CN107267406A - 一种重组毕赤酵母工程菌、全细胞催化剂及莱鲍迪苷a的合成方法 - Google Patents

一种重组毕赤酵母工程菌、全细胞催化剂及莱鲍迪苷a的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达蔗糖合成酶Sus1的重组毕赤酵母及其联合表面展示UDP‑糖基转移酶UGT76G1毕赤酵母催化合成莱鲍迪苷A的方法。蔗糖合成酶Sus1的氨基酸序列如Seq No.1所示。其编码基因如Seq No2所示。胞内表达载体pPICZA‑Sus1是将Sus1编码基因克隆至毕赤酵母表达载体pPICZA获得。重组毕赤酵母工程菌是将上述载体线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得，从而实现Sus1的胞内表达。上述重组毕赤酵母全细胞催化剂可有效地用于联合催化合成莱鲍迪苷A，RA产量达到2.2mg/mL，不仅提高了莱鲍迪苷A(RA)的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A(RA)的生产加工开辟新的工业化途径。

Description

一种重组毕赤酵母工程菌、全细胞催化剂及莱鲍迪苷A的合成 方法
技术领域
本发明涉及生物技术及食品化工领域，尤其涉及蔗糖合成酶基因表达的毕赤酵母工程菌以及重组毕赤酵母在催化合成莱鲍迪苷A中的应用。
背景技术
甜菊糖(Steviol glycoside)是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，限制其应用。甜菊苷(Stevioside)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖中含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10％和2-4％。莱鲍迪苷A(RA)是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜昧剂，其甜度是蔗糖的150-300倍，热值仅为蔗糖的1/300，而且口味纯正，没有后苦味；因而具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法有：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性。但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。因此，建立一种高效合成莱胞迪苷A的方法十分必要。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种表达蔗糖合成酶Sus1的重组毕赤酵母工程菌及其构建方法。
本发明所解决的技术问题还在于将共表达蔗糖合成酶Sus1的重组毕赤酵母工程菌作为全细胞催化剂用于合成莱鲍迪苷A。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA序列的表达载体转化到毕赤酵母而获得：
所述外源DNA为编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述蔗糖合成酶Sus1的氨基酸序列如Seq No.1所示。所述外源DNA序列如Seq No.2所示。
其中，所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA，得到的胞内表达载体pPICZA-Sus1。
优选地，所述重组毕赤酵母工程菌是所述胞内表达载体pPICZA-Sus1线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。
另外，本发明还提供了一种全细胞催化剂，包含本发明的重组毕赤酵母工程菌。
优选地，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：
所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：
挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵3天后在6000rpm，4℃离心5min回收菌体；冻干后即为重组毕赤酵母全细胞催化剂。
另外，本发明还提供了一种莱鲍迪苷A的合成方法，该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以上述方案中的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。
优选地，该方法包括如下步骤：
包括如下步骤：
(1)按如下组分及其浓度制备反应体系；
50mM PBS缓冲液，
3mM MgCl2，
50mM蔗糖，
1mM UDP，
10mg/mL甜菊苷；
(2)加入菌体量为30OD重组毕赤酵母与30OD菌体量的全细胞催化剂，于37℃进行反应，反应12h后停止反应；
(3)将反应液稀释5倍后，用0.2um水系尼龙膜过滤后用液相色谱检测RA的合成。
与现有技术相比，本发明优点在于：
与现有技术相比，本发明优点在于：构建得到的重组毕赤酵母工程菌能实现Sus1的胞内表达；发酵获得的全细胞催化剂可与表面展示UGT76G1菌株联合催化合成RA，RA产量达到2.2mg/mL。不仅提高了莱鲍迪苷A(RA)的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A(RA)的生产加工开辟新的工业化途径。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
附图说明
图1为重组毕赤酵母全细胞催化剂合成RA。A、B分别为反应前后的液相色谱检测结果。ST和RA的出峰时间分别为10.1min和10.8min左右。
具体实施方式
下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
基因Sus1的合成
以NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的Sus1基因，其序列分别如Seq No.2示，通过生物技术公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行全基因合成，合成的基因克隆在pUC57质粒(购自金斯瑞生物科技公司)上，得到质粒pUC57-Sus1。
实施例2
胞内表达载体pPICZA-Sus1的构建
根据Sus1基因序列设计正向引物SF(含EcoR I酶切位点)和反向引物SR(含Not I酶切位点)。以实施例1中的质粒pUC57-Sus1为模板，SF和SR为引物进行PCR扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，与同样经过EcoRI和NotI双酶切的质粒pPICZA用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coli Top10(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)，经博莱霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经EcoR I和Not I双酶切鉴定正确后，得到胞内表达载体pPICZA-Sus1。含有重组质粒pPICZA-Sus1的克隆菌株E.coli Top10/pPICZA-Sus1加15％甘油于-80℃保存。
实施例3
重组毕赤酵母工程菌GS115/9K/pPICZA-SUS1的构建及全细胞催化剂的获得
将空载体pPIC9K经mssI单酶切线性化并纯化后电转化并纯化后电转化Pichiapastoris GS115(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)感受态细胞，并在卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子；将胞内表达载体pPICZA-Sus1经mss I单酶切线性化并纯化后电转化并纯化后电转化上述重组毕赤酵母，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子；进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/9K/pPICZA-SUS1。
挑取上述重组毕赤酵母工程菌GS115/9K/pPICZA-SUS1接种至BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵3天后在6000rpm，4℃离心5min回收菌体；菌体冻干后即得到重组毕赤酵母全细胞催化剂。
实施例4
重组毕赤酵母全细胞催化剂合成莱胞迪苷A
200ul反应体系包含以下成分：50mM PBS缓冲液，3mM MgCl2，50mM蔗糖，1mM UDP，10mg/mL ST(甜菊苷)。加入菌体量为30OD重组毕赤酵母与30OD菌体量的全细胞催化剂，于37℃进行反应，反应12h后停止反应。将反应液稀释5倍后，用0.2um水系尼龙膜过滤后用液相色谱检测RA的合成。
