BR112016019823B1 - Método de síntese de glucano e hidrólise de subproduto de sacarídeo solúvel - Google Patents

Método de síntese de glucano e hidrólise de subproduto de sacarídeo solúvel Download PDF

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Abstract

MÉTODO DE HIDRÓLISE, COMPOSIÇÃO E MÉTODOS DE ENRIQUECIMENTO DE FRUTOSE E DE FERMENTAÇÃO. É descrito um método de hidrólise de uma ligação alfa-1,3 ou alfa- 1,6 glicosilglicose em sacarídeo (dissacarídeo ou oligossacarídeo). Este método compreende o contato do sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase tal como transglicosidase sob condições apropriadas e, durante essa etapa de contato, a enzima hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo. Este método é útil, por exemplo, para reduzir a quantidade de oligossacarídeos em um filtrado isolado de uma reação de síntese de glucano.

Description

[001] O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios Norte-Americanos n° 61/945.233 (depositado em 27 de fevereiro de 2014), 61/945.241 (depositado em 27 de fevereiro de 2014), 62/004.290 (depositado em 29 de maio de 2014), 62/004.308 (depositado em 29 de maio de 2014), 62/004.312 (depositado em 29 de maio de 2014), 62/004.300 (depositado em 29 de maio de 2014), 62/004.314 (depositado em 29 de maio de 2014) e 62/004.305 (depositado em 29 de maio de 2014), todos os quais são integralmente incorporados ao presente como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção encontra-se no campo de hidrólise enzimática de pequenos polímeros de açúcar. Especificamente, a presente invenção refere-se à hidrólise de oligossacarídeos e dissacarídeos que compreendem uma ou mais ligações alfa-1,3 ou alfa-1,6-glicosilclicose com uma enzima de alfaglicosidase.
REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DEPOSITADA ELETRONICAMENTE
[003] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web na forma de listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo denominado CL6220USNP_SequenceListing_ST25.txt criado em onze de fevereiro de 2015 e que possui tamanho de 266 quilobytes, depositado simultaneamente com o presente relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do presente relatório descritivo e é integralmente incorporada ao presente como referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Transglicosidases (EC.2.4.1.24, 1,4-alfaglucano 6- alfaglicosiltransferase) são enzimas de D-glicosiltransferase que catalisam reações hidrolíticas e de transferência mediante incubação com alfa-D-glico- oligossacarídeos (1951, Pazur e French, J. Amer. Chem. Soc. 73: 3536). Maltose é o substrato de maior preferência para reações de transglicosilação com essa enzima. A transferência ocorre mais frequentemente para HO-6, produzindo isomaltose a partir de D-glicose, ou panose (6-O-alfa glicosil maltose) a partir de maltose. Transglicosidase pode também transferir um resíduo de glicosila para HO-2 ou HO-3 de outra unidade de D-glicosila para formar Kojibiose ou Nigerose. Essa enzima pode transferir adicionalmente uma unidade D-glicosila de volta para HO-4, para reformar maltose.
[005] Como resultado de reações de transglicosilação com transglicosidase, resíduos de malto-oligossacarídeos são convertidos em isomalto-oligossacarídeos (IMO) que contêm proporção mais alta de resíduos de glicosila ligados por ligações alfa-D-1,6 glicosídicas da extremidade não redutora. Açúcares IMO são utilizados em muitas formulações de alimentos e bebidas na Ásia. Brier et al (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2003/0167929) descreveram o uso de transglicosidase para produzir IMO a partir de mosto de cevada.
[006] Poulose et al (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514) descreveram o uso de transglicosidase para degradar polissacarídeos tais como gomas xantana e guar. Goma xantana compreende uma cadeia principal celulósica na qual glicoses alternadas são ligadas 1,3 a ramos que contêm manose e ácido glucurônico. A cadeia principal de goma guar compreende resíduos de manose ligados por beta-1,4 aos quais resíduos de galactose são ligados por alfa-1,6 em manoses alternadas.
[007] Lantero et al (Patente Norte-Americana n° 5.770.437) descreveram o uso de transglicosidase para degradar sacarose, melezitose e tre-halose. Esses açúcares compreendem glicose ligada a frutose por meio de ligações de 1,2-(sacarose), 1,3-(melezitose) ou 1,1-(tre-halulose).
[008] Embora várias atividades hidrolíticas de transglicosidase tenham sido descritas, esse tipo de enzima geralmente é considerado alfaglicosidase, considerando sua capacidade de hidrolisar ligações alfa entre dois resíduos de glicosila. Transglicosidase é associada, por exemplo, com a atividade de maltase (hidrólise da ligação alfa-1,4 glicosídica entre os dois resíduos de glicosila de maltose), que é um tipo de atividade de alfaglicosidase.
