の安定な導入によって増強されることが理解される。一般に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡのレシピエントである宿主中に本来常在していないが、所与の宿主からのＤＮＡセグメントを単離するために、および、続いてそのＤＮＡの１または２以上の追加のコピーを同一の宿主に導入するために、例えば、遺伝子の産物の産生を増強または遺伝子の発現パターンを変化させるために、本発明の範囲内である。一部の例において、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発によって、内因性遺伝子またはＤＮＡ配列を修飾し、または置き換えることもする。好適な組換え宿主には、微生物、植物細胞、および植物が含まれる。
用語「組換え遺伝子」は、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列であって、かかる宿主に同一または類似の遺伝子またはＤＮＡ配列がすでに存在し得るか否かには関係しない。この文脈において「導入された」または「増強された」とは、当技術分野において、人の手によって導入されるかまたは増強されることを意味するとして知られている。したがって、組換え遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であってもよく、または同じ種に由来するかこれに存在するＤＮＡ配列であってもよいが、組換え宿主を形成するために、組換え方法によって宿主に組み込まれている。宿主に導入された組換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得ること、および、ＤＮＡの１または２以上の追加コピーを提供するために導入され、これによりそのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または修飾された発現を可能にすることが、理解される。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドとしては、Stevia rebaudianaにより作られたものが含まれる。ステビアからの機能性ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子は、Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)に報告されている。S. rebaudianaのＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および３に記載されている。酵母での発現のために最適化されたＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２および４に記載されている。ＵＧＴの８５Ｃ２、９１Ｄ２ｅ、７４Ｇ１および７６Ｇ１についてＤＮＡ２．０コドン最適化された配列は、それぞれ配列番号８２、８４、８３および８５に記載されている。以下の「機能性ホモログ」の節に記載された、ＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７４Ｇ１の変異体も参照のこと。例えば、６５、７１、２７０、２８９および３８９の位置に置換を含有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを用いることができる（例えばＡ６５Ｓ、Ｅ７１Ｑ、Ｔ２７０Ｍ、Ｑ２８９Ｈ、およびＡ３８９Ｖ）。
一部の態様において、組換え宿主は微生物である。組換え微生物は、ルブソシドを生産するために、ステビオールを含有する培地上で増殖させることができる。別の態様においてはしかし、組換え微生物は、ステビオール生合成に関与する１または２以上の組換え遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。好適なＣＤＰＳポリペプチドが知られている。例えば適切なＣＤＰＳ酵素には、Stevia rebaudiana、Streptomyces clavuligerus、Bradyrhizobium japonicum、Zea mays、およびArabidopsisにより作られたものが含まれる。例えば、表５および配列番号１２９〜１３１、１５８、および１６０を参照。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４〜３９、１５７および１５９に記載されている。配列番号３４〜３６に記載のヌクレオチド配列は、酵母での発現のために修飾された。ポリペプチドが同定されたソース生物からのヌクレオチド配列が同定され、配列番号３７〜３９に示されている。
一部の態様において、非修飾ポリペプチドのアミノ末端に葉緑体輸送ペプチドを欠くＣＤＰＳポリペプチドを使用することができる。例えば、図１４に示す（配列番号１５７）、Zea maysＣＤＰＳコード配列の５’末端からの最初の１５０ヌクレオチドを、除去することができる。これにより、葉緑体輸送ペプチドをコードする、図１４（配列番号１５８）に示すアミノ酸配列のアミノ末端の５０残基が除去される。切断型ＣＤＰＳ遺伝子を新しいＡＴＧ翻訳開始部位に取り付け、プロモーター、典型的には構成的または高発現プロモーターに、動作可能に連結することができる。切断型コード配列の複数のコピーを微生物発現に導入すると、プロモーターからのＣＤＰＳポリペプチドの発現により、ｅｎｔ−カウレン生合成を指向する炭素フラックスの増加がもたらされる。
ＣＤＰＳ−ＫＳ二機能性タンパク質（配列番号１３６および１３７）を使用することもできる。表６に示すＣＤＰＳ−ＫＳ二機能性酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現のために修飾した（配列番号４８および配列番号４９を参照）。ポリペプチドが初めに同定されたソース生物からのヌクレオチド配列は、配列番号５０および５１に記載されている。Gibberella fujikuroiの二機能性ＣＤＰＳ−ＫＳ酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現のために修飾した（図１５Ａ、配列番号１６１を参照）。
このように、ＵＧＴ７４Ｇ１とＵＧＴ８５Ｃ２に加えてＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ伝子を含む微生物は、ステビオールを原料として使用する必要なしに、ステビオールモノシドおよびルブソシドの両方を生産することができる。
一部の態様において、組換え微生物はさらに、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）をコードする組換え遺伝子を発現する。好適なＧＧＰＰＳポリペプチドが知られている。例えば、好適なＧＧＰＰＳ酵素には、Stevia rebaudiana、Gibberella fujikuroi、Mus musculus、Thalassiosira pseudonana、Streptomyces clavuligerus、Sulfulobus acidocaldarius、Synechococcus種およびArabidopsis thalianaにより作られるものが挙げられる。表７および配列番号１２１〜１２８を参照。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８〜３３に記載されている。配列番号１８〜２５に記載のヌクレオチド配列を、酵母での発現のために修飾し、一方ポリペプチドが同定されたソース生物からのヌクレオチド配列は、配列番号２３〜２６に記載されている。
一部の態様において、組換え微生物はさらに、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生産に関与する組換え遺伝子、例えばメチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路の遺伝子または下で説明されるメバロン酸（ＭＥＶ）経路の遺伝子を発現することができ、低下したホスファターゼ活性を有し、および／または本明細書で説明するように、ショ糖合成酵素（ＳＵＳ）を発現する。
Ｂ．２ レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、およびレバウジオシドＥの生合成ポリペプチド
レバウジオシドＡの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウジオシドＡは以下により形成される：ステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化による１３−Ｏ−ステビオールモノシドの形成、ステビオールモノシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化によるステビオール−１，２−ビオシドの形成、ステビオール−１，２−ビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化によるステビオシドの形成、およびステビオシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化。各グルコシル化反応が起こる順序は変えることができる。図２Ａを参照。
レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＤの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウジオシドＥは以下により形成される：ステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化によるステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの形成、ステビオール１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化によるステビオール−１，２−ビオシドの形成、１，２−ビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化による１，２−ステビオシドの形成、および１，２−ステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化によるレバウジオシドＥの形成。レバウジオシドＤは、レバウジオシドＥのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化により形成される。各グルコシル化反応が起こる順序は変えることができる。例えば、１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化は、経路の最後のステップであってもよく、ここでレバウジオシドＡは経路における中間体である。図２Ｃを参照。
組換え宿主における、ステビオールのレバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、および／またはレバウジオシドＥへの変換は、次の機能性ＵＧＴ：ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、８５Ｃ２、および７６Ｇ１、および任意に９１Ｄ２を発現することによって達成できることが発見された。したがって、これらの４種または５種のＵＧＴの組み合わせを発現する組換え微生物は、ステビオールを原料として用いる場合に、レバウジオシドＡおよびレバウジオシドＤを作ることができる。典型的には、これらの遺伝子の１または２以上が、天然にそれらを持たない微生物中に形質転換された組換え遺伝子である。また、本明細書においてＳＭ１２ＵＧＴと呼ぶＵＧＴは、ＵＧＴ９１Ｄ２を置換可能であることも発見された。
一部の態様において、５種未満（例えば、１、２、３または４種）のＵＧＴが、宿主中で発現される。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１を発現する組換え微生物は、レバウジオシドＡを原料として用いた場合、レバウジオシドＤを作ることができる。２種の機能性ＵＧＴ、すなわちＥＵＧＴ１１および７６Ｇ１、ならびに任意に機能性９１Ｄ１２を発現する組換え微生物は、ルブソシドまたは１，２−ステビオシドを原料として用いた場合、レバウジオシドＤを作ることができる。別の代替案として、３種の機能性ＵＧＴ、すなわちＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、７６Ｇ１、および任意に９１Ｄ１２を発現する組換え微生物は、培地中にモノシドであるステビオール−１３−Ｏグルコシドを与えた場合に、レバウジオシドＤを作ることができる。同様に、組換え微生物中での、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシドの、レバウジオシドＤへの変換は、培地中にステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを与えた場合、ＥＵＧＴ１１、８５Ｃ２、７６Ｇ１、および任意に９１Ｄ１２のＵＧＴをコードする遺伝子の発現により、達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の１または２以上は、天然にそれらを持たない宿主に形質転換された組換え遺伝子である。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドには、上述のものが含まれる。好適なＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオール１，２配糖体であるアクセプター分子のＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’に、グルコース部分を付加する。従ってＵＧＴ７４Ｇ１は、例えば、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−Ｏ−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−Ｏ−グルコース、１３−Ｏ−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能性ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドはまた、グルコース以外の糖類、例えば、ステビオールラムノシドおよびステビオールキシロシドを含有するステビオール配糖体基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒することもできる。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄを参照のこと。好適なＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドとしては、S. rebaudianaによって生産され、Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)に報告されているものを含む。S. rebaudianaＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号７に示す。配列番号７のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現のために最適化し、これを配列番号８に示す。「機能性ホモログ」の節に記載されたＵＧＴ７６Ｇ１変異体も参照のこと。
好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール−１３−モノグルコシド１，２−グルコシラーゼとも呼ばれる）として機能し、グルコース部分を、アクセプター分子であるステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移する。
好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはまた、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分を、アクセプター分子ルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移して、ステビオシドを生産する。ＥＵＧＴ１１ポリペプチドはまた、グルコース部分を、アクセプター分子ルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移して、１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ルブソシドを生産する（図３の化合物２）。
機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはまた、ステビオール１３−Ｏ−グルコシドおよびルブソシド以外のステビオール配糖体基質を利用する反応を、触媒することもできる。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、ステビオシドを基質として用いて、グルコース部分を１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移して、レバウジオシドＥを生産することができる（図３の化合物３参照）。機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはまた、レバウジオシドＡを基質として用いて、グルコース部分をレバウジオシドＡの１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移して、レバウジオシドＤを生産することができる。例に示すように、ＥＵＧＴ１１は、反応を類似の条件下、すなわち、類似の時間、温度、純度およい基質濃度で実施した場合に、対応するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５）の速度よりも少なくとも２０倍速い速度で（例えば、少なくとも２５倍または少なくとも３０倍速く）、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換することができる。したがって、ＥＵＧＴ１１は、類似の条件下でインキュベートされた場合に、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも大量のＲｅｂＤを生産する。
さらに、機能性ＥＵＧＴ１１は、ルブソシドまたはステビオシドを基質とする顕著なＣ−２’の１９−Ｏ−ジグリコシル化活性を示し、一方ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、これらの基質を用いて、検出可能なジグリコシル化活性を有さない。したがって、機能性ＥＵＧＴ１１はＵＧＴ９１Ｄ２ｅから、ステビオール配糖体基質特異性の違いにより区別することができる。図３は、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅによる、１９−Ｏ−１，２ジグリコシル化反応の概略図を提供する。
機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは通常、グルコース部分を、Ｃ−１３位置に１，３結合グルコースを有するステビオール化合物へと転移せず、すなわち、グルコース部分の、ステビオール１，３−ビオシドおよび１，３−ステビオシドへの転移は起こらない。
機能性ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン二リン酸グルコース以外の供与体からの糖部分を転移することができる。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホＤ−キシロシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして作用することができ、キシロース部分をアクセプター分子、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’へと転移する。別の例として、機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホＬ−ラムノシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして作用することができ、ラムノース部分をアクセプター分子、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’へと転移する。
好適なＥＵＧＴ１１ポリペプチドは本明細書に記載されており、Oryza sativa（GenBankアクセッション番号AC133334）からのＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むことができる。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号１５２に記載のアミノ酸列と、少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有することができる（図７参照）。配列番号１５２のアミノ酸列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５３に記載されている。配列番号１５４は、酵母での発現のためにコドン最適化された、配列番号１５２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
適当な機能性ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドには、本明細書に開示されているもの、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＵＧＴ９１Ｄ２ｍと指定されたポリペプチドを含む。Stevia rebaudiana由来の例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号５に示す。配列番号６は、酵母での発現のためにコドン最適化された、配列番号５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。配列番号５のポリペプチドをコードするS. rebaudianaヌクレオチド配列を、配列番号９に示す。S. rebaudiana由来の例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｍポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１０および１２に示し、これらは、それぞれ配列番号１１および１３に示す核酸配列によりコードされる。さらに、配列番号５のアミノ酸残基２０６、２０７、および３４３における置換を含んでいるＵＧＴ９１Ｄ２変異体を用いることができる。例えば、配列番号９５に示すアミノ酸配列であって、野生型ＵＧＴ９２Ｄ２ｅ（配列番号５）Ｇ２０６Ｒ、Ｙ２０７Ｃ、およびＷ３４３Ｒについて次の変異を有するものを用いることができる。さらに、アミノ酸残基２１１および２８６における置換を含むＵＧＴ９１Ｄ２変異体を用いることができる。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２変異体は、配列番号５（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ）の位置２１１においてロイシンに対してメチオニンの置換を、位置２８６においてバリンに対してアラニンの置換を含むことができる。
上述したように、本明細書においてＳＭ１２ＵＧＴと呼ぶＵＧＴは、ＵＧＴ９１Ｄ２を置換することができる。適当な機能性ＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドとしては、Ipomoea purpurea（日本アサガオ）によって作られ、Morita et al. Plant J. 42, 353-363 (2005)に記載されているものが含まれる。I. purpureaＩＰ３ＧＧＴポリペプチドをコードするアミノ酸配列は、配列番号７６に記載される。配列番号７７は、酵母での発現のためにコドン最適化された、配列番号７６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。別の好適なＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドは、Ｒ２５Ｓ変異を有するＢｐ９４Ｂ１ポリペプチドである。Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308 (2008)およびSawada et al. J. Biol. Chem. 280:899-906 (2005)を参照のこと。Bellis perennis（赤デイジー）ＵＧＴ９４Ｂ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７８に記載される。配列番号７９は、酵母での発現のためにコドン最適化された、配列番号７８のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
一部の態様において、組換え微生物は、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＤを生産するために、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを含有する培地上で増殖させる。かかる態様において、微生物は、機能性ＥＵＧＴ１１、機能性ＵＧＴ７４Ｇ１、機能性ＵＧＴ８５Ｃ２、機能性ＵＧＴ７６Ｇ１、および任意に機能性ＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有してこれを発現し、ステビオール、ステビオールモノシドの一方もしくは両方、またはルブソシドを原料として用いた場合に、レバウジオシドＡおよびレバウジオシドＤを蓄積することができる。
別の態様において、組換え微生物は、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＤを生産するために、ルブソシドを含有する培地上で増殖させる。かかる態様において、微生物は、機能性ＥＵＧＴ１１、機能性ＵＧＴ７６Ｇ１、および任意に機能性ＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有してこれを発現し、ルブソシドを原料として用いた場合に、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＤを生産することができる。
別の態様において、組換え微生物は、ステビオール生合成に関与する１または２種以上の遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。したがって、例えば、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子を、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、および任意に機能性ＵＧＴ９１Ｄ２（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）に加えて含んでいる微生物は、培養培地中にステビオールを含む必要なしに、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、および／またはレバウジオシドＥを生産することができる。
一部の態様において、組換え宿主はさらに、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸のレベルを上昇させて、ステビオール生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えＧＧＰＰＳ遺伝子を含んでこれを発現する。一部の態様において、組換え宿主はさらに、ゲラニルゲラニル二リン酸、ｅｎｔ−カウレン酸またはファルネシルピロリン酸を消費する非ステビオール経路の発現を抑制するコンストラクトを含み、これにより、ステビオールおよびステビオール配糖体生合成経路を通るフラックスを増加させる。例えば、エルゴステロールなどのステロール生産経路へのフラックスは、ＥＲＧ９遺伝子の下方制御により低減することができる。以下のＥＲＧ９の節および例２４〜２５を参照。ジベレリンを産生する細胞では、ジベレリン合成を下方制御して、ｅｎｔ−カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加することができる。カロテノイド産生生物では、ステビオールへのフラックスは、１または２以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方制御によって増加することができる。一部の態様において、組換え微生物はさらに、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生産に関与する組換え遺伝子、例えば下記のＭＥＰまたはＭＥＶ経路の遺伝子を発現することができ、低下したホスファターゼ活性を有し、および／または本明細書に説明するようにＳＵＳを発現する。
当業者は、異なるＵＧＴ遺伝子の相対的発現レベルを調節することにより、組換え宿主が、ステビオール配糖体生成物を所望の割合で特異的に生産するように、調整できることを認識する。ステビオール生合成遺伝子およびステビオール配糖体生合成遺伝子の転写調節は、当業者に周知の技術を用いて、転写活性化と抑制との組み合わせによって達成することができる。in vitroでの反応では、当業者は、ＵＧＴ酵素の様々なレベルの組み合わせを加えることで、または異なるＵＧＴＳの組み合わせの相対的活性に影響を及ぼす条件下で、合成を、各ステビオール配糖体の所望の割合に指向させることを認識する。当業者は、レバウジオシドＤまたはＥのより高い割合、またはレバウジオシドＤまたはＥへのより効率的な変換は、１３−Ｏ−グルコシド反応（基質レバウジオシドＡおよびステビオシド）と比較して、１９−Ｏ−グルコシド反応についてのより高い活性を有するジグリコシル化酵素により、得ることができる。
一部の態様において、微生物などの組換え宿主はレバウジオシドＤ富化ステビオール配糖体組成物を生産し、これは、総ステビオール配糖体の重量の少なくとも３％より多くのレバウジオシドＤ、例えば、少なくとも４％のレバウジオシドＤ、少なくとも５％のレバウジオシドＤ、１０〜２０％のレバウジオシドＤ、２０〜３０％のレバウジオシドＤ、３０〜４０％のレバウジオシドＤ、４０〜５０％のレバウジオシドＤ、５０〜６０％のレバウジオシドＤ、６０〜７０％のレバウジオシドＤ、７０〜８０％のレバウジオシドＤを有するものである。一部の態様において、微生物などの組換え宿主は、少なくとも９０％のレバウジオシドＤ、例えば、９０〜９９％のレバウジオシドＤを有する、ステビオール配糖体組成物を生産する。存在するその他のステビオール配糖体としては、図２Ｃに示すもの、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、およびステビオシドが挙げられる。一部の態様において、宿主（例えば微生物）により生産されたレバウジオシドＤ富化組成物はさらに精製され、こうして精製されたレバウジオシドＤまたはレバウジオシドＥは次に、他のステビオール配糖体、香料、または甘味剤と混合することができて、望ましい香料系または甘味料組成物を得る。例えば、組換え宿主により生産されたレバウジオシドＤ富化組成物は、異なる組換え宿主により生産されたレバウジオシドＡ−、Ｃ−、またはＦ−富化組成物と組み合わせることができ、ここでレバウジオシドＡ、Ｆ、またはＣは、ステビア抽出物から精製されたか、またはin vitroで生産されたものである。
一部の態様において、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＢ、ステビオールモノグルコシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ルブソシド、ステビオシド、またはレバウジオシドＥは、適切なＵＤＰ−糖および／またはＵＤＰ−糖の再生のための無細胞系を供給しつつ、in vitroの方法を用いて生産することができる。例えば、Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008)；Masada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007)を参照。一部の態様において、ショ糖およびショ糖合成酵素は、グリコシル化反応の間に生成されたＵＤＰからＵＤＰ−グルコースを再生するために、反応槽内に供給してもよい。図１１を参照。ショ糖合成酵素は、任意の適切な生物に由来することができる。例えば、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudianaまたはCoffea arabicaからのショ糖合成酵素コード配列を、適切なプロモーターの制御下で発現プラスミドにクローニングし、例えば微生物または植物などの宿主中で発現することができる。
複数の反応を必要とする変換は、同時にまたは段階的に実施することができる。例えば、レバウジオシドＤは、濃縮抽出物として市販されているかまたは生合成を介して生産されたレバウジオシドＡから、ＵＤＰ−グルコースおよびＥＵＧＴ１１の理論量または過剰量を添加して、生産することができる。代替として、レバウジオシドＤは、ＥＵＧＴ１１および好適なＵＧＴ７６Ｇ１酵素を用いて、ステビオシドおよびレバウジオシドＡについて富化されたステビオール配糖体抽出物から生産することができる。一部の態様において、ホスファターゼは、二次生成物を除去し、反応収率を改善するために使用される。in vitro反応のためのＵＧＴおよび他の酵素は、可溶性形態または固定化形態で提供することができる。
一部の態様において、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＥは、植物抽出物由来のステビオール配糖体の混合物を含むステビオールおよび／またはステビオール配糖体などの前駆体分子を含有する原材料を供給された全細胞を用いて、生産することができる。原材料は、細胞増殖中または細胞増殖の後に供給することができる。全細胞は懸濁液中にあるか、または固定化することができる。全細胞は、例えば、アルギン酸カルシウムビーズまたはアルギン酸ナトリウムビーズなどのビーズに捕捉されていてもよい。全細胞は、中空繊維管反応器系に連結されてもよい。全細胞を濃縮し、膜反応器系内に封入してもよい。全細胞は、発酵ブロス中または反応緩衝液中であってもよい。一部の態様において、透過化剤は、基質の細胞内への効率的転移のために利用される。一部の態様において、細胞を、トルエンなどの溶媒、またはTriton-XまたはTweenなどの洗浄剤を用いて透過化処理する。一部の態様において、細胞を、界面活性剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤で透過化処理する。一部の態様において、細胞を、エレクトロポレーションまたはわずかな浸透圧ショックなどの周期的な機械的ショックにより透過化処理する。細胞は１種の組換えＵＧＴまたは複数の組換えＵＧＴを含むことができる。例えば、細胞は、ステビオシドとＲｅｂＡの混合物が効率的にＲｅｂＤに変換されるように、ＵＧＴ ７６Ｇ１とＥＵＧＴ１１を含むことができる。一部の態様において、全細胞は、第ＩＩＩＡ節に記載の宿主細胞である。一部の態様において、全細胞は、E. coliなどのグラム陰性細菌である。一部の態様において、全細胞は、例えばBacillusなどのグラム陽性細菌である。一部の態様において、全細胞は、例えばAspergillusなどの真菌種、またはSaccharomycesなどの酵母である。一部の態様において、用語「全細胞生体触媒」とは、上記のように全細胞を増殖させて（例えば、培地中に、および任意に透過化処理して）ｒｅｂＡまたはステビオシド等の基質を提供し、細胞からの酵素を用いて最終産物に変換するようなプロセスを指すために用いられる。細胞は、生存可能であってもなくてもよいし、生物変換反応の間に増殖しても、しなくてもよい。対照的に発酵では、細胞は増殖培地で培養され、炭素およびグルコースなどのエネルギー源が供給され、最終産物は生細胞で産生される。
Ｂ．３ ズルコシドＡおよびレバウジオシドＣの生合成ポリペプチド
レバウジオシドＣおよび／またはズルコシドＡの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化およびラムノシル化が関与する。具体的には、ズルコシドＡは以下により形成することができる：ステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化によるステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの形成、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコシドのＣ−２’のラムノシル化による１，２ラムノビオシドの形成、および１，２ラムノビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化。レバウジオシドＣは、ズルコシドＡのＣ−１３−Ｏ−グルコ−スのＣ−３’のグルコシル化により形成することができる。各グリコシル化反応が起こる順序は変えることができる。図２Ｂを参照。
組換え宿主における、ステビオールのズルコシドＡへの変換は、次の機能性ＵＧＴ：８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１および／または９１Ｄ２ｅ、および７４Ｇ１をコードする遺伝子（単数または複数）の発現によって達成できることが発見された。したがって、これらの３種または４種のＵＧＴおよびラムノース合成酵素を発現する組換え微生物は、培地中にステビオールを供給した場合、ズルコシドＡを作ることができる。代替的に、２種のＵＧＴ、すなわちＥＵＧＴ１１と７４Ｇ１、およびラムノース合成酵素を発現する組換え微生物は、モノシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを培地中に供給した場合に、ズルコシドＡを生産することができる。同様に、組換え微生物におけるステビオールのレバウジオシドＣへの変換は、ステビオールを供給する場合は、ＵＧＴである８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、７６Ｇ１、任意に９１Ｄ２、およびラムノース合成酵素をコードする遺伝子（単数または複数）の発現により；ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドを供給する場合は、ＵＧＴであるＥＵＧＴ１１、および／または９１Ｄ２、７４Ｇ１、および７６Ｇ１、およびラムノース合成酵素をコードする遺伝子の発現により；ステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを供給する場合は、ＵＧＴである８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、および／または９１Ｄ２ｅ、７６Ｇ１、およびラムノース合成酵素をコードする遺伝子の発現により；または、ルブソシドを供給する場合は、ＵＧＴであるＥＵＧＴ１１、および／または９１Ｄ２ｅ、７６Ｇ１、およびラムノース合成酵素をコードする遺伝子の発現により、達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の１または２以上は、天然にそれらを持たない微生物中に形質転換された組換え遺伝子である。
好適なＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドとしては、本明細書に記載の機能性ＵＧＴポリペプチドが含まれる。ラムノース合成酵素は、ステビオール化合物受容体のラムノシル化のためのＵＤＰ−ラムノース供与体の量を増加させる。適切なラムノース合成酵素には、Arabidopsis thalianaにより作られたものを含み、例えばA. thalianaＲＨＭ２遺伝子の産物である。
一部の態様において、ＵＧＴ７９Ｂ３ポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドを置換する。好適なＵＧＴ７９Ｂ３ポリペプチドには、Arabidopsis thalianaにより作られたものを含み、これらはステビオール１３−Ｏモノシドをin vitroでラムノシル化することができる。A. thalianaＵＧＴ７９Ｂ３は、グルコシル化化合物をラムノシル化して、１，２−ラムノシドを形成することができる。Arabidopsis thalianaのＵＧＴ７９Ｂ３のアミノ酸配列を配列番号１５０に示す。配列番号１５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１５１に示す。
一部の態様において、レバウジオシドＣは、ＵＤＰ−糖の再生のための適切なＵＤＰ−糖および／または無細胞系を供給しつつ、in vitroの方法を用いて生産することができる。例えば、Jewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJおよびSwartz JRによる、“An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology” in Molecular Systems Biology, 4, article 220 (2008)およびMasada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007)などを参照。一部の態様において、ショ糖およびショ糖合成酵素を、グリコシル化反応の間にＵＤＰからＵＤＰ−グルコースを再生するために、反応槽内に供給してもよい。図１１を参照のこと。ショ糖合成酵素は、任意の適切な生物に由来することができる。例えば、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudianaまたはCoffea arabicaからのショ糖合成酵素コード配列を、適切なプロモーターの制御下で発現プラスミドにクローニングし、宿主（例えば、微生物または植物）において発現することができる。一部の態様において、ＲＨＭ２酵素（ラムノース合成酵素）をＮＡＤＰＨと共に供給して、ＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ラムノースを生成することができる。
反応は、同時にまたは段階的に行うことができる。例えば、レバウジオシドＣは、理論量のＵＤＰ−ラムノースおよびＥＵＧＴ１１の添加と、続くＵＧＴ７６Ｇ１および理論量または過剰なＵＤＰ−グルコースの添加により、生産することができる。一部の態様において、ホスファターゼを用いて二次生成物を除去し、反応収率を改善する。in vitro反応のためのＵＧＴおよび他の酵素は、可溶性形態または固定化形態で提供することができる。一部の態様において、レバウジオシドＣ、ズルコシドＡ、または他のステビオールラムノシドは、上述のように全細胞を用いて生産することができる。細胞は、１つの組換えＵＧＴまたは複数の組換えＵＧＴを含むことができる。例えば、細胞は、ステビオシドとＲｅｂＡの混合物が効率的にＲｅｂＤに変換されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１とＥＵＧＴ１１を含むことができる。一部の態様において、全細胞は、第ＩＩＩＡ節に記載された宿主細胞である。