甜菊苷(ST)和莱鲍迪苷A(RA)的出峰时间为10.1min和10.8min左右。由图1可知，反应12h后ST被消耗，同时生成RA。实验表明Sus1在重组酵母胞内活性表达，反应物蔗糖和UDP进入细胞后在Sus1的作用下生成UDPG和果糖。生成的UDPG从胞内运出，在表面展示UGT76G1的毕赤酵母催化下与ST反应生成产物RA。RA产量达到2.2mg/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110>广州康琳奈生物科技有限公司
<120>一种重组毕赤酵母工程菌、全细胞催化剂及莱鲍迪苷A的合成方法
<160> 2
<210> 1
<211> 808
<212> PRT
<400> 1
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD
MATDRLTRVHELRERLDETLSANRNEILALLSRIEGKGKGILQHHQVIAEFEEIPEESRQKLTDGAFGEVLRSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNVHALVVEVLQPAEYLRFKEELVDGSSNGNFVLELDFEPFTASFPRPTLNKSIGNGVQFLNRHLSAKLFHDKESLHPLLEFLRLHSVKGKTLMLNDRIQNPDALQHVLRKAEEYLGTVPPETPYSAFEHKFQEIGLERGWGDNAERVLESIQLLLDLLEAPDPCTLETFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALENEMLHRIKQQGLDIVPRILIITRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGTEHSHILRVPFRTENGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDVAHELAKELQGKPDLIVGNYSDGNIVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPESDIYWKKLEERYHFSCQFTADLFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADQTIYFPHTETSRRLTSFHTEIEELLYSSVENEEHICVLKDRSKPIIFTMARLDRVKNITGLVEWYGKNAKLRELVNLVVVAGDRRKESKDLEEKAEMKKMYSLIETYKLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRVIADTKGAFVQPAVYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCNGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDRAADLLVEFFEKVKVDPSHWDKISQAGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRRESRRYLEMFYALKYRKLAESVPLAVE
<210> 2
<211> 2427
<212> DNA
<400> 2
ATGGCTAACGCCGAGAGAATGATTACCAGAGTCCACTCCCAAAGAGAGAGATTGAACGAGACCCTTGTCAGTGAGAGAAACGAAGTCTTGGCATTGCTTTCTAGAGTTGAAGCTAAGGGTAAAGGAATTTTGCAACAGAACCAAATCATCGCCGAATTTGAGGCATTGCCAGAGCAGACCAGAAAGAAATTGGAAGGTGGACCATTTTTCGATTTGCTTAAATCCACTCAAGAAGCTATTGTTCTTCCACCTTGGGTCGCCTTGGCAGTTAGACCAAGACCTGGTGTCTGGGAATACTTGAGAGTTAACCTTCATGCTTTGGTTGTCGAAGAGCTTCAACCAGCCGAGTTTTTGCACTTCAAAGAAGAATTGGTTGATGGTGTTAAGAACGGAAACTTCACACTTGAATTGGATTTTGAGCCTTTCAATGCTTCTATCCCAAGACCTACCTTGCATAAATACATTGGTAACGGAGTTGACTTTTTGAACAGACATCTTTCTGCTAAGTTGTTCCACGATAAGGAATCCTTGCTTCCATTGCTTAAGTTCCTTAGATTGCATTCACACCAAGGTAAAAACCTTATGTTGAGTGAAAAGATTCAAAACCTTAACACATTGCAGCACACCTTGAGAAAAGCTGAAGAGTATCTTGCCGAATTGAAGTCAGAGACTTTGTACGAAGAGTTTGAAGCAAAGTTTGAAGAGATTGGTTTGGAGAGAGGTTGGGGAGACAATGCCGAAAGAGTTTTGGATATGATCAGATTGCTTTTGGACCTTTTGGAGGCTCCAGATCCTTGTACCCTTGAAACTTTCTTGGGAAGAGTCCCAATGGTTTTCAACGTTGTCATTTTGTCTCCTCATGGTTACTTTGCTCAAGACAATGTTTTGGGATATCCTGATACTGGTGGACAAGTTGTCTACATTTTGGACCAGGTTAGAGCCCTTGAAATTGAGATGTTGCAGAGAATCAAACAACAGGGTTTGAACATCAAGCCAAGAATTTTGATCTTGACCAGACTTTTGCCTGATGCTGTTGGTACTACTTGTGGAGAAAGATTGGAGAGAGTTTACGACTCCGAGTATTGCGATATTTTGAGAGTCCCTTTTAGAACTGAAAAGGGAATCGTTAGAAAGTGGATCTCTAGATTCGAGGTCTGGCCTTACTTGGAAACCTATACTGAGGATGCTGCCGTTGAACTTTCCAAAGAGTTGAATGGTAAACCAGACTTGATTATCGGTAACTATTCAGATGGAAATTTGGTTGCTAGTCTTTTGGCCCATAAATTGGGAGTCACACAATGTACCATTGCTCACGCCTTGGAAAAGACTAAGTACCCTGATTCTGACATCTATTGGAAGAAATTGGATGACAAGTACCATTTTTCCTGCCAATTCACTGCAGACATCTTCGCTATGAACCACACAGATTTCATCATCACATCTACCTTCCAAGAAATCGCCGGTTCCAAAGAGACTGTTGGACAGTATGAATCTCATACTGCATTCACACTTCCAGGTTTGTACAGAGTTGTCCACGGAATCGATGTCTTTGACCCAAAGTTCAATATTGTTTCACCTGGTGCTGATATGAGTATCTACTTTCCTTATACAGAAGAGAAAAGAAGATTGACCAAGTTCCATTCAGAAATTGAAGAGCTTTTGTATAGTGACGTCGAAAACAAAGAGCACCTTTGTGTTTTGAAGGATAAGAAAAAGCCAATCTTGTTTACTATGGCTAGACTTGACAGAGTCAAAAATCTTTCAGGTTTGGTTGAGTGGTACGGAAAGAACACAAGACTTAGAGAATTGGCCAATCTTGTTGTCGTTGGTGGAGACAGAAGAAAGGAGAGTAAGGATAACGAAGAGAAAGCAGAAATGAAAAAGATGTACGATTTGATCGAAGAGTACAAGCTTAACGGTCAATTCAGATGGATCTCTTCCCAGATGGACAGAGTTAGAAATGGTGAATTGTACAGATACATCTGTGATACTAAGGGAGCATTTGTTCAACCTGCCTTGTATGAGGCATTCGGTCTTACTGTCGTTGAAGCTATGACTTGTGGATTGCCAACCTTTGCCACTTGCAAAGGTGGACCTGCAGAAATTATCGTTCATGGTAAATCTGGATTCCATATTGATCCATACCACGGAGATCAAGCAGCTGACACCTTGGCTGATTTCTTTACTAAATGCAAGGAGGACCCTTCTCACTGGGATGAAATTTCCAAAGGTGGATTGCAGAGAATCGAAGAGAAGTACACTTGGCAAATCTACTCACAGAGACTTTTGACTTTGACAGGTGTCTATGGATTTTGGAAACACGTTAGTAATTTGGATAGACTTGAGGCAAGAAGATACTTGGAAATGTTCTACGCTCTTAAGTATAGACCATTGGCACAAGCTGTTCCTTTGGCTCAGGATGACTAA

