CN104232496B - 一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷a中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组毕赤酵母工程菌及将其用作全细胞催化剂合成莱鲍迪苷A的方法。本发明的重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码UDP‑糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的重组毕赤酵母工程菌实现Sus1的胞内表达和UGT76G1的表面展示表达，将本发明重组毕赤酵母用作全细胞催化剂可有效地用于合成莱鲍迪苷A，不仅提高了莱鲍迪苷A的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A的生产加工开辟新的工业化途径。

Description

一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用。

背景技术

甜菊糖（Steviol glycoside）是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，限制其应用。甜菊苷（Stevioside）和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A）是甜菊糖中含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10%和2-4%。莱鲍迪苷A (RA) 是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜昧剂，其甜度是蔗糖的150-300 倍，热值仅为蔗糖的1 /300，而且口味纯正，没有后苦味；因而具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法有：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性，但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。那么，是否能够从莱鲍迪苷A (RA)的生物合成途径入手，结合基因工程技术、构建一种以相应底物为基础，通过发酵高效合成莱鲍迪苷A (RA)的工程菌，并将其运用于莱鲍迪苷A (RA)的合成加工领域，以提高莱鲍迪苷A (RA)的合成效率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A (RA)的生产加工开辟新的工业化途径就显得十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌及其构建方法。

本发明所解决的技术问题还在于将共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌作为全细胞催化剂用于合成莱鲍迪苷A。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：

编码蔗糖合成酶基因的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，

编码UDP-糖基转移酶的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。

其中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶基因的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶的DNA序列。

优选地，所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1。

另外，本发明还提供了一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO. 3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.4所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；

步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌；或者，将将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌；再将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌。

优选地，所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1。

优选地，所述步骤三具体包括：将表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1经Kpn2 I单酶切线性化并纯化后电转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并在MD平板上筛选阳性转化子，从而得到工程菌GS115/ UGT76G1；再将胞内表达载体pPICZA-Sus1经Pme I单酶切线性化并纯化后电转化上述GS115/ UGT76G1感受态细胞，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/ Sus1- UGT76G1。

另外，本发明还提供了一种全细胞催化剂，包含本发明的重组毕赤酵母工程菌。

优选地，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：

（1）挑取上述重组毕赤酵母工程菌接种至BMGY培养基进行初级培养至OD600接近5.0-6.0，离心收集细胞；

（2）然后将收集的细胞重悬到BMMY 培养基至起始OD600接近0.5-1.0，于25-35℃条件下进行次级培养，次级培养过程中每天补加终浓度1%甲醇，发酵3天后在离心回收菌体；

（3）菌体冻干后即得到含重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂。

另外，本发明还提供了一种莱鲍迪苷A的合成方法，该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以本发明的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。

优选地，该方法包括如下步骤：

（1）按如下组分及其浓度制备反应体系；

50mM PBS缓冲液，

3mM MgCl2，

250 mM 蔗糖，

0.5-1mM UDP，

3mg/mL甜菊苷；

（2）向反应体系中加入菌体量为30OD含有重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂，于37℃进行反应12h后终止反应；

（3）每200ul反应液用600ul正丁醇萃取反应体系中的莱鲍迪苷A，吸取上层正丁醇萃取液而后进行纯化分离得到莱鲍迪苷A。

与现有技术相比，本发明优点在于：

本发明构建得到的重组毕赤酵母工程菌能同时实现蔗糖合成酶Sus1的胞内表达和UDP-糖基转移酶UGT76G1的表面展示表达。而从原理上讲蔗糖合成酶Sus1能够将蔗糖的糖基转移至UDP上生成UDPG和果糖，而UDP-糖基转移酶UGT76G1能特异性地催化ST苷和UDPG反应合成RA。因此，利用本发明共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母能有效地将上述两步反应联合起来，以甜菊苷（ST）为原料、蔗糖为糖基供体，进行生物转化高效合成合成莱鲍迪苷A（RA）。由本发明具体实施例中的实验结果也充分表明采用本发明方案发酵获得的全细胞催化剂可高效合成莱鲍迪苷A (RA)，其底物ST的转化率达到95%以上，产量超过93%，不仅提高了莱鲍迪苷A (RA)的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A (RA)的生产加工开辟新的工业化途径。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1为重组毕赤酵母全细胞催化剂合成RA。A、B分别为反应前后的液相色谱检测结果。ST和RA的出峰时间分别为6.1 min和7.8 min左右。