他の態様において、組換え宿主は、ステビオール生合成に関与する１種または２種以上の遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。したがって、例えば、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子を、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＥＵＧＴ１１遺伝子、任意にＵＧＴ９１Ｄ２ｅ遺伝子、およびＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子に加えて含んでいる微生物は、培養培地中にステビオールを含む必要なしに、レバウジオシドＣを生産することができる。さらに、組換え宿主は典型的には、ラムノース合成酵素をコードする内因性または組換え遺伝子を発現する。かかる遺伝子は、ステビオール化合物受容体のラムノシル化のためのＵＤＰ−ラムノース供与体の増加した量を提供するのに有用である。適切なラムノース合成酵素としては、A. thaliana ＲＨＭ２遺伝子の産物などの、Arabidopsis thalianaによって作られたものが含まれる。
当業者は、異なるＵＧＴ遺伝子の相対的発現レベルを調節すること、およびＵＤＰ−ラムノースの利用可能性を調節することにより、組換え宿主が、ステビオール配糖体生成物を所望の割合で特異的に生産するように、調整できることを認識する。ステビオール生合成遺伝子およびステビオール配糖体生合成遺伝子の転写調節は、当業者に周知の技術を用いて、転写活性化と抑制との組み合わせにより達成することができる。in vitroでの反応では、当業者は、ＵＧＴ酵素の様々なレベルの組み合わせを加えることで、または異なるＵＧＴＳの組み合わせの相対的活性に影響を及ぼす条件下で、合成を、各ステビオール配糖体の所望の割合に指向させることを認識する。
一部の態様において、組換え宿主はさらに、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸のレベルを上昇させてレバウジオシドＡ生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えＧＧＰＰＳ遺伝子を含みこれを発現する。一部の態様において、組換え宿主はさらに、ゲラニルゲラニル二リン酸、ｅｎｔ−カウレン酸またはファルネシルピロリン酸を消費する非ステビオール経路の発現を抑制または低減するコンストラクトをさらに含み、これにより、ステビオールおよびテビオール配糖体の生合成経路を介してフラックスを増加させる。例えば、エルゴステロールなどのステロール生産経路へのフラックスは、ＥＲＧ９遺伝子の下方制御により低減することができる。以下のＥＲＧ９の節および例２４〜２５を参照。ジベレリンを産生する細胞では、ジベレリン合成を下方制御して、ｅｎｔ−カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加することができる。カロテノイド生産生物において、ステビオールへのフラックスは、１または２以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方制御によって増加することができる。
一部の態様において、組換え宿主はさらに、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生産に関与する組換え遺伝子、例えばＭＥＰまたはＭＥＶ経路における遺伝子を含んでこれを発現し、低下したホスファターゼ活性を有し、および／または本明細書に説明するようにＳＵＳを発現する。
一部の態様において、微生物などの組換え宿主は、総ステビオール配糖体に対して少なくとも１５％より多くのレバウジオシドＣを、例えば少なくとも２０％のレバウジオシドＣ、３０〜４０％のレバウジオシドＣ、４０〜５０％のレバウジオシドＣ、５０〜６０％のレバウジオシドＣ、６０〜７０％のレバウジオシドＣ、７０〜８０％のレバウジオシドＣ、８０〜９０％のレバウジオシドＣを有するステビオール配糖体組成物を生産する。一部の態様において、微生物などの組換え宿主は、少なくとも９０％のレバウジオシドＣを、例えば９０〜９９％のレバウジオシドＣを有するステビオール配糖体組成物を生産する。存在するその他のステビオール配糖体としては、図２ＡおよびＢに示されているもの、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、ステビオールラムノビオシド、レバウジオシドＡ、およびズルコシドＡを含んでよい。一部の態様において、宿主により生産されたレバウジオシドＣ富化組成物はさらに精製され、こうして精製されたレバウジオシドＣまたはズルコシドＡは次に、他のステビオール配糖体、香料、または甘味剤と混合されて、所望のフレーバー系または甘味組成物を得る。例えば、組換え微生物により生産されたレバウジオシドＣ富化組成物は、異なる組換え微生物によって生産されたレバウジオシドＡ、ＦまたはＤが富化された組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウジオシドＡ、ＦまたはＤと、またはin vitroで生産されたレバウジオシドＡ、ＦまたはＤと、組み合わせることができる。
Ｂ．４ レバウジオシドＦ生合成ポリペプチド
レバウジオシドＦの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化およびキシロシル化が関与する。具体的には、レバウジオシドＦは、以下により形成される：ステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化による、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの形成、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のキシロシル化による、ステビオール−１，２−キシロビオシドの形成、１，２−キシロビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化による、１，２−ステビオキシロシドの形成、および１，２−ステビオキシロシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化による、レバウジオシドＦの形成。各グルコシル化反応が起こる順序は変えることができる。図２Ｄを参照。
組換え宿主におけるステビオールのレバウジオシドＦへの変換は、以下の機能性ＵＧＴ：８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、および／または９１Ｄ２ｅ、７４Ｇ１、および７６Ｇ１をコードする遺伝子を、内因性または組換え発現されたＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼと共に発現することによって達成できることが発見された。したがって、これらの４種または５種のＵＧＴを内因性または組換えＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼと共に発現する組換え微生物は、培地中にステビオールを供給した場合に、レバウジオシドＦを作ることができる。代替的に、２種の機能性ＵＧＴ、ＥＵＧＴ１１または９１Ｄ２ｅ、および７６Ｇ１を発現する組換え微生物は、培地中にルブソシドを供給した場合に、レバウジオシドＦを作ることができる。別の代替案として、機能性ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する組換え微生物は、１，２−ステビオラムノシドを供給した場合に、レバウジオシドＦを作ることができる。別の代替案として、７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１および／または９１Ｄ２ｅ、７６Ｇ１を発現する組換え微生物は、培地中にモノシド、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドを供給した場合に、レバウジオシドＦを作ることができる。同様に、組換え微生物における、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシドのレバウジオシドＦへの変換は、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを供給した場合、ＵＧＴである８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、および／または９１Ｄ２ｅ、および７６Ｇ１をコードする遺伝子の発現により達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の１または２以上は、天然にそれらを持たない宿主中に形質転換された組換え遺伝子である。
好適なＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドには、本明細書に記載の機能性ＵＧＴポリペプチドが含まれる。一部の態様において、上述のように、ＵＧＴ７９Ｂ３ポリペプチドはＵＧＴ９１を置換する。ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼは、ステビオール化合物受容体のキシロシル化のためのＵＤＰ−キシロース供与体の量を増加させる。好適なＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼとしては、Arabidopsis thalianaまたはCryptococcus neoformansによって作られたものが含まれる。例えば、好適なＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、それぞれ、A. thalianaのＵＧＤ１遺伝子およびＵＸＳ３遺伝子によってコードされることができる。Oka and Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006)を参照。
一部の態様において、レバウジオシドＦは、ＵＤＰ−糖の再生のための適切なＵＤＰ−糖および／または無細胞系を供給しつつ、in vitroの方法を用いて生産することができる。例えば、Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008)；Masada S et al. FEBS Letters, Vol. 581, 2562-2566 (2007)を参照。一部の態様において、ショ糖およびショ糖合成酵素を、グリコシル化反応の間にＵＤＰからＵＤＰ−グルコースを再生するために、反応槽内に供給してもよい。図１１を参照のこと。ショ糖合成酵素は、任意の適切な生物に由来することができる。例えば、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudianaまたはCoffea arabicaからのショ糖合成酵素コード配列を、適切なプロモーターの制御下で発現プラスミドにクローニングし、宿主（例えば、微生物または植物）において発現することができる。一部の態様において、適切な酵素、例えばArabidopsis thalianaのＵＧＤ１（ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ）およびＵＸＳ３（ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼ）酵素をＮＡＤ＋補因子と共に供給することにより、ＵＤＰ−キシロースをＵＤＰ−グルコースから生産することができる。
反応は、同時にまたは段階的に行うことができる。例えば、レバウジオシドＦは、ルブソシドから、理論量のＵＤＰ−キシロースおよびＥＵＧＴ１１の添加と、続いてＵＧＴ７６Ｇ１および過剰または理論量のＵＤＰ−グルコースの添加により、生産することができる。一部の態様において、ホスファターゼを用いて二次生成物を除去し、反応収率を改善する。in vitro反応のためのＵＧＴおよび他の酵素は、可溶性形態または固定化形態で提供することができる。一部の態様において、レバウジオシドＦまたは他のステビオールキシロシドは、上述のように全細胞を用いて生産することができる。例えば、細胞は、ステビオシドとＲｅｂＡの混合物が効率的にＲｅｂＤに変換されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＥＵＧＴ１１を含むことができる。一部の態様において、全細胞は、第ＩＩＩＡ節に記載された宿主細胞である。
他の態様において、組換え宿主は、ステビオール生合成に関与する１種または２種以上の遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。したがって、例えば、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子を、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、任意にＵＧＴ９１Ｄ２ｅ遺伝子、およびＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子に加えて含んでいる微生物は、培養培地中にステビオールを含む必要なしに、レバウジオシドＦを生産することができる。さらに、組換え宿主は典型的には、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする内因性または組換え遺伝子を発現する。かかる遺伝子は、ステビオール化合物受容体のキシロシル化のためのＵＤＰ−キシロース供与体の増加した量を提供するのに有用である。適切なＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼとしては、Arabidopsis thaliana またはCryptococcus neoformansによって作られたものが含まれる。例えば、適切なＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、それぞれ、A. thalianaのＵＧＤ１遺伝子およびＵＸＳ３遺伝子によってコードされることができる。Oka and Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006)を参照。
当業者は、異なるＵＧＴ遺伝子の相対的発現レベルを調節すること、およびＵＤＰ−キシロースの利用可能性を調節することにより、組換え宿主が、ステビオール配糖体生成物を所望の割合で特異的に生産するように、調整できることを認識する。ステビオール生合成遺伝子の転写調節は、当業者に周知の技術を用いて、転写活性化と抑制との組み合わせによって達成することができる。in vitroでの反応では、当業者は、ＵＧＴ酵素の様々なレベルの組み合わせを加えることで、または異なるＵＧＴＳの組み合わせの相対的活性に影響を及ぼす条件下で、合成を、各ステビオール配糖体の所望の割合に指向させることを認識する。
一部の態様において、組換え宿主はさらに、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸のレベルを上昇させてレバウジオシドＡ生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えＧＧＰＰＳ遺伝子を含んでこれを発現する。一部の態様において、組換え宿主はさらに、ゲラニルゲラニル二リン酸、ｅｎｔ−カウレン酸またはファルネシルピロリン酸を消費する非ステビオール経路の発現を抑制するコンストラクトをさらに含み、これにより、ステビオールおよびテビオール配糖体の生合成経路を介してフラックスを増加させる。例えば、エルゴステロールなどのステロール生産経路へのフラックスは、ＥＲＧ９遺伝子の下方制御により低減することができる。以下のＥＲＧ９の節および例２４〜２５を参照。ジベレリンを生産する細胞では、ジベレリン合成を下方制御して、ｅｎｔ−カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加することができる。カロテノイド生産生物において、ステビオールへのフラックスは、１または２以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方制御によって増加することができる。一部の態様において、組換え宿主はさらに、ジテルペン生合成に関与する組換え遺伝子、例えば下記のＭＥＰ経路の遺伝子を含み、これを発現する。
一部の態様において、微生物などの組換え宿主はレバウジオシドＦ富化ステビオール配糖体組成物を生産し、これは、総ステビオール配糖体の重量に対して少なくとも４％より多くのレバウジオシドＦを、例えば少なくとも５％のレバウジオシドＦ、少なくとも６％のレバウジオシドＦ、１０〜２０％のレバウジオシドＦ、２０〜３０％のレバウジオシドＦ、３０〜４０％のレバウジオシドＦ、４０〜５０％のレバウジオシドＦ、５０〜６０％のレバウジオシドＦ、６０〜７０％のレバウジオシドＦ、７０〜８０％のレバウジオシドＦを有するものである。一部の態様において、微生物などの組換え宿主は、少なくとも９０％のレバウジオシドＦを、例えば９０〜９９％のレバウジオシドＦを有するステビオール配糖体組成物を生産する。存在するその他のステビオール配糖体としては、図２ＡおよびＤに示されているもの、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、ステビオールキシロビオシド、レバウジオシドＡ、ステビオキシロシド、ルブソシドおよびステビオシドを含んでよい。一部の態様において、宿主により生産されたレバウジオシドＦ富化組成物は、他のステビオール配糖体、香料、または甘味剤と混合して、所望のフレーバー系または甘味組成物を得る。例えば、組換え微生物により生産されたレバウジオシドＦ富化組成物は、異なる組換え微生物によって生産されたレバウジオシドＡ、ＣまたはＤが富化された組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウジオシドＡ、ＣまたはＤと、またはin vitroで生産されたレバウジオシドＡ、ＣまたはＤと、組み合わせることができる。
Ｃ．その他のポリペプチド
ステビオールまたはステビオール配糖体のより効率的またはより大規模な生産をその発現が促進するところの追加のポリペプチドに対する遺伝子も、組換え宿主に導入することができる。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞はまた、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳまたはＧＧＤＰＳと称される）をコードする１または２以上の遺伝子も含有することができる。別の例として、組換え宿主は、ラムノース合成酵素をコードする１または２以上の遺伝子、またはＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよび／またはＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする１または２以上の遺伝子を、含有することができる。別の例として、組換え宿主はまた、シトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）をコードする１または２以上の遺伝子を含有することができる。組換えＣＰＲの発現は、ＮＡＤＰ＋の循環を促進してＮＡＤＰＨを再生し、これはテルペノイド生合成のための補因子として利用される。他の方法もＮＡＤＨＰレベルを再生するために使用することができる。ＮＡＤＰＨが制限的となる状況において、株はさらに、外因性トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むように修飾することができる。例えば、Sauer et al., J. Biol. Chem. 279: 6613-6619 (2004)を参照。所望の補因子レベルが増大されるように、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの比率を低下するかまたはその他で変更するための他の方法は、当業者に周知である。
別の例として、組換え宿主は、ＭＥＰ経路またはメバロン酸経路における１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含有することができる。かかる遺伝子は有用であり、その理由は、ジテルペン生合成経路への炭素のフラックスを増加させることができて、ゲラニルゲラニル二リン酸をイソペンテニル二リン酸から、およびジメチルアリル二リン酸を経路により生産するからである。こうして生産されたゲラニルゲラニル二リン酸は、ステビオール生合成ポリペプチドおよびステビオール配糖体生合成ポリペプチドの発現により、ステビオールおよびステビオール配糖体生合成へと指向される。
別の例として、組換え宿主は、ショ糖合成酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含むことができ、さらに、所望によりショ糖取り込み遺伝子を含有することができる。ショ糖合成酵素反応は、発酵宿主においてまたは全細胞生物変換プロセス中での、ＵＤＰ−グルコースプールを増加するために使用することができる。これは、グリコシル化の間に生産されたＵＤＰおよびショ糖からＵＤＰ−グルコースを再生し、効率的なグリコシル化を可能にする。一部の生物において、内因性インベルターゼの破壊は、ショ糖の分解を防止するのに有利である。例えば、S. cerevisiaeＳＵＣ２インベルターゼが破壊されてよい。ショ糖合成酵素（ＳＵＳ）は、任意の適切な生物由来であり得る。例えば、限定はされないが、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudianaまたはCoffea arabicaからのショ糖合成酵素コード配列を、適切なプロモーターの制御下で発現プラスミドにクローニングすることができ、宿主（例えば、微生物または植物）において発現される。ショ糖合成酵素はかかる株において、ショ糖トランスポーター（例えば、A. thaliana ＳＵＣ１トランスポーターまたはその機能性ホモログ）および１または２以上のＵＧＴ（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１またはその機能性ホモログの１または２以上）と組み合わせて、発現することができる。ショ糖を含む培地中で宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースだけでなく、１または２以上のグルコシド（例えばステビオール配糖体）の生産を促進することができる。
さらに、本明細書で説明するように、組換え宿主は低下したホスファターゼ活性を有し得る。
Ｃ．１ ＭＥＰ生合成ポリペプチド
一部の態様において、組換え宿主は、イソプレノイド生合成のためのメチルエリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含む。ＭＥＰ経路の酵素としては、デオキシキシルロース５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール合成酵素（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸合成酵素（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸合成酵素（ＨＤＳ）および１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸合成酵素（ＨＤＲ）を含む。１または２以上のＤＸＳ遺伝子、ＤＸＲ遺伝子、ＣＭＳ遺伝子、ＣＭＫ遺伝子、ＭＣＳ遺伝子、ＨＤＳ遺伝子および／またはＨＤＲ遺伝子を、組換え微生物に組み込むことができる。Rodriguez-Concepcion and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002)を参照。
ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＣＭＳ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＳおよび／またはＨＤＲポリペプチドをコードする適切な遺伝子としては、E. coli、Arabidopsis thalianaおよびSynechococcus leopoliensisによって作られるものが含まれる。ＤＸＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば米国特許第7335815号に記載されている。
Ｃ．２ メバロン酸生合成ポリペプチド
一部の態様において、組換え宿主は、イソプレノイド生合成のためのメバロン酸経路に関与する酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含む。宿主への形質転換に適した遺伝子は、メバロン酸経路における酵素をコードし、例えば、切断型３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡ還元酵素（ｔＨＭＧ）、および／またはメバロン酸キナーゼ（ＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＰＤ）をコードする遺伝子である。したがって、１または２以上のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＭＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子、および／またはＭＰＰＤ遺伝子は、微生物などの組換え宿主に組み込むことができる。
メバロン酸経路ポリペプチドをコードする適切な遺伝子が知られている。例えば、適切なポリペプチドとしては、E. coli、Paracoccus denitrificans、Saccharomyces cerevisiae、Arabidopsis thaliana、Kitasatospora griseola、Homo sapiens、Drosophila melanogaster、Gallus gallus, Streptomyces種KO-3988、Nicotiana attenuata、Kitasatospora griseola、Hevea brasiliensis、 Enterococcus faecium、およびHaematococcus pluvialisにより作られたものを含む。例えば、表８および米国特許第7,183,089号、第5,460,949号、および第5,306,862号を参照。
Ｃ．３ ショ糖合成酵素ポリペプチド
ショ糖合成酵素（ＳＵＳ）は、ＵＤＰ−糖を生成するためのツールとして使用することができる。ＳＵＳ（EC 2.4.1.13）は、ＵＤＰ−グルコースおよび果糖の、ショ糖およびＵＤＰからの形成を触媒する（図１１）。したがってＵＧＴの反応により生成されたＵＤＰは、ショ糖の存在下でＵＤＰ−グルコースに変換することができる。例えば、Chen et al. (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:8866-8867；Shao et al. (2003) Appl. Env. Microbiol. 69:5238-5242；Masada et al. (2007) FEBS Lett. 581:2562-2566；およびSon et al. (2009) J. Microbiol. Biotechnol. 19:709-712を参照。
ショ糖合成酵素は、ＵＤＰ−グルコースを生成してＵＤＰを除去するために使用することができ、様々な系における化合物の効率的なグリコシル化を促進する。例えば、ショ糖を利用する能力が欠損した酵母を、ショ糖トランスポーターおよびＳＵＳを導入することにより、ショ糖上で増殖させることができる。例えば、Saccharomyces cerevisiaeは効率的なショ糖取り込み系を有さず、ショ糖の利用には細胞外ＳＵＣ２に依存する。内因性のS. cerevisiae ＳＵＣ２インベルターゼを破壊することと組換えＳＵＳを発現することの組み合わせは、細胞外ではなく細胞内のショ糖を代謝可能な酵母株をもたらした（Riesmeier et al. ((1992) EMBO J. 11:4705-4713）。この株は、ｃＤＮＡ発現ライブラリによる形質転換および、ショ糖を取り込む能力を得た形質転換体の選択によって、ショ糖トランスポーターを単離するために用いられた。
本明細書に記載されるように、in vivoでの組換えショ糖合成酵素とショ糖トランスポーターの合わせた発現が、ＵＤＰ−グルコースの利用可能性の増加と望ましくないＵＤＰの除去をもたらすことができる。例えば、組換えショ糖合成酵素、ショ糖トランスポーター、およびグリコシルトランスフェラーゼの機能的発現を、天然のショ糖分解系（S. cerevisiaeの場合はＳＵＣ２）のノックアウトと組み合わせて、増加した量のグリコシル化化合物、例えばステビオール配糖体を産生可能な細胞を生産するために用いることができる。このより高いグリコシル化能力は、少なくとも、（ａ）ＵＤＰ−グルコースをよりエネルギー効率の高い様式で産生する高い能力、および（ｂ）増殖培地からのＵＤＰの除去（ＵＤＰがグリコシル化反応を阻害できるため）、によるものである。
ショ糖合成酵素は、任意の適切な生物に由来することができる。例えば、限定はされないが、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudiana、またはCoffea arabicaからのショ糖合成酵素コード配列（例えば、図１９Ａ〜１９Ｃ、配列番号１７８、１７９および１８０参照）を、適切なプロモーターの制御下で発現プラスミドにクローニングし、宿主（例えば、微生物または植物）中に発現することができる。本明細書の実施例に記載されるように、ＳＵＳコード配列をＳＵＣ２（ショ糖加水分解酵素）欠損のS. cerevisiae株に発現させて、酵母による細胞外のショ糖の分解を回避することができる。ショ糖合成酵素を、かかる株において、ショ糖トランスポーター（例えば、A. thalianaＳＵＣ１トランスポーターまたはその機能性ホモログ）および１または２以上のＵＧＴ（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはそれらの機能性ホモログの１種または２種以上）と組み合わせて発現させることができる。ショ糖を含有する培地中で宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースだけでなく、１または２以上のグルコシド（例えば、ステビオールグルコシド）の生産を促進することができる。いくつかの場合において、ショ糖合成酵素およびショ糖トランスポーターは、特定の化合物（例えば、ステビオール）の生産のための組換え体でもある宿主細胞において、ＵＧＴと共に発現可能であることにも留意されたい。
Ｃ．４ ＥＲＧ９活性の調節
本開示の目的は、スクアレン経路のテルペノイド前駆体の蓄積を増加させるという概念に基づいて、テルペノイドを生産することである。テルペノイドの非限定的な例としては、ヘミテルペノイド、１イソプレン単位（５個の炭素）；モノテルペノイド、２イソプレン単位（１０Ｃ）；セスキテルペノイド、３イソプレン単位（１５Ｃ）；ジテルペノイド、４イソプレン単位（２０Ｃ）（例えばギンコライド）；トリテルペノイド、６イソプレン単位（３０Ｃ）；テトラテルペノイド、８イソプレン単位（４０Ｃ）（例えばカロテノイド）；および多数のイソプレン単位のポリテルペノイドが挙げられる。
ヘミテルペノイドとしては、イソプレン、プレノールおよびイソ吉草酸が挙げられる。モノテルペノイドとしては、ゲラニルピロリン酸、ユーカリプトール、リモネンおよびピネンが挙げられる。セスキテルペノイドとしては、ファルネシルピロリン酸、アルテミシニンおよびビサボロールが挙げられる。ジテルペノイドとしては、ゲラニルゲラニルピロリン酸、ステビオール、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリンおよびアフィジコリンが挙げられる。トリテルペノイドとしては、スクアレンおよびラノステロールが挙げられる。テトラテルペノイドとしては、リコピンおよびカロテンが挙げられる。
テルペンは、数個のイソプレン単位の組み合わせから得られる炭化水素である。テルペノイドは、テルペン誘導体と考えることができる。テルペンという用語は、テルペノイドを含むように広く用いられることもある。テルペンと同様にテルペノイドも、用いられるイソプレン単位の数に応じて分類することができる。本発明は、テルペノイドに、および特に、前駆体であるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からスクアレン経路を介して誘導されるテルペノイドに焦点を当てる。
テルペノイドとしては、以下が理解されている：限定はされないがイソプレン、プレノールおよびイソ吉草酸などの、ヘミテルペノイドクラスのテルペノイド；限定はされないがゲラニルピロリン酸、ユーカリプトール、リモネンおよびピネンなどの、モノテルペノイドクラスのテルペノイド；限定はされないがファルネシルピロリン酸、アルテミシニンおよびビサボロールなどの、セスキテルペノイドクラスのテルペノイド；限定はされないがゲラニルゲラニルピロリン酸、ステビオール、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリンおよびアフィジコリンなどの、ジテルペノイドクラスのテルペノイド；限定はされないがラノステロールなどの、トリテルペノイドクラスのテルペノイド；限定はされないがリコピンやカロテンなどの、テトラテルペノイドクラスのテルペノイド。
一態様において、本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から生合成されるテルペノイドの生産に関する。特に、かかるテルペノイドはステビオールであってよい。
一態様において、本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から生合成されるテルペノイドの生産に関する。特に、かかるテルペノイドはステビオールであってよい。
細胞
本発明は、第ＩＩＩ節に記載の任意の宿主などの細胞であって、図２２に示したコンストラクトを含むように修飾された前記細胞に関する。したがって主要な側面において、本発明は、核酸配列を含む細胞であって、該核酸配列が、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的であり、かつこれとヘアピン二次構造要素を形成する、少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
および式中、Ｘ３は任意であり、存在する場合は、Ｘ２とＸ４の間のヘアピンループの形成に関与するヌクレオチドを含み、
および式中、Ｘ１およびＸ５は、独立しておよび任意に、１または２以上のヌクレオチドを含み、および、
式中、前記オープンリーディングフレームは、発現すると、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）をコードし、例えばスクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）またはその生物学的活性断片と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド配列をコードし、前記断片は、前記スクアレン合成酵素と、少なくとも１００個のアミノ酸のオーバーラップの範囲内で少なくとも７０％の配列同一性を有する、
を有する、前記細胞に関する。
異種挿入配列を含む上述の核酸に加えて、細胞はまた、１または２以上の追加の異種核酸配列（例えば、第Ｉ節のステビオールおよびステビオール配糖体生合成ポリペプチドのいずれかをコードする核酸）を含んでもよい。１つの好ましい態様において、細胞は、該細胞におけるＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含む。
異種挿入配列
異種挿入配列は、ヘアピンの二次構造要素をヘアピンループに適合させることができる。ヘアピン部分は、互いに相補的でハイブリダイズする部分Ｘ２およびＸ４を含む。Ｘ２およびＸ４部分は、ループ、すなわちヘアピンループを形成するヌクレオチドを含む部分Ｘ３に隣接する。相補的という用語は、当業者により、互いにヌクレオチド毎に、５’末端から３’末端または逆向きに数えて比較した２つの配列を意味すると理解される。
異種挿入配列は、ヘアピンを完成するのに十分長く、異種挿入配列の３’末端直後のインフレームに存在するＯＲＦの限定翻訳を可能にするのに十分短い。したがって一態様において、異種挿入配列は、１０〜５０ヌクレオチドを、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２２ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２１ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２０ヌクレオチド、より好ましくは１９ヌクレオチドを含む。
Ｘ２およびＸ４は、独立して、Ｘ２の少なくとも４個のヌクレオチドの連続した配列が、Ｘ４の少なくとも４個のヌクレオチドの連続した配列に相補的であれば、任意の適切な数のヌクレオチドからなることができる。好ましい態様において、Ｘ２およびＸ４は、同数のヌクレオチドからなる。
Ｘ２は例えば、４〜２５の範囲（４〜２０の範囲など）、例えば４〜１５の範囲（６〜１２の範囲など）、例えば８〜１２の範囲（９〜１１の範囲など）のヌクレオチドからなってよい。
Ｘ４は例えば、４〜２５の範囲（４〜２０の範囲など）、例えば４〜１５の範囲（６〜１２の範囲など）、例えば８〜１２の範囲（９〜１１の範囲など）のヌクレオチドからなってよい。
好ましい一態様において、Ｘ２は、Ｘ４のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなり、すなわちＸ２の全てのヌクレオチドは、Ｘ４のヌクレオチド配列に相補的であることが好ましい。
好ましい一態様において、Ｘ４は、Ｘ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなり、すなわちＸ４の全てのヌクレオチドは、Ｘ２のヌクレオチド配列に相補的であることが好ましい。非常に好ましくは、Ｘ２およびＸ４は同数のヌクレオチドからなり、ここで、Ｘ２は、Ｘ２とＸ４の全長にわたってＸ４に相補的である。
Ｘ３は不在であってよく、すなわち、Ｘ３はゼロのヌクレオチドからなってよい。Ｘ３はまた、１〜５の範囲のヌクレオチド、例えば１〜３の範囲からなることも可能である。
Ｘ１は不在であってよく、すなわち、Ｘ１はゼロのヌクレオチドからなってよい。Ｘ１はまた、１〜２５の範囲（１〜２０の範囲など）、例えば１〜１５の範囲（１〜１０の範囲など）、例えば１〜５の範囲（１〜３の範囲など）のヌクレオチドからなることも可能である。
Ｘ５は不在であってよく、すなわち、Ｘ５はゼロのヌクレオチドからなってよい。Ｘ５はまた、１〜５の範囲のヌクレオチド、例えば１〜３の範囲からなることも可能である。
配列は、本明細書上記で定義された要件を満たす任意の好適な配列であってもよい。したがって、異種挿入配列は、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、および配列番号１８４からなる群から選択される配列を含んでもよい。好ましい態様において、挿入配列は、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、および配列番号１８４からなる群から選択される。
スクアレン合成酵素
スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）は、ステロールの生産を導く生合成経路に最初に関与する酵素である。これは、ファルネシルピロリン酸から中間のプレスクアレンピロリン酸を経由するスクアレンの合成を触媒する。この酵素は、テルペノイド／イソプレノイドの生合成において重要な分岐点となる酵素であり、ステロール経路を介してイソプレン中間体のフラックスを調節すると考えられている。酵素は、ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＤＦＴ１）と呼ばれることもある。
ＳＱＳのメカニズムは、２単位のファルネシルピロリン酸を、スクアレンに変換することである。
少なくとも１つの原核生物が、機能的に類似した酵素を有することが示されてはいるが、ＳＱＳは、真核生物または高等生物の酵素であると考えられている。
構造および力学の観点から、スクアレン合成酵素はフィトエン合成酵素に最も密接に類似しており、このフィトエン合成酵素は、多数の植物において、多くのカロテノイド化合物の前駆体であるフィトエンの精緻化に重要な役割を果たす。
高レベルの配列同一性は、第１の配列が第２の配列に由来する可能性を示している。アミノ酸配列同一性は、２つの整列した配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメントに続いて候補配列中のアミノ酸の７０％が、参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性はコンピュータ解析の支援によって決定することができ、例えば、限定はされないが、Ｄ節に記載のようにClustalWコンピュータアラインメントプログラムである。デフォルト設定でこのプログラムを使用して、クエリおよび参照ポリペプチドの成熟（生物活性）部分を整列させる。完全に保存された残基の数を計数し、参照配列ポリペプチドの長さで割り算する。ClustalWアルゴリズムは、ヌクレオチド配列の整列のために同様に使用してもよい。配列同一性は、アミノ酸配列について示されたものと同様の方法で計算することができる。
１つの重要な態様において、本発明の細胞は、本明細書に定義のように、発現の際に、スクアレン合成酵素が配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、からなる群から選択される前記スクアレン合成酵素に対して、少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％、例えば少なくとも９９．６％、例えば少なくとも９９．７％、例えば少なくとも９９．８％、例えば少なくとも９９．９％、例えば１００％同一であるところのスクアレン合成酵素をコードする核酸配列を含む。
プロモーター
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。プロモーターは、それらが調節する遺伝子の近くに、同一鎖上、典型的には上流側に位置している（センス鎖の５’領域に向かって）。転写が起こるためには、ＲＮＡポリメラーゼとして知られているＲＮＡを合成する酵素が、遺伝子の近くのＤＮＡに付着しなければならない。プロモーターは、特定のＤＮＡ配列ならびに、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子と呼ばれるタンパク質のための、安全な初期結合部位を提供する応答エレメントを含有する。これらの転写因子は、特定のプロモーターに付着して遺伝子発現を調節する対応するヌクレオチドの、特定のアクチベーターまたはリプレッサー配列を有する。
細菌において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連するシグマ因子によって認識され、次に多くの場合、近くにあるそれ自身のＤＮＡ結合部位に結合するアクチベータータンパク質によって、プロモーターＤＮＡに運ばれる。真核生物においてプロセスはより複雑であり、少なくとも７つの異なる因子が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターへの結合のために必要である。プロモーターは、他の調節領域（エンハンサー、サイレンサー、境界要素／絶縁体）と協調して働き、所定の遺伝子の転写レベルを指示することができる、重要な要素を表す。
プロモーターは通常、問題のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に直接隣接しており、プロモーター中の位置は転写開始部位に対して指定され、ここでＲＮＡの転写が、特定遺伝子に対して開始される（すなわち、上流の位置は−１から計測される負の数であり、例えば−１００は、１００塩基対上流の位置である）。