[009] Não obstante as descrições acima, descobriu-se, surpreendentemente, que alfaglicosidases como transglicosidase (EC 2.4.1.24) podem hidrolisar ligação alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosídica de glicosilglicose. Enzimas alfaglicosidases são descritas no presente como sendo úteis para degradar dissacarídeos e oligossacarídeos que contêm glicosil alfa-1,3-glicose e glicosil alfa-1,6-glicose.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0010] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método de hidrólise de uma ligação de alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo que compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose, em que o sacarídeo é um dissacarídeo ou oligossacarídeo e o método compreende: contato do sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo e a quantidade do sacarídeo é reduzida em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato.
[0011] Em outra realização, a enzima alfaglicosidase do método de hidrólise é imobilizada.
[0012] Em outra realização, o sacarídeo do método de hidrólise possui grau de polimerização antes da hidrólise de 3 a 7. Em outra realização, a concentração do sacarídeo após a etapa de contato é de menos de 50% da concentração do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato.
[0013] Em outra realização, as condições apropriadas do método de hidrólise compreendem (i) reação de síntese de glucano; ou (ii) uma fração obtida da reação de síntese de glucano; em que o sacarídeo é um subproduto da reação de síntese de glucano. A reação de síntese de glucano gera pelo menos um produto de alfaglucano insolúvel em outra realização. Em outra realização, a fração é um filtrado da reação de síntese de glucano. Em outra realização, a reação de síntese de glucano gera pelo menos um produto de alfaglucano solúvel que é (i) um produto de glicosiltransferase ou (ii) um produto da ação concertada de glicosiltransferase e alfaglicano-hidrolase capaz de hidrolisar polímeros de glucano que contêm uma ou mais ligações alfa-1,3- glicosídicas ou uma ou mais ligações alfa-1,6-glicosídicas. A fração é uma fração cromatográfica da reação de síntese de glucano em outra realização na qual a reação de síntese de glucano gera pelo menos um produto de alfaglucano solúvel.
[0014] Em outra realização, a enzima alfaglicosidase é transglicosidase. Em outra realização, a transglicosidase compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 1.
[0015] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma composição produzida por meio de contato de um sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase, em que o sacarídeo é um dissacarídeo ou oligossacarídeo e compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose, a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo e a composição compreende quantidade reduzida do sacarídeo em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato.
[0016] Em outra realização, o sacarídeo da composição possui grau de polimerização antes da hidrólise de 3 a 7. A concentração do sacarídeo após a etapa de contato é, por exemplo, de menos de 50% da concentração do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato.
[0017] Em outra realização, o sacarídeo da composição encontra- se em (i) uma reação de síntese de glucano; ou (ii) uma fração obtida da reação de síntese de glucano; em que o sacarídeo é um subproduto da reação de síntese de glucano. Em outra realização, a fração é um filtrado da reação de síntese de glucano ou uma fração cromatográfica da reação de síntese de glucano.
[0018] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de enriquecimento de frutose presente em uma fração de reação de síntese de glucano, que compreende: (a) contato de uma fração obtida de uma reação de síntese de glucano com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação de alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendida na fração; e (b) separação de frutose da fração hidrolisada da etapa (a) para obter uma composição que contém concentração mais alta de frutose em comparação com a concentração de frutose da fração da etapa (a).
[0019] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de fermentação que compreende: (a) contato de uma fração obtida a partir de uma reação de síntese de glucano com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendido na fração; (b) fermentação da fração da etapa (a) com um micróbio para gerar um produto, em que a fermentação pode ser realizada após a etapa (a) ou simultaneamente com a etapa (a); e (c) isolamento opcional do produto de (b); em que o rendimento do produto de (b) aumenta em comparação com o rendimento de produto da fermentação de uma fração da reação de síntese de glucano que não tenha sido colocada em contato com a enzima.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E SEQUÊNCIAS