图2为重组毕赤酵母全细胞催化剂循环使用能力的检测。

图3为合成体系中UDP添加量对RA产量的影响。

具体实施方式

下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

基因Sus1和UGT76G1的合成

以NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的Sus1和UGT76G1基因，其序列分别如Seq No.3和Seq No.4所示，通过生物技术公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）进行全基因合成，合成的基因克隆在pUC57质粒（购自金斯瑞生物科技公司）上，得到质粒pUC57-Sus1和pUC57- UGT76G1。

实施例2

胞内表达载体pPICZA-Sus1和展示表达载体pGCW61-UGT76G1的构建

根据Sus1基因序列设计正向引物SF（含EcoR I酶切位点）和反向引物SR（含Not I酶切位点）。以实施例1中的质粒pUC57- Sus1为模板，SF和SR为引物进行PCR扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，与同样经过EcoR I和Not I双酶切的质粒pPICZA用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10（购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司），经博莱霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经EcoR I和Not I双酶切鉴定正确后，得到胞内表达载体pPICZA-Sus1。含有重组质粒pPICZA-Sus1的克隆菌株E.coli Top10/ pPICZA-Sus1加15%甘油于-80℃保存。

根据UGT76G1基因设计正向引物UF（含EcoR I酶切位点）和反向引物UR（含Mlu I酶切位点）。以实施例1中的质粒pUC57-UGT76G1为模板，UF和UR为引物进行PCR扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Mlu I进行双酶切。根据毕赤酵母锚定蛋白Gcw61p的编码基因设计正向引物GF（含Mlu I酶切位点）和反向引物GR（含Not I酶切位点）。以毕赤酵母基因组为模板，GF和GR为引物进行PCR扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶Mlu I和Not I进行双酶切。将上述两个片段与经过EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10（购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司），经卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经酶切鉴定正确后，得到展示表达载体pGCW61-UGT76G1。含有重组质粒pGCW61- UGT76G1的克隆菌株E.coli Top10/ pGCW61- UGT76G1加入15%甘油于-80℃保存。

实施例3

重组毕赤酵母工程菌GS115/Sus1-UGT76G1的构建及全细胞催化剂的获得

将展示表达载体pGCW61-UGT76G1经Kpn2 I单酶切线性化并纯化后电转化Pichiapastoris GS115（购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司）感受态细胞，并在MD平板上筛选阳性转化子；从而得到工程菌GS115/ UGT76G1。将胞内表达载体pPICZA-Sus1经Pme I单酶切线性化并纯化后电转化上述GS115/ UGT76G1感受态细胞，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子；进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/ Sus1- UGT76G1。

挑取上述重组毕赤酵母工程菌GS115/ Sus1-UGT76G1接种至BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm, 4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY 培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1%甲醇。发酵3天后在6000rpm，4℃ 离心5min回收菌体；菌体冻干后即得到重组毕赤酵母全细胞催化剂。

实施例4

重组毕赤酵母全细胞催化剂合成莱胞迪苷A

200ul反应体系包含以下成分：50mM PBS缓冲液，3mM MgCl2，250 mM 蔗糖，1mMUDP，3mg/mL ST(甜菊苷)。加入菌体量为30OD重组毕赤酵母全细胞催化剂，于37℃进行反应。反应12h后停止反应，每200ul反应液用600ul正丁醇萃取产物RA。吸取上层正丁醇萃取液，用0.2um有机系尼龙膜过滤后用液相色谱检测RA的合成。