プロモーターエレメント
・ コアプロモーター―適切に転写を開始するために必要なプロモーターの最小部分
O 転写開始部位（ＴＳＳ）
O 開始部位の約−３５ｂｐ上流および／または下流
O ＲＮＡポリメラーゼの結合部位
・ ＲＮＡポリメラーゼＩ：リボソームＲＮＡをコードする遺伝子を転写
・ ＲＮＡポリメラーゼＩＩ：メッセンジャーＲＮＡおよび特定の小核ＲＮＡをコードする遺伝子を転写
・ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ：ｔＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡをコードする遺伝子を転写
O 一般的な転写因子結合部位
・ 近位プロモーター―プライマリ調節エレメントを含有する傾向がある遺伝子の上流の近位配列
O 開始部位の約−２５０ｂｐ上流
O 特定の転写因子結合部位
・ 遠位プロモーター―多くの場合に近位プロモーターよりも弱い影響を有する追加の調節エレメントを含み得る遺伝子の上流の、遠位配列
O さらに上流の全て（ただし、その影響が位置／方向に依存しない、エンハンサーまたはそ他の調節領域を除く）
O 特定の転写因子結合部位
原核生物プロモーター
原核生物において、プロモーターは、転写開始部位の上流の−１０および−３５位置の２つの短い配列から構成される。シグマ因子は、ＲＮＡＰのプロモーターへの結合を高めるのに役立つだけでなく、ＲＮＡＰが、転写する特定の遺伝子を標的化することも助ける。
−１０における配列は、プリブノーボックスまたは−１０エレメントと呼ばれ、通常は６つのヌクレオチドＴＡＴＡＡＴで構成されている。プリブナウボックスは、原核生物において転写を開始するのに不可欠である。
−３５における他の配列（−３５エレメント）は、通常７つのヌクレオチドＴＴＧＡＣＡＴで構成されている。その存在により、非常に高い転写速度が可能となる。
上記のコンセンサス配列の両方は、平均的には保存されているが、ほとんどのプロモーター中で無傷では見出されない。平均して各コンセンサス配列中の６塩基対のわずか３個が、任意の所与のプロモーター中に見出される。−１０および−３５の両方で無傷のコンセンサス配列を有するプロモーターは、今日まで同定されていない；−１０／−３５ヘキサマーの完全な保存を有する人工プロモーターは、非常に高い効率でＲＮＡ鎖の開始を促進することが見出されている。
いくつかのプロモーターは、ＵＰエレメント（コンセンサス配列５’−ＡＡＡＷＷＴＷＴＴＴＴＮＮＮＡＡＡＮＮＮ−３’；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｎ＝任意の塩基）を、−５０を中心に含有する；−３５エレメントの存在は、ＵＰエレメント含有プロモーターからの転写に重要ではないように思われる。
真核生物プロモーター
真核生物のプロモーターは、通常、遺伝子（ＯＲＦ）の上流に位置しており、転写開始部位から数キロ塩基（ｋｂ）離れて調節エレメントを有することができる。真核生物において、転写複合体は、ＤＮＡがそれ自体に折り返すことを誘導でき、これは、実際の転写部位から遠く離れて調節配列を配置すること可能にする。多くの真核生物プロモーターはＴＡＴＡボックス（配列ＴＡＴＡＡＡ）を含み、これは次にＲＮＡポリメラーゼ転写複合体の形成を助けるＴＡＴＡ結合タンパク質に結合する。ＴＡＴＡボックスは通常、転写開始部位に非常に近く位置する（多くは５０塩基以内）。
本発明の細胞は、プロモーター配列を含む核酸配列を含む。プロモーター配列は、本発明のために限定されず、選択した宿主細胞に適した任意のプロモーターであることができる。
本発明の一態様において、プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターである。
本発明のさらなる態様において、プロモーターは、内因性プロモーター、ＰＧＫ−１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＦＢＡ１、ＧＡＬ１−１０、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ２５、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１−Ｓ、ＧＡＬ１−Ｌ、ＴＥＦ１、ＡＤＨ１、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、プロゲステロン、ＲＵ４８６、およびラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される。
転写後調節
転写後調節は、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の制御であり、したがって遺伝子の転写と翻訳の間である。
調節の最初の例は転写においてであり（転写調節）、ここでクロマチン構造により、および転写因子の活性のにより、遺伝子が差動的に転写される。
産生された後、異なる転写物の安定性および分布は、転写物の様々な工程および速度を制御するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）によって調節される（転写後調節）：例えば選択的スプライシング、核分解（エキソソーム）、プロセシング、核輸出（３つの代替経路）、貯蔵または分解のためのＤＣＰ２体における隔離（sequestration）、および最終的に翻訳などのイベントである。これらのタンパク質は、転写物の特定の配列または二次構造、通常は転写物の５’および３’ＵＴＲに結合するＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）によって、これらのイベントを実現する。
キャッピング、スプライシング、ポリ（Ａ）尾部の添加、配列特異的な核輸出速度などを調節すること、およびいくつかの文脈においてはＲＮＡ転写物の隔離を調節することは、真核生物で起こるが、原核生物では起こらない。この調節はタンパク質または転写物の結果であり、このタンパク質または転写物は次に制御されて、特定の配列に対して親和性を有し得る。
キャッピング
キャッピングは、５’−５’結合によりｍＲＮＡの５末端を３末端に変更し、これはｍＲＮＡを、外来ＲＮＡを分解する５’エキソヌクレアーゼから保護する。キャップはまた、リボソーム結合も支援する。
スプライシング
スプライシングは、ＲＮＡに転写された非コード領域であるイントロンを除去して、ｍＲＮＡがタンパク質を作製できるようにする。細胞はこれを、イントロンのいずれかの側にスプライセオソームを結合し、イントロンを結合円にループして、次にこれを切断することにより行う。次に、エクソンの両端が一緒に接合される。
ポリアデニル化
ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）尾部の３’末端への付加であり、すなわちポリ（Ａ）尾部は、複数のアデノシン一リン酸から構成される。ポリＡ配列は３’エキソヌクレアーゼに対するバッファとして作用し、したがってｍＲＮＡの半減期を延長する。さらに、長いポリ（Ａ）尾部は、翻訳を増加させることができる。このようにしてポリ（Ａ）尾部は、本発明のコンストラクトの翻訳をさらに調節して、最適な翻訳速度に到達するために用いることができる。
真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳のための成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成するプロセスの一部である。
ポリ（Ａ）尾部はまた、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳、および安定性のために重要である。
一態様において、本明細書上記で定義される本発明の細胞の核酸配列は、ポリアデニル／ポリアデニル化配列をさらに含み、好ましくは該ポリアデニル／ポリアデニル化配列の５’末端は、オープンリーディングフレーム、例えばスクアレン合成酵素をコードするオープンリーディングフレームの３’末端に、動作可能に連結されている。
ＲＮＡ編集
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡ分子中の配列変化をもたらすプロセスであり、酵素によって触媒される。これらの酵素には、ｍＲＮＡ分子の特定のアデノシン残基を加水分解脱アミノ化によりイノシンに変換する、Adenosine Deaminase Acting on RNA（ＡＤＡＲ）酵素が含まれる。３種類のＡＤＡＲ酵素、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３がクローニングされたが、最初の２つのサブタイプのみが、ＲＮＡ編集活性を有することが示されている。多くのｍＲＮＡはＲＮＡ編集の影響を受けやすく、これらは以下を含む：グルタミン酸受容体サブユニットのＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５およびＧｌｕＲ６（ＡＭＰＡおよびカイニン酸受容体の成分である）、セロトニン２Ｃ受容体、ＧＡＢＡ−アルファ３受容体サブユニット、トリプトファンヒドロキシラーゼ酵素ＴＰＨ２、デルタ肝炎ウイルスおよびマイクロＲＮＡの１６％以上。ＡＤＡＲ酵素に加えて、ＣＤＡＲ酵素が存在し、これらは、特定のＲＮＡ分子中のシトシンをウラシルに変換する。これらの酵素は「ＡＰＯＢＥＣ」と呼ばれ、口蓋心臓顔面症候群（２２ｑ１１）で生じる染色体欠失に近くかつ精神病にリンクされている領域である２２ｑ１３に、遺伝子座を有する。編集処理はウイルスの機能を変更するため、ＲＮＡ編集は、広く感染症に関連して検討されている。
転写後調節エレメント
転写後調節エレメント（ＰＲＥ）の使用は多くの場合、特定用途のための十分な性能を有するベクターを得るために必要である。Schambach et al in Gene Ther. (2006) 13(7):641-5には、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）の、レトロウイルスおよびレンチウイルス遺伝子導入ベクターの３’非翻訳領域への導入が、力価および導入遺伝子発現の両方を増強することが報告されている。ＰＲＥの増強活性は、その配列の正確な構成およびベクターの前後関係（context）、およびそれが導入された細胞に依存する。
したがって、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などのＰＲＥの使用は、遺伝子治療アプローチを使用する場合、本発明の細胞の調製に有用であり得る。
したがって一態様において、本明細書に定義された細胞の核酸配列はさらに、転写後調節エレメントを含む。
さらなる態様において、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
末端反復
宿主ＤＮＡに遺伝子配列を挿入するには、ウイルスは多くの場合、何千回も繰り返されるＤＮＡの配列、いわゆる反復、または長末端反復（ＬＴＲ）および逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む末端反復を使用し、ここで前記反復配列は、５’末端反復および３’末端反復の両方であってよい。ＩＴＲは、一本鎖ベクターＤＮＡが、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換された後の、核におけるコンカテマー形成を支援する。ＩＴＲ配列は、ウイルスベクター例えばＡＡＶ２などのＡＡＶに由来し得る。
一態様において、本明細書に定義された細胞の核酸配列またはベクターは、５’末端反復および３’末端反復を含む。
一態様において、前記５’および３’末端反復は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）および長末端反復（ＬＴＲ）から選択される。
一態様において、前記５’および３’末端反復は、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）である。
ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素
本発明の微生物細胞は、好ましい態様において、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）をコードする異種核酸配列を含有してもよい。例えば表７を参照。ＧＧＰＰＳは、１個のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）分子を、１個のゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）分子に変換する化学反応を触媒する酵素である。ＧＧＰＰＳをコードする遺伝子は、例えば、メバロン酸経路を含有する生物において見出され得る。
本発明で使用されるＧＧＰＰＳは、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）分子のゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）分子への変換を触媒することができる、任意の有用な酵素であってよい。特に本発明で用いられるＧＧＰＰＳは、以下の反応を触媒することができる任意の酵素であってよい：
（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸−＞二リン酸＋ゲラニルゲラニル二リン酸。
本発明と共に使用するＧＧＰＰＳは、EC 2.5.1.29の下に分類される酵素であることが好ましい。
ＧＧＰＰＳは、例えば細菌、真菌または哺乳動物などのさまざまなソースからのＧＧＰＰＳであってよい。ＧＧＰＰＳは、あらゆる種類のＧＧＰＰＳであることができ、例えばＧＧＰＰＳ−１、ＧＧＰＰＳ−２、ＧＧＰＰＳ−３、またはＧＧＰＰＳ−４である。ＧＧＰＰＳは、野生型ＧＧＰＰＳまたはその機能性ホモログであってよい。
例えば、ＧＧＰＰＳは、S. acidicaldariusのＧＧＰＰＳ−１（配列番号１２６）、A.nidulansのＧＧＰＰＳ−２（配列番号２０３）、S. cerevisiaeのＧＧＰＰＳ−３（配列番号１６７）、M. musculusのＧＧＰＰＳ−４（配列番号１２３）、または前述の任意のものの機能性ホモログであってよい。
前記ＧＧＰＰＳをコードする異種核酸は、前記ＧＧＰＰＳをコードする任意の核酸配列であってよい。したがって、ＧＧＰＰＳが野生型タンパク質である本発明の態様において、核酸配列は、例えば、前記タンパク質をコードする野生型ｃＤＮＡ配列であってもよい。しかしながら、異種核酸が任意の特定のＧＧＰＰＳをコードする核酸配列であり、ここで前記核酸が特定の微生物細胞に対してコドン最適化されているケースは多い。例えば微生物細胞がS. cerevisiaeである場合、ＧＧＰＰＳをコードする核酸は、好ましくはS. cerevisiaeでの最適な発現のためにコドン最適化されている。
ＧＧＰＰＳの機能性ホモログは好ましくは、上記の活性を有し、参照ＧＧＰＰＳの配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を共有するタンパク質である。配列同一性を決定するための方法は、本明細書の節「スクアレン合成酵素」およびＤ節に上述されている。
一態様において、本発明の微生物などの細胞は、ＧＧＰＰＳまたはその機能性ホモログをコードする核酸配列を含み、ここで前記機能性ホモログは、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１６７および配列番号２０３からなる群から選択されるＧＧＰＰＳと、少なくとも７５％、例えば少なくとも７６％、例えば少なくとも７７％、例えば少なくとも７８％、例えば少なくとも７９％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８３％、例えば少なくとも８４％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８８％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも９９．５％、例えば少なくとも９９．６％、例えば少なくとも９９．７％、例えば少なくとも９９．８％、例えば少なくとも９９．９％、例えば１００％、同一である。
ＧＧＰＰＳをコードする前記異種核酸配列は、一般に、微生物細胞内でＧＧＰＰＳの発現を指令する核酸配列に動作可能に連結されている。微生物細胞内でＧＧＰＰＳの発現を指令する核酸配列は、プロモーター配列であってよく、好ましくは、前記プロモーター配列は、特定の微生物細胞に応じて選択される。プロモーターは、例えば、本明細書の上の節「プロモーター」に記載されたプロモーターのいずれかであってもよい。
ベクター
ベクターは、外来遺伝物質を別の細胞に転移するための媒体として使用されるＤＮＡ分子である。ベクターの主な種類は、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体である。すべての操作されたベクターに共通するのは、複製の起点、マルチクローニング部位、および選択可能なマーカーである。
ベクターそれ自体は一般的には、インサート（導入遺伝子）およびベクターの「主鎖」として機能するより大きな配列から構成される、ＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に伝達するベクターの目的は、典型的には、インサートを単離し、掛け合わせ、または標的細胞に発現することである。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞における導入遺伝子の発現のためであり、一般に、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。転写ベクターと呼ばれる単純なベクターは、転写されることができるのみであり、翻訳されない：それらは、標的細胞内で複製されることができるが、発現ベクターとは異なり、翻訳されない。転写ベクターは、それらのインサートを増幅するために使用される。
ベクターの標的細胞への挿入は、通常、細菌細胞については形質転換、真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれ、ただしウイルスベクターの挿入は多くの場合、形質導入（トランスダクション）と呼ばれる。
プラスミド
プラスミドベクターは、宿主細胞内で自動的に複製可能な、二本鎖で一般に環状のＤＮＡ配列である。プラスミドベクターは、最小限、宿主内でのプラスミドの半独立の複製を許容する複製起点と、導入遺伝子インサートから構成される。現代のプラスミドは一般に多くの機能を有し、特に、インサートの挿入のためのヌクレオチドオーバーハングを含む「多重クローニング部位」、およびインサートの両側に複数の制限酵素コンセンサス部位を含む。転写ベクターとして利用されるプラスミドの場合には、細菌をプラスミドと共にインキュベートすると、何時間かのうちに細菌内に数百または数千のベクターのコピーが生成され、このベクターは細菌から抽出することができ、多重クローニング部位を制限酵素により切断することができて、百倍または千倍に増幅されたインサートを切り出すことができる。これらのプラスミド転写ベクターは、特徴的に、翻訳されたｍＲＮＡにおけるポリアデニル化配列と翻訳終結配列をコードする重要な配列を欠き、転写ベクターからのタンパク質発現を不可能にする。プラスミドは、接合性／伝達性および非接合性であってよい：
−接合性：接合を介してＤＮＡの転移を媒介し、したがって細菌細胞の集団の中で急速に拡散する；例えば、 Ｆプラスミド、多くのＲおよび一部のｃｏｌプラスミド。
−非接合性：接合を介してＤＮＡを媒介しない、例えば、多くのＲおよびｃｏｌプラスミド。
ウイルスベクター
ウイルスベクターは一般に遺伝子操作されたウイルスであり、非感染性にされた修飾ウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡを保有するが、ウイルスプロモーターおよび導入遺伝子は含んでおり、したがってウイルスプロモーターによる導入遺伝子の翻訳を可能にするものである。しかし、ウイルスベクターは多くの場合感染性配列を欠いているので、それらは、大規模トランスフェクションのためのヘルパーウイルスまたはパッケージングラインを必要とする。ウイルスベクターはしばしば、インサートの宿主ゲノムへの永久的な組込みのために設計されるため、導入遺伝子の組込み後に、宿主ゲノム中に特有の遺伝マーカーを残す。例えばレトロウイルスは、挿入後に特徴的なレトロウイルス組込みパターンを残し、これは検出可能であり、ウイルスベクターが宿主ゲノム中に組み込まれたことを示す。
一態様において、本発明は、培養可能な細胞などの宿主細胞、例えば酵母細胞または任意の他の適切な真核細胞をトランスフェクトすることができる、ウイルスベクターにも関する。ベクターは次に、前記細胞を、本明細書に記載の異種挿入配列を含む核酸を用いて、トランスフェクトすることができる。
ウイルスベクターは、レンチウイルス、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＡＩＶ、ＣＩＶを含むレトロウイルス科に由来するベクターからなる群から選択されるウイルスベクターなどの、任意の適切なウイルスベクターであり得る。
ウイルスベクターはまた、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶおよびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択されてもよい。
微生物細胞がＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含む本発明の態様では、該異種核酸は、スクアレン合成酵素をコードする核酸を含有するベクター上に位置するか、またはＧＧＰＰＳをコードする異種核酸は、異なるベクター上に位置してよい。前記のＧＧＰＰＳをコードする異種核酸は、本明細書上述のベクターのいずれかに含まれていてもよい。
微生物細胞がＨＭＣＲをコードする異種核酸を含む本発明の態様では、該異種核酸は、スクアレン合成酵素をコードする核酸を含有するベクター上に位置するか、またはＨＭＣＲをコードする異種核酸は、異なるベクター上に位置してよい。前記のＨＭＣＲをコードする異種核酸は、本明細書で上述のベクターのいずれかに含まれていてもよい。ＧＧＰＰＳをコードする異種核酸およびＨＭＣＲをコードする異種核酸は、同一または個別のベクター上に配置されてもよいことは、本発明の範囲内である。
転写
転写は、すべてのベクターに必要な要素である：ベクターの前提条件は、インサートを増加させることである（ただし発現ベクターは後に、増加したインサートの翻訳も駆動するが）。したがって、安定な発現は安定した転写によって決定され、これは一般的に、ベクター内のプロモーターに依存する。しかし発現ベクターは、様々な発現パターンを有する：構成的（一貫した発現）または誘導的（特定の条件または化学物質のもとでのみの発現）。この発現は異なるプロモーター活性に基づくものであり、転写後の活性には基づかない。したがって、これら２つの異なる種類の発現ベクターは、異なる種類のプロモーターに依存する。
ウイルスプロモーターは、プラスミドおよびウイルスベクターにおいて構成的発現のために多く使用されるが、これは、それらが通常、多数の細胞株および種類の一定した転写を確実にもたらすからである。
誘導的発現は、誘導条件に応答するプロモーターに依存する：例えば、マウス乳癌ウイルスプロモーターは、デキサメタゾンの適用後にのみ転写を開始し、ショウジョウバエの熱ショックプロモーターは、高温の後にのみ惹起される。転写はｍＲＮＡの合成である。遺伝情報は、ＤＮＡからＲＮＡにコピーされる。
発現
発現ベクターは、例えばポリアデニル化尾部（本明細書の上記参照）をコードする配列を必要とし：ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼから保護し、かつ転写および翻訳終結を確実にする、転写されたプレｍＲＮＡの末端にポリアデニル化尾部を作成し：ｍＲＮＡ産生を安定化する。
最小ＵＴＲ長さ：ＵＴＲは、転写または翻訳を妨げ得る特定の特性を含むため、最適な発現ベクターには、最短のＵＴＲまたはＵＴＲなしがコードされる。
Kozak配列：ベクターはｍＲＮＡに、ｍＲＮＡ翻訳のためにリボソームを組み立てるKozak配列をコードしなければならない。
上記の条件は、真核生物の発現ベクターには必要であるが、原核生物では不要である。
現代のベクターとしては、導入遺伝子インサートおよび主鎖以外の追加の特徴を包含してよく、例えば以下である：プロモーター（上述）、遺伝マーカーであって、例えばベクターが宿主のゲノムＤＮＡに組み込まれたことを確認可能にするもの、抗生物質選択のための抗生物質耐性遺伝子、および精製のための親和性タグ。
一態様において、本発明の細胞は、発現ベクターなどのベクターに組み込まれた核酸配列を含む。
一態様において、ベクターは、プラスミドベクター、コスミド、人工染色体およびウイルスベクターからなる群から選択される。
プラスミドベクターは、細菌、真菌および酵母中で維持および複製が可能であるべきである。
本発明はまた、プラスミドおよびコスミドベクター、ならびに人工染色体ベクターを含む細胞に関する。
重要な因子は、ベクターが機能的であり、かつベクターが、本明細書に記載されるように異種挿入配列を含む少なくとも核酸配列を含むことである。
一態様において、ベクターは、真菌および哺乳動物細胞において機能的である。
一態様において、本発明は、本明細書に定義されたベクターで形質転換または形質導入された細胞に関する。
テルペノイドの生産方法
本明細書で上述したように、本発明の細胞（例えば組換え宿主細胞）は、工業関連のテルペノイドの収量を高めるのに有用である。
従って本発明の細胞は様々なセットアップで用いることができ、テルペノイド前駆体の蓄積を増加させ、したがって前記（上流）テルペノイド前駆体の酵素的変換から得られるテルペノイド生成物の収量を増加させることができる。
したがって一態様において、本発明は、細胞培養物における、スクアレン経路を介して合成されるテルペノイド化合物を生産するための方法に関し、該方法は、以下のステップ：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること、
（ｃ）テルペノイド生成物の化合物を回収すること、を含む。
本明細書上記で定義された遺伝子操作されたコンストラクトを含む細胞を提供することによって、テルペノイド前駆体の蓄積が増強される（図２０）。
したがって別の側面において、本発明は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からなる群から選択されるテルペノイド前駆体に由来するテルペノイドを生産するための方法に関し、該方法は、
（ａ）前記前駆体をスクアレン合成酵素経路の酵素に接触させること、
（ｂ）テルペノイド生成物を回収すること、
を含む。
一態様において、本明細書上記で定義した方法のテルペノイド（生成物）は、ヘミテルペノイド、モノテルペン、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルペン、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、およびポリテルペノイドからなる群から選択される。
さらなる態様において、テルペノイドは、ファルネシルリン酸、ファルネソール、ゲラニルゲラニル、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、プレノール、イソ吉草酸、ゲラニルピロリン酸、ユーカリプトール、リモネン、ピネン、ファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、アフィジコリン、ラノステロール、リコピンおよびカロテンからなる群から選択される。
テルペノイド生成物は、追加の精製プロセスにおける出発点として使用することができる。したがって一態様において、この方法はさらに、ファルネシルリン酸を脱リン酸化して、ファルネソールを生産することを含む。
対象生成物のテルペノイド化合物を調製するプロセスで使用される１つの酵素または複数酵素は、好ましくは、テルペノイド前駆体であるファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸などの「下流に位置する」酵素であり、例えば、図２０のスクアレン合成経路に示された、ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸などのテルペノイド前駆体の下流に位置する酵素である。目的生成物テルペノイドを調製するプロセスで使用される酵素であって、本発明による前駆体の蓄積に基づく前記酵素は、したがって、ジメチルアリルトランスフェラーゼ（EC 2.5.1.1）、イソプレン合成酵素（EC 4.2.3.27）およびゲラニルトランスフェラーゼ（EC 2.5.1.10）からなる群から選択することができる。
本発明は、少なくとも部分的にリボソームのＲＮＡへの結合を立体的に妨げて、スクアレン合成酵素の翻訳を低減することにより、動作することができる。したがって一側面において、本発明は、機能性スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）の翻訳速度を低減するための方法に関し、前記方法は以下を含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養すること。
同様に、別の側面において、本発明は、ファルネシル−ｐｐのスクアレンへの転換を低下させるための方法に関し、前記方法は以下を含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養すること。
図２０に示すように、ＥＲＧ９のノックダウンは、スクアレン合成酵素の前駆体の増加をもたらす。したがって一側面において、本発明は、ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸からなる群から選択される化合物の蓄積を増強するための方法に関し、該方法は、以下のステップを含む：
（ａ）本明細書上記で定義された細胞を提供すること、および
（ｂ）（ａ）の細胞を培養すること。
一態様において、本明細書上記で定義された本発明の方法はさらに、ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸化合物を回収することを含む。回収された化合物は、所望のテルペノイド生成物の化合物を生産するためのさらなるプロセスで使用されてもよい。さらなるプロセスは、本明細書上記で実施および定義されるプロセスと同一の細胞培養物中で行うことができ、例えば、本発明の細胞によるテルペノイド前駆体の蓄積である。代替的に、回収された前駆体を別の細胞培養物または無細胞系に添加して、所望の生成物を生産してもよい。
前駆体は中間体であり、主に安定した中間体ではあるが、テルペノイド生成物の特定の内因的生産が、テルペノイド前駆体基質に基づいて起こる場合がある。また、本発明の細胞はさらなる遺伝子修飾を有していてもよく、これにより、テルペノイド前駆体（本発明の細胞のコンストラクト）の蓄積および、所望のテルペノイド生成物への全てのまたは実質的に全ての後続の生合成プロセスの両方の実施が可能となる。
したがって一態様において、本発明の方法はさらに、スクアレン経路を介して合成された化合物を回収することを含み、該化合物は、前記ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸に由来するものである。時には、本発明の細胞を培養する場合に、スクアレン合成酵素阻害剤を含むことが有利であり得る。スクアレン合成酵素の、例えばラパキスタットによる化学的阻害は、当該技術分野において知られており、例えば心血管疾患の予防においてコレステロールレベルを低下させる方法として調査されている。また、この酵素の変異体は高コレステロール血症の遺伝的関連の一部となり得ることが示唆されている。他のスクアレン合成酵素阻害剤としては、ザラゴジン酸およびRPR 107393が含まれる。
したがって、一態様において、本明細書上記に定義された方法（複数可）の培養ステップは、スクアレン合成酵素阻害剤の存在下で行われる。
本発明の細胞はさらに、特定のキーとなるテルペノイド前駆体の生産をさらに増強するように、遺伝子操作されてもよい。一態様において、細胞は、以下からなる群から選択される１または２以上の酵素の活性を強化する、および／または過剰発現させるように、さらに遺伝子操作される：ホスホメバロン酸キナーゼ（EC 2.7.4.2）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸合成酵素（EC 1.17.7.1）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸還元酵素（EC 1.17.1.2）、イソペンテニル二リン酸δ−イソメラーゼ１（EC 5.3.3.2）、短鎖Ｚ−イソプレニル二リン酸合成酵素（EC 2.5.1.68）、ジメチルアリルトランスフェラーゼ（EC 2.5.1.1）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（EC 2.5.1.10）およびゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（EC 2.5.1.29）。
本明細書上記のように、本発明の一態様において、微生物細胞は、本明細書上記のスクアレン合成酵素をコードする核酸、およびＧＧＰＰＳをコードする異種核酸の両方を含む。かかる微生物細胞は、ＧＧＰＰおよびＧＧＰＰがその生合成における中間体であるテルペノイドの調製に、特に有用である。
したがって一側面において、本発明は、ＧＧＰＰを調製する方法に関し、該方法は以下のステップを含む：
ａ．核酸配列を含む微生物細胞を提供すること、ここで該核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書上記に定義の通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含み；
ｂ．ａの微生物細胞を培養すること；
ｃ．ＧＧＰＰを回収すること。
別の側面において、本発明は、そのＧＧＰＰが生合成経路における中間体であるところのテルペノイドの調製方法に関し、ここで該方法は以下のステップを含む：
ａ．微生物細胞を提供すること、ここで該微生物細胞は核酸配列を含み、該核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書上記に定義の通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含み；
ｂ．ａの微生物細胞を培養すること；および
ｃ．テルペノイドを回収すること、
ここで前記テルペノイドは、ＧＧＰＰをその生合成中間体として有する、上記の節「テルペノイド」に記載の任意のテルペノイドであってよく；および前記微生物細胞は、本明細書上記の節「細胞」に記載の任意の微生物細胞であってよく；および前記プロモーターは、本明細書上記の節「プロモーター」に記載の任意のプロモーターなどの、任意のプロモーターであってよく；および前記異種挿入配列は、本明細書上記の節「異種挿入配列」に記載の任意の異種挿入配列であってよく；および前記オープンリーディングフレームはスクアレン合成酵素をコードし、これは本明細書上記の節「スクアレン合成酵素」に記載の任意のスクアレン合成酵素であってよく；および前記ＧＧＰＰＳは、本明細書上記の節「ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素」に記載の任意のＧＧＰＰＳであってよい。
この態様において、前記微生物細胞は任意に、前記テルペノイドの生合成経路に関与する１または２以上の酵素をコードする１または２以上の追加の異種核酸を含有してもよい。
１つの特定の側面において、本発明は、ステビオールを調製する方法に関し、ここで該方法は以下のステップを含む：
ａ．微生物細胞を提供すること、ここで該微生物細胞は核酸配列を含み、該核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書上記に定義の通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含み；
ｂ．ａの微生物細胞を培養すること；
ｃ．ステビオールを回収すること、
ここで前記微生物細胞は、本明細書上記の節「細胞」に記載の任意の微生物細胞であってよく；および前記プロモーターは、本明細書上記の節「プロモーター」に記載の任意のプロモーターなどの、任意のプロモーターであってよく；および前記異種挿入配列は、本明細書上記の節「異種挿入配列」に記載の任意の異種挿入配列であってよく；および前記オープンリーディングフレームはスクアレン合成酵素をコードし、これは本明細書上記の節「スクアレン合成酵素」に記載の任意のスクアレン合成酵素であってよく；および前記ＧＧＰＰＳは、本明細書上記の節「ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素」に記載の任意のＧＧＰＰＳであってよい。
この態様において、前記微生物細胞は任意に、ステビオールの生合成経路に関与する１または２以上の酵素をコードする１または２以上の追加の異種核酸を含有してもよい。
別の側面において、本発明は、そのＧＧＰＰが生合成経路における中間体であるところのテルペノイドの調製方法に関し、ここで該方法は以下のステップを含む：
ａ．微生物細胞を提供すること、ここで該微生物細胞は核酸配列を含み、該核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書上記に定義の通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含み、
およびここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＨＭＣＲの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＨＭＣＲをコードする異種核酸を含み；
ｂ．ａの微生物細胞を培養すること；
ｃ．テルペノイドを回収すること、
ここで前記テルペノイドは、ＧＧＰＰをその生合成の中間体として有する、本明細書上記の節「テルペノイド」に記載の任意のテルペノイドであってよく；ここで前記微生物細胞は、本明細書上記の節「細胞」に記載の任意の微生物細胞であってよく；および前記プロモーターは、本明細書上記の節「プロモーター」に記載の任意のプロモーターなどの、任意のプロモーターであってよく；および前記異種挿入配列は、本明細書上記の節「異種挿入配列」に記載の任意の異種挿入配列であってよく；および前記オープンリーディングフレームはスクアレン合成酵素をコードし、これは本明細書上記の節「スクアレン合成酵素」に記載の任意のスクアレン合成酵素であってよく；および前記ＧＧＰＰＳは、本明細書上記の節「ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素」に記載の任意のＧＧＰＰＳであってよく；および前記ＨＭＣＲは、本明細書上記の節「ＨＭＣＲ」に記載の任意のＨＭＣＲであってよい。
この態様において、前記微生物細胞は任意に、前記テルペノイドの生合成経路に関与する１または２以上の酵素をコードする１または２以上の追加の異種核酸を含有してもよい。
特定の側面において、本発明は、ステビオールの調製方法に関し、ここで該方法は以下のステップを含む：
ａ．微生物細胞を提供すること、ここで該微生物細胞は核酸配列を含み、該核酸は、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、本明細書上記に定義の通りであり、
ここで前記微生物細胞はさらに、前記細胞内でのＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含み；
ｂ．ａの微生物細胞を培養すること；
ｃ．ステビオールを回収すること、
ここで前記微生物細胞は、本明細書上記の節「細胞」に記載の任意の微生物細胞であってよく；および前記プロモーターは、本明細書上記の節「プロモーター」に記載の任意のプロモーターなどの、任意のプロモーターであってよく；および前記異種挿入配列は、本明細書上記の節「異種挿入配列」に記載の任意の異種挿入配列であってよく；および前記オープンリーディングフレームはスクアレン合成酵素をコードし、これは本明細書上記の節「スクアレン合成酵素」に記載の任意のスクアレン合成酵素であってよく；および前記ＧＧＰＰＳは、本明細書上記の節「ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素」に記載の任意のＧＧＰＰＳであってよく、および前記ＨＭＣＲは、本明細書上記の節「ＨＭＣＲ」に記載の任意のＨＭＣＲであってよい。
この態様において、前記微生物細胞は任意に、ステビオールの生合成経路に関与する１または２以上の酵素をコードする１または２以上の追加の異種核酸を含有してもよい。
一態様において、細胞はさらに、以下：アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素またはその触媒ドメイン、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ファルネシルピロリン酸合成酵素、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸合成酵素、および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼおよびファルネシルピロリン酸合成酵素、からなる群から選択される１または２以上の酵素の活性を強化する、および／または過剰発現させるように、さらに遺伝子操作される。
本発明の方法の一態様において、細胞は、ＥＲＧ９オープンリーディングフレーム内に変異を含む。
本発明の方法の別の態様において、細胞は、ＥＲＧ９［デルタ］：：ＨＩＳ３欠失／挿入対立遺伝子を含む。
さらに別の態様において、本発明の方法の化合物を回収するステップは、細胞培養培地からの該化合物の精製をさらに含む。
Ｄ．機能性ホモログ
上記ポリペプチドの機能性ホモログはまた、組換え宿主においてステビオールまたはステビオール配糖体の生産に使用するのにも適している。機能性ホモログは、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（単数または複数）の１または２以上を実行するポリペプチドである。機能性ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってよく、配列類似性は、収束的または発散的進化的事象に起因し得る。このように、機能性ホモログは、文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログなどと称されることもある。天然に存在する機能性ホモログの変異体、例えば野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドは、それ自体が機能性ホモログであり得る。機能性ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介して、または別の天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせることによって（「ドメイン交換」）、作ることもできる。本明細書に記載の機能性ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための技術は周知であり、特に指向進化技術、部位特異的突然変異誘発技術およびランダム突然変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特異的活性を増大させ、基質特異性を改変し、発現レベルを変化させ、細胞内局在を変化させ、またはポリペプチド：ポリペプチドの相互作用を所望の方法で変更するのに有用である。かかる修飾ポリペプチドは、機能性ホモログと考えられている。用語「機能性ホモログ」は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用されることもある。