Claims (8)

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA序列的表达载体转化到毕赤酵母而获得：
所述外源DNA为编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述蔗糖合成酶Sus1的氨基酸序列如Seq No.1所示。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述外源DNA序列如SeqNo.2所示。
3.如权利要求2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA，得到的胞内表达载体pPICZA-Sus1。
4.如权利要求3所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述重组毕赤酵母工程菌是所述胞内表达载体pPICZA-Sus1线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。
5.一种全细胞催化剂，其特征在于：包括如权利要求1-4中任意一项所述的重组毕赤酵母工程菌。
6.如权利要求5所述的全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：
挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵3天后在6000rpm，4℃离心5min回收菌体；冻干后即为重组毕赤酵母全细胞催化剂。
7.一种莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于：该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以权利要求5或6中所述的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。
8.如权利要求7所述的莱鲍迪苷A的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)按如下组分及其浓度制备反应体系；
50mM PBS缓冲液，
3mM MgCl2，
50mM蔗糖，
1mM UDP，
10mg/mL甜菊苷；
(2)加入菌体量为30OD重组毕赤酵母与30OD菌体量的全细胞催化剂，于37℃进行反应，反应12h后停止反应；
(3)将反应液稀释5倍后，用0.2um水系尼龙膜过滤后用液相色谱检测RA的合成。
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