甜菊苷（ST）和莱鲍迪苷A（RA）的出峰时间为6.1 min和7.8 min左右。由图1可知，反应12h后大部分ST被消耗，同时RA大量生成。实验表明Sus1在重组酵母胞内活性表达，反应物蔗糖和UDP进入细胞后在Sus1的作用下生成UDPG和果糖。生成的UDPG从胞内运出，在表面展示UGT76G1的催化下与ST反应生成产物RA。进一步计算得到，ST的转化率为95.56%，同时RA的产率为93.79%。

实施例5

重组毕赤酵母全细胞催化剂循环使用能力的检测

循环使用能力是全细胞催化剂的一个重要性能指标，因而要对的重组毕赤酵母全细胞催化剂的循环使用能力进行评价。将实施3中获取的重组毕赤酵母加入反应体系，控制RA合成体系中的菌体量为30OD，将反应12h后的反应液于9000rpm离心2 min，上清液取出保存于- 20 °C待用，用于测量RA的产量。菌体用pH7.2的0.05M PBS缓冲液洗涤两次，再次加入RA合成体系进行RA的合成。重复上述操作共进行五次反应，每个反应设3组平行，最后用液相色谱检测RA的生成，结果如图2所示。由图2可知，以第一次RA产量为100%，第二次反应的RA产量略有降低，而第三次重复使用时RA产量下降至51.61%。 因此，循环使用次数应控制在三次以内，最好不要超过两次。

实施例6

莱胞迪苷A合成体系中UDP添加量的优化

RA合成体系中UDP的价格相对较高，为控制RA合成成本、提高合成反应的经济性，对反应体系中UDP的添加量进行优化。在200ul反应体系中添加不同浓度的UDP（0、0.25、0.5、0.75、1mmol/L），全细胞催化剂的量控制为30OD。37 °C反应12h，液相检测RA的产量。如图3所示，体系中不添加UDP，合成反应无法启动，没有RA生成。随着UDP添加量的增加，RA的合成也相应增加。添加量大于0.25 mmol/L时，RA的生成量变化并不明显。在进行RA合成反应时，应综合根据UDP的成本和RA的产量选择适和的UDP添加量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>广州康琳奈生物科技有限公司

<120>一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用

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Claims (7)

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：

编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，

编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示;

所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体是将如SEQID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO. 4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1。

2.一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO. 3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO. 4所示；

步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；所述胞内表达载体是将如SEQ ID NO. 3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQ ID NO.4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61- UGT76G1;

步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌；或者，将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌；再将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌。

3.如权利要求2所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：将表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1经Kpn2 I单酶切线性化并纯化后电转化Pichiapastoris GS115感受态细胞，并在MD平板上筛选阳性转化子，从而得到工程菌GS115/UGT76G1；再将胞内表达载体pPICZA-Sus1经Pme I单酶切线性化并纯化后电转化上述GS115/ UGT76G1感受态细胞，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/ Sus1- UGT76G1。

4.一种全细胞催化剂，其特征在于：包含如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌。

5.如权利要求4所述的全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：

（1）挑取上述重组毕赤酵母工程菌接种至BMGY培养基进行初级培养至OD600接近5.0-6.0，离心收集细胞；

（2）然后将收集的细胞重悬到BMMY 培养基至起始OD600接近0.5-1.0，于25-35℃条件下进行次级培养，次级培养过程中每天补加终浓度1%甲醇，发酵3天后在离心回收菌体；

（3）菌体冻干后即得到含重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂。

6.一种莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于：该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以权利要求4或5中所述的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。

7.如权利要求6所述的莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）按如下组分及其浓度制备反应体系；

50mM PBS缓冲液，

3mM MgCl2，

250 mM 蔗糖，

0.5-1mM UDP，

3mg/mL甜菊苷；

（2）向反应体系中加入菌体量为30OD含有重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂，于37℃进行反应12h后终止反应；

（3）每200ul反应液用600ul正丁醇萃取反应体系中的莱鲍迪苷A，吸取上层正丁醇萃取液而后进行纯化分离得到莱鲍迪苷A。