機能性ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列のアラインメントの分析によって同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対してクエリを実行して、ステビオールまたはステビオール配糖体生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列分析には、ＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＳ、ＫＯまたはＫＡＨアミノ酸配列を参照配列として用いる、非重複データベースのBLAST、相互（reciprocal）BLASTまたPSI-BLAST分析を含む。アミノ酸配列は、いくつかの例では、ヌクレオチド配列から推定される。４０％以上の配列同一性を有するデータベース内のポリペプチドは、ステビオールまたはステビオール配糖体生合成ペプチドとしての適合性のためのさらなる評価の候補である。アミノ酸配列類似性は、例えば、１つの疎水性残基の別のものとの置換、または１つの極性残基の別のものとの置換などの、保存的アミノ酸置換を可能にする。所望により、かかる候補の手動による検査を実施して、さらに評価すべき候補数を絞り込むことができる。手動検査は、例えば保存された機能的ドメインなどの、ステビオール生合成ポリペプチド中に存在するドメインを有すると考えられる候補を選択することによって、行うことができる。
保存領域は、ステビオールまたはステビオール配糖体生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域であって、反復配列であり、幾つかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびβシート）を形成し、正または負に荷電したドメインを確立し、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す前記領域を位置付けることによって同定することができる。例えば、種々のタンパク質モチーフまたはドメインについてのコンセンサス配列を記述するPfamのウェブサイト、ワールドワイドウェブのsanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/を参照。Pfamデータベースに含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載されている。保存領域はまた、近縁の種からの同一または関連するポリペプチドの配列を整列させることによっても決定することができる。近縁の種は、好ましくは、同一ファミリーからのものである。一部の態様においては、２つの異なる種からの配列のアラインメントが適切である。
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。一部の態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％ 、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
例えば、組換え宿主内でステビオール配糖体を生産するのに適したポリペプチドとしては、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ、ＵＧＴ８５Ｃ、およびＵＧＴ７６Ｇの機能性ホモログを含む。かかるホモログは、ＥＵＧＴ１１（配列番号１５２）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ（配列番号１０）、ＵＧＴ８５Ｃ（配列番号３）、またはＵＧＴ７６Ｇ（配列番号７）のアミノ酸配列に対して９０％を超える（例えば少なくとも９５％または９９％の）配列同一性を有する。ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ、ＵＧＴ８５Ｃ、およびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドの変異体は、典型的には、一次アミノ酸配列中に１０以下のアミノ酸置換を、例えば７以下のアミノ酸置換、５または保存的アミノ酸置換、または１〜５のアミノ酸置換を有する。しかしながら一部の態様において、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ、ＵＧＴ８５Ｃ、およびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドの変異体は、１０以上のアミノ酸置換（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、１０〜２０、１０〜３５、２０〜３０、または２５〜３５のアミノ酸置換）を有することができる。置換は、保存的、または一部の態様では、非保存的であってもよい。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド内の非保存的変化の非限定的な例としては、グリシンからアルギニンへ、およびトリプトファンからアルギニンへの変化を含む。ＵＧＴ７６Ｇポリペプチド内の非保存的置換の非限定的な例としては、バリンからグルタミン酸へ、グリシンからグルタミン酸へ、グルタミンからアラニンへ、およびセリンからプロリンへの置換を含む。ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドへの変化の非限定的な例としては、ヒスチジンからアスパラギン酸へ、プロリンからセリンへ、リジンからスレオニンへ、およびスレオニンからアルギニンへの変化を含む。
一部の態様において、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、予測ループの外側のポリペプチドの領域におけるアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有することができ、例えば、残基２０〜２６、３９〜４３、８８〜９５、１２１〜１２４、１４２〜１５８、１８５〜１９８、および２０３〜２１４は、配列番号５のＮ末端ドメインの予測ループであり、残基３８１〜３８６は、Ｃ末端ドメインの予測ループである。例えば、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、配列番号５の残基１〜１９、２７〜３８、４４〜８７、９６〜１２０、１２５〜１４１、１５９〜１８４、１９９〜２０２、２１５〜３８０、または３８７〜４７３に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことができる。一部の態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、配列番号５の残基３０、９３、９９、１２２、１４０、１４２、１４８、１５３、１５６、１９５、１９６、１９９、２０６、２０７、２１１、２２１、２８６、３４３、４２７、および４３８からなる群から選択される１または２以上の残基において、アミノ酸置換を有することができる。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２機能性ホモログは、残基２０６、２０７、および３４３の１または２以上においてアミノ酸置換を有することができ、例えば配列番号５の残基２０６におけるアルギニン、残基２０７におけるシステイン、および残基３４３におけるアルギニンである。配列番号９５を参照。ＵＧＴ９１Ｄ２の他の機能性ホモログは、以下の１または２以上を有することができる：配列番号５の、残基３０におけるチロシンまたはフェニルアラニン、残基９３におけるプロリンまたはグルタミン、残基９９におけるセリンまたはバリン、残基１２２におけるチロシンまたはフェニルアラニン、残基１４０におけるヒスチジンまたはチロシン、残基１４２におけるセリンまたはシステイン、残基１４８におけるアラニンまたはスレオニン、残基１５２におけるメチオニン、残基１５３におけるアラニン、残基１５６におけるアラニンまたはセリン、残基１６２におけるグリシン、残基１９５におけるロイシンまたはメチオニン、残基１９６におけるグルタミン酸、残基１９９におけるリシンまたはグルタミン酸、残基２１１におけるロイシンまたはメチオニン、残基２１３におけるロイシン、残基２２１におけるセリンまたはフェニルアラニン、残基２５３におけるバリンまたはイソロイシン、残基２８６におけるバリンまたはアラニン、残基４２７におけるリシンまたはアスパラギン、残基４３８におけるアラニン、および残基４６２におけるアラニンまたはスレオニンのいずれか。別の態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２機能性ホモログは、残基２１１にメチオニンおよび残基２８６にアラニンを含む。
一部の態様において、有用なＵＧＴ８５Ｃホモログは、１または２以上のアミノ酸置換を、配列番号３の残基９、１０、１３、１５、２１、２７、６０、６５、７１、８７、９１、２２０、２４３、２７０、２８９、２９８、３３４、３３６、３５０、３６８、３８９、３９４、３９７、４１８、４２０、４４０、４４１、４４４、および４７１において有することができる。有用なＵＧＴ８５Ｃホモログの非限定的な例としては、以下を有するポリペプチドが挙げられる：（配列番号３に対して）残基６５（例えば残基６５にセリン）における置換、残基６５おける置換と、残基１５（残基１５にロイシン）、２７０（例えば、残基２７０にメチオニン、アルギニン、またはアラニン）、４１８（例えば、残基４１８にバリン）、４４０（例えば、残基４４０にアスパラギン酸）、または４４１（例えば、残基４４１にアスパラギン）との組み合わせ；残基１３（例えば、残基１３にフェニルアラニン）、１５、６０（例えば、残基６０にアスパラギン酸）、２７０、２８９（例えば、残基２８９にヒスチジン）、および４１８；残基１３、６０および２７０における置換；残基６０および８７における置換（例えば、残基８７にフェニルアラニン）；残基６５、７１における置換（例えば、残基７１にグルタミン）、２２０（例えば、残基２２０にスレオニン）、２４３（例えば、残基２４３にトリプトファン）、および２７０；残基６５、７１、２２０、２４３、２７０、および４４２における置換；残基６５、７１、２２０、３８９における置換（例えば、残基３８９にバリン）、および３９４（例えば、残基３９４にバリン）；残基６５、７１、２７０、２８９における置換；残基２２０、２４３、２７０、および３３４における置換（例えば、残基３３４にセリン）；または残基２７０および２８９における置換。以下のアミノ酸変異は、８５Ｃ２ポリペプチドにおける活性の損失を生じなかった：Ｖ１３Ｆ、Ｆ１５Ｌ、Ｈ６０Ｄ、Ａ６５Ｓ、Ｅ７１Ｑ、Ｉ８７Ｆ、Ｋ２２０Ｔ、Ｒ２４３Ｗ、Ｔ２７０Ｍ、Ｔ２７０Ｒ、Ｑ２８９Ｈ、Ｌ３３４Ｓ、Ａ３８９Ｖ、Ｉ３９４Ｖ、Ｐ３９７Ｓ、Ｅ４１８Ｖ、Ｇ４４０Ｄ、およびＨ４４１Ｎ。活性なクローンで見られた追加の変異としては、Ｋ９Ｅ、Ｋ１０Ｒ、Ｑ２１Ｈ、Ｍ２７Ｖ、Ｌ９１Ｐ、Ｙ２９８Ｃ、Ｋ３５０Ｔ、Ｈ３６８Ｒ、Ｇ４２０Ｒ、Ｌ４３１Ｐ、Ｒ４４４Ｇ、およびＭ４７１Ｔが含まれる。一部の態様において、ＵＧＴ８５Ｃ２は、位置６５（例えば、セリン）、７１（グルタミン）、２７０（メチオニン）、２８９（ヒスチジン）、および３８９（バリン）での置換を含む。
Stevia rebaudianaＵＧＴの７４Ｇ１、７６Ｇ１および９１Ｄ２ｅであって、ヒトＭＤＭ２タンパク質の最初の１５８のアミノ酸の、Ｎ末端のインフレーム融合を有するもの、およびStevia rebaudianaＵＧＴ８５Ｃ２であって、合成ＰＭＩペプチド（4 X TSFAEYWNLLSP、配列番号８６）の４つの繰り返しのＮ末端のインフレーム融合を有するものを、それぞれ配列番号９０、８８、９４および９２に示す；融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列については、配列番号８９、９２、９３、および９５を参照。
一部の態様において、有用なＵＧＴ７６Ｇホモログは、配列番号７の残基２９、７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６, ２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１、および３４６において、１または２以上のアミノ酸置換を有することができる。有用なＵＧＴ７６Ｇホモログの非限定的例としては、置換（配列番号７について）を、残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、および２９１；残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、および２９１；または残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１、および３４６、において有するポリペプチドが挙げられる。表９を参照。
例えばＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅの基質特異性を改変する方法は当業者に知られており、限定されないが、部位特異的／合理的突然変異誘発アプローチ、ランダムな方向進化アプローチ、およびランダム突然変異誘発／飽和技術を酵素の活性部位付近で実施する組み合わせがあげられる。例えばSarah A. Osmani, et al. Phytochemistry 70 (2009) 325-347を参照。
候補配列は、典型的には参照配列の長さの８０％〜２００％の長さを有し、例えば参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％の長さを有する。機能性ホモログポリペプチドは典型的には、参照配列の長さの９５％〜１０５％の長さを、例えば参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０％、またはその間の任意の範囲の長さを有する。任意の候補核酸またはポリペプチドの、参照核酸またはポリペプチドに対するパーセント同一性は、次のように決定することができる。参照配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を、１または２以上の候補配列に対して、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをそれらの全長にわたって（グローバルアライメント）行うことを可能にするコンピュータプログラムClustalW（バージョン1.83、デフォルトパラメータ）を用いて整列させる。Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003)。
ClustalWは、参照配列および１または２以上の候補配列の間のベストマッチを計算し、同一性、類似点および相違点を決定できるようにそれらを整列させる。１または２以上の残基のギャップを、参照配列、候補配列、またはその両方に挿入して、配列アラインメントを最大にすることができる。核酸配列の高速のペアワイズアライメントのために、以下のデフォルトのパラメータが使用される：word size：２；window size：４；scoring method：パーセンテージ；number of top diagonals：４；およびgap penalty：５。核酸配列の多重アラインメントのために、以下のパラメータが使用される：gap opening penalty：１０．０；gap extension penalty：５．０；およびweight transition：ｙｅｓ。タンパク質配列の高速なペアワイズアライメントのために、以下のパラメータが使用される：word size：１；window size：５；scoring method：パーセンテージ；number of top diagonals：５；およびgap penalty：３。タンパク質配列の多重アラインメントのために、以下のパラメータが使用される：weight matrix：blosum；gap opening penalty：１０．０；gap extension penalty：０．０５；hydrophilic gaps：オン；hydrophilic residues：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；residue-specific gap penalties：オン。ClustalWの出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ClustalWは、例えばワールドワイドウェブ（(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）のBaylor College of Medicine Search Launcherサイトおよび、ワールドワイドウェブ（ebi.ac.uk/clustalw）のEuropean Bioinformatics Instituteサイトで実行することができる。
候補核酸またはアミノ酸配列の参照配列に対する同一性パーセントを決定するために、配列をClustalWを使用して整列させ、アラインメントにおける同一マッチの数を参照配列の長さで除算し、その結果を１００倍する。同一性パーセント値は、最も近い１０分の１の値に丸めることができることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、よび７８．１４は７８．１に切り捨てられ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は、７８．２に切り上げられる。
機能性ＵＧＴは、グルコシル化または酵素によって行われる他の酵素活動に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解され、したがってかかるポリペプチドは、それ以外の場合よりも長い可能性がある。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、精製タグ（例えば、ＨＩＳタグまたはＧＳＴタグ）、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、またはアミノ末端またはカルボキシ末端に付加された分泌タグを含むことができる。一部の態様において、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、レポーターとして機能するアミノ酸配列、例えば緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質を含む。
ＩＩ．ステビオールおよびステビオール配糖体生合成核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに適した１または２以上の調節領域にセンス方向に動作可能に結合しているそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、多シストロン性ｍＲＮＡからの複数の遺伝子産物を発現することができるため、所望の場合、複数のポリペプチドの発現が、それらの微生物のための単一の調節領域の制御下で可能である。調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように調節領域とコード配列が配置されている場合に、コード配列と調節領域は動作可能に連結されていると考えられる。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子のための調節領域の下流１〜約５０個のヌクレオチドの間に位置される。
多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種において同定された、すなわち異種核酸である。したがって、組換え宿主が微生物の場合、コード配列は他の原核生物または真核微生物由来、植物または動物由来であり得る。しかしいくつかの場合においては、コード配列は、宿主に先天的に（native）存在して、その生物に再導入された配列である。ネイティブ配列は多くの場合、外因性核酸に結合した非天然配列の存在により、例えば、組換え核酸コンストラクト中のネイティブ配列に隣接する非ネイティブ調節配列により、天然に存在する配列から区別することができる。加えて、安定に形質転換された外因性核酸は、典型的には、ネイティブ配列が見出される位置以外の位置に組み込まれている。
「調節領域」とは、転写または翻訳の開始および速度、および転写または翻訳産物の安定性および／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域としては、限定はされないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびそれらの組み合わせを含む。調節領域は、典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域はまた、少なくとも１つの制御エレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などを含んでもよい。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように調節領域とコード配列を配置することにより、コード配列に動作可能に連結される。例えば、コード配列とプロモーター配列を動作可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的にはプロモーターの下流１〜約５０ヌクレオチドの間に配置される。しかし調節領域は、翻訳開始部位の上流約５，０００ヌクレオチド、または転写開始部位の上流の約２，０００ヌクレオチドまでに配置することが可能である。
含められる調節領域の選択はいくつかの要因に依存し、限定はされないが、効率性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および特定の培養段階での優先的発現を含む。当業者にとって、コード配列に対して調節領域を適切に選択して配置することにより、コード配列の発現を調節することは、日常的事項である。１つより多くの調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性エレメントが存在し得ることが理解される。
１または２以上の遺伝子を、組換え核酸コンストラクト中に、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の生産の離散的側面に有用な「モジュール」として組み合わせることができる。複数の遺伝子を、モジュール内、特に多シストロン性モジュール内に組み合わせることにより、様々な種におけるモジュールの使用を容易にする。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスター、またはＵＧＴ遺伝子クラスターは、適切な調節領域を挿入した後に、モジュールを様々な種に導入することができるように、多シストロン性モジュール内に組み合わせることができる。別の例として、ＵＧＴ遺伝子クラスターは、各ＵＧＴコード配列が別個の調節領域に動作可能に連結されてＵＧＴモジュールを形成するように、組み合わせることができる。かかるモジュールは、単シストロン性発現が必要であるかまたは望まれる種において、用いることができる。ステビオールまたはステビオール配糖体の生産に有用な遺伝子に加えて、組換えコンストラクトは、典型的には、複製起点および適切な種におけるコンストラクトの維持のための１または２以上の選択マーカーも含有する。
遺伝コードの縮重のため、多数の核酸が特定のポリペプチドをコード可能であることが理解され、すなわち、多くのアミノ酸に対して、アミノ酸のコドンとして機能する１より多くのヌクレオチドトリプレットが存在する。したがって、所与のポリペプチドに対するコード配列中のコドンは、特定の宿主における最適な発現が、その宿主（例えば、微生物）のための適切なコドンバイアス表を用いて得られるように、変更することができる。配列番号１８〜２５、３４〜３６、４０〜４３、４８〜４９、５２〜５５、６０〜６４、７０〜７２、および１５４は、ステビオールおよびステビオール配糖体の生合成のための特定の酵素をコードするヌクレオチド配列であって、酵母での発現の増加のために修飾されたものを示す。単離された核酸のように、これらの修飾された配列は、精製された分子として存在することができ、組換え核酸コンストラクトのモジュールを構築するために使用するベクターまたはウイルスに組み込むことができる。
いくつかの場合において、内因性ポリペプチドの１または２以上の機能の阻害は、代謝中間体をステビオールまたはステビオール配糖体の生合成に転用するために望ましい。例えば、酵母株においてステロールの合成を下方制御して、例えばスクアレンエポキシダーゼを下方制御して、ステビオールまたはステビオール配糖体の生産をさらに増加することが望ましい場合がある。別の例として、特定の内因性遺伝子産物、例えば、本明細書で説明するように二次代謝産物またはホスファターゼからグルコース部分を除去するグリコヒドロラーゼの、分解機能を阻害することが望ましい場合がある。別の例として、ステビオール配糖体の輸送に関与する膜輸送体の発現を抑制して、グリコシル化ステビオシドの分泌が阻害されるようにすることができる。かかる調節は、ステビオール配糖体の分泌を微生物の培養中の所望の時間抑制し、これにより収穫時の配糖体産物（単数または複数）の収量を増大させるために、有益であり得る。このような場合において、ポリペプチドまたは遺伝子産物の発現を阻害する核酸は、株に形質転換された組換えコンストラクト中に含まれてもよい。代替的に、突然変異誘発を用いて、その機能を阻害することが望まれる遺伝子において、突然変異体を生成することができる。
ＩＩＩ．宿主
Ａ．微生物
多くの原核生物および真核生物は、本明細書に記載の組換え微生物の構築に使用するのに適しており、例えば、グラム陰性細菌、酵母および真菌である。ステビオールまたはステビオール配糖体生産菌株として使用するために選択された種および菌株は、初めに、どの産生遺伝子が菌株に対して内因性であるか、およびどの遺伝子が存在しないかを決定するために、分析される。内因性の対応物が株には存在しない遺伝子は、１または２以上の組換えコンストラクト中に集められ、その後、欠落している機能（複数可）を供給するために株に形質転換される。
例示的な原核生物および真核生物の種を、以下により詳細に説明する。しかし、他の種も好適となり得ることが理解される。例えば適切な種は、以下の群から選択される属であってよい：Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowia。かかる属の代表的な種としては、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis 32、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuro／Gibberella fujikuroi、Candida utilisおよびYarrowia lipolyticaを含む。一部の態様において、微生物は、Gibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus niger、またはSaccharomyces cerevisiaeなどの子嚢菌であることができる。一部の態様において、微生物は、Escherichia coli、Rhodobacter sphaeroides、またはRhodobacter capsulatusなどの原核生物であることができる。特定の微生物を用いて、高スループット様式で目的の遺伝子をスクリーニングおよび試験することができ、一方で、所望の生産性または増殖特性を有する他の微生物を用いて、ステビオール配糖体の大規模生産ができることが、理解される。
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiaeは、合成生物学において広く使用されているシャーシ生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。変異体のライブラリ、プラスミド、代謝に関する詳細なコンピュータモデルおよび、S. cerevisiaeについて利用可能なその他の情報が存在し、生成物の収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能にする。組換え微生物を作製する方法は知られている。
ステビオール生合成遺伝子クラスターは、多数の既知のプロモーターのいずれかを用いて、酵母中で発現することができる。テルペン類を過剰生産する株が知られており、ステビオールおよびステビオール配糖体の生産に利用可能なゲラニルゲラニル二リン酸の量を増加するために使用することができる。
Aspergillus種
Aspergillus spp種、例えばA. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeは、食糧生産に広く用いられている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. niger、およびA. terreusのゲノムについてヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスの強化および生成物の収量増加のための、内因性経路の合理的な設計と変更を可能にする。Aspergillusについて代謝モデルが開発されており、またトランスクリプトーム研究やプロテオミクス研究もなされている。A. nigerは、クエン酸およびグルコン酸など多くの食品成分の工業的生産のために培養され、したがってA. nigerなどの種は、一般に、ステビオールおよびステビオール配糖体などの食品成分の生産に適している。
Escherichia coli
Escherichia coliは、合成生物学において広く使用されている別のプラットフォーム生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。Saccharomycesと同様に、変異体のライブラリ、プラスミド、代謝に関する詳細なコンピュータモデルおよび、E. coliについて利用可能なその他の情報が存在し、生成物の収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能にする。上記Saccharomycesに対するものと同様の方法を用いて、組換えE. coli微生物を作製することができる。
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種は、培養中に大量のジベレリンを生産することが知られているので、有用であり得る。したがって、大量のステビオールおよびステビオール配糖体を生産するためのテルペン前駆体は、既に内因性遺伝子によって生産されている。したがって、ステビオールまたはステビオール配糖体生合成ポリペプチドのための組換え遺伝子を含むモジュールを、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要なしに、かかる属の種に導入することができる。
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）
Arxula adeninivoransは、珍しい生化学的特性の二形性酵母（温度４２℃まではパン酵母のように出芽酵母として増殖し、この閾値を上回ると糸状形で増殖する）である。これは広範囲の基質上で増殖することができ、硝酸塩を同化することができる。これは、天然プラスチックを生産できる株の生成に、または環境試料中のエストロゲンについてのバイオセンサーの開発に、成功して適用されている。
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolyticaは、広い範囲の基質上で増殖することができる二形性酵母である（Arxula adeninivoransを参照）。これは、産業用途に高いポテンシャルを有するが、商業的に利用可能な組換え産物はまだ存在しない。
Rhodobacter種
Rhodobacterは、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。E. coliと同様に、利用可能な変異体のライブラリならびに適切なプラスミドベクターが存在し、生成物の収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能にする。カロテノイドとCoQ10の増産のために、イソプレノイド経路がRhodobacterの膜性細菌種において操作された。米国特許公開第20050003474号および第20040078846号を参照。上記のE. coliに対するものと同様の方法を用いて、組換えRhodobacter微生物を作製することができる。
Candida boidinii
Candida boidiniiは、メチロトローフ酵母（メタノールで増殖することができる）である。他のメチロトローフ種、例えばHansenula polymorphaおよびPichia pastorisと同様に、これは、異種タンパク質の生産のための優れたプラットフォームを提供する。分泌された外来タンパク質の複数グラム範囲の収量が報告されている。計算方法であるＩＰＲＯによれば、最近になって、Candida boidiniiのキシロース還元酵素の補因子特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的に切り替える変異が予測された。
Hansenula polymorpha（Pichia angusta）
Hansenula polymorphaは、別のメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiを参照）。これはさらに、広範囲の他の基質上で増殖が可能である；熱耐性があり、硝酸塩を同化することができる（Kluyveromyces lactisも参照）。これはまた、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンα−２ａの生産、さらに技術的酵素の範囲に適用されている。
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactisは、ケフィアの生産に定期的に適用される酵母である。これはいくつかの糖で増殖することができ、最も重要なのは、牛乳やホエイに存在する乳糖で増殖できることである。これはチーズの生産のために、特にキモシン（仔牛の胃に通常に存在する酵素）の生産に、成功して適用されている。生産は、４０，０００Ｌスケールで発酵槽にて行われる。
Pichia pastoris
Pichia pastorisは、メチロトローフ酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorphaを参照）。これは、外来タンパク質の生産のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素は、キットとして入手可能であり、タンパク質の生産のために学術分野で世界的に用いられている。株は、複雑なヒトグリカン（酵母グリカンは類似しているが、ヒトに見出されるものと同一ではない）を生産できるように操作されている。
Physcomitrella種
懸濁培養で増殖させた場合のPhyscomitrellaコケは、酵母または他の真菌培養物と類似した特性を有する。この属は、他の種類の細胞では生産が困難となり得る、植物二次代謝産物の生産のための重要な細胞種類となっている。
Ｂ．植物細胞または植物
一部の態様において、本明細書に記載の核酸およびポリペプチドは、全体的なステビオール配糖体の生産を増加させるため、または他に比例して特定のステビオール配糖体の生産を富化するために、植物または植物細胞に導入される。したがって宿主は、本明細書に記載の少なくとも１つの組換え遺伝子を含む植物または植物細胞であることができる。植物または植物細胞は、そのゲノム内に組換え遺伝子を組み込むことによって形質転換することができ、すなわち、安定に形質転換することができる。安定に形質転換された細胞は、典型的には、各細胞分裂において、導入された核酸を保持する。植物または植物細胞はまた、組換え遺伝子がそのゲノムに組み込まれないように、一過性に形質転換することもできる。一過性に形質転換された細胞は、典型的には、各細胞分裂において導入された核酸の全てまたは一部分を失い、導入された核酸は十分な数の細胞分裂の後に、娘細胞において検出できなくなる。一過性形質転換および安定形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞は、本明細書に記載の方法において有用となり得る。
本明細書に記載の方法において使用されるトランスジェニック植物細胞は、植物全体の一部または全てを構成することができる。かかる植物は、栽培箱、温室、または耕地でのいずれかで、考慮している種に適切な方法で成長させることができる。トランスジェニック植物は、特定の目的のために、例えば、組換え核酸を他の系統に導入するため、組換え核酸を他の種に転移するため、または他の望ましい形質のさらなる選択のために、必要に応じて栽培できる。代替的に、トランスジェニック植物は、かかる技術に適した種のために、栄養繁殖させることができる。本明細書で用いる場合、トランスジェニック植物はまた、後代が導入遺伝子を継承しているとの条件下で、最初のトランスジェニック植物の後代も指す。トランスジェニック植物が生成した種子を成長させ、次いで自家受粉させて（または異種交配後に自家受粉させて）、核酸コンストラクトのホモ接合種子を得ることができる。
トランスジェニック植物は、懸濁培養物、または組織もしくは器官培養で増殖させることができる。本発明の目的のために、固体および／または液体組織培養技術を使用することができる。固体培地を使用する場合は、トランスジェニック植物細胞は、媒地上に直接配置することができるか、または、フィルター上に配置してこれを次に媒地と接触して配置することができる。液体培地を使用する場合は、トランスジェニック植物細胞は、浮遊装置に、例えば液体媒地に接触する多孔質膜上に配置することができる。
一過性形質転換された植物細胞を用いる場合、レポーター活性を有するレポーターポリペプチドをコードするレポーター配列を、形質転換手順に含めることができ、レポーター活性または発現のためのアッセイは、形質転換後の適当な時期に行うことができる。アッセイを実施するのに適した時間は、一般的に、形質転換の約１〜２１日後、例えば約１〜１４日、約１〜７日、または約１〜３日後である。一過性アッセイの使用は、異なる種における迅速な分析のため、または以前に特定のレシピエント細胞においてその発現が確認されていない異種ポリペプチドの発現を確認するのに、特に便利である。
単子葉植物および双子葉植物に核酸を導入するための技術は当技術分野で周知であり、限定はされないが、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、エレクトロポレーションおよび粒子銃形質転換、米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第6,329,571号、および第6,013,863号を含む。細胞または培養組織を形質転換のためのレシピエント組織として用いる場合、所望により、植物は形質転換された培養物から、当業者に周知の技術によって再生することができる。
トランスジェニック植物の集団を、導入遺伝子の発現により付与される形質または表現型を有する集団のメンバーについてスクリーニングする、および／または選択することができる。例えば、単一の形質転換事象の後代の集団を、ステビオールまたはステビオール配糖体生合成ポリペプチドまたは核酸の発現の所望のレベルを有する植物について、スクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を、発現レベルを同定するために用いることができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン解析またはＰＣＲ増幅；ＲＮＡ転写物を検出するための、ノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；およびポリペプチドを検出するための、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが含まれる。in situハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／または核酸の存在または発現を検出するために、用いることができる。参照された全技術を実行するための方法が知られている。別の方法として、独立した形質転換事象を含む植物の集団を、ステビオール配糖体の生産またはステビオール配糖体の調節された生合成などの所望の形質を有する植物について、スクリーニングすることができる。選択および／またはスクリーニングは、１または２以上の世代に渡り、および／または、２つ以上の地理的位置において、行うことができる。いくつかの場合において、トランスジェニック植物を、所望の表現型を誘導する条件、またはトランスジェニック植物において所望の表現型を生成するのに必要とされる他の条件の下で、成長させ選択することができる。また、選択および／またはスクリーニングは、表現型が植物によって示されることが期待される特定の発達段階の間に、適用することができる。選択および／またはスクリーニングは、導入遺伝子を欠く対照植物と比べて、ステビオール配糖体レベルに統計的に有意な差を有するトランスジェニック植物を選択するために、実施することができる。
本明細書に記載の核酸、組換え遺伝子およびコンストラクトは、多くの単子葉植物および双子葉植物および植物細胞系を形質転換するために使用することができる。適切な単子葉植物の非限定的な例としては、例えば、イネ、ライムギ、モロコシ、キビ、コムギ、トウモロコシ、およびオオムギなどの作物を含む。植物はまた、アスパラガス、バナナ、またはタマネギなどの非穀物単子葉植物である。植物はまた、ステビア（Stevia rebaudiana）、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、エンドウ、ゼラニウム、ホウレンソウ、またはタバコなどの双子葉植物である。いくつかの場合において、植物は、典型的には細胞質およびミトコンドリア中に見出される、メバロン酸経路などのフェニルリン酸産生のための前駆体経路を含むことができる。非メバロン酸経路は、植物プラスチドにおいてより頻繁に見出される[Dubey, et al., 2003 J. Biosci. 28 637-646]。当業者は、ステビオール配糖体生合成ポリペプチドの発現を、リーダー配列の使用により適切な細胞小器官に標的化して、ステビオール配糖体の生合成が、植物細胞の所望の部位で起こるようにすることができる。所望により当業者は、適切なプロモーターを使用して、合成を例えば植物の葉に指向させる。発現はまた、所望により、カルス培養や毛状根培養などの組織培養中で生じてもよい。
一態様において、本明細書に記載の１または２以上の核酸またはポリペプチドは、ステビア（例えばStevia rebaudiana）に導入されて、全体的なステビオール配糖体の生合成が増加されるか、または全体的なステビオール配糖体組成物が、１または２以上の特定のステビオール配糖体（例えばレバウジオシドＤ）について選択的に富化されるようにする。例えば、１または２以上の組換え遺伝子をステビアに導入して、ＥＵＧＴ１１酵素（例えば配列番号１５２またはその機能性ホモログ）が単独で、または以下の１または２以上と組み合わせて、発現されるようにすることができる：ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（例えば配列番号５またはその機能性ホモログ）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ（例えば配列番号１０）などのＵＧＴ９１Ｄ酵素；「機能性ホモログ」の節に記載の変異体などのＵＧＴ８５Ｃ酵素、「機能性ホモログ」の節に記載の変異体などのＵＧＴ７６Ｇ１酵素、またはＵＧＴ７４Ｇ１酵素。核酸コンストラクトは典型的には、ＵＧＴポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結された適切なプロモーター（例えば、３５Ｓ、ｅ３５Ｓ、またはｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーター）を含む。核酸は、Agrobacterium媒介の形質転換により；プロトプラストへのエレクトロポレーション媒介の遺伝子転移、または粒子照射により、ステビア中に導入することができる。Singh, et al., Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic Sugar, Tuber and Fiber, Edited by Chittaranjan Kole and Timothy C. Hall, Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115を参照。ステビアの葉由来カルスの粒子照射について、パラメータは以下である：距離６ｃｍ、１０００ｐｓｉのＨｅ圧力、金粒子、および１回の照射。
ステビア植物は、上記Singh et al., 2008に記載されるように体細胞不定胚形成によって再生することができる。特に、葉切片（長さ約１〜２ｃｍ）を、５〜６週齢のin vitroで栽培した植物から取り出し、ビタミンＢ５、３０ｇのショ糖および３ｇのゲルライトを補充したＭＳ培地上でインキュベート（向軸側を下向き）することができる。２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を、６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン（ＫＮ）、またはゼアチンと組み合わせて使用することができる。前胚形成塊（proembryogenic mass）は８週間の継代培養の後に現れる。継代培養の２〜３週間以内に、体細胞胚が培養物の表面に現れる。胚は、ＢＡを２，４−Ｄ，ａ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、またはインドール酪酸（ＩＢＡ）と組み合わせて含有する培地中で成熟させることができる。発芽し小植物を形成した成熟体細胞胚を、カルスから切り出すことができる。小植物が３〜４週に到達した後、小植物をバーミキュライトと共に鉢に移して、順化のために栽培箱内で６〜８週間成長させ、温室に移す。
一態様において、ステビオール配糖体は、イネで生産される。イネおよびトウモロコシは、Agrobacterium媒介形質転換などの技法を用いて容易に形質転換可能である。バイナリーベクター系は、単子葉植物へのAgrobacterium外来遺伝子導入のために、一般に利用される。例えば、米国特許第6,215,051号および第6,329,571号を参照。バイナリーベクター系において、１つのベクターは目的の遺伝子（例えば、本明細書に記載のＵＧＴ）含むＴ−ＤＮＡ領域を含み、他のベクターは、ｖｉｒ領域を含有する武装解除したＴｉプラスミドである。共組込みベクターおよび可動性ベクターを用いることもできる。形質転換すべき組織の種類および前処理、使用されるAgrobacterium株、植菌の持続時間、Agrobacteriumによる異常増殖および壊死の予防は、当業者により容易に調整することができる。イネの未熟な胚細胞を、バイナリーベクターを使用して、Agrobacteriumによる形質転換のために調製することができる。使用される培養培地には、フェノール化合物が補充される。代替的に、形質転換は、真空浸潤を用いて植物体に行うことができる。例えば、WO 2000037663、WO 2000063400、および WO 2001012828を参照。
ＩＶ．ステビオール配糖体の生産方法
本明細書に記載の組換え宿主は、ステビオールまたはステビオール配糖体を生産する方法において使用することができる。例えば組換え宿主が微生物である場合、方法は、組換え微生物を培養培地中、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体生合成遺伝子が発現される条件下で、増殖させることを含み得る。組換え微生物は、フェッドバッチまたは連続プロセスで増殖させることができる。典型的には、組換え微生物は発酵槽中、規定の温度（単数または複数）で所望の期間増殖される。方法で使用される特定の微生物に依存して、例えばイソペンテニル生合成遺伝子およびテルペン合成酵素およびシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子もまた、存在し発現され得る。基質および中間体のレベル、例えばイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、カウレンおよびカウレン酸などのレベルは、公表された方法に従って分析用に培養培地から試料を抽出することにより、決定することができる。
組換え微生物を、培養物中で所望の期間増殖させた後、ステビオールおよび／または１または２以上のステビオール配糖体を、次に当技術分野で周知の様々な技術を用いて培養物から回収することができる。一部の態様において、透過化剤を添加して、宿主に入る供給原料および出力される生成物を支援することができる。組換え宿主が植物または植物細胞である場合、ステビオールまたはステビオール配糖体を、当技術分野で周知の様々な技術を用いて植物組織から抽出することができる。例えば、培養された微生物または植物組織の粗溶解産物を遠心分離して、上清を得ることができる。得られた上清は次に、例えばＣ−１８カラムなどのクロマトグラフィーカラムに適用し、水で洗浄して親水性化合物を除去し、次にメタノールなどの溶媒で目的の化合物（単数または複数）の溶出を行う。化合物（単数または複数）は、次いで分取ＨＰＬＣによりさらに精製することができる。WO 2009/140394も参照。
生産されたステビオール配糖体（例えばレバウジオシドＤ）の量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約１５００ｍｇ／Ｌ、例えば約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１５００ｍｇ／Ｌ、または約２００〜約１０００ｍｇ／Ｌであることができる。一般に、より長い培養時間は、より大量の生成物につながる。したがって組換え微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日、培養することができる。
なお、本明細書で説明する様々な遺伝子およびモジュールは、１種の微生物よりもむしろ、２種または３種以上の組換え微生物中に存在し得ることが理解される。複数の組換え微生物を使用する場合、それらは、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を生産するために、混合培養物中で増殖させることができる。例えば、第１の微生物は、ステビオール生産のための１または２以上の生合成遺伝子を含むことができ、一方第２の微生物は、ステビオール配糖体生合成遺伝子を含む。あるいは、２または３以上の微生物それぞれを別々の培養培地で増殖することができ、第１の培養培地の生成物例えばステビオールは、第２の培養培地中に導入することができて、これは後続の中間体に変換されるか、またはレバウジオシドＡなどの最終製品に変換される。第２の、または最終微生物によって生産された生成物は、その後回収される。一部の態様においては、組換え微生物が、培養培地以外の栄養源を用い発酵槽以外のシステムを利用して増殖されることも、理解されるであろう。
ステビオール配糖体は、異なる食品系において必ずしも同等の性能を有する必要はない。したがって合成を、選択したステビオール配糖体組成物に指向する能力を有することが望ましい。本明細書に記載の組換え宿主は、特定のステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＤ）について選択的に富化され、一貫した味プロファイルを有する組成物を生産することができる。したがって、本明細書に記載の組換え微生物、植物、および植物細胞は、所与の食品用の所望の甘味プロファイルを満たし、かつバッチ間で一貫した各ステビオール配糖体の割合を有するように調整された組成物の生産を、促進することができる。本明細書に記載の微生物は、ステビア抽出物中に見られる望ましくない植物副産物を生成しない。したがって、本明細書に記載の組換え微生物によって生産されたステビオール配糖体組成物は、ステビア植物から誘導される組成物とは区別される。
Ｖ．食品
本明細書に開示する方法によって得られたステビオール配糖体は、食品、栄養補助食品および甘味料組成物を製造するために使用することができる。例えば、レバウジオシドＡまたはレバウジオシドＤなどの実質的に純粋なステビオールまたはステビオール配糖体は、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、焼き菓子、チューインガム、ハードおよびソフトキャンディ、およびソースなどの食品に含まれることができる。実質的に純粋なステビオールまたはステビオール配糖体はまた、医薬品（pharmaceutical product）、医薬品（medicinal product）、栄養補助食品（dietary supplements）および栄養補助食品（nutritional supplements）などの非食品に含めることができる。実質的に純粋なステビオールまたはステビオール配糖体はまた、農業およびペット産業両方のための動物飼料製品に含まれていてもよい。代替的に、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の混合物を、組換え微生物を別々に培養するか、それぞれが特定のステビオールまたはステビオール配糖体を生産する異なる植物／植物細胞を成長させ、各微生物または植物／植物細胞から実質的に純粋な形態でステビオールまたはステビオール配糖体を回収し、次いで化合物を組み合わせて所望の割合で各化合物を含有する混合物を得ることにより、製造することができる。本明細書に記載の組換え微生物、植物、および植物細胞は、現在のステビア製品と比較してより正確で一貫した混合物を得ることを可能にする。別の代替では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオール配糖体を、例えばサッカリン、デキストロース、ショ糖、果糖、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に、食品に組み込むことができる。ステビオールまたはステビオール配糖体の、他の甘味料に対する重量比は、最終食品において良好な味を達成するために、必要に応じて変えることができる。例えば、米国特許公開第2007/128311号を参照。一部の態様において、ステビオールまたはステビオール配糖体は、風味モジュレーターとして香味料（例えば、柑橘類）と共に提供されてもよい。例えば、レバウジオシドＣは、特に炭水化物ベースの甘味料のための、甘味増強剤または甘味モジュレーターとして使用することができ、食品中の砂糖の量を低減可能である。
本明細書に記載の組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産される組成物は、食品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、食品中に、ステビオール配糖体および食品の種類に応じて、乾燥重量ベースで、約２０ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇから約１８００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇの範囲の量で、組み込むことができる。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、デザート、冷菓子（例えばアイスクリーム）、乳製品（例えばヨーグルト）、または飲料（例えば炭酸飲料）中に、食品が乾燥重量ベースで最大５００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、焼き菓子（例えばビスケット）中に、食品が乾燥重量ベースで最大３００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、ソース（例えばチョコレートシロップ）中または野菜製品（例えばピクルス）中に、食品が乾燥重量ベースで最大１０００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、パンの中に、食品が乾燥重量ベースで最大１６０ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、ハードまたはソフトキャンディ中に、食品が乾燥重量ベースで最大１６００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。組換え微生物、植物、または植物細胞によって生産されるステビオール配糖体組成物は、加工果実製品（例えば、フルーツジュース、フルーツフィリング、ジャムおよびゼリー）の中に、食品が乾燥重量ベースで最大１０００ｍｇのステビオール配糖体／食品ｋｇを有するように、組み込むことができる。
例えば、かかるステビオール配糖体組成物は、９０〜９９％のレバウジオシドＡおよび検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有することができ、食品中に乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇで、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇで、組み込まれることができる。
かかるステビオール配糖体組成物は、３％を超えるレバウジオシドＢを有するレバウジオシドＢ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のレバウジオシドＢの量が乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、レバウジオシドＢ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、１５％を超えるレバウジオシドＣを有するレバウジオシドＣ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のレバウジオシドＣの量が乾燥重量ベースで２０〜６００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、２０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２０〜９５ｍｇ／ｋｇ、２０〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５０〜９５ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、レバウジオシドＣ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、３％を超えるレバウジオシドＤを有するレバウジオシドＤ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のレバウジオシドＤの量が乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、レバウジオシドＤ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、３％を超えるレバウジオシドＥを有するレバウジオシドＥ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のレバウジオシドＥの量が乾燥重量ベースで２５〜１６００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、レバウジオシドＥ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、４％を超えるレバウジオシドＦを有するレバウジオシドＦ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のレバウジオシドＦの量が乾燥重量ベースで２５〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５〜９５ｍｇ／ｋｇ、５０〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５０〜９５ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、レバウジオシドＦ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、４％を超えるズルコシドＡを有するズルコシドＡ富化組成物であることができ、食品中に、製品中のズルコシドＡの量が乾燥重量ベースで２５〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５〜９５ｍｇ／ｋｇ、５０〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５０〜９５ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、ズルコシドＡ富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、２つの位置すなわち１３−Ｏ−グルコースまたは１９−Ｏ−グルコースのいずれかでキシロシル化されたルブソシドについて富化された組成物であることができる。かかる組成物は、４％を超えるキシロシル化ルブソシド化合物を有することができ、食品中に、製品中のキシロシル化ルブソシド化合物の量が乾燥重量ベースで２５〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５〜９５ｍｇ／ｋｇ、５０〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５０〜９５ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、キシロシル化ルブソシド富化組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
かかるステビオール配糖体組成物は、２つの位置すなわち１３−Ｏ−グルコースまたは１９−Ｏ−グルコースのいずれかでラムノシル化された化合物について、または、１つのラムノースおよび複数のグルコースを含有する化合物（例えばステビオール１３−Ｏ−１，３−ジグリコシド−１，２−ラムノシド）について、富化された組成物であることができる。かかる組成物は、４％を超えるラムノシル化化合物を有することができ、食品中に、製品中のラムノシル化化合物の量が乾燥重量ベースで２５〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるよう、例えば、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５〜９５ｍｇ／ｋｇ、５０〜７５ｍｇ／ｋｇまたは５０〜９５ｍｇ／ｋｇとなるように、組み込まれることができる。一般的には、ラムノシル化化合物について富化された組成物は、検出不可能な量のステビア植物由来の不純物を有する。
一部の態様において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオール配糖体は、卓上用甘味料または「cup-for-cup」製品に組み込まれる。このような製品は、典型的には、当業者に周知の例えばマルトデキストリンなどの１または２以上の増量剤で、適切な甘味レベルまで希釈される。レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、またはラムノシル化もしくはキシロシル化化合物について富化されたステビオール配糖体組成物は、乾燥重量ベースで例えば１０，０００〜３０，０００ｍｇのステビオール配糖体／製品ｋｇで、卓上用に小袋に包装することができる。
一部の態様において、本開示は、以下の項目に関する：
１．核酸配列を含む組換え宿主細胞であって、該核酸が、オープンリーディングフレームに動作可能に連結された異種挿入配列を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
式中、Ｘ３は、ゼロヌクレオチドまたはヘアピンループを形成する１もしくは２以上のヌクレオチドを含み、
式中、Ｘ１およびＸ５は、各々独立して、ゼロヌクレオチドまたは１もしくは２以上のヌクレオチドからなり、式中、前記オープンリーディングフレームは、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）をコードする、
を有する、前記組換え宿主細胞。
２．項目１に記載の組換え細胞であって、核酸が、５’から３’の順序で、オープンリーディングフレームに動作可能に連結された異種挿入配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、ここで前記異種挿入配列およびオープンリーディングフレームは、項目１に定義の通りである、前記組換え細胞。
３．核酸配列を含む細胞であって、該核酸が、
ｉ）プロモーター配列、これは
ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続した核酸に相補的であり、これとヘアピン二次構造要素を形成する、少なくとも４つの連続した核酸を含み、および
式中、Ｘ３は、不対核酸を含み、これによりＸ２とＸ４の間にヘアピンループを形成し、および
式中、Ｘ１およびＸ５は、独立しておよび任意に、１または２以上の核酸を含み、および、
式中、前記オープンリーディングフレームは、発現すると、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）またはその生物学的活性断片と少なくとも約７０％の同一性を有するポリペプチド配列をコードし、前記断片は、前記スクアレン合成酵素と、少なくとも１００個のアミノ酸のオーバーラップの範囲内で少なくとも約７０％の配列同一性を有する、
を有する、前記細胞。
４．異種挿入配列が、１０〜５０のヌクレオチド、好ましくは１０〜３０のヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５のヌクレオチド、より好ましくは１７〜２２のヌクレオチド、より好ましくは１８〜２１のヌクレオチド、より好ましくは１８〜２０のヌクレオチド、より好ましくは１９のヌクレオチドを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
５．Ｘ２およびＸ４が、同数のヌクレオチドからなる、項目１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
６．全てのＸ２が、４〜２５の範囲、例えば４〜２０の範囲、例えば４〜１５の範囲、例えば６〜１２の範囲、例えば８〜１２の範囲、例えば９〜１１の範囲のヌクレオチドからなる、項目１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
７．全てのＸ４が、４〜２５の範囲、例えば４〜２０の範囲、例えば４〜１５の範囲、例えば６〜１２の範囲、例えば８〜１２の範囲、例えば９〜１１の範囲のヌクレオチドからなる、項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
８．Ｘ２が、Ｘ４のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる、項目１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
９．Ｘ４が、Ｘ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる、項目１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
１０．Ｘ３が不在である、すなわちＸ３がゼロのヌクレオチドからなる、項目１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
１１．Ｘ３が、１〜５の範囲、例えば１〜３の範囲のヌクレオチドからなる、項目１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
１２．Ｘ１が不在である、すなわちＸ１がゼロのヌクレオチドからなる、項目１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
１３．Ｘ１が、１〜２５の範囲、例えば１〜２０の範囲、例えば１〜１５の範囲、例えば１〜１０の範囲、例えば１〜５の範囲、例えば１〜３の範囲のヌクレオチドからなる、項目１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
１４．Ｘ５が不在である、すなわちＸ５がゼロのヌクレオチドからなる、項目１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
１５．Ｘ５が、１〜５の範囲、例えば１〜３の範囲のヌクレオチドからなる、項目１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
１６．異種挿入配列が、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、および配列番号１８４からなる群から選択される配列を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
１７．異種挿入配列が、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、および配列番号１８４からなる群から選択される、項目１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
１８．スクアレン合成酵素が、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２からなる群から選択されるスクアレン合成酵素に、少なくとも７５％同一である、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
１９．プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、項目１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
２０．プロモーターが、内因性プロモーター、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＦＢＡ１、ＧＡＬ１−１０、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ２５、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１−Ｓ、ＧＡＬ１−Ｌ、ＴＥＦ１、ＡＤＨ１、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ヒトＵｂｉＣ、ＲＳＶ、ＥＦ−１α、ＳＶ４０、Ｍｔ１、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｍｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲ、Ｍｘ１、プロゲステロン、ＲＵ４８６およびラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
２１．核酸配列がさらに、ポリアデニル配列を含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
２２．ポリアデニル配列の５’末端が、項目１の核酸の３’末端に動作可能に連結されている、項目２１に記載の細胞。
２３．核酸配列がさらに、転写後調節エレメントを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
２４．転写後調節エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、項目２３に記載の細胞。
２５．核酸が、５’末端反復および３’末端反復を含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
２６．５’末端反復および３’末端反復が、逆方向末端反復（ＩＴＲ）および長末端反復（ＬＴＲ）から選択される、項目２５に記載の細胞。
２７．核酸配列がベクターに組み込まれている、項目１〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
２８．ベクターが発現ベクターである、項目２７に記載の細胞。
２９．ベクターが、プラスミドベクター、コスミド、人工染色体およびウイルスベクターからなる群から選択される、項目２７に記載の細胞。
３０．プラスミドベクターが、細菌、真菌および酵母において維持されて複製することができる、項目２９に記載の細胞。
３１．ウイルスベクターが、レンチウイルス、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＡＩＶ、ＣＩＶを含むレトロウイルス科由来のベクターからなる群から選択される、項目２９に記載の細胞。
３２．ウイルスベクターが、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、 ＨＳＶ、コロナウイルス、ウシパピローマウイルス、Ｍｏ−ＭＬＶおよびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、項目３１に記載の細胞。
３３．ベクターが、哺乳動物細胞において機能的である、項目２７〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
３４．細胞が、項目２７〜３３のいずれか一項に記載のベクターで形質転換または形質導入される、項目１〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
３５．細胞が真核細胞である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
３６．細胞が原核細胞である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
３７．細胞が、例えば酵母およびアスペルギルス等の真菌細胞；クロレラ属およびプロトセカ属などの微細藻類；植物細胞；および、ヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、ネズミ、ラット、マウスおよびウサギ細胞などの哺乳動物細胞からなる群から選択される、項目３５に記載の細胞。
３８．酵母が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、およびCandida albicansからなる群から選択される、項目３７に記載の細胞。
３９．細胞が、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、ＢＨＫ細胞からなる群から選択される、項目３７に記載の細胞。
４０．細胞が、E. coli、Corynebacterium、Bacillus、PseudomonasまたはStreptomycesである、項目３６に記載の細胞。
４１．原核細胞または真菌細胞が、メバロン酸独立経路の酵素の少なくとも一部を発現するように遺伝子操作されている、項目３５〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
４２．細胞がさらに、該細胞におけるＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結されたＧＧＰＰＳをコードする異種核酸を含む、項目１〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
４３．ＧＧＰＰＳが、配列番号１２６、配列番号１２３、配列番号２０３、配列番号１６７、および前述のいずれかと少なくとも７５％の配列同一性を有するそれらの機能性ホモログからなる群から選択される、項目４２に記載の細胞。
４３．スクアレン経路を介して合成されるテルペノイド化合物を生産する方法であって、該方法が、以下のステップ：
（ａ）項目１〜４２のいずれか一項に記載の細胞を提供すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること、
（ｃ）テルペノイド生成物の化合物を回収すること、
を含む、前記方法。
４４．ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からなる群から選択されるテルペノイド前駆体に由来するテルペノイドを生産するための方法であって、以下：
（ａ）前記前駆体を、スクアレン合成酵素経路の酵素と接触させること、
（ｂ）テルペノイド生成物を回収すること、
を含む、前記方法。
４５．テルペノイド生成物が、ヘミテルペノイド、モノテルペン、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルペン、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、およびポリテルペノイドからなる群から選択される、項目４４または４５に記載の方法。
４６．テルペノイドが、ファルネシルリン酸、ファルネソール、ゲラニルゲラニル、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、プレノール、イソ吉草酸、ゲラニルピロリン酸、ユーカリプトール、リモネン、ピネン、ファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、アフィジコリン、ラノステロール、リコピンおよびカロテンからなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
４７．方法がさらに、ファルネシルリン酸を脱リン酸化してファルネソールを生産することを含む、項目４６に記載の方法。
４８．スクアレン合成酵素経路の酵素が、ジメチルアリルトランスフェラーゼ（EC 2.5.1.1）、イソプレン合成酵素（EC 4.2.3.27）、およびゲラニルトランストランスフェラーゼ（EC 2.5.1.10）からなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
４９．機能性スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）の翻訳速度を低下させる方法であって、方法が、
（ａ）項目１〜４２のいずれか一項に記載の細胞を提供すること、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養すること、
を含む、前記方法。
５０．ファルネシル−ｐｐのスクアレンへの転換を低下させるための方法であって、方法が、
（ｄ）項目１〜４２のいずれか一項に記載の細胞を提供すること、
（ｅ）（ｄ）の細胞を培養すること、
を含む、前記方法。
５１．ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸からなる群から選択される化合物の蓄積を増強するための方法であって、方法が、次のステップ：
（ａ）項目１〜４２のいずれか一項に記載の細胞を提供すること、および
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養すること。
を含む、前記方法。
５２．ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸化合物を回収することをさらに含む、項目５１に記載の方法。
５３．スクアレン経路を介して合成された化合物を回収することをさらに含み、ここで該化合物が、ファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸および／またはゲラニルゲラニルピロリン酸に由来するものである、項目５１または５２に記載の方法。
５４．細胞を培養するステップが、スクアレン合成酵素阻害剤の存在下で行われる、項目４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
５５．細胞がさらに、ホスホメバロン酸キナーゼ（EC 2.7.4.2）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.33）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸合成酵素（EC 1.17.7.1）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸還元酵素（EC 1.17.1.2）、イソペンテニル二リン酸δ−イソメラーゼ１（EC 5.3.3.2）、短鎖Ｚ−イソプレニル二リン酸合成酵素（EC 2.5.1.68）、ジメチルアリルトランスフェラーゼ（EC 2.5.1.1）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（EC 2.5.1.10）およびゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（EC 2.5.1.29）からなる群から選択される１または２以上の酵素の活性を増強し、および／またはこれを過剰発現するように遺伝子操作されている、項目４３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
５６．細胞がさらに、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素またはその触媒ドメイン、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、メバロナートキナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ファルネシルピロリン酸合成酵素、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸合成酵素、および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼおよびファルネシルピロリン酸合成酵素からなる群から選択される１または２以上の酵素の活性を増強し、および／またはこれを過剰発現するように遺伝子操作されている、項目４３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
５７．細胞が、ＥＲＧ９オープンリーディングフレームの変異を含む、項目４３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
５８．細胞が、ＥＲＧ９［デルタ］：：ＨＩＳ３欠失／挿入対立遺伝子を含む、項目４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
５９．化合物を回収するステップが、該化合物を細胞培養培地から精製することを含む、項目４３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
ＶＩ．例
本発明は以下の例においてさらに説明されるが、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載の例において、特に断らない限り、次のＬＣ−ＭＳ法をステビオール配糖体およびステビオール経路中間体の分析に用いた。
１）ステビオール配糖体の分析
ＬＣ−ＭＳ分析は、Agilent 1200 SeriesＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA）を用いて、これにPhenomenex(R) kinetexのＣ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ粒子、１００Åの細孔サイズ）を取り付け、TSQ Quantum Access（ThermoFisher Scientific）トリプル四重極質量分析計に接続し、加熱エレクトロスプレーイオン（ＨＥＳＩ）源を用いて行った。溶出は、溶離液Ｂ（ＭｅＣＮに０．１％ギ酸）および溶離液Ａ（水に０．１％ギ酸）の移動相を用いて、勾配を、０．０分から１．０分でＢ：１０→４０％に増加させ、１．０分から６．５分でＢ：４０→５０％に、および６．５分から７．０分でＢ：５０→１００％に増加させ、最後に洗浄して再平衡化することにより、実施した。流速は０．４ｍｌ／分、およびカラム温度は３０℃であった。ステビオール配糖体の検出は、ポジティブモードでＳＩＭ（Single Ion Monitoring）を用いて、次のｍ／ｚトレースにより行った。
ステビオール配糖体レベルは、ＬＧＣ規格の認証標準物質を用いて得られた検量線と比較することで定量した。例えば、０．５〜１００μＭのレバウジオシドＡの標準溶液を、検量線を作成するために一般に用いた。
２）ステビオールおよびｅｎｔ−カウレン酸の分析
ステビオールおよびｅｎｔ−カウレン酸のＬＣ−ＭＳ分析を、上記のシステムで行った。分離のために、Thermo Science Hypersil Goldカラム（Ｃ−１８、３μｍ、１００×２．１ｍｍ）を用い、２０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液を溶離液Ａとして、およびアセトニトリルを溶離液Ｂとして用いた。勾配条件は、０．０分から１．０分でＢ：２０→５５％、１．０分から７．０分で５５→１００％、最後に洗浄および再平衡化であった。流速は０．５ｍｌ／分、およびカラム温度は３０℃であった。ステビオールおよびｅｎｔ−カウレン酸の検出は、ネガティブモードでＳＩＭ（Single Ion Monitoring）を用いて、次のｍ／ｚトレースにより行った。
３）ＵＤＰ−グルコースのＨＰＬＣ定量化
ＵＤＰ−グルコースの定量のために、Agilent 1200シリーズＨＰＬＣシステムを、Waters XBridgeＢＥＨアミド（２．５μＭ、３．０×５０ｍｍ）カラムと共に用いた。溶離液Ａは１０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９．０）であり、溶離液Ｂはアセトニトリルであった。勾配条件は、０．０分〜０．５分：９５％のＢを保持、０．５分〜４．５分：Ｂを９５〜５０％に低下、４．５分〜６．８分：５０％のＢを保持、および最後に９５％のＢに再平衡化であった。流速は０．９ｍｌ／分、およびカラム温度は２０℃であった。ＵＤＰ−グルコースは、ＵＶ２６２ｎｍの吸光度により検出した。
ＵＤＰ−グルコースの量は、市販の標準（例えばSigma Aldrichから）を用いて得られた検量線と比較することにより定量した。
例１―ＥＵＧＴ１１の識別
１５種類の遺伝子を、ＲｅｂＡの１，２−グリコシル化活性について試験した。表１０を参照。
これらの遺伝子のin vitroの転写および翻訳を行い、得られたＵＧＴをＲｅｂＡおよびＵＤＰ−グルコースと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応をＬＣ−ＭＳにより分析した。ＥＵＧＴ１１（イネ、 AC133334、配列番号１５２）を含有する反応混合物は、かなりの量のＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが示された。図４のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを参照。図４の左側のパネルに示すように、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、ＲｅｂＡを原料として用いた場合に、微量のＲｅｂＤを生産した。図４の右側のパネルに示すように、ＥＵＧＴ１１は、ＲｅｂＡを原料として用いた場合に、かなりの量のＲｅｂＤを生産した。生産されたＲｅｂＤの量の予備的定量化により、ＥＵＧＴ１１はＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換について約３０倍効率的であることが示された。
さらなるＥＵＧＴ１１の特徴付けおよび、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとの定量的比較のために、ＥＵＧＴ１１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５３、非コドン最適化、図７）を、１つはＮ末端にＨＩＳタグを含み、１つはＮ末端にＧＳＴタグを含む、２つのE. coli発現ベクターにクローニングした。ＥＵＧＴ１１を両方の系を用いて発現させ、精製した。精製された酵素をＵＤＰ−グルコースおよびＲｅｂＡと共にインキュベートすると、ＲｅｂＤが生産された。
例２―ＥＵＧＴ１１反応の同定
ＥＵＧＴ１１を、in vitroの転写および翻訳によって生産し、ＲｅｂＤ経路において種々の基質と共にインキュベートした。同様の実験を、in vitroで転写および翻訳されたＵＧＴ９１Ｄ２ｅを用いて実施した。図３は、ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅが行う、１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化反応の概略図を示す。化合物１〜３は、質量および推定保持時間のみによって同定された。図３に示す数字はＬＣ−ＭＳクロマトグラムから得られた指示されたステビオール配糖体の平均ピーク高さであり、定量的ではないが、２つの酵素の活性を比較するために使用することができる。ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、ステビオールを基質として用いることができなかった。両酵素はステビオール１９−Ｏ−モノグルコシド（ＳＭＧ）を化合物１に変換することができ、ＥＵＧＴ１１はＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも、１９−ＳＭＧの化合物１への変換について約１０倍も効率的であった。
両酵素は、同等の活性でルブソシドをステビオシドに変換することができ、ただしＥＵＧＴ１１のみが、ルブソシドを化合物２および化合物３（ＲｅｂＥ）に変換することができた。図５を参照。図５の左側のパネルは、ルブソシドのステビオシドへの変換のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図５の右側のパネルは、ルブソシドの、ステビオシド、化合物２および化合物３（ＲｅｂＥ）への変換のクロマトグラムを示す。ルブソシドの化合物３への変換は、ステビオールの１９および１３位置において、２回の連続した１，２−Ｏ−グリコシル化を必要とする。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、１つの実験で微量の化合物３（ＲｅｂＥ）を生産することができ、一方ＥＵＧＴ１１は、かなりの量の化合物３を生産した。
両酵素は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することができた。しかしＥＵＧＴ１１は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することにおいて、約３０倍優れていた。全体的にＥＵＧＴ１１は、ルブソシドのステビオシドへの変換を除きすべての反応（同様の時間、濃度、温度、および酵素の純度）において、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも多くの生成物を生産するようである。
例３―酵母におけるＥＵＧＴ１１の発現
ＥＵＧＴ１１をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化し（配列番号１５４）、全４つのＵＧＴ（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ８５Ｃ２）をコードする核酸と共に酵母に形質転換した。得られた酵母株を、ステビオールを含有する培地中で増殖させ、蓄積したステビオール配糖体をＬＣ−ＭＳで分析した。ＥＵＧＴ１１は、ＲｅｂＤの生産のために必要であった。他の実験では、ＲｅｂＤの生産はＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ８５Ｃ２で観察された。
例４― １９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ステビオール配糖体でのＵＧＴ活性
ＥＵＧＴ１１によって生産された１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ステビオール配糖体は、 ＲｅｂＤに変換されるためにさらなるグリコシル化を必要とする。以下の実験を行って、他のＵＧＴが、これらの中間体を基質として使用できるかどうかを決定した。
１つの実験では、化合物１の１９−ＳＭＧからのin vitroでの生産を、ＵＤＰ−グルコースの存在下でＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅのいずれかにより行った。試料を煮沸した後、ＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＤＰ−グルコースを添加した。試料をＬＣ−ＭＳにより分析し、化合物２が検出された。この実験は、ＵＧＴ８５Ｃ２が化合物１を基質として使用できることを示した。
別の実験では、化合物２を、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＵＤＰ−グルコースと共にインキュベートした。反応物をＬＣ−ＭＳにより分析した。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、化合物２を化合物３（ＲｅｂＥ）に変換できなかった。化合物２をＥＵＧＴ１１およびＵＤＰ−グルコースと共にインキュベートすると、化合物３の生産がもたらされる。ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＲｅｂＥをＲｅｂＤ生産のための基質として使用することができた。
このことは、ステビオール配糖体の１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化が、ＲｅｂＤ生産の任意の時に生じ得ることを示し、これは、下流の酵素が１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化中間体を代謝可能だからである。
例５―ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅの配列の比較
ＥＵＧＴ１１のアミノ酸配列（配列番号１５２、図７）、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅのアミノ酸配列（配列番号５）を、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448 (1998)）を用いて整列させた。図６参照。ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、４５７個のアミノ酸にわたり４２．７％同一である。
例６―ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの１９−１，２−ジグリコシル化活性の修飾
多くのＵＧＴについて、結晶構造が利用可能である。一般に、ＵＧＴのＮ末端半分は主に基質結合に関与し、一方でＣ末端半分は、ＵＤＰ−糖供与体の結合に関与している。
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの二次構造を、結晶化されたＵＧＴの二次構造上にモデル化することにより、図８に示すように高度に分岐した一次配列にもかかわらず、二次構造の保存されたパターンを明らかにした。ＵＧＴ７１Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｈ２の結晶構造が報告されている（例えばH. Shao et al, The Plant Cell November 2005 vol. 17 no 11 3141-3154およびL. Li et al., J Mol Biol. 2007 370(5):951-63を参照）。公知のループであるαヘリックスおよびβシートが、図８のＵＧＴ９１Ｄ２ｅに示されている。これらのＵＧＴの一次構造レベルでの相同性はかなり低いが、二次構造は保存されているように見え、ＵＧＴ８５Ｈ２およびＵＧＴ７１Ｇ１におけるかかるアミノ酸の位置に基づいた、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅへの基質結合に関与するアミノ酸の位置についての予測を可能にしている。
基質結合に一般に関与する領域をＵＧＴ９１Ｄ２ｅに重ね合わせて、これがＵＧＴ９１Ｄ１（GenBankアクセッション番号タンパク質アクセッション番号AAR06918、GI：37993665）からの２２個のアミノ酸の違いとほぼ一致することが示された。ＵＧＴ９１Ｄ１はステビアで高度に発現され、機能性ＵＧＴであると考えられている。しかし、その基質はステビオール配糖体ではない。このことは、ＵＧＴ９１Ｄ１が、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとは異なる、２２個のアミノ酸によって定義することができる別の基質を有することを示唆している。図９は、ＵＧＴ９１Ｄ１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅのアミノ酸配列のアラインメントである。ボックスは、基質結合に関与することが報告されている領域を表す。濃い灰色で強調表示したアミノ酸は、ＵＧＴ９１Ｄ１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅの間の２２個のアミノ酸の違いを示す。星印は、結晶構造が決定されたＵＧＴでの基質結合に関与することが示されているアミノ酸を意味する（特定の１つのアミノ酸の下の複数の星印は、２つ以上の構造決定されたＵＧＴにおいて、基質結合が示されていることを意味する）。２つのＵＧＴ９１の間の２２アミノ酸の差異には強い相関があり、これは基質結合に関与することが知られている領域であり、結晶構造決定ＵＧＴの基質結合に実際に関与するアミノ酸である。これは、２つのＵＧＴ９１の間の２２アミノ酸の違いが、基質結合に関与することを示唆する。
全２２種類の変更された９１Ｄ２ｅを、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターからＸＪｂ自己溶解E. coli株で発現させた。酵素の活性を評価するために、in vitroとin vivoの２つの基質供給実験を行った。ほとんどの突然変異体は野生型よりも低い活性を有したが、５つの変異体が増大した活性を示した。これは、in vitroでの転写および翻訳（ＩＶＴ）で再生され、Ｃ５８３Ａ、Ｃ６３１ＡおよびＴ８５７Ｃが、野生型ＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも約３倍高いステビオシド形成活性を有しており、一方、Ｃ６６２ｔおよびＡ１３１３Ｃは、約２倍のステビオシド形成活性を有することを示した（ヌクレオチド番号）。これらの変更は、それぞれ、Ｌ１９５Ｍ、Ｌ２１１Ｍ、Ｖ２８６Ａ；およびＳ２２１ＦおよびＥ４３８Ａに対応するアミノ酸変異を引き起こす。増大した活性は基質によって異なり、Ｃ５８３ＡおよびＣ６３１Ａは、１３−ＳＭＧを基質として用いてほぼ１０倍の増加を示し、ルブソシドを基質として用いて約３倍の増加を示し、一方、Ｔ８５７Ｃは、１３−ＳＭＧまたはルブソシドいずれかを基質として用いて、３倍の増加を示した。
これらの変異が加法的であるかどうかを調査するために、ある範囲の二重変異体を作り、活性について分析した（図１０）。この特定の実験では、前の４つの実験よりも活性の高い野生型のレベルが観察された；しかし、変異の相対的な活性は同じままである。ルブソシドは、４種のＵＧＴ（ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）を発現するS. cerevisiae株の多くに蓄積するため、ステビオシド形成活性は、ステビオール配糖体生産の増加により重要となり得る。このように、二重変異体Ｃ６３１Ａ／Ｔ８５７Ｃ（ヌクレオチド番号）は有用であり得る。この変異体はＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂと名付けられ、これはアミノ酸修飾Ｌ２１１ＭおよびＶ２８６Ａを含有する。実験は、S. cerevisiae発現のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ変異体を用いてin vitroで再現されている。
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの１９−１，２−ジグリコシル化活性を改善するため、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとＵＧＴ９１Ｄ１の間の２２アミノ酸の違いの、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの指向性飽和変異原性スクリーニングを実施した。GeneArt’s(R)（Life Technologies, Carlsbad, CA）の部位飽和突然変異誘発を用いて、それぞれの変異を含むライブラリを得た。ライブラリを、９１Ｄ２ｅの突然変異型をＧＳＴ融合タンパク質として発現する、ｐＧＥＸ４Ｔ１細菌発現プラスミドのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングし、新しいライブラリを得た（Ｌｉｂ＃１１６）。Ｌｉｂ＃１１６を、XJbAutolysis E. coli株（ZymoResearch, Orange, CA）に形質転換して、４１８の予想変異（すなわち、各位置で１９個の異なるアミノ酸を有する、２２の位置）を含有する約１６００のクローンを生成した。９１Ｄ２ｅ（ＥＰＣＳ１３１４）、９１Ｄ２ｅ−ｂ（ＥＰＳＣ１８８８）またはＥＵＧＴ１１（ＥＰＳＣ１７４４）ならびに空のｐＧＥＸ４Ｔ１（ＰＳＢ１２）のＧＳＴタグ付きバージョンを発現する他のプラスミドも、同様に形質転換した。
ＬＣ−ＭＳによるスクリーニング
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅの約１６００の変異体クローンを分析するために、E. coli形質転換体を、９６ウェルフォーマットで、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）およびクロラムフェニコール（３３ｍｇ／ｌ）を含有する１ｍｌのＮＺＣＹＭ中３０℃で一晩増殖させた。翌日、１５０μｌの各培養物を、２４ウェルフォーマットで、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）、クロラムフェニコール（３３ｍｇ／ｌ）、アラビノース３ｍＭ、ＩＰＴＧ０．１ｍＭおよびエタノール２％（ｖ／ｖ）を含有する３ｍｌのＮＺＣＹＭに植菌し、２０℃および２００ｒｐｍで〜２０時間インキュベートした。翌日細胞を遠沈し、ペレットを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、および完全ミニプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡフリー（３つの錠剤／１００ｍｌ）（Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland）を含有する１００μｌの溶解緩衝液中に再懸濁し、−８０℃で少なくとも１５分間冷凍して、細胞溶解を促進した。ペレットを室温で解凍し、５０μｌのDNaseミックス（Ｈ２Ｏ中１μｌの１．４ｍｇ／ｍｌのDNase（〜８００００／ｍｌ）、１．２μｌの５００ｍＭのＭｇＣｌ２および４７．８μｌの４×ＰＢＳ緩衝液）を各ウェルに添加した。プレートを、ゲノムＤＮＡの分解を可能にするために、５００ｒｐｍで室温で５分間振とうした。プレートを４℃で３０分間、４０００ｒｐｍで遠沈し、ＧＳＴ−９１Ｄ２ｅ−ｂについて記載したように、ルブソシドまたはレバウジオシドＡを基質として用いて、６μｌの溶解物をＵＧＴのin vitro反応において使用した。各場合において、得られた化合物であるステビオシドまたはレバウジオシドＤ（ｒｅｂＤ）は、ＬＣ−ＭＳにより測定した。結果を、対応する対照（９１Ｄ２ｅ、９１Ｄ２ｅ−ｂ、ＥＵＧＴ１１および空のプラスミド）を発現する溶解物によって生産されるステビオシドまたはｒｅｂＤと比較して分析した。９１Ｄ２ｅ−ｂを発現するものと同様またはこれより高い活性を示すクローンを、一次ヒットとして選択した。
１６００のクローンの半分および対応する対照を、ルブソシドおよびレバウジオシドＡをグリコシル化するそれらの能力について検定した。ステビオシドおよびＲｅｂＤをＬＣ−ＭＳにより定量した。使用した条件下で、ネイティブＵＧＴ９１Ｄ２ｅを発現するクローンからの溶解物は、両方の基質についてほぼバックグラウンド付近の活性を示し（約０．５μＭのステビオシドおよび１μＭのＲｅｂＤ）、一方、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂを発現するクローンは、一貫して改善された生成物形成を示す（＞１０μＭのステビオシド；＞１．５μＭのＲｅｂＤ）。ＥＵＧＴ１１を発現するクローンは、特に基質としてＲｅｂＡを用いると、一貫して高いレベルの活性を示す。スクリーニングにおいて、クローンを一次ヒットとして検討するためのカットオフは、一般に両方の生成物について１．５μＭとしたが、いくつかのケースでは、それぞれ独立のアッセイのために調節した。
例７―ＥＵＧＴ１１ホモログ
ＥＵＧＴ１１タンパク質配列を用いたＮＣＢＩｎｒデータベースのBlastp検索により、１４の植物種から約７９の潜在的ＵＧＴホモログが明らかにされた（そのうちの１つはステビアＵＧＴ９１Ｄ１であり、保存されたＵＧＴ領域においてはＥＵＧＴ１１と約６７％同一であるが、全体としては４５％未満）。保存された領域において９０％以上の同一性を有するホモログは、トウモロコシ、ダイズ、Arabidopsis（シロイヌナズナ）、ブドウ、およびSorghum（ソルガム）から同定された。完全長ＥＵＧＴ１１ホモログの全体的な相同性は、アミノ酸レベルで２８〜６８％にすぎなかった。
ＲＮＡの植物材料からの抽出は、Iandolino et al.（Iandolino et al., Plant Mol Biol Reporter 22, 269-278, 2004）に記載された方法、RNeasy Plant mini Kit（Qiagen）を製造業者の使用説明書に従って、またはFast RNA Pro Green Kit（MP Biomedicals）を用いて製造業者の使用説明書に従って行った。ｃＤＮＡは、AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Agilent）により製造業者の使用説明書に従って生成した。ゲノムＤＮＡは、FastDNAキット（MP biomedicals）を用いて製造業者の説明書に従って抽出した。ＰＣＲをｃＤＮＡに対して、Dream Taqポリメラーゼ（Fermentas）またはPhusionポリメラーゼ（New England Biolabs）のいずれかおよび、ホモログを増幅するように設計されたプライマーのシリーズを用いて行った。
ＰＣＲ反応は、SyberSafe含有アガロース−ＴＡＥゲル中で電気泳動により分析した。ＤＮＡは、トランスイルミネーターでＵＶ照射によって可視化した。正しいサイズのバンドを切り出し、製造業者の仕様に従ってスピンカラムで精製し、TOPO−Zeroブラント（Phusionポリメラーゼによって生成された生成物用）またはTOPO-TA（Dream Taqで生成された生成物用）にクローニングした。ＰＣＲ産物を含有するTOPOベクターは、E. coliＤＨ５Ｂαに形質転換し、適切な選択抗生物質を含むＬＢ−寒天プレート上にプレーティングした。ＤＮＡを生存コロニーから抽出し、配列決定した。正確な配列を有する遺伝子は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩでの制限消化により切り出し、同様に消化したＩＶＴ８ベクターにクローニングし、E. coliに形質転換した。ＰＣＲはすべてのクローニングされた遺伝子について実施して、in vitroの転写および翻訳に必要な遺伝子およびフランキング領域を増幅した。タンパク質を、製造者の指示に従ってPromega L5540、TNT T7 Quick for PCR DNA Kitを用いて、ＰＣＲ生成物からin vitroの転写および翻訳により生成した。タンパク質の生成を、３５Ｓ−メチオニンの取り込みと、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離とTyphoon蛍光イメージャー上での可視化により評価した。
活性アッセイをセットした：各in vitro反応の合計２０％（容量で）、０．１ＭのルブソシドまたはＲｅｂＡ、５％のＤＭＳＯ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０１単位の高速アルカリホスファターゼ（Fermentas）、および０．３ｍＭのＵＤＰ−グルコース（最終濃度）であった。３０℃で１時間のインキュベーション後、試料をＬＣ−ＭＳにより、上記のようにステビオシドおよびＲｅｂＤの生産について分析した。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（例６に記載の二重変異体）を陽性対照として、ＥＵＧＴ１１と共に使用した。初期のアッセイ条件下で、クローンＰ６４Ｂ（表１１を参照）は、ルブソシドおよびＲｅｂＡを使用して微量の生成物を生産した。表１１は、ＥＵＧＴ１１と比較したアミノ酸レベルでの同一性パーセントを、ＵＧＴの全長について示し、これは２８〜５８％の範囲であった。高い量の相同性（９６〜１００％）は配列の短いストレッチにわたって観察され、植物のＵＧＴの高度に保存されたドメインを示すことができる。
例８―Ｒｅｂ−Ｄの無細胞生体触媒による生産
無細胞アプローチは、ＲｅｂＡ、ステビオシドまたはステビオール配糖体混合物がＲｅｂＤに酵素的に変換される、in vitroの系である。この系は理論量のＵＤＰ−グルコースを必要とし、したがってショ糖合成酵素を使用したＵＤＰおよびショ糖からのＵＤＰ−グルコースの再生を用いることができる。さらに、ショ糖合成酵素は、反応中に生成されたＵＤＰを取り除き、これは、グリコシル化反応について観察される緩和された生成物阻害により、グリコシル化生成物への変換を向上させる。WO 2011/153378を参照。
酵素の発現および精製
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（例６に記載）およびＥＵＧＴ１１は、ＲｅｂＤを産生するＲｅｂＡのグリコシル化を触媒する重要な酵素である。これらのＵＧＴは細菌（E. coli）中で発現されたが、当業者は、かかるタンパク質はまた、異なる方法および宿主（例えば、Bacillus種などの他の細菌、Pichia種またはSaccharomyces種などの酵母、他の真菌（例えばAspergillus）、またはその他の生物）を使用して調製可能であることを理解する。例えばタンパク質は、in vitroの転写および翻訳により、またはタンパク質合成によって生産することができる。
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂおよびＥＵＧＴ１１遺伝子を、ｐＥＴ３０ａまたはｐＧＥＸ４Ｔ１プラスミド中にクローニングした。得られたベクターを、ＸＪｂ（ＤＥ３）自己溶解E. coli株（ZymoResearch, Orange, CA）に形質転換した。最初にE. coli形質転換体をＮＺＣＹＭ培地中で３０℃で一晩増殖させ、次に３ｍＭのアラビノースおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、さらに３０℃で一晩インキュベーションした。対応する融合タンパク質を、親和性クロマトグラフィにより、６ＨＩＳ−またはＧＳＴ−タグおよび標準的な方法を用いて精製した。当業者は、例えばゲル濾過または他のクロマトグラフィ技術などの他のタンパク質精製法も、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿／結晶化または分別と共に使用され得ることを理解する。ＥＵＧＴ１１は初期条件を用いて良好に発現したが、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂは、タンパク質の溶解度を増加させるために、基本プロトコルにいくつかの変更を必要とし、これには、一晩の発現の温度を３０℃から２０℃へ低下させ、発現培地に２％エタノールを添加することを含む。一般的に、２〜４ｍｇ／Ｌの可溶性ＧＳＴ−ＥＵＧＴ１１および４００〜８００μｇ／ｌのＧＳＴ−ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂが、この方法で精製された。
ＥＵＧＴ１１の安定性
反応を行って、種々のＲｅｂＡからＲｅｂＤへの反応条件下でＥＵＧＴ１１の安定性を探求した。基質を反応混合物から省略し、ＥＵＧＴ１１を様々な時間プレインキュベーションした。酵素の、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中でのプレインキュベーションに続いて、基質（１００μＭのＲｅｂＡ）および他の反応成分（３００μＭのＵＤＰ−グルコース、および１０Ｕ／ｍＬのアルカリホスファターゼ（Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA））を添加した（インキュベーション開始の０、１、４または２４時間後）。次いで反応を２０時間進行させ、その後反応を停止し、ＲｅｂＤ生成物の形成を測定した。実験は、異なる温度で繰り返した：３０℃、３２．７℃、３５．８℃、および３７℃。
酵素を３７℃でプレインキュベーションすると、ＥＵＧＴ１１の活性は急速に低下し、１時間後に約半分の活性に達し、４時間後にはほとんど活性を有しなかった。３０℃では、活性は４時間後には顕著に低下せず、２４時間後に約３分の１の活性が残った。これは、ＥＵＧＴ１１が熱不安定性であることを示唆する。
ＥＵＧＴ１１の熱安定性を評価し、これをステビオールグリコシル化経路における他のＵＧＴと比較するために、タンパク質の変性温度を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて決定した。変性温度ＴＤを推定するＤＳＣサーモグラムの使用は、例えばE. Freire in Methods in Molecular Biology 1995, Vol. 40 191-218に記載されている。ＤＳＣを、６ＨＩＳ精製ＥＵＧＴ１１を用いて実施し、見かけのＴＤとして３９℃を得た；一方、ＧＳＴ精製９１Ｄ２ｅ−ｂを用いた場合、測定されたＴＤは７９℃であった。参考のために、６ＨＩＳ精製のＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、およびＵＧＴ８５Ｃ２を用いて測定したＴＤは、全ケースにおいて８６℃であった。当業者は、酵素固定化または熱保護剤の反応物への添加により、タンパク質の安定性を向上させることができる。熱保護剤の非限定的な例としては、トレハロース、グリセロール、硫酸アンモニウム、ベタイン、トリメチルアミンオキシド、およびタンパク質が挙げられる。
酵素反応速度論
一連の実験を行って、ＥＵＧＴ１１および９１Ｄ２ｅ−ｂの速度論パラメータを決定した。両酵素について、１００μＭのＲｅｂＡ、３００μＭのＵＤＰ−グルコース、および１０Ｕ／ｍＬのアルカリホスファターゼ（Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA）を反応に使用した。ＥＵＧＴ１１については、反応は、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７および、２％の酵素を用いて３７℃で行った。９１Ｄ２ｅ−ｂについては、反応は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．６および２０％（容量）の酵素を用いて３０℃で行った。初期速度（Ｖ０）は、生成物対時間のプロットの線形範囲で算出した。
初めに線形区間を調査するために、初期の時間過程を各酵素について実施した。ＥＵＧＴ１１は、１００μＭのＲｅｂＡおよび３００μＭのＵＤＰ−グルコースの初期濃度で３７℃で４８時試験した。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂは、２００μＭのＲｅｂＡおよび６００μＭのＵＤＰ−グルコースの初期濃度で３７℃で２４時試験した。これらの範囲決定の研究に基づき、ＥＵＧＴ１１については最初の１０分、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂについては最初の２０分が、生成物の形成に関して線形範囲であることを決定し、したがって各反応の初期速度をこれらの区間で算出した。ＥＵＧＴ１１の場合、試験したＲｅｂＡ濃度は、３０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、および５００μＭであった。ＵＤＰ−グルコースの濃度は常にＲｅｂＡ濃度の３倍であり、インキュベーションは３７℃で行った。計算されたＶ０を基質濃度の関数としてプロットすることにより、ミカエリス−メンテン曲線を作成した。Ｖ０の逆数と［Ｓ］の逆数をプロットすることにより、ラインウィーバー−バーク図を得て、ここでｙ＝３３９．８５ｘ＋１．８６４４；Ｒ２＝０．９７５９であった。
ＶｍａｘとＫＭパラメータは、ｘおよびｙ切片から算出した曲線適合ラインウィーバー−バークのデータから求めた：（ｘ＝０、ｙ＝１／Ｖｍａｘ）および（ｙ＝０、ｘ＝−１／ＫＭ）。さらに、同じパラメータは、Excelのソルバー機能を用いて、非線形最小二乗回帰によっても計算した。両方の方法で得られたＥＵＧＴ１１とＲｅｂＡについての結果を、この例のすべての速度論パラメータと共に表１２に示す。非線形最小二乗適合法およびラインウィーバー−バークプロットの両方からの結果を表１２に示す。Ｋｃａｔは、Ｖｍａｘをアッセイにおけるタンパク質のおよその量で割った値に基づいて算出する。
グリコシル化反応におけるＵＤＰ−グルコースの濃度、およびＥＵＧＴ１１のＵＤＰ−グルコースに対する親和性の影響を調べるために、同様の反応速度論解析を実施した。ＥＵＧＴ１１を、増加量のＵＤＰ−グルコース（２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭ）と共にインキュベートし、過剰量のＲｅｂＡ（５００μＭ）を維持した。速度論パラメータは上記のように計算し、表１２に示した。
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂの場合、試験したＲｅｂＡ濃度は、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、および５００μＭであった。ＵＤＰ−グルコースの濃度は常にＲｅｂＡ濃度の３倍であり、インキュベーションは３０℃にて、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂのための上記の反応条件で行った。速度論パラメータは前述のように計算し、得られた動力学的パラメータを表１２に示す。さらに、ＵＤＰ−グルコースに対するＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂの速度論パラメータも決定した。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂを、増加量のＵＤＰ−グルコース（３０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭ）と共にインキュベートし、過剰量のＲｅｂＡ（１５００μＭ）を維持した。インキュベーションは３０℃にて、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂのための最適条件で行った。速度論パラメータは前述のように計算し、結果を表１２に示す。
ＥＵＧＴ１１と９１Ｄ２ｅ−ｂについての速度論パラメータの比較により、９１Ｄ２ｅ−ｂが、より低いＫｃａｔおよびＲｅｂＡに対するより低い親和性（より高いＫＭ）を有し、しかし９１Ｄ２ｅ−ｂのＵＤＰ−グルコースに対するＫＭは、ＥＵＧＴ１１より低いと結論付けられた。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂは、特定の基質についての触媒反応の速度（Ｋｃａｔ）と酵素−基質結合の強度（ＫＭ）についての情報を組み合わせると、触媒効率の測度であるＫｃａｔ／ＫＭについて、より低い値を有する。
反応における制限因子を決定する
ＥＵＧＴ１１のための上記の条件下では、与えられたＲｅｂＡの約２５％がＲｅｂＤに変換された。これらの条件の制限因子は、酵素、ＵＤＰ−グルコースまたはＲｅｂＡのいずれかである。これらの可能性を見分けるための実験を設定した。標準的なアッセイ過程を４時間実施した。次に、余分なＲｅｂＡ基質、余分な酵素、余分なＵＤＰ−グルコース、または余分な酵素とＵＤＰ−グルコースのいずれかを添加した。余分な酵素の添加は、約５０％の変換率の相対的増加をもたらし、余分のＲｅｂＡまたはＵＤＰ−グルコースのみの添加は、変換を顕著に増加させず、しかし酵素とＵＤＰ−グルコースの同時添加は、変換をおよそ２倍に増加させた。
ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換反応における、ボーラス量のＵＤＰ−グルコースと新鮮な酵素の添加のこの利点の限界を調べるために、実験を行った。追加の酵素または酵素とＵＤＰ−グルコースを、１、６、２４および２８時間後に添加した。余分なＥＵＧＴ１１とＵＤＰ−グルコース両方を添加した場合に、７０％以上の変換が達成された。他の成分は、変換に有意な影響を及ぼさなかった。これは、ＥＵＧＴ１１が反応の主要な制限因子であるが、ＵＤＰ−グルコースも制限的であることを示す。ＵＤＰ−グルコースはＲｅｂＡよりも３倍高い濃度で存在するため、これはＵＤＰ−グルコースが、少なくともＥＵＧＴ１１の存在下では、反応混合物中でいくらか不安定であり得ることを示している。あるいは以下に説明するように、ＥＵＧＴ１１はＵＤＰ−グルコースを代謝する可能性がある。
阻害試験
ショ糖、果糖、ＵＤＰ、生成物（ＲｅｂＤ）および純度の低いステビア抽出物原材料の不純物などの要因が、ステビオール配糖体基質のＲｅｂＤへの変換の程度を阻害するかどうかを決定するために、実験を実施した。標準反応混合物において、潜在的な阻害剤（ショ糖、果糖、ＵＤＰ、ＲｅｂＤ、またはステビオール配糖体の商業的ブレンド（ステビア、Steviva Brands, Inc., Portland, OR））の過剰量を添加した。インキュベーション後、ＲｅｂＤ生産を定量した。商業的なステビアミックス５００μｇ／ｍｌ（ＬＣ−ＭＳでの評価により、約６０％の１，２−ステビオシド、３０％のＲｅｂＡ、５％ルブソシド、２％の１，２−ビオシド、１％未満のＲｅｂＤ、ＲｅｂＣ等）の添加は、阻害的とは見出されず、しかし全体的なＲｅｂＤの生産を（添加なしで約３０μＭから約６０μＭへ）、ブレンドによって最初に添加されたＲｅｂＤ（約５μＭ）をはるかに超えて増加させた。試験した分子の中でＵＤＰのみが、ＬＣ−ＭＳにより測定されるように、使用される濃度（５００μＭ）においてＲｅｂＤ生産に対する阻害効果を有することが示された。生産されたＲｅｂＤは、７μＭ未満であった。この阻害はＲｅｂＤ生産のためのin vitroまたはin vivoでの反応において緩和することができ、それは、酵母によるか、またはショ糖と共に添加されたＳＵＳ（ショ糖合成酵素酵素）のいずれかにより、ＵＤＰリサイクル系をＵＤＰ−グルコースに含めることによる。さらに、より少ない量のＵＤＰ−グルコース（３００μＭ）で作業する場合、ＵＤＰ−Ｇを除去するためのアルカリホスファターゼの添加は、in vitroでのグリコシル化により生産されるＲｅｂＤの量を増加させず、生産されたＵＤＰは、これらの濃度では阻害的でない可能性を示唆する。
ＲｅｂＡ対粗ステビオール配糖体ミックス
いくつかの実験において、粗ステビオール配糖体ミックスを、精製ＲｅｂＡの代わりにＲｅｂＡ源として使用した。このような粗ステビオール配糖体ミックスは、ＲｅｂＡとともに高い割合でステビオシドを含むため、ＵＧＴ７６Ｇ１を反応物に含めた。in vitroの反応を上記のように、０．５ｇ／ｌのSteviva(R)ミックスを基質としておよび酵素（ＵＧＴ７６Ｇ１および／またはＥＵＧＴ１１）を用いて実施し、３０℃でインキュベートした。ステビオール配糖体の存在は、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
ＵＧＴ７６Ｇ１のみを反応物に添加した場合、ステビオシドは、非常に効率的にＲｅｂＡに変換された。未知のペンタ−グリコシド（４．０２分に保持時間ピークを有する）も検出された。ＥＵＧＴ１１のみを反応物に添加した場合、大量のＲｅｂＥ、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤおよび未知のステビオールペンタグリコシド（３．１５分に保持時間ピークを有する）が見出された。ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ７６Ｇ１の両方を反応物に添加した場合、ステビオシドのピークが低下し、ほぼ完全にＲｅｂＡおよびＲｅｂＤに変換された。微量の未知のステビオール−ペンタグリコシド（４．０２分にピーク）も存在した。ＲｅｂＥは検出されず、第２の未知のステビオールペンタグリコシド（３．１５分にピーク）も同様であった。この結果は、ＲｅｂＤをin vitroで生成するための基質としてのステビア抽出物の使用は、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ７６Ｇ１を組み合わせて用いる場合に可能であることを示唆する。
非特異的ＵＤＰ−グルコース代謝
ＥＵＧＴ１１が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換からは独立して、ＵＤＰ−グルコースを代謝することができるかどうかを決定するために、ＧＳＴ精製ＥＵＧＴ１１をＲｅｂＡ基質の存在下または不在下でインキュベートし、ＴＲ−ＦＲＥＴTranscreener(R)キット（BellBrook Labs）を用いて、ＵＤＰ−グルコースの使用をＵＤＰの放出として測定した。Transcreener(R)キットは、抗体に結合したトレーサー分子に基づく。トレーサー分子は、ＵＤＰまたはＡＤＰにより高感度かつ定量的に置き換えられる。ＦＰキットには、抗体に結合したAlexa633トレーサーが含まれる。トレーサーはＵＤＰ／ＡＤＰによって置き換えられる。置き換えられたトレーサーは自由に回転し、蛍光偏光の低減をもたらす。したがって、ＵＤＰの生産は偏光の低減に比例する。ＦＩキットには、抗体に結合したクエンチされたAlexa594トレーサーが含まれ、これはIRDye(R) QC-1クエンチャーに結合している。トレーサーはＵＤＰ／ＡＤＰによって置き換えられ、これにより、置き換えられたトレーサーはクエンチされず、蛍光強度の正の増加をもたらす。したがって、ＵＤＰの生産は蛍光の増加に比例する。ＴＲ−ＦＲＥＴキットには、抗体−Ｔｂの複合体に結合されたHiLyte647トレーサーが含まれる。ＵＶ範囲（約３３０ｎｍ）でのテルビウム錯体の励起は、トレーサーへのエネルギー転移および、時間遅延の後により高い波長（６６５ｎｍ）での発光をもたらす。トレーサーはＵＤＰ／ＡＤＰによって置き換えられて、ＴＲ−ＦＲＥＴの減少を引き起こす。
測定されたＵＤＰ−グルコースは、ＲｅｂＡ基質の存在から独立して、同一であることが観察された。ＵＤＰの放出は、酵素の不在下では検出されなかった。これは、ＵＤＰ−グルコースのＥＵＧＴ１１による非特異的分解を示す。それにもかかわらず、ＲｅｂＡが添加されるとＲｅｂＤは生産され続け、ＥＵＧＴ１１が、非特異的ＵＤＰ−グルコース分解よりもＲｅｂＡグリコシル化を優先的に触媒することを示唆する。
ＲｅｂＡまたは他の明らかなグリコシル化基質の不在下における、グルコース分子の移動先を探すために、実験を設定した。以前のすべての反応における１つの共通因子は、トリス緩衝液および／または微量のグルタチオンの存在であり、両方が、潜在的なグリコシル化部位を含む。これらの分子の、非特異的ＵＤＰ−グルコース消費に対する効果を、ＲｅｂＡの存在下または不在下で、ＧＳＴ精製されたＥＵＧＴ１１（グルタチオンと共に）およびＨＩＳ精製酵素（グルタチオンを含まない）を用いて、in vitro反応においてアッセイした。ＵＤＰ−グルコースの使用を、ＴＲ−ＦＲＥＴTranscreener(R)キットを用いて、ＵＤＰ−放出として測定した。ＵＤＰの放出はすべての場合に発生し、ＲｅｂＡの存在とは無関係であった。ＵＤＰの放出は、ＨＩＳ精製酵素を用いた場合に遅かったが、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換における酵素の全体的な触媒活性も低く、アッセイにおいて存在する活性で可溶性酵素の量の低下を示唆している。したがって、ＥＵＧＴ１１によるＵＤＰ−グルコース代謝は、試験した条件下で基質の存在とは無関係であり、反応におけるグルタチオンの存在とは無関係であるように見える。
ＥＵＧＴ１１によるＵＤＰ−グルコースの代謝に対するトリスの効果を試験するために、ＧＳＴ−ＥＵＧＴ１１を、溶出のためにトリスまたはＰＢＳベースの緩衝液を用いて精製し、いずれの場合にも同様の量のタンパク質を得た。トリス−およびＰＢＳ−精製酵素を、上記と同様の方法で、ＲｅｂＡの存在下または不在下で、それぞれ緩衝液としてトリスおよびＨＥＰＥＳを用いるin vitro反応において使用した。両方の条件では、ＵＤＰの放出は、ＲｅｂＡが添加されたかどうかに関わらず反応において同一であり、ＥＵＧＴ１１によるＵＤＰ−グルコースの代謝が、反応におけるＲｅｂＡおよびトリス両方の存在から独立していることを示す。これは、検出されたＵＤＰ放出が、何らかの形でＥＵＧＴ１１の特性に起因する人工産物であるか、あるいは、ＥＵＧＴ１１がＵＤＰ−グルコースを加水分解できることを示唆する。ＥＵＧＴ１１は、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの優先的変換において依然として効率的であり、ＵＤＰ−Ｇの損失は、以下に記載のショ糖合成酵素リサイクル系の付加により補償することができる。
ＲｅｂＡの溶解性
ＲｅｂＡの溶解性は、全細胞アプローチおよび無細胞アプローチ両方のために使用できる濃度を決定する。いくつかの異なるＲｅｂＡの水溶液を作製し、室温で数日間放置した。貯蔵の２４時間後、ＲｅｂＡは、５０ｍＭ以上の濃度で沈殿した。２５ｍＭのＲｅｂＡは４〜５日後に沈殿し始め、一方１０ｍＭ以下の濃度のものは、４℃で保存した場合でさえも溶液のままであった。
ＲｅｂＤの溶解性
ＲｅｂＤの溶解性を、いくつかの異なるＲｅｂＤの水溶液を作製し、３０℃で７２時間インキュベートすることによって評価した。ＲｅｂＤは、最初に１ｍＭ以下の濃度でも水に溶解性であることが見出され、一方０．５ｍＭ以下の濃度は、より長時間安定であることが判明した。当業者は、溶解性が、ｐＨ、温度、または異なるマトリックスなどの任意の数の条件によって影響され得ることを認識する。
ショ糖合成酵素
ショ糖合成酵素（ＳＵＳ）は、他の小分子のグリコシル化のために、ＵＤＰおよびショ糖からＵＤＰ−グルコースを再生するために（図１１）用いられている（Masada Sayaka et al. FEBS Letters 581 (2007) 2562-2566）。A. thaliana、S. rebaudiana、およびコーヒー（Coffea arabica）からの３種類のＳＵＳ１遺伝子を、ｐＧＥＸ４Ｔ１ E. coli発現ベクターにクローニングした（配列については図１７を参照）。ＥＵＧＴ１１について記載されたものと同様の方法を用いて、約０．８ｍｇ／ｌのＧＳＴ−ＡｔＳＵＳ１（A. thalianaのＳＵＳ１）を精製した。ＣａＳＵＳ１（Coffea arabicaのＳＵＳ１）およびＳｒＳＵＳ１（S. rebaudianaのＳＵＳ１）の初期発現と続くＧＳＴ精製は、タンパク質を大量に生産しなかったが、しかしウェスタンブロットにより分析した場合、ＧＳＴ−ＳｒＳＵＳ１の存在が確認された。ＧＳＴ−ＳｒＳＵＳ１を２％エタノールの存在下、２０℃で発現させた場合、約５０μｇ／ｌの酵素が生産された。
精製されたＧＳＴ−ＡｔＳＵＳ１およびＧＳＴ−ＳｒＳＵＳ１のＵＤＰ−グルコース再生活性を評価するため、実験を行った。in vitroアッセイを、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５および１ｍＭのＵＤＰ（最終濃度）で行った。〜２．４μｇの精製ＧＳＴ−ＡｔＳＵＳ１、〜０．１５μｇのＧＳＴ−ＳｒＳＵＳ１、または〜１．５μｇの市販のＢＳＡ（New England Biolabs, Ipswich, MA）も添加した。反応は、〜２００ｍＭのショ糖の存在または不在下で行われ、３７℃で２４時間インキュベートした。生成物ＵＤＰ−グルコースは、分析の節で説明したようにＨＰＬＣにより測定した。ＡｔＳＵＳ１は、ショ糖が存在する場合に〜０．８ｍＭのＵＤＰ−グルコースを生産した。 ＳｒＳＵＳ１または陰性対照（ＢＳＡ）を用いた場合、ＵＤＰ−グルコースは観察されなかった。ＳｒＳＵＳ１について観察された活性の欠如は、精製された酵素の低品質および濃度によって説明可能である。ＡｔＳＵＳ１によるＵＤＰ−グルコースの生産はショ糖依存性であり、したがってＡｔＳＵＳ１は、小分子のグリコシル化（図１１、上記）のために、ＥＵＧＴ１または他のＵＧＴで用いるＵＤＰ−グルコースを再生するための連結された反応に使用できると結論された。
ＳＵＳは、図１１に示すように、ショ糖およびＵＤＰからのＵＤＰ−グルコースと果糖の形成を触媒する。このＵＤＰ−グルコースは次に、ＲｅｂＡをグリコシル化してＲｅｂＤを生産するために、ＥＵＧＴ１１によって使用することができる。上記のようなin vitroアッセイを行い、〜２００ｍＭのショ糖、１ｍＭのＵＤＰ、１００μＭのＲｅｂＡ、〜１．６μｇの精製されたＧＳＴ−ＡｔＳＵＳ１および〜０．８μｇのＧＳＴ−ＥＵＧＴ１１を添加した。生成物であるＲｅｂＤの形成は、ＬＣ−ＭＳによって評価した。ＡｔＳＵＳ、ＥＵＧＴ１１、ショ糖およびＵＤＰをＲｅｂＡと混合した場合、８１±５μＭのＲｅｂＤが形成された。反応はＡｔＳＵＳ、ＥＵＧＴ１１、およびショ糖の存在に依存していた。変換速度は、前に外因的に提供されたＵＤＰ−グルコースを用いて観察されたものと同様であった。このことは、ＡｔＳＵＳが、ＥＵＧＴ１１によるＲｅｂＤ形成のためのＵＤＰ−グルコースの再生に使用できることを示す。
例９：ＲｅｂＤの全細胞生体触媒の生産
この例では、ＲｅｂＡまたは他のステビオール配糖体からのＲｅｂＤの生産において全細胞生物触媒系を使用するための因子である、いくつかのパラメータを検討した。細胞膜を横断する原材料の能力およびＵＤＰ−グルコースの利用可能性は、２つのかかる因子である。透過化剤および異なる細胞型を検討して、どの系がＲｅｂＤ生産のための最も有益であるかを確認した。
透過化剤
いくつかの異なる透過化剤が、通常は細胞膜を横断することができない様々な化合物の細胞内酵素変換を可能にすることが、以前から示されている（Chow and Palecek, Biotechnol Prog. 2004 Mar-Apr;20(2):449-56）。いくつかの場合において、アプローチは細胞の部分的な溶解に似ており、酵母においては多くの場合、洗浄剤による細胞膜の除去と、小さな分子に対して透過性である残りの細胞壁内部への酵素の封入に依存する。これらの方法に共通するのは、透過化剤への曝露と、次いで基質添加前の遠心分離ステップによる細胞のペレット化である。例えば、酵母の透過性に関しては、Flores et al., Enzyme Microb. Technol., 16, pp. 340-346 (1994)；Presecki & Vasic-Racki, Biotechnology Letters, 27, pp. 1835-1839 (2005)；Yu et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 34, 151-156 (2007)；Chow and Palecek, Cells. Biotechol. Prog., 20, pp. 449-456 (2004)；Fernandez et al., Journal of Bacteriology, 152, pp. 1255-1264 (1982)；Kondo et al., Enzyme and microbial technology, 27, pp. 806-811 (2000)；Abraham and Bhat, J Ind Microbiol Biotechnol, 35, pp. 799-804 (2008)；Liu et al.,: Journal of bioscience and bioengineering, 89, pp. 554-558 (2000)；およびGietz and Schiestl, Nature Protocols, 2, pp. 31-34 (2007)を参照。細菌の透過化処理に関しては、Naglak and Wang, Biotechnology and Bioengineering, 39, pp. 732-740 (1991)；Alakomi et al., Applied and environmental Microbiology, 66, pp. 2001-2005 (2000)；およびFowler and Zabin, Journal of bacteriology, 92, pp. 353-357 (1966)を参照。この例に記載したように、細胞が生存可能なままであれば、de novoのＵＤＰ−グルコース生合成を保持可能であることが決定された。
E. coliおよび酵母中における透過化の条件を確立するために、実験を行った。増殖する細胞（S. cerevisiaeまたはE. coli）を、透過化剤の異なる濃度／組合せで処理した：S. cerevisiaeの透過化にはトルエン、クロロホルム、およびエタノール、E. coliの透過化にはグアニジン、乳酸、ＤＭＳＯおよび／またはリトンＸ−１００。ＲｅｂＡおよび高濃度の他の潜在的基質に対する両モデル生物の耐性も評価した。透過性は、ＲｅｂＡ含有培地でのインキュベーション後のＥＵＧＴ１１発現生物から生産されるＲｅｂＤの量により測定した（供給実験）。酵素活性のモニタリングは、透過化剤への暴露の前後に、細胞を溶解してin vitroアッセイで放出されたＵＧＴの活性を分析することにより行った。
酵母では、試験した透過化処理条件のいずれも、検出されたバックグラウンド（すなわち、供給に用いたＲｅｂＡストックに存在する不純物ＲｅｂＤレベル）を上回るＲｅｂＤの増加をもたらさなかった。これは、試験した条件下で、酵母細胞がＲｅｂＡに対して不透過性のままであるか、および／または、溶媒に起因する細胞生存度の低下が、ＥＵＧＴ１１活性の低下ももたらすことを示す。
E. coliでは、試験した条件のいずれも、細胞の透過化および、続くバックグラウンドレベルを上回るＲｅｂＤの生産をもたらさなかった。検出可能レベルのＲｅｂＤは、ＥＵＧＴ１１を発現する株からの溶解物をin vitro反応で用いた場合に測定され（データは示さず）、これは、すべての透過化処理の後にもＥＵＧＴ１１酵素が存在して活性であることを示す（ただし活性レベルは変化する）。透過化処理は細胞の生存度にほとんどまたは全く影響しなかったが、ただし、０．２Ｍのグアニジンおよび０．５％のトリトンＸ−１００で処理した培養物は例外であり、この場合は生存度が大幅に低下した。
S. cerevisiaeはまた、トリトンＸ−１００、Ｎ−ラウリルサルコシン（ＬＳ）、または酢酸リチウム＋ポリエチレングリコール（ＬｉＡｃ＋ＰＥＧ）を用いて、細胞のさらなる増殖を許容しない透過化アッセイに供した。すなわち、これらの条件下で、細胞は透過化により、内側に酵素およびｇＤＮＡを保つためのバリアとしての細胞壁を保持しつつ細胞膜を完全に除去することによって、成長不能にされる。このような方法においては、ＵＤＰ−グルコースは、上記のように補足されまたは再循環することができる。純粋なin vitroのアプローチに対する透過化処理の利点は、個々の酵素を個別に生産して単離する必要がないことである。
Ｎ−ラウリルサルコシン処理はＥＵＧＴ１１の不活性化をもたらし、ＬｉＡｃ／ＰＥＧが適用された場合に、ＲｅｂＤのわずかな増加のみが検出された（データは示さず）。トリトンＸ−１００の０．３％または０．５％での処理はしかし、ＥＵＧＴ１１の活性を維持しつつ、ＲｅｂＤの量をバックグラウンドレベルよりも増加させた（図１８を参照）。トリトンＸ−１００アッセイについては、一晩培養物をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。６単位のＯＤ６００に対応する細胞を、それぞれ０．３％または０．５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。処理した細胞を３０℃で３０分間ボルテックスおよびインキュベートした。処理後、細胞をＰＢＳ緩衝液中で洗浄した。ＧＳＴ−ＥＵＧＴ１１について記載したように、５単位のＯＤ６００に対応する細胞をin vitroアッセイにおいて使用し、０．６単位のＯＤ６００を、ＬＳ処理試料について記載したように、反応緩衝液中に再懸濁し、３０℃で一晩インキュベートした。未処理試料を対照として用いた。
ＥＵＧＴ１１を発現する形質転換体からの溶解物は、細胞が未処理またはＬｉＡＣ／ＰＥＧもしくはトリトンＸ１００での処理後の場合に、いくらかのＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することができた（反応物中８〜５０μＭが測定された）。しかし、ＬＳで処理された細胞ペレットの溶解物中では、ＲｅｂＤは測定されなかった。透過化処理したが非溶解の細胞は、０．３％または０．５％のトリトンＸ−１００で処理した場合に、いくらかのＲｅｂＤを生産することができ（１．４〜１．５μＭが測定された）（図１８）、ＬＳまたはＬｉＡＣ／ＰＥＧで処理した試料では、ＲｅｂＤは見出されなかった。これらの結果は、全細胞を用い、トリトンＸ−１００を透過化剤として用いた場合に、ＲｅｂＤがＲｅｂＡから、生体触媒により生産できることを示す。
例１０：コドン最適化ＵＧＴ配列のアセスメント
ＵＧＴの９１ｄ２ｅ、７４Ｇ１、７６Ｇ１、および８５Ｃ２のための最適なコード配列を、GeneArt（Regensburg, Germany）（それぞれお配列番号６、２、８および４）またはＤＮＡ２．０（(Menlo Park, CA）（それぞれお配列番号８４、８３、８５および８２）によって供給される２つの方法論を用いて、酵母発現のために設計および合成した。ＵＧＴの９１ｄ２ｅ、７４Ｇ１、７６Ｇ１、および８５Ｃ２のアミノ酸配列（それぞれ配列番号５、１、７および３）は変化しなかった。
野生型、ＤＮＡ２．０、およびをGeneArtの配列をin vitro活性についてアッセイし、ステビオール配糖体経路の基質における反応性を比較した。ＵＧＴを高コピー（２μ）ベクターに挿入し、強力な構成的プロモーター（ＧＰＤ１）（ベクターＰ４２３−ＧＰＤ、Ｐ４２４−ＧＰＤ、Ｐ４２５−ＧＰＤ、およびＰ４２６−ＧＰＤ）から発現させた。プラスミドは、汎用Watchmaker株ＥＦＳＣ３０１（WO2011/153378の例３に記載）に個別に形質転換し、アッセイは、等量の細胞（８ＯＤ単位）から調製した細胞溶解物を用いて行った。酵素反応のために、６μＬの各細胞溶解物を３０μＬの反応物中、０．２５ｍＭのステビオール（最終濃度）と共にインキュベートしてＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２クローンを試験し、０．２５ｍＭの１３−ＳＭＧ（１３ＳＭＧ）（最終濃度）と共にインキュベートして７６Ｇ１ＵＧＴおよび９１Ｄ２ｅＵＧＴを試験した。アッセイは３０℃で２４時間行った。ＬＣ−ＭＳ分析の前に、１容量の１００％ＤＭＳＯを各反応物に添加し、試料を１６０００ｇで遠心分離し、上清を分析した。
GeneArt最適化遺伝子を発現する溶解物は、試験した条件下で高レベルのＵＧＴ活性を提供した。野生型酵母に対する割合として表した場合、GeneArt溶解物は、ＵＧＴ７４Ｇ１について野生型と同等の活性を、ＵＧＴ７６Ｇ１について１７０％の活性を、ＵＧＴ８５Ｃ２について３４０％の活性を、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅについて１３０％の活性を示した。S. cerevisiaeで発現された場合、ＵＧＴ８５Ｃ２を用いると、ＲｅｂＡおよびＲｅｂＤ生産のための細胞の全体的なフラックスおよび生産性を向上させることができる。
コドン最適化ＵＧＴ８５Ｃ２が１９−ＳＭＧの蓄積を減らし、ルブソシドおよび高度にグリコシル化されたステビオール配糖体の生産を増加できるかどうかを判断するために、さらなる実験を実施した。１９−ＳＭＧおよびルブソシドの生産を、野生型ＵＧＴ７４Ｇ１およびコドン最適化ＵＧＴ８５Ｃ２を強力な構成的プロモーター（ＧＰＤ１）（それぞれ、ベクターＰ４２６−ＧＰＤおよびＰ４２３−ＧＰＤ）の下で高コピー（２μ）ベクターから発現するS. cerevisiae株ＢＹ４７４１の、ステビオール供給実験において分析した。総グリコシドレベルについて、全培養試料（細胞除去なし）を取り、等量のＤＭＳＯに入れて沸騰させた。報告の細胞内濃度は、細胞をペレット化し、採取元の培養試料の体積に対して５０％のＤＭＳＯに再懸濁させ、続いて沸騰させることによって得た。「総」グリコシドレベルおよび、正規化された細胞内レベルを、その後、ＬＣ−ＭＳを用いて測定した。野生型ＵＧＴ７４Ｇ１と野生型ＵＧＴ８５Ｃ２を用いて、合計で約１３．５μＭのルブソシドが生産され、最大の正規化細胞内濃度は約７μＭであった。対照的に、野生型ＵＧＴ７４Ｇ１とコドン最適化ＵＧＴ８５Ｃ２を使用した場合、最大で２６μＭのルブソシドが生産され、または野生型ＵＧＴ８５Ｃ２を用いて生産されたものの約２倍が生産された。さらに、ルブソシドの最大正規化細胞内濃度は１３μＭであり、再び、野生型ＵＧＴ８５Ｃ２を使用して生産されたものの約２倍であった。１９−ＳＭＧの細胞内濃度は、野生型ＵＧＴ８５Ｃ２を使用した場合の最大３５μＭから、コドン最適化ＵＧＴ８５Ｃ２を使用した場合の１９μＭに大幅に低下した。その結果、約１０μＭ低い合計の１９−ＳＭＧが、コドン最適化ＵＧＴ８５Ｃ２について測定された。これは、より多くの１９−ＳＭＧがルブソシドに変換されることを示し、野生型ＵＧＴ８５Ｃ２がボトルネックであることを確認する。
多様性スクリーニングの間に、ＵＧＴ８５Ｃ２の別のホモログが、Stevia rebaudianaのｃＤＮＡクローニングの際に発見された。このホモログは、保存されたアミノ酸多型の以下の組み合わせを有する（野生型S. rebaudianaＵＧＴ８５Ｃのアミノ酸番号については、コード配列はアクセッション番号AY345978.1に記載）：Ａ６５Ｓ、Ｅ７１Ｑ、Ｔ２７０Ｍ、Ｑ２８９Ｈ、およびＡ３８９Ｖ。このクローンはＵＧＴ８５Ｃ２のＤ３７と呼ばれ、ＰＣＲ産物のin vitro転写／翻訳を通して発現された（TNT(R)T7 Quick for PCR DNA kit、Promega）。発現産物を、ステビオール（０．５ｍＭ）を糖受容体として用い、アッセイを２４時間インキュベートしたことを除いてWO/2011/153378の記載と同様にして、グリコシル化活性についてアッセイした。野生型ＵＧＴ８５Ｃ２対照アッセイと比較して、Ｄ３７酵素は、約３０％高いグリコシル化活性を有するようである。
例１１：新規なS. rebaudianaＫＡＨの同定
部分配列（GenBankアクセッション番号BG521726）は、ステビアＫＡＨといくらかの相同性を有するStevia rebaudianaのＥＳＴデータベースにおいて同定された。部分配列を、生のStevia rebaudianaのパイロシーケンシング読み取りに対し、CLC Main Workbenchソフトウェアを使用してblast検索した。部分配列の末端に部分的に重なった読み取りが同定され、部分配列の長さを増加するために用いられた。配列が開始および終止コドン双方を包含するまで、これを数回行った。完全な配列を、生のパイロシーケンシング読み取りに対して完全な配列をblast検索することにより、導入され得るヌクレオチド置換およびフレームシフト突然変異について分析した。得られた配列を、ＳｒＫＡＨｅ１と指定した。図１２を参照。
ＳｒＫＡＨｅ１によってコードされるＫＡＨの活性を、S. cerevisiaeのバックグラウンド株CEN.PK 111-61Aにおいてin vivoで評価した；この株は、酵母二次代謝産物イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からステビオール−１９−Ｏ−モノシドへの生合成経路全体を構成する酵素（ただし、ｅｎｔ−カウレン酸をステビオールに変換するステビオール合成酵素を除く）をコードする遺伝子を発現するものである。
簡単に説明すると、S. cerevisiae株CEN.PK 111-61Aを修飾して、ＴＰＩ１およびＧＰＤ１酵母プロモーター駆動の転写と共に、染色体に組み込まれた遺伝子のコピーから以下を発現するようにした：Aspergillus nidulansのＧＧＰＰＳ、１５０ｎｔ切断型Zea maysＣＤＰＳ（新しい開始コドンと共に；以下を参照）、S. rebaudianaのＫＡ、S. rebaudianaのＫＯおよび、Stevia rebaudianaのＵＧＴ７４Ｇ１。これらの全ての遺伝子を発現するCEN.PK 111-61A酵母株を、ＥＦＳＣ２３８６と指定した。このように、ＥＦＳＣ２３８６株には次の組込み遺伝子が含まれている：Aspergillus nidulansゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）；Zea mays ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）；Stevia rebaudianaｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）；Stevia rebaudianaｅｎｔ−カウレン酸化酵素（ＫＯ）；およびStevia rebaudiana ＵＧＴ７４Ｇ１を、ＩＰＰおよびＦＰＰからステビオール−１９−Ｏ−モノシドへの経路と組み合わせて、ただしステビオール合成酵素（ＫＡＨ）は含まない。
異なるステビオール合成酵素の発現（エピソーム発現プラスミドからの）を、ＥＦＳＣ２３８６株において種々のＣＰＲ（エピソーム発現プラスミドから）の発現と組み合わせて試験し、ステビオール−１９−Ｏ−モノシドの生産を、培養物試料抽出物のＬＣ−ＭＳ分析により検出した。ＣＰＲをコードする核酸を、ｐ４２６ ＧＰＤ塩基性プラスミドのマルチクローニング部位に挿入し、一方、ステビオール合成酵素をコードする核酸は、Ｐ４１５ ＴＥＦ塩基性プラスミドのマルチクローニング部位に挿入した（Mumberg et al., Gene 156 (1995), 119-122によるｐ４ＸＸ塩基性プラスミドシリーズ）。ステビオール−１９−Ｏ−モノシドの生産は、機能的なステビオール合成酵素が存在する場合に生じる。
ＥＦＳＣ２３８６株においてエピソーム発現プラスミドから発現されたＫＡＨは、以下である：「ｉｎｄＫＡＨ」（Kumar et al.,アクセッション番号DQ398871；Reeja et al.,アクセッション番号EU722415）；「ＫＡＨ１」（Brandle et al., 米国特許公開第2008/0064063 A1号からのS. rebaudianaステビオール合成酵素）；「ＫＡＨ３」（Yamaguchi et al., 米国特許公開第2008/0271205 A1号からのA. thalianaステビオール合成酵素）；「ＳｒＫＡＨｅ１」（上記のように、S. rebaudianaｃＤＮＡからクローニングされたS. rebaudianaステビオール合成酵素）；および「ＤＮＡ２．０．ＳｒＫＡＨｅ１」（S. rebaudianaステビオール合成酵素をコードするコドン最適化配列（ＤＮＡ２．０）、図１２Ｂ参照）。
ＥＦＳＣ２３８６株においてエピソーム発現プラスミドから発現されたＣＰＲは、以下である：「ＣＰＲ１」（S. rebaudiana ＮＡＤＰＨ依存性Ｐ４５０還元酵素（Kumar et al.,アクセッション番号DQ269454）；「ＡＴＲ１」（A. thalianaＣＰＲ、アクセッション番号CAA23011、図１３も参照）；「ＡＴＲ２」(A. thalianaＣＰＲ、アクセッション番号CAA46815、図１３も参照)；「ＣＰＲ７」(S. rebaudianaＣＰＲ、図１３も参照、ＣＰＲ７は「ＣＰＲ１」に類似)；「ＣＰＲ８」（S. rebaudianaＣＰＲ、Artemisia annuaＣＰＲと類似、図１３参照）および「ＣＰＲ４」(S. cerevisiae ＮＣＰ１（アクセッション番号YHR042W、図１３も参照）。
表１３は、ＥＦＳＣ２３８６株における、ステビオール合成酵素とＣＰＲの様々な組み合わせによるステビオール−１９−Ｏ−モノシド（μＭ）のレベルを示す。
S. cerevisiaeで発現された場合、ＫＡＨ３および、ＳｒＫＡＨｅ１によりコードされたステビオール合成酵素のみが、活性を有していた。ステビオール合成酵素をコードするＤＮＡ２．０コドン最適化ＳｒＫＡＨｅ１配列は、それぞれが最適なＣＰＲと共発現させた場合に、コドン最適化ＫＡＨ３と比べて約一桁高いステビオール−１９−Ｏ−モノシドの蓄積レベルをもたらした。この例で提示される実験において、ＫＡＨ１とＡＴＲ２ ＣＰＲの組み合わせは、ステビオール−１９−Ｏ−モノシドの生産をもたらさなかった。
例１２−ＣＰＲとＫＯの対合
この例で言及されるCEN.PK S. CerevisiaeのＥＦＳＣ２３８６株およびＣＰＲは、例１１に記載されている（「S. rebaudianaＫＡＨの同定」）。ＥＦＳＣ２３８６には、次の組込み遺伝子が含まれている：Aspergillus nidulansゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）；Zea maysｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（ＣＤＰＳ）；Stevia rebaudianaｅｎｔ−カウレン合成酵素（ＫＳ）；およびStevia rebaudianaｅｎｔ−カウレン酸化酵素（ＫＯ）。この株は、ＬＣ−ＭＳ分析で検出されるｅｎｔ−カウレン酸を生産する。
シトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）のコレクションをＥＦＳＣ２３８６株において発現させ、試験した；「ＣＰＲ１」（S. rebaudianaＮＡＤＰＨ依存シトクロムＰ４５０還元酵素、Kumarら、アクセッション番号DQ269454）；「ＡＴＲ１」（A. thalianaＣＰＲ、アクセッション番号CAA23011）、「ＡＴＲ２」（A. thalianaＣＰＲ、アクセッション番号CAA46815）、「ＣＰＲ７」（S. rebaudianaＣＰＲ、ＣＰＲ７は「ＣＰＲ１」に類似）、「ＣＰＲ８」（S. rebaudianaＣＰＲ、Artemisia annuaのＣＰＲに類似；および「ＣＰＲ４」（S. cerevisiae ＮＣＰ１、アクセッション番号YHR042W）。
S. cerevisiaeの内因性ネイティブＣＰＲ（表１４でＣＰＲ４と呼ぶ）の過剰発現、および特にA. thaliana ＣＰＲの１つすなわちＡＴＲ２の過剰発現は、Stevia rebaudianaカウレン酸化酵素の良好な活性化を提供し（後者は表１４においてＫＯ１と呼ばれる）、ｅｎｔ−カウレン酸の蓄積の増加をもたらす。ＬＣ−ＭＳクロマトグラムのｅｎｔ−カウレン酸ピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す表１４を参照のこと。ＫＯ１は、ＣＰＲの追加の過剰発現のないｅｎｔ−カウレン酸生成酵母対照株である。
例１３−ステビオール経路におけるＫＳ−５とＫＳ−１の評価
酵母株ＥＦＳＣ１９７２は、以下をコードする組込み遺伝子コピーにより発現される、ＩＰＰ／ＦＰＰからルブソシドへの生合成経路を有するCEN.PK 111-61AのS. cerevisiae株である：Aspergillus nidulans ＧＧＰＰＳ（内部名はＧＧＰＰＳ−１０）、Stevia rebaudianaのＫＳ（ＫＳ１、配列番号１３３）、Arabidopsis thalianaのＫＡＨ（ＫＡＨ−３、配列番号１４４）、Stevia rebaudianaのＫＯ（ＫＯ１、配列番号１３８）、Stevia rebaudianaのＣＰＲ（ＣＰＲ−１、配列番号１４７）、完全長Zea maysのＣＤＰＳ（ＣＤＰＳ−５、配列番号１５８）、Stevia rebaudianaのＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）およびStevia rebaudianaのＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３）。さらにＥＦＳＣ１９７２は、内因性プロモーターの銅誘導性プロモーターＣＵＰ１との置き換えによる、ＥＲＧ９遺伝子発現の下方制御を有する。
ＥＦＳＣ１９７２が、ＴＥＦ１プロモーターからStevia rebaudianaのＳｒＫＡＨｅ１を発現するＣＥＮ／ＡＲＳベースのプラスミドで形質転換され、および、Synechococcus種のＧＧＰＰＳ（ＧＧＰＰＳ−７）およびＧＰＤプロモーターからのZea mays ＣＤＰＳ（切断型ＣＤＰＳ−５）の切断バージョンを発現する２μベースのプラスミドで同時形質転換された場合、その結果は、ルブソシド（および１９−ＳＭＧ）の増殖を障害されたS. cerevisiae生産者が得られる。この株は、以下のテキスト中で「強化ＥＦＳＣ１９７２」と呼ばれる。遅い増殖率が、毒性の経路中間体ｅｎｔ−コパリル二リン酸の蓄積によって引き起こされているかどうかを判断するために、カウレン合成酵素（ＫＳ）遺伝子のコレクションを「強化ＥＦＳＣ１９７２」株において発現させ、その後の増殖とステビオール配糖体の生産を評価した。
A. thalianaＫＳ（ＫＳ５）の発現は、「強化ＥＦＳＣ１９７２」株の改善された増殖とステビオール配糖体生産をもたらした。図１６を参照。増殖に対する同様のプラスの効果は、強化ＥＦＳＣ１９７２におけるStevia rebaudianaのカウレン合成酵素（ＫＳ−１）のさらなる過剰発現によっては達成できない。
例１４−酵母株ＥＦＳＣ１８５９
Saccharomyces cerevisiae株のＥＦＳＣ１８５９は、ゲノムに組み込まれて強力な構成的ＧＰＤ１およびＴＰＩプロモーターから発現される、ＧＧＰＰＳ−１０、ＣＤＰＳ−５、ＫＳ−１、ＫＯ−１、ＫＡＨ−３、ＣＰＲ−１およびＵＧＴ７４Ｇ１のコード配列を含んでいる。表１５参照。さらに、酵母ＥＲＧ９遺伝子の内因性プロモーターは、ＥＲＧ９スクアレン合成酵素の下方制御のために銅誘導性プロモーターＣＵＰ１と置き換えられた。標準的な酵母増殖培地において、かかる培地中の銅濃度が低いため、ＥＲＧ９遺伝子は非常に低いレベルで転写される。この株におけるエルゴステロール生産の減少は、イソプレノイド生合成に利用可能なイソプレン単位の量の増加をもたらす。また、ＥＦＳＣ１８５９株は、ＧＰＤ１プロモーターを用いて、２ミクロンのマルチコピーベクターからＵＧＴ８５Ｃ２を発現する。ＥＦＳＣ１８５９は、ルブソシドおよびステビオール１９−Ｏ−グリコシドを生産する。
Zea maysＣＤＰＳのＤＮＡは、葉緑体シグナルペプチドの存在または不在のもとで、ＧＰＤプロモーターを用いて、２ミクロンのマルチコピープラスミドから発現された。Zea maysＣＤＰＳのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図１４に示す。葉緑体シグナルペプチドはヌクレオチド１〜１５０によってコードされ、アミノ酸配列の残基１〜５０に相当する。
ＥＦＳＣ１８５９＋トウモロコシの全長ＣＤＰＳプラスミド、およびＥＦＳＣ＋トウモロコシの切断型ＣＤＰＳプラスミドを、４％グルコースを有する酵母選択培地中で増殖させた。ルブソシドおよび１９−ＳＭＧ生産はＬＣ−ＭＳにより測定して、生産レベルを推定した。プラスチドリーダー配列の除去は、野生型配列と比較して、ステビオール配糖体の生産を増加させたようには見えず、ＣＤＰＳ輸送ペプチドは、ステビオール配糖体生合成の消失を引き起こすことなく、除去可能であることが実証される。
例１５−酵母株ＥＦＳＣ１９２３
Saccharomyces cerevisiae株CEN.PK 111-61Aを、様々な生物からのステビオール配糖体経路酵素の導入によってステビオール配糖体を生産するように修飾した。修飾された株は、ＥＦＳＣ１９２３と指定した。
ＥＦＳＣ１９２３株は以下を含む：Aspergillus nidulansのＧＧＰＰ合成酵素遺伝子発現カセットをS. cerevisiaeのＰＲＰ５−ＹＢＲ２３８Ｃ遺伝子間領域に、Zea maysの全長ＣＤＰＳとStevia rebaudianaのＣＰＲ遺伝子発現カセットをＭＰＴ５−ＹＧＬ１７６Ｃ遺伝子間領域に、Stevia rebaudianaのカウレン合成酵素とＣＤＰＳ−１遺伝子発現カセットをＥＣＭ３−ＹＯＲ０９３Ｃ遺伝子間領域に、Arabidopsis thalianaのＫＡＨとStevia rebaudianaのＫＯ遺伝子発現カセットをＫＩＮ１−ＩＮＯ２遺伝子間領域に、Stevia rebaudianaのＵＧＴ７４Ｇ１遺伝子発現カセットをＭＧＡ１−ＹＧＲ２５０Ｃ遺伝子間領域に、Stevia rebaudianaのＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子発現カセットを、ＴＲＰ１遺伝子のＯＲＦを置き換えることにより組み込む。表１５を参照。また、酵母ＥＲＧ９遺伝子の内因性プロモーターは、銅誘導性プロモーターＣＵＰ１で置き換えた。
ＥＦＳＣ１９２３株は、４％のグルコースを有する酵母選択培地上で、約５μＭのステビオール配糖体、ステビオール１９−Ｏ−モノシドを生産した。
例１６−酵母株ＥＦＳＣ１９２３における切断型トウモロコシＣＤＰＳの発現
表１５に示す、Zea maysのＣＤＰ合成酵素コード配列の５’末端の１５０のヌクレオチド（配列番号１５７、図１４参照）を削除し、コード配列の残りの部分に新たな翻訳開始ＡＴＧを設け、切断配列を、Saccharomyces cerevisiaeのＥＦＳＣ１９２３のマルチコピープラスミドｐ４２３ＧＰＤ中のＧＰＤ１プロモーターに動作可能に連結した。プラスミドｐ４２３ＧＰＤは、Mumberg, D et al, Gene, 156 : 119-122 (1995)に記載されている。ＥＦＳＣ１９２３とＥＦＳＣ１９２３に、ｐ４２３ＧＰＤ−Ｚ．ｍ．ｔＣＤＰＳを加えたものを、４％のグルコースを含む酵母選択培地で９６時間増殖させた。これらの条件下で、ＥＦＳＣ１９２３＋ｐ４２３ＧＰＤ−Ｚ．ｍ．ｔＣＤＰＳ（切断型Zea maysＣＤＰＳ）によって生産されたステビオール１９−Ｏ−モノシドの量は、プラスミドなしのＥＦＳＣ１９２３によって生産されたものの約２．５倍以上であった。
表１５からのArabidopsis thalianaＫＡＨコード配列を、ＧＰＤ１プロモーターの制御下で、ｐ４２６ＧＰＤと指定されたマルチコピープラスミドに挿入した。プラスミドｐ４２６ＧＰＤはMumberg, D et al, Gene, 156 : 119-122 (1995)に記載されている。ＥＦＳＣ１９２３＋ｐ４２６ＧＰＤ−Ａ．ｔ．ＫＡＨおよびプラスミドなしのＥＦＳＣ１９２３により生産されたステビオール１９−Ｏ−モノシドの量の間には、有意差は観察されなかった。
ＥＦＳＣ１９２３を、ｐ４２３ＧＰＤ−Ｚ．ｍ．ｔＣＤＰＳおよびｐ４２６ ｐ４２６ＧＰＤ−Ａ．ｔ．ＫＡＨの両方で形質転換した。驚くべきことに、これらの条件下で両方のプラスミド（すなわち、切断型Zea maysＣＤＰＳおよびArabidopsisＫＡＨ）を保有するＥＦＳＣ１９２３により生産されるステビオール１９−Ｏ−モノシドの量は、ＥＦＳＣ１９２３のみによって生産される量より６倍以上多かった。
Gibberella fujikuroiからの二機能性ＣＤＰＳ−ＫＳ（ＮＣＢＩアクセッション番号Q9UVY5.1、図１５）をクローニングして、切断型ＣＤＰＳ−５と比較した。二機能性GibberellaＣＤＰＳ−ＫＳを、ＧＰＤプロモーターと共に２μプラスミドにクローニングし、ＧＰＤプロモーターからの２μベースのプラスミドからのArabidopsis thalianaＫＡＨ−３を発現するプラスミドを用いて、ＥＦＳＣ１９２３中に形質転換した。振盪フラスコ実験において、この二機能性ＣＤＰＳ−ＫＳは、ＫＡＨ−３のみを有するＥＦＳＣ１９２３株よりも、ステビオール１９−Ｏ−モノシドの生産において約５．８倍も高活性であった。しかし試験した条件下において、ＫＡＨ−３と切断型ＣＤＰＳの組み合わせよりは最適ではないことが見出された。したがって、さらなる株を、ＫＳ−５と切断型ＣＤＰＳを用いて構築した。
例１７−中間体の毒性
S. cerevisiaeの活力に対する、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸（ＣＤＰ）またはｅｎｔ−カウレンの生産の効果を、実験室のS. cerevisiae株CEN.PKのバックグラウンドにおいて、次の発現によって調べた：Synechococcus種ＧＧＰＰのみ（ＧＧＰＰ生産）、ＧＧＰＰと共に５０アミノ酸のＮ末端切断型Zea maysＣＤＰＳ（例１６を参照）（ＣＤＰ生産）、または、ＧＧＰＰ、切断型ＣＤＰＳ、およびArabidopsis thalianaカウレン合成酵素（ＫＳ５）を共に（ｅｎｔ−カウレン生産）。遺伝子は、ＧＰＤプロモーターが切断型ＣＤＰＳおよびＫＳ５の転写を駆動して、２μプラスミドから発現され、一方ＧＧＰＰＳの転写はＡＤＨ１プロモーターによって駆動される。これらのプラスミドの様々な組み合わせ（ＧＧＰＰのみ；ＧＧＰＰ＋切断型ＣＤＰＳ；またはＧＧＰＰ＋切断型ＣＤＰＳ＋ＫＳ５）または遺伝子挿入なしのプラスミドにより形質転換された、S. cerevisiae CEN.PKの増殖が観察された。ＧＧＰＰの生産、特にＣＤＰの生産は、最終製品として生産された場合、S. cerevisiaeに対して毒性であった。興味深いことに、ｅｎｔ−カウレンは、この実験における生産量では、酵母に対して毒性ではないようであった。
例１８−内因性ホスファターゼ活性の破壊
酵母遺伝子ＤＰＰ１とＬＰＰ１は、それぞれＦＰＰとＧＧＰＰをファルネソールとゲラニルゲラニオールに分解するホスファターゼをコードする。遺伝子をコードするＤＰＰ１を、ＥＦＳＣ１９２３株において取り除き（例１５に記載）、ステビオール配糖体の生産に影響したかどうかを判断した。このｄｐｐ１変異株を、葉緑体移行配列を欠いたZea maysＣＤＰＳを発現するプラスミドでさらに形質転換すると（例１６）、大小両方の形質転換体が出現した。「大コロニー」タイプの株は、「小コロニー」タイプの株およびＤＰＰ１無削除株と比べて、試験条件の下で〜４０％多い１９−ＳＭＧを生産した。これらの結果は、ＤＰＰ１の削除がステビオール配糖体生産に対して正の効果を有することができ、したがって酵母でのプレニルピロリン酸の分解は、ステビオール配糖体の生産に負の影響を与える可能性があることを示している。
例１９−破壊されたＳＵＣ２遺伝子による、グルコースからバニリングルコシドを生産する遺伝的に安定な酵母レポーター株の構築
グルコースからバニリングルコシドを生成する酵母株を、基本的にBrochado et al.（(2010) Microbial Cell Factories 9:84-98）（株ＶＧ４）に記載のようにして作製したが、ただし、酵母ゲノム中のＥＣＭ３間座の領域に、酵母ＴＰＩ１プロモーターによって制御されるE. coli ＥｎｔＤ ＰＰＴａｓｅを有する発現カセットをさらに組込み（Hansen et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75(9):2765-2774に記載されているように）、コード配列をＭＥＴ１５発現カセットで置換することによりＳＵＣ２を破壊し、および、コード配列をＴｎ５ｂｌｅ発現カセットで置換することによりＬＥＵ２を破壊してフレオマイシンに対する耐性を付与した。生じた酵母株をＶ２８と呼ぶ。この株はまた、図１９に示すアミノ酸配列を有する組換えA. thaliana ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７２Ｅ２、GenBankアクセッション番号Q9LVR1）をコードする（配列番号１７８）。
例２０−既にバニリングルコシドを生合成している酵母におけるショ糖トランスポーターおよびショ糖合成酵素の発現
Arabidopsis thaliana由来のショ糖トランスポーターＳＵＣ１は、プルーフリーディングＰＣＲポリメラーゼを用いて、A. thalianaから調製したｃＤＮＡからＰＣＲ増幅により単離した。得られたＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩでの制限消化によって転移し、強力なＴＥＦプロモーターから遺伝子を発現させることが可能な低コピー数の酵母発現ベクターＰ４１６−ＴＥＦ （ＣＥＮ−ＡＲＳベースのベクター）の対応する位置に挿入した。得られたプラスミドをｐＶＡＮ１９２と名付けた。コードされたショ糖トランスポーターの配列を図１９Ｂに示す（GenBankアクセッション番号AEE35247、配列番号１７９）。
Coffea arabicaからのショ糖合成酵素ＳＵＳ１（アクセッション番号CAJ32596）を、プルーフリーディングＰＣＲポリメラーゼを使用して、C. arabicaから調製したｃＤＮＡからＰＣＲ増幅により単離した。ＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩでの制限消化によって転移し、強力なＧＰＤプロモーターから遺伝子を発現させることが可能な高コピー数の酵母発現ベクターｐ４２５−ＧＰＤ（２μｍベースのベクター）の対応する位置に挿入した。得られたプラスミドをｐＭＵＳ５５と名付けた。コードされたショ糖合成酵素の配列を図１９Ｃに示す（GenBankアクセッション番号CAJ32596；配列番号１８０）。
ｐＶＡＮ１９２とｐＭＵＳ５５を、遺伝的形質転換により、酢酸リチウム形質転換プロトコルを用いて酵母株Ｖ２８に導入し、酵母株Ｖ２８：：ｐＶＡＮ１９２：：ｐＭＵＳ５５を作製した。対照株は、Ｖ２８を空のプラスミドＰ１４６−ＴＥＦとＰ４２５−ＧＰＤで形質転換することにより作製した。
これら２種の酵母株を、５００ｍｌの三角振とうフラスコ内の２００ｍｌの培養物中で、芳香族アミノ酸なしのＳＣ（完全合成）増殖培地に２％グルコースおよび２％ショ糖を補充しｐＨを５．０に調整したものを用いて増殖させた。培養物を、中程度の回転数（１５０ｒｐｍ）で３０℃で７２時間インキュベートした。試料を７２時間で取り出し、バニリングルコシドの含有量を決定した。下記の表から分かるように、対照株（空のプラスミドＰ１４６−ＴＥＦおよびＰ４２５−ＧＰＤを含む）におけるＶＧ生産は３３０ｍｇ／ＬのＶＧであったが、ショ糖合成酵素およびショ糖トランスポーターを発現する酵母株Ｖ２８：：ｐＶＡＮ１９２：：ｐＭＵＳ５５は、４４５ｍｇ／ＬのＶＧを生産し、これはＶＧ生産における３４．８％の増加に相当した。
これは、ショ糖合成酵素とショ糖トランスポーターおよびグリコシルトランスフェラーゼの同時発現が、小分子アグリコンをグリコシル化する能力を増加させ、グリコシル化されたアグリコンの濃度が顕著に増加したことを示している。この場合には、バニリングルコシル化の顕著な改善により、最終生成物バニリン−Ｏ−β−グルコシドの力価の顕著な増加がもたらされた。
例２１−ステビオール配糖体生産株の改良
Saccharomyces cerevisiaeＥＦＳＣ２７６３の菌株構築
酵母株ＥＦＳＣ２７６３は、３つの栄養要求性の修飾、すなわちＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３の欠失を含む、野生型Saccharomyces cerevisiae株に由来している。株の遺伝学は安定化されており、規則的な二倍体または倍体酵母株として使用することができる。ＥＦＳＣ２７６３は、４つのＤＮＡコンストラクトのゲノム組込みによって、ステビオール配糖体生産酵母に変換された。各コンストラクトは、酵母ゲノム中に相同組換えによって導入された複数の遺伝子を含んでいる。さらに、コンストラクト１および２は、相同組換えにより組み合わされる（assembled）。
最初のコンストラクトは８つの遺伝子を含み、ＤＰＰ１遺伝子座に挿入され、ＤＰＰ１を破壊しかつ部分的に削除する（例１８参照）。挿入されたＤＮＡは以下を含む：ＮａｔＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するA. gossypiiＴＥＦプロモーターと続いてA. gossypiiからのＴＥＦターミネーター；ネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターから発現される、Gene Artコドン最適化S. rebaudiana ＵＧＴ８５Ｃ２（例１０参照）と、続いてネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター；ＴＰＩ１プロモーターを用いて発現されるS. rebaudianaＣＰＲ−８（図１３参照）と、続いてネイティブ酵母ＴＤＨ１ターミネーター；ＰＤＣ１プロモーターから発現されるA. thalianaカウレン合成酵素（ＫＳ−５、例１３参照、配列番号１５６）と、続いてネイティブ酵母ＦＢＡ１ターミネーター；ＴＥＦ２プロモーターを用いて発現されるSynechococcus種ＧＧＰＰＳ（ＧＧＰＰＳ−７）と、続いてネイティブ酵母ＰＦＩ１ターミネーター；ＴＥＦ１プロモーターから発現されるＤＮＡ２．０コドン最適化S. rebaudiana ＫＡＨｅ１（例１１参照、配列番号１６５）と、続いてＥＮＯ２ターミネーター；ＦＢＡ１プロモーターを用いて発現されるS. rebaudianaＫＯ−１と、続いてネイティブ酵母ＴＤＨ２ターミネーター；およびＰＧＫ１プロモーターを用いて発現されるZea mays切断型ＣＤＰＳ（例１４参照）と、続いてネイティブ酵母ＡＤＨ２ターミネーター。
第２のコンストラクトがＹＰＲＣΔ１５座に挿入され、これは以下を含む：ＫａｎＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するA. gossypiiからのネイティブ酵母ＴＥＦプロモーターと、続いてA. gossypiiからのＴＥＦターミネーター；ＰＧＫ１プロモーターから発現されるGene Artコドン最適化A. thalianaＡＴＲ２（図１３Ｂ参照）と、続いて酵母ＡＤＨ２ターミネーター；ＴＰＩ１プロモーターから発現されるS. rebaudiana ＵＧＴ７４Ｇ１と、続いて酵母ＴＤＨ１ターミネーター；ＴＥＦ１プロモーターから発現されるGene Artコドン最適化S. rebaudianaＵＧＴ７６Ｇ１と、続いて酵母ＥＮＯ２ターミネーター；およびＧＰＤ１プロモーターから発現されるGene Artコドン最適化S. rebaudianaＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（例６参照）と、続いて酵母ＣＹＣ１ターミネーター。
第１および第２のコンストラクトは、交配および切開によって同じ胞子クローン中で合わせた。この酵母株はその後、第３および第４のコンストラクトを用いて２つの連続イベントで形質転換した。
第３のコンストラクトは、遺伝子ＰＲＰ５とＹＢＲ２３８Ｃの間に組み込まれており、以下を含む：K. lactisＬＥＵ２遺伝子を発現するA. gossypiiからのＴＥＦプロモーターと、続いてA. gossypiiからのＴＥＦターミネーター；ＤＮＡ２．０最適化S. rebaudianaＫＡＨｅ１を発現するＧＰＤ１プロモーターと、続いてＣＹＣ１ターミネーター；およびZea mays切断型ＣＤＰＳを発現するＴＰＩ１プロモーター。第４のコンストラクトは、遺伝子ＥＣＭ３とＹＯＲ０９３Ｃの間に発現カセットと共に組み込まれており、発現カセットは以下を含む：K. pneumoniaeｈｐｈ遺伝子を発現するA. gossypiiからのＴＥＦプロモーターと、続いてA. gossypiiからのＴＥＦターミネーター；ＧＰＤ１プロモーターから発現されるSynechococcus種のＧＧＰＰＳと、続いてＣＹＣ１ターミネーター；およびA. thalianaカウレン合成酵素を発現するＴＰＩ１プロモーター。利用した４つの遺伝子マーカーは、その後削除された。
細胞および培養液からの総ステビオール配糖体をＤＭＳＯ抽出後にＬＣ−ＭＳで分析した結果、ＥＦＳＣ２７７２は、３ｍｌのＳＣ（完全合成）培地中３０℃で、ディープウェルプレート内３２０ＲＰＭで振盪しつつ４日間増殖させた後に、４０〜５０μＭまたは２〜３μＭ／ＯＤ６００のレバウジオシドＡを生産する。
Saccharomyces cerevisiaeＥＦＳＣ２７７２の菌株構築
ＥＦＳＣ２７７２は、遺伝子マーカーが除去されなかったことを除いて２７６３株とよく似ており、この株は、形質転換により２つのプラスミドｐ４１３ＴＥＦ（ＨＩＳ３マーカーを有するパブリックドメインＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミド）およびｐ４１６−ＴＥＦ（ＵＲＡ３マーカーを有するパブリックドメインＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミド）を導入することによって原栄養体性にされており、ＥＦＳＣ２７７２と呼ぶ。
細胞および培養液からの総ステビオール配糖体のＤＭＳＯ抽出後にＬＣ−ＭＳで分析した結果、ＥＦＳＣ２７７２は、ディープウェルプレートでの増殖後に、２７６３と同様のレベルのレバウジオシドＡを生産する。高い光学濃度と高い力価が、２Ｌ（作業容量）の発酵槽内での好気性フェッドバッチ増殖を介して得られ、この増殖には、基本培地中（完全合成培地）での約１６時間の増殖期と、続く〜１００時間の、炭素およびエネルギー源として利用されるグルコースを、微量金属、ビタミン、塩、および酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸の補足と組み合わせて供給することが含まれる。ｐＨは５付近に維持し、温度設定は３０℃であった。ＬＣ−ＭＳによって証明されるように、合わせた細胞および細胞外生成物の濃度は、２つの異なる実験において、９２０〜１６６０ｍｇ／ＬのＲｅｂＡと、約３００〜３２０ｍｇ／ＬのＲｅｂＤの間であり、より高い力価の結果が得られた場合の培養液中には、約７００ｍｇ／ＬのＲｅｂＡが検出された。さらに、ＲｅｂＢの大きなピークが見られ、当業者は、ＵＧＴ７４Ｇ１の追加のコピーまたはＵＧＴ７４Ｇ１の上方制御が、ＲｅｂＢのＲｅｂＡへの変換をさらに増加させることを認識する。
ＥＦＳＣ２７４３株を上記と同様の方法で作製したが、ただし、原栄養体性を付与する二つのプラスミドは用いず、ＴＥＦプロモーターからＥＵＧＴ１１を発現するｐ４１６（ＣＥＮ／ＡＲＳ）ベースのプラスミドを追加した。この株は、上記のようにフェッドバッチ発酵で増殖させた。この株は、９２０ｍｇ／ＬのＲｅｂＤの総量を生産し、さらに約９：１のＲｅｂＤ対ＲｅｂＡの比率が見られた。約３６０ｍｇ／ＬのＲｅｂＤが、培養液中に見出された。
例２２−ＵＤＰ−グルコース容量
例２１において、酵母が、１ｍＭを超えるステビオール、例えばＲｅｂＤ、ＲｅｂＢおよびＲｅｂＡなどを、完全にグリコシル化できることが示された。同様に、Saccharomyces株は、６０ｍＭもの他の小分子生成物をグリコシル化することができる（データは示さず）。しかしながら、酵母のネイティブのＵＤＰ−グルコース再生系のグリコシル化の限界は未知であるか、または、細胞壁合成に必要なＵＤＰ−グルコースのプールを補充する速度は未知である。したがって、ＵＤＰ−グルコース生産の増加が、酵母におけるグリコシル化の速度を増加させるかどうかを調べるために、実験を設計した。ｓｕｃ２欠失変異体を、ショ糖トランスポーターをコードするA. thalianaｓｕｃ１遺伝子、ＵＧＴ７４Ｇ１およびA. thalianaＳＵＳを有するプラスミドで形質転換した。ＵＧＴ７４Ｇ１は急速に、ステビオールをステビオール１９−Ｏ−モノグルコシド（１９−ＳＭＧ）にグリコシル化することができる。形質転換体は、ロイシン、ヒスチジンおよびウラシルを欠いた４ｍｌのＳＣ培地を含む１３ｍｌの培養管中で一晩事前に増殖させた。翌日、２ＯＤ６００単位に相当する細胞を遠沈し、２％ショ糖および／または１００μＭのステビオールを含む新鮮な培地２ｍｌに再懸濁した。培養物を、培養管中で３０℃で３日間振とうした。１時間、３時間、６時間、２１時間および４６時間後、アリコートを採取した。１００μｌの培養物のアリコートを遠沈し、等量のＤＭＳＯを添加した。試料をボルテックスし、８０℃で１５分間加熱し、遠心分離し、１９−ＭＧ含量をＬＣ−ＭＳにより分析した。試験した時点で、野生型株とＳＵＳ１増強株の間に、ステビオールのグリコシル化の速度の差は観察されなかった。これは、ＵＧＴ７４Ｇ１によるステビオールのグリコシル化が、酵母により再生されるＵＤＰ−グルコースよりも遅い速度で進行し、余分なＵＤＰ−グルコースが、in vivoでの小分子のグリコシル化の高い力価を達成するために必要とされないことを示唆している。それにもかかわらず、ＳＵＳの、in vitroでＵＤＰ−グルコースをリサイクルするための使用は、例８に示されており、したがってin vivo系におけるその使用は、ＵＤＰ−グルコースが制限的となる場合に、ステビオール配糖体の生産速度を増加させることが予想される。
例２３−グルコースからのin vivoでのＲｅｂＣおよびＲｅｂＦの生産
ステビオールからのＲｅｂＣの生産
これまでの実験（公開番号WO/2011/153378）により、組換え発現されたArabidopsis thalianaＲＨＭ２（ラムノース合成酵素、遺伝子座タグAT1G53500）が、ＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−ラムノースに変換できることが示された。このＵＤＰ−ラムノースは、in vitroでＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびステビオール−１３−Ｏ−モノグルコシドと共にインキュベートした場合に、ステビオール−１３−Ｏ−グルコピラノシル−１，２−ラムノシドを生産するために使用することができる。
さらに実験が行われて、in vivoで酵母において全４種のＵＧＴおよびＲＨＭ２を発現させ、続いてステビオールを供給することにより、ステビオールからのＲｅｂＣの生産が確認された。ＥＦＳＣ３０１株（MAT alpha, lys2ADE8 his3ura3leu2trp1）を、野生型の遺伝子配列を発現する以下のプラスミドで形質転換した：野生型ＵＧＴ７４Ｇ１を発現するｐ４２４ＧＰＤ（アクセッション番号AY345982）；野生型８５Ｃ２を発現するｐ４２３ＧＰＤ（アクセッション番号AY345978.1）；および野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（アクセッション番号AY345974）およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅをＧＰＤプラスミドのもとで発現するｐ４２６ＧＰＤ由来プラスミド。ＲＨＭ２または空のｐ４２５ＧＰＤ対照プラスミドのいずれかを発現するプラスミドｐ４２５ＧＰＤは、ＵＧＴで同時形質転換した。形質転換体は、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンおよびウラシルを欠くＳＣ培地２〜３ｍｌを含む１３ｍＬの培養管中で一晩事前に増殖させた。翌日、増殖が０．４のＯＤ６００単位に達した後、細胞を遠沈し、２５μＭのステビオールを含む新鮮な培地に再懸濁し、培養管中３０℃で３日間振盪した。１００μＬの培養物のアリコートを遠沈した。２００μＬの５０％ＤＭＳＯをペレットに添加しながら、等容量のＤＭＳＯをこの試料の上清に加えた。試料をボルテックスし、８０℃で１５分間加熱し、遠心分離し、ステビオール配糖体含量をＬＣ−ＭＳにより分析した。ＲｅｂＣは、ＲＨＭ２遺伝子をＵＧＴと共発現させた場合にのみ、増殖培地と細胞抽出物中に検出された。定量化により、ほぼ等量のＲｅｂＡとＲｅｂＣが生産されたことが示された。これは、ＲＨＭ２が、in vivoでかなりの量のＵＤＰ−ラムノースを生産することができ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅがin vivoで効率的にラムノシル化できることを示している。他の２つの化合物はＬＣ−ＭＳにより、それぞれ５．６４および５．３３の保持時間、ならびに１グルコース−および１ラムノース（ステビオール−１，２ラムノビオシド）および２グルコース−および１ラムノース（ズルコシドＡ）に対応するｍ／ｚ比であることが観察された。これは、ステビオール配糖体経路の残りのＵＧＴがラムノシル化中間体を受容できること、すなわち、ラムノシル化ステップが最後に行われる必要がないことを示唆している。
さらに、一連のin vitro実験を行って、レバウジオシドＣ経路に何らかのデッドエンド反応が発生するかどうかを判定した。図２Ｂを参照。例えば、ルブソシドに対するＵＧＴ９１Ｄ２ｅのラムノシル化活性および、その後のＵＧＴ７６Ｇ１による生成物のＲｅｂＣへの変換が、in vitro反応を用いて実証された。この実験では、組換え的にE. coliで発現され精製されたＵＧＴ９１Ｄ２ｅとＲＨＭ２を、ルブソシド、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋およびＵＤＰ−グルコースと共に一晩インキュベートした。続いて反応混合物を沸騰させて酵素を変性させた。反応物のアリコートを、ＵＧＴ７６Ｇ１とＵＤＰ−グルコースの酵素調製物に添加した。ルブソシドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとＲＨＭ２の存在下で、ｍ／ｚが２−グルコースおよび１−ラムノースのステビオールに対応する化合物に変換された。次いでこの化合物を、ＵＧＴ７６Ｇ１の存在下でＲｅｂＣに変換し、これは、中間体がズルコシドＡであることを示す。この実験はしたがって、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅが、ルブソシドをラムノシル化でき、ＵＧＴ７６Ｇ１がこの生成物をＲｅｂＣに変換できることを実証する。
同様に、in vitroでの反応により、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅによる１３−ＳＭＧのラムノシル化（１グルコースと１ラムノースのステビオール化合物を形成する）およびＵＧＴ７６Ｇ１による２グルコースと１ラムノースの化合物のその後の形成が示された。この化合物は、固有の保持時間（４．５６分）を有し、ステビオール１３−Ｏ−１，３−ジグリコシド−１，２−ラムノシドであると考えられている。この化合物はまた、ステビオールを、４種のＵＧＴおよびＲＨＭ２を発現する酵母に供給した場合にも観察された。
現在のデータから、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは１３−ＳＭＧとルブソシドをラムノシル化できることが示されている。また、ＵＧＴ７４Ｇ１とＵＧＴ７６Ｇ１は、１３−ＳＭＧからＵＧＴ９１Ｄ２ｅによって生成されたラムノシル化化合物を代謝できることが示されている。これらの化合物を、残りのＵＧＴ（前のステップにどのＵＧＴを使用したかに応じて、ＵＧＴ７４Ｇ１またはＵＧＴ７６Ｇ１）と共にインキュベートすると、ＲｅｂＣが形成される。これは、ＵＧＴ７４Ｇ１とＵＧＴ７６Ｇ１がラムノシル化基質をグリコシル化することができるために、グリコシル化の順序は、ほとんど重要ではないことを示す。
グルコースからのＲｅｂＣの生産
ＲＨＭ２およびＵＧＴの７６Ｇ１と９１Ｄ２ｅを発現するプラスミドを、安定したルブソシドの生産者であるＥＦＳＣ１９２３株に形質転換した（例１５を参照）。この酵母は、ＵＧＴの８５Ｃ２（アクセッション番号AY345978.1）および７４Ｇ１（アクセッション番号AY345982）をゲノムに組み込まれ、また栄養要求性の修飾を有する、Saccharomyces cerevisiaeのCEN.PK 111-61A誘導体である。ＥＦＳＣ１９２３株（例１５を参照）において、ＥＲＧ９によってコードされているスクアレン合成酵素の発現は、内因性プロモーターをＣＵＰ１銅誘導性プロモーターで置き換えることによって下方制御された。ＥＦＳＣ１９２３株は、さらに以下も含む：Aspergillus nidulansＧＧＰＰ合成酵素（ＧＧＰＰＳ−１０）発現カセットをS. cerevisiaeＰＲＰ５−ＹＢＲ２３８Ｃ遺伝子間領域に；Zea mays全長ＣＤＰＳ（ＣＤＰＳ−５）およびStevia rebaudianaＣＰＲ（ＣＰＲ−１）遺伝子発現カセットを、ＭＰＴ５−ＹＧＬ１７６Ｃ遺伝子間領域に；Stevia rebaudianaカウレン合成酵素およびＣＤＰＳ（ＫＳ−１／ＣＤＰＳ−１）遺伝子発現カセットを、ＥＣＭ３−ＹＯＲ０９３Ｃ遺伝子間領域に； Arabidopsis thalianaＫＡＨ（ＫＡＨ−３）およびStevia rebaudianaＫＯ（ＫＯ−１）遺伝子発現カセットを、ＫＩＮ１−ＩＮＯ２遺伝子間領域に；Stevia rebaudianaＵＧＴ７４Ｇ１遺伝子発現カセットを、ＭＧＡ１−ＹＧＲ２５０Ｃ遺伝子間領域に；および、ＴＲＰ１遺伝子ＯＲＦ２０を置き換えることにより組み込まれたStevia rebaudianaＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子発現カセット。挿入されたステビオール経路遺伝子は、公開されたPCT WO/2011/153378の表１１に記載されている。
ＥＦＳＣ１９２３株は、ＧＰＤプロモーターの制御下で、ＧＰＤプロモーターを用いて野生型ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２配列を発現するｐ４２３ＧＰＤ由来のプラスミド、および野生型ＵＧＴ７４Ｇ１（アクセッション番号AY345974）およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５を参照）を発現するｐ４２６ＧＰＤ由来のプラスミドで形質転換した。Arabidopsis thalianaＲＨＭ２（酵素遺伝子座タグAT1G53500）または空のｐ４２５ＧＰＤ対照プラスミドを発現するプラスミドｐ４２５ＧＰＤを、共形質転換した。形質転換体は、ロイシン、ヒスチジン、およびウラシルを欠くＳＣ培地２〜３ｍｌを含む１３ｍＬの培養管中で、一晩事前に増殖させた。翌日、増殖が０．４単位のＯＤ６００に達した後、これを遠沈し、新鮮な培地に再懸濁し、培養管中３０℃で３日間振盪した。１００μＬの培養物を遠沈した；２００μＬの５０％ＤＭＳＯをペレットに添加しながら、等容量のＤＭＳＯをこれの上清に加えた。試料をボルテックスし、８０℃で１５分間加熱し、遠沈し、ステビオール配糖体含量をＬＣ−ＭＳにより分析した。
培地およびこの株の正規化された細胞内含有量の分析は、ＲｅｂＣの生産を示した。ＬＣ−ＭＳにより、約８μＭのＲｅｂＣと４μＭのＲｅｂＡの生産が決定された。さらに、ステビオール供給後の中間体の生産は、この実験では検出されなかった。ＲｅｂＣの蓄積は、厳密にＲＨＭ２の発現に依存していた。この例は、グルコースからのＲｅｂＣのde novo生合成を実証する。
ステビオールおよびグルコースからの追加のステビオール配糖体の生成
上記と同じＧＰＤベースのプラスミドを用いて、ＵＧＴ７４Ｇ１とＵＧＴ８５Ｃ２を含有する安定ステビオール生産株のＥＦＳＣ１９２３を、ＲｅｂＢ（ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ／ＥＵＧＴ１１）、ＲｅｂＥ（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ／ＥＵＧＴ１１）、およびズルコシドＡ（ＲＨＭ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ／ＥＵＧＴ１１）を生産するために必要なＵＧＴと共に形質転換した。より高いジグリコシル化活性を有することが判明した野生型ＥＵＧＴ１１（NCBI NP_001051007）を、この実験のためにｐ４２４ＧＰＤにクローニングした。形質転換体を、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンおよびウラシルを欠くＳＣ培地２〜３ｍｌを含む１３ｍＬの培養管中で一晩事前に増殖させた。翌日、増殖が０．４のＯＤ６００単位に達した後、細胞を遠沈し、２５μＭのステビオールを含有する新鮮な培地に再懸濁し（グルコース実験を除く）、培養管中３０℃で３日間振盪した。１００μＬの培養物のアリコートを遠沈した。２００μＬの５０％ＤＭＳＯをペレットに添加しながら、等容量のＤＭＳＯをこの試料の上清に加えた。試料をボルテックスし、８０℃で１５分間加熱し、遠心分離し、ステビオール配糖体含量をＬＣ−ＭＳにより分析した。ＬＣ−ＭＳ分析により、S. cerevisiaeにおける、グルコースまたはステビオールからのＲｅｂＢ、ＲｅｂＥ、およびズルコシドＡのin vivoでの生産が確認された。例えば図２Ａおよび２Ｂ参照。高濃度のステビオール配糖体が、ステビオール供給後に観察された（クロマトグラムによる判定）。
ＥＵＧＴ１１を用いたＲｅｂＦ経路中間体の特徴付け
ＵＧＴ９１Ｄ２ｅとＥＵＧＴ１１のキシロシル化特性を、in vitroで比較した。糖供与体としてＵＤＰ−キシロースを使用することにより、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは以前に、ステビオール−１３−Ｏ−モノグルコシドをキシロシル化し、ＲｅｂＦ生合成における重要な中間体を形成することが示された（公開番号WO/2011/153378）。ＥＵＧＴ１１とＵＧＴ９１Ｄ２ｅを用いた同様のin vitro実験により、これらのＵＧＴはルブソシドをキシロシル化可能であることが示されている。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅを用いる場合、ＬＣ−ＭＳ分析は、２つのグルコース分子および１つのキシロースのステビオールに対応するｍ／ｚ比を有する新たなピークを示す。図２６を参照。保持時間のシフトにより、このピークは、１３−Ｏ−グルコース上でキシロシル化されたルブソシドに対応すると考えられている。ＥＵＧＴ１１を用いる場合、ＬＣ−ＭＳ分析は、保持時間３．９９および４．３９分において、２つのグルコースと１つのキシロースのステビオールに対応するｍ／ｚ比を有する、同様の大きさの２つの新しいピークを示す。これらの生成物は、１３−Ｏ−グルコースまたは１９−Ｏ−グルコースの２つの位置のどちらかの上でキシロシル化されたルブソシドに対応する可能性が高い。
グルコースからのＲｅｂＦの生産
ＲｅｂＦのin vivo生産には、ArabidopsisからのＵＧＤ１（ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ）およびＵＳＸ３（ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼ）のクローニングが、ＵＤＰ−キシロースの生産のために必要である。ＵＧＤ１とＵＸＳ３を、２つの発現カセットを含むＰ４２５−ＧＰＤ由来の高コピー（２μ）ベクターに挿入し、強力な構成的プロモーター（それぞれＴＰＩ１とＧＰＤ１）から発現させた。プラスミドは、ＲｅｂＡ生産株のＥＦＳＣ２７６３（例２１に記載）に形質転換し、選択培地（ＳＣ−ｌｅｕ）で３日間培養した。ＬＣ−ＭＳの結果は明らかに、保持時間４．１３分において３つのグルコースおよび１つのキシロースのステビオールに対応するｍ／ｚ比を有する新たなピークの出現を示し、これはＲｅｂＦとして同定され（商業的なＲｅｂＦ規格に基づく）、および２つのグルコースおよび１つのキシロースのステビオールに対応するｍ／ｚ比を有する、別の新たなピーク（上記）の出現も示し、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅが、in vivoでキシロシル化を行うことが可能であることを示した。これらのピークは、陰性対照においては見られなかった。
例２４−異種インサートを用いたスクアレン合成酵素（ＥＲＧ９）下方制御の影響
Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母では、メバロン酸経路は、スクアレンへの生合成経路における多くのイソプレノイドリン酸中間体を生成する（図２０参照）。酵母におけるスクアレン合成酵素は、ＥＲＧ９である。以下のGenBankアクセッション番号を参照：Saccharomyces cerevisiaeのスクアレン合成酵素についてはP29704.2；Schizosaccharomyces pombeのスクアレン合成酵素についてはP36596；Yarrowia lipolyticaのスクアレン合成酵素についてはQ9Y753；Candida glabrataのスクアレン合成酵素についてはQ9HGZ6；Ashbya gossypiiのスクアレン合成酵素についてはQ752X9；Cyberlindnera jadiniiのスクアレン合成酵素についてはO74165；Candida albicansのスクアレン合成酵素についてはP78589；Saccharomyces cerevisiaeのラノステロール合成酵素についてはP38604；ホモサピエンスのスクアレン合成酵素についてはP37268；Mus musculusのスクアレン合成酵素についてはP53798；およびRattus norvegicusのスクアレン合成酵素についてはQ02769。図２５を参照（配列番号１９２〜２０２）。
ＥＲＧ９遺伝子の５’ＵＴＲ中のステムループ構造の導入
野生型ＥＲＧ９プロモーター領域を、相同組換えによりＣＹＣ１プロモーター配列および５’ＵＴＲ配列に置き換えた。５’ＵＴＲ領域は、ステムループ構造を形成することができる配列を含んでいる。配列番号１８１〜１８３を参照。配列番号１８４を使用することもできる。
配列番号１８１（異種インサート１）：TGAATTCGTTAACGAATTC
配列番号１８２（異種インサート２）：TGAATTCGTTAACGAACTC
配列番号１８３（異種インサート３）：TGAATTCGTTAACGAAGTC
配列番号１８４（異種インサート４）：TGAATTCGTTAACGAAATT
特定のメカニズムに束縛されることなく、ステムループは、ＡＵＧに対する５’−３’指向リボソームスキャンを部分的にブロックし、転写物の翻訳を減らすことができる。異なる度合の塩基対を有するステムループを試験して、酵母株の増殖に影響を与えることなしにＦＰＰのレベルを高めるのに十分な程度まで、ＥＲＧ９転写物の翻訳を低減するステムループを見出した。
ＥＲＧ９プロモーター上流配列を含むＤＮＡ断片（相同組換えのため）、ヌーセオスリシンに対する耐性を付与する遺伝子（ＮＡＴＲ）の発現カセット、ＣＹＣ１プロモーター（配列番号１８５、図２１）、ステムループ構造を有する５’ＵＴＲ配列、およびＥＲＧ９のＯＲＦ配列（相同組換えのため）を、ＰＣＲにより生成した。ＣＹＣ１プロモーターまたはＫＥＸ２プロモーター（配列番号１８６）のいずれかを含むがステムループを含まないＤＮＡ断片も、対照として生成した。組換えのための隣接ＥＲＧ９配列およびステムループ構造を、ＰＣＲオリゴを介して導入した。相同組換えのためのコンストラクトの概要を図２２に示す。ＤＮＡ断片を、S.cerevisiaeの宿主株に形質転換し、これを次にヌーセオスリシン含有の増殖プレート上で選択した。ネイティブＥＲＧ９プロモーターのＣＹＣ１プロモーターへの成功した交換とステムループ含有５’ＵＴＲ配列とを有するクローンを同定した。ステムループ領域の概要と配列を図２３に示す。５％と同定された配列は、配列番号１８１を有する異種インサートに対応し、２０％と同定された配列は、配列番号１８２を有する異種インサートに対応し、および５０％と同定された配列は、配列番号１８３を有する異種インサートに対応する。
ＦＰＰ蓄積の評価（増大効果）
アモルファ−４，１１−ジエン合成酵素（ＡＤＳ）遺伝子は、植物Artemisia annuaにおいて、１つのＦＰＰ分子をアモルファ−４，１１−ジエンに変化させる化学反応を触媒する。遺伝子はS.cerevisiaeにおいて機能的および効率的であり、ＥＲＧ９遺伝子の異種の５’ＵＴＲに導入されたステムループ構造を有する菌株におけるＦＰＰの蓄積を、間接的に評価するために使用することができる。ＡＤＳをコードするS.cerevisiaeコドン最適化核酸（GenBankアクセッション番号AAF61439）を、ＰＧＫ１プロモーターの制御下で、マルチコピープラスミド（２μ）にクローニングし、野生型に形質転換し、S.cerevisiae株を操作した。Ro et al. 2006. Nature 440(7086):940-943；Paradise et al. Biotechnol Bioeng. 2008 Jun 1;100(2):371-8；Newman et al. Biotechnol Bioeng 95(4):684-691)に記載されているようにして、アモルファ−４，１１−ジエンの生産を測定し、標準化合物であるカリオフィレンと比較した。
化学物質
ドデカンおよびカリオフィレンは、Sigma-Aldrich（St.Louis, MO）から購入した。完全合成（ＳＣ）培地の配合のための完全サプリメント混合物は、Formedium（英国）から購入した。他のすべての化学物質はSigma-Aldrichから購入した。
酵母培養
操作された酵母株は、ウラシルを除いた２％グルコースのＳＣで増殖させた。培養物を３０℃で一晩増殖させ、次いで２５ｍｌのＳＣ培地を含む２５０ｍＬの振盪フラスコ中で主培養物に植菌するために用いて、６００ｎｍで０．１の光学密度まで増殖させた。主培養物を、３０℃で７２時間増殖させた。非常に低濃度のアモルファジエンは水性培養物から揮発性であるため、２．５ｍｌのドデカンを各培養フラスコに添加して、生産されたアモルファジエンを捕捉して保持した。１０μｌのドデカン層をサンプルし、ＧＣ−ＭＳによる定量のために酢酸エチル中で１００倍に希釈した。
アモルファジエンのＧＣ−ＭＳ分析
ＧＣ−ＭＳを用いて、酵母培養物からのアモルファジエンの生産を測定した。試料は以下のような方法を用いて分析した：使用したＧＣオーブン温度プログラムは、８０℃で２分、次に１６０℃まで３０℃／分で、次に１７０℃まで３℃／分で、最後に３００℃まで３０℃／分で上昇、および２分間の最終の保持であった。インジェクタとＭＳ四重極検出器の温度は、それぞれ２５０℃および１５０℃であった。１μｌをスプリットレスモードで注入した。ＭＳは、フルスキャンモードで操作した。総イオンを用いたカリオフィレン標準曲線を用いて、（−）−ｔｒａｎ−カリオフィレン当量におけるアモルファジエン濃度を算出した。
異なるプロモーターコンストラクトを含む異なる株の分析は、配列番号１８１のクレオチド配列を有する異種インサートを用いた場合に、インサートなしまたは配列番号１８２および１８３のクレオチド配列を有するインサートを用いた場合と比較して、アモルファジエンの生産の増加（２．５ｘ）を示した。図２４参照。配列番号１８１に記載の異種インサートは、最も安定な二次構造を有する。比較のために、非修飾ＥＲＧ９を有する野生型酵母も分析し（図２４：ＣＴＲＬ−ＡＤＳ）、この株は、さらに低いアモルファジエンの生産を示した。逆に、常に弱いプロモーターＳｃＫｅｘ２を含むコンストラクトは、より高いアモルファジエンの生産を示した（６ｘ）。
例２５−スクアレン合成酵素（ＥＲＧ９）下方制御およびＧＧＰＰＳ過剰発現のＧＧＰＰ生産に対する影響の解析
ＧＧＰＰ蓄積の評価
S.cerevisiaeは、ＧＧＰＰＳ（ＢＴＳ１）を含む。ＢＴＳ１に加えて、S.cerevisiaeにおいて機能的かつ効率的ないくつかの異種ＧＧＰＰＳ酵素が存在する。機能性ＧＧＰＰＳがS.cerevisiaeで過剰発現されると、これはＧＧＰＰの蓄積をもたらし、これはS.cerevisiae酵素のＤＰＰ１およびＬＰＰ１によってゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）に変換され得る。ＧＧＯＨは、部分的に酵母培養培地に輸送される。ＧＧＯＨはＧＣ−ＭＳによって測定することができ、その蓄積は、ＧＧＰＰを基質として使用する酵素が利用可能なＧＧＰＰの潜在的プールを評価するために、間接的に用いることができる。
４つの異なるＧＧＰＰＳ（ＧＧＰＰＳ−１（S.acidicaldarius、表７参照）、ＧＧＰＰＳ−２（A. nidulans、図２５、配列番号２０３）、ＧＧＰＰＳ−３（S.cerevisiae、ＢＴＳ１、図２５、配列番号１６７）、およびＧＧＰＰＳ−４（M. musculus、表７参照））を評価した。ＧＧＰＰＳ−１、ＧＧＰＰＳ−２、およびＧＧＰＰＳ−４をコードするヌクレオチド配列は、S.cerevisiaeコドン最適化した。ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする全ての核酸は、ＰＧＫ１プロモーターの制御下でマルチコピープラスミド（２μ）にクローニングし、２つの異なるＥＲＧ９下方制御株、ＫＥＸ２−ＥＲＧ９およびＣＹＣ１（５％）−ＥＲＧ９に形質転換した（例２４参照）。
操作された酵母株は、ウラシルを除いた２％グルコースのＳＣで増殖させた。完全合成（ＳＣ）培地の配合のための完全サプリメント混合物は、Formedium（英国）から購入した。他のすべての化学物質はSigma-Aldrich （St.Louis, MO）から購入した。全ての光学濃度の測定は、６００ｎｍのＯＤで行った。培養物を３０℃で一晩増殖させ、２５ｍｌのＳＣ培地を含有する２５０ｍｌのバッフルなしの培養フラスコに、０．１のＯＤ６００で植菌するために使用した。主培養物を３０℃で７２時間増殖させた。
ＧＧＯＨの蓄積を測定するために、酵母細胞（ペレット）および酵母培養培地（上清）を別々に抽出し、ＧＣ−ＭＳによる分析の前に合わせた。上清は、ヘキサンで１：１の比率で抽出した。ペレットは、最初に２０％のＫＯＨと５０％のエタノールを含む溶液中で鹸化を行い、溶解した細胞は、最終的にヘキサンで１：１の比率で抽出した。使用したＧＣオーブン温度プログラムは、８０℃で２分、次に１６０℃まで３０℃／分で、次に１７０℃まで３℃／分で、最後に３００℃まで３０℃／分で上昇、および２分間の保持であった。インジェクタおよびＭＳ四重極検出器の温度はそれぞれ、２５０℃および１５０℃であった。２μｌをスプリットレスモードで注入した。ＭＳは、フルスキャンモードで操作した。
ＧＧＰＰＳが、ＣＹＣ１（５％）−ＥＲＧ９株またはＫＥＸ２−ＥＲＧ９株において過剰発現された場合、全４種のＧＧＰＰＳポリペプチドにおいて、ＧＧＰＰＳが発現されなかった対照と比較して、ＧＧＯＨ（ＧＧＰＰ）生産の大幅な増加が観察された。注目すべきことには、ＣＹＣ１（５％）−ＥＲＧ９株は、ＫＥＸ２−ＥＲＧ９株よりも２〜４倍高いＧＧＯＨ（ＧＧＰＰ）の蓄積を示した。結果を図２６に示す。
その他の態様
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前の記述は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図し、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。他の側面、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内である。

Claims (14)

  1. 配列番号１５２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主であって、
    前記宿主が、任意に以下：
    （ａ）ＵＧＴ９１ｄ２ｅまたはＵＧＴ９１ｄ２ｍポリペプチド、例えば配列番号５の残基２１１および２８６に置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド（例としては、配列番号５の残基２１１にメチオニンおよび残基２８６にアラニンを有するＵＧＴ９１ｄ２ｅ−ｂなど）をコードする組換え遺伝子；
    （ｂ）図１２Ｃに記載のアミノ酸配列（配列番号１６４）（ＫＡＨｅ１）と約８０％の同一性を有するステビオール合成酵素ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
    （ｃ）葉緑体輸送ペプチドを欠くｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（EC 5.5.1.13；ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
    （ｄ）Arabidopsis thaliana由来のＳＵＣ１配列などのショ糖トランスポーター、およびCoffea arabica、Arabidopsis thalianaまたはS. rebaudiana由来のＳＵＳ１配列などのショ糖合成酵素をコードする１または２以上の外因性核酸であって、特に前記１または２以上の外因性核酸の発現およびグルコシルトランスフェラーゼの発現が、宿主におけるウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）レベルの上昇をもたらす、前記外因性核酸；
    （ｅ）図１３に記載のS. rebaudianaＣＰＲアミノ酸配列（配列番号１７０）と少なくとも約８０％の配列同一性を有するＣＰＲポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
    （ｆ）核酸の配列であって、該核酸が、オープンリーディングフレームに動作可能に連結された異種挿入配列を含み、ここで該異種挿入配列が、一般式（Ｉ）：
    −Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５− （Ｉ）
    式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、式中、Ｘ３は、ゼロヌクレオチドまたはヘアピンループを形成する１もしくは２以上のヌクレオチドを含み、式中、Ｘ１およびＸ５は、各々独立して、ゼロヌクレオチドまたは１もしくは２以上のヌクレオチドからなる、ここで前記オープンリーディングフレームは、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）をコードする、
    を有する、前記核酸配列；
    （ｇ）S. rebaudianaＫＯポリペプチドをコードする１または２以上の外因性核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１３８と少なくとも約８０％の同一性を有する配列、および配列番号１６８などのA. thalianaＣＰＲポリペプチドを含む、前記外因性核酸；
    （ｈ）A. thalianaＫＳポリペプチドをコードする組換え遺伝子であって、該ポリペプチドが、配列番号１５６と少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含む、前記組換え遺伝子；
    （ｉ）ＵＧＴ８５Ｃをコードするコドン最適化組換え遺伝子；および
    （ｊ）ＧＧＰＰＳをコードする組換え遺伝子、
    の１または２以上を含む、前記組換え宿主。
  2. ）図１２Ｃに記載のアミノ酸配列（配列番号１６４）と少なくとも約８０％の同一性、例えば約８５％の同一性、約９０％の同一性、約９５％の同一性、または約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主。
  3. 核酸配列を含む組換え宿主細胞であって、前記核酸が、オープンリーディングフレームに動作可能に連結された異種挿入配列を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
    −Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
    式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
    式中、Ｘ３は、ゼロヌクレオチドまたはヘアピンループを形成する１もしくは２以上のヌクレオチドを含み、
    式中、Ｘ１およびＸ５は、各々独立して、ゼロヌクレオチドまたは１もしくは２以上のヌクレオチドからなる、ここで前記オープンリーディングフレームは、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）をコードする、
    を有する、前記組換え宿主細胞。
  4. 核酸配列が、
    ｉ）プロモーター配列、これは
    ｉｉ）異種挿入配列に動作可能に連結され、これは
    ｉｉｉ）オープンリーディングフレームに動作可能に連結され、これは
    ｉｖ）転写終結シグナルに動作可能に連結されている、
    を含み、ここで前記異種挿入配列は、一般式（Ｉ）：
    −Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
    式中、Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４つの連続したヌクレオチドに相補的であり、かつこれとステム二次構造要素を形成する、少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、および式中、Ｘ３は、Ｘ２とＸ４の間にヘアピンループを形成するヌクレオチドを含み、および式中、Ｘ１およびＸ５は、独立しておよび任意に、１または２以上の核酸を含み、および、
    ここで前記オープンリーディングフレームは、発現すると、スクアレン合成酵素（EC 2.5.1.21）またはその生物学的活性断片と少なくとも約７０％の同一性を有するポリペプチド配列をコードし、前記断片は、前記スクアレン合成酵素と、少なくとも１００個のアミノ酸のオーバーラップの範囲内で少なくとも約７０％の配列同一性を有する、
    請求項３に記載の細胞。
  5. 細胞が、前記細胞内でＧＧＰＰＳの発現を指向する核酸配列に動作可能に連結したＧＧＰＰＳをコードする異種核酸をさらに含む、請求項３または４に記載の細胞。
  6. 葉緑体輸送ペプチドを欠くｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素（EC 5.5.1.13；ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子をコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主。
  7. ポリペプチドが、非修飾のZea maysＣＤＰＳポリペプチドのカルボキシ末端から５０個のアミノ酸を欠くZea maysＣＤＰＳである、請求項６に記載の宿主。
  8. 宿主がさらに、以下：
    配列番号３に記載のアミノ酸配列と約９０％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
    配列番号７に記載のアミノ酸配列と約９０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
    組換え遺伝子などの、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子；および
    ＵＧＴ９１Ｄ２機能性ホモログをコードする遺伝子；
    の１または２以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の前記宿主。
  9. 宿主がさらに、以下：
    （ｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子；
    （ｉｉ）二機能性のコパリル二リン酸合成酵素とカウレン合成酵素とをコードする遺伝子、または、配列番号１２９〜１３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するコパリル二リン酸合成酵素などの、コパリル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子および、配列番号１３２〜１３５または配列番号１５６に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも約９０％の配列同一性を有するカウレン合成酵素などの、カウレン合成酵素をコードする遺伝子、
    （ｉｉｉ）配列番号１３８〜１４１に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも約９０％の配列同一性を有するカウレン酸化酵素などの、カウレン酸化酵素をコードする遺伝子；
    （ｉｖ）配列番号１４２〜１４６および１６４に記載のアミノ酸配列の１つと少なくとも約９０％の配列同一性を有するステビオール合成酵素などの、ステビオール合成酵素をコードする遺伝子；
    （ｖ）切断型ＨＭＧ−ＣｏＡをコードする遺伝子；
    （ｖｉ）ＣＰＲをコードする遺伝子；
    （ｖｉｉ）ラムノース合成酵素をコードする遺伝子；
    （ｖｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；および
    （ｉｘ）ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、
    の１または２以上を含み、
    ここで特に、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、または（ｉｘ）の遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子である、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主。
  10. 宿主が微生物、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主。
  11. ステビオール配糖体を生産する方法であって、
    ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主を培養培地中にて、遺伝子が発現される条件下で、例えば１または２以上の前記遺伝子の発現を誘導して、増殖させること；および
    ｂ）前記宿主により生産されたステビオール配糖体を回収すること；
    を含む、前記方法。
  12. ステビオール配糖体が、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドで形質転換された透過化宿主細胞中で生産される、請求項１１に記載の方法。
  13. ステビオール配糖体がレバウジオシドＡであり、レバウジオシドＤが、糖供与体からのグルコース部分の、レバウジオシドＡへの転移の際に生産される、請求項１２に記載の方法。
  14. 細胞におけるＵＤＰ−グルコースレベルを上昇させて、ＵＤＰレベルを低下させる方法であって、該方法は、ショ糖を含む培地中で、組換えショ糖合成酵素および組換えショ糖トランスポーターを細胞内に発現させることを含み、ここで前記細胞はショ糖分解が欠乏しているか、または前記の発現が細胞におけるＵＤＰレベルの低下およびＵＤＰ−グルコースレベルの上昇をもたらし、これにより細胞におけるグリコシル化を増加させる、前記の方法。
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