[0020] Figura 1: espectro de NMR 1H de material filtrado de reação de glucano antes (material de partida) e depois (material tratado) do tratamento de hidrólise com enzima NOVO 188 (vide os Exemplos 2-3).
[0021] Figura 2: espectro de NMR 1H de material filtrado de reação de glucano antes (material de partida) e depois (material tratado) do tratamento de hidrólise com transglicosidase TG L-2000 (vide os Exemplos 23). TABELA 1 RESUMO DOS NÚMEROS DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS E DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0022] As revelações de toda a literatura de patente e não de patente mencionada são integralmente incorporadas ao presente como referência.
[0023] Da forma utilizada no presente, a expressão “invenção" ou "presente invenção" não se destina a ser limitadora, mas aplica-se geralmente a qualquer das invenções definidas nas reivindicações ou descritas no presente. Essas expressões são utilizadas de forma intercambiável no presente.
[0024] As expressões “sacarídeo”, “molécula de sacarídeo" e "carboidrato" são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam dissacarídeo ou oligossacarídeo, a menos que indicado em contrário. “Dissacarídeo” no presente designa um carboidrato que contém dois monossacarídeos ligados por uma ligação glicosídica. “Oligossacarídeo” designa no presente um carboidrato que consiste de dois a nove monossacarídeos, por exemplo, ligados por ligações glicosídicas. Oligossacarídeo pode também ser denominado no presente “oligômero”. Monossacarídeos que são compreendidos em um dissacarídeo ou oligossacarídeo, por exemplo, podem ser denominados “unidades de monossacarídeos” ou “unidades monoméricas”. Os monossacarídeos preferidos no presente são frutose e glicose.
[0025] As expressões “ligação glicosídica” e “união glicosídica” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam o tipo de ligação covalente que liga uma molécula de carboidrato a outra molécula de carboidrato.
[0026] As expressões “ligação alfa-1,3 glicosilglicose”, “ligação alfa-1,3 glicose-glicose” e “glicose-alfa 1,3-glicose” designam no presente ligação alfa-1,3-glicosídica entre duas moléculas de alfa-D-glicose. As expressões “ligação alfa-1,6 glicosilglicose”, “ligação alfa-1,6 glicose-glicose” e “glicose-alfa 1,6-glicose” designam no presente ligação alfa-1,6-glicosídica entre duas moléculas de alfa-D-glicose. Ligação(ões) alfa-1,3 glicosilglicose e/ou ligação(ões) alfa-1,6 glicosilglicose no presente é(são) compreendida(s) em um dissacarídeo ou oligossacarídeo em certas realizações.
[0027] As expressões “ligação alfa-1,5 glicosilfrutose”, “ligação alfa-1,5 glicose-frutose” e “glicosealfa-1,5-frutose” no presente designam ligação alfa-1,5-glicosídica entre uma molécula de alfa-D-glicose e uma molécula de frutose. Ligação alfa-1,5 glicosilfrutose no presente é compreendida em um dissacarídeo ou oligossacarídeo em certas realizações.
[0028] “Alfa-D-glicose” no presente pode também denominar-se “glicose”.
[0029] Dissacarídeo contendo uma ligação alfa-1,5 glicosilfrutose é denominado no presente leucrose. As expressões “leucrose” e “D- glicopiranosil alfa(1-5)-D-frutopiranose” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Leucrose possui a estrutura a seguir:
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[0030] As expressões “alfaglicosidase”, “alfa-1,4-glicosidase” e “alfa-D-glicosídeo glico-hidrolase” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Alfaglicosidases (EC 3.2.1.20) (“EC” designa o número da Comissão de Enzimas) foram reconhecidas anteriormente como enzimas que catalisam a liberação hidrolítica de resíduos de alfa-D-glicose (1,4)-ligados não redutores terminais de substratos de oligossacarídeos (por exemplo, dissacarídeos) e polissacarídeos. Alfaglicosidases são agora descritas no presente como também apresentando atividade hidrolítica para ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose. Enzimas transglicosidase e glicoamilase são exemplos de alfaglicosidases com essa atividade.
[0031] As expressões “transglicosidase” (TG), “enzima transglicosidase” e “1,4-alfaglucano 6-alfaglicosiltransferase” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Transglicosidases (EC.2.4.1.24) foram anteriormente reconhecidas como enzimas D-glicosiltransferase que catalisam reações hidrolíticas e de transferência mediante incubação com certos alfa-D- glico-oligossacarídeos. Transglicosidases são agora descritas no presente como também apresentando atividade hidrolítica para ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose.
[0032] As expressões “glicoamilase” (GA), “enzima glicoamilase” e “alfa-1,4-glucano glico-hidrolase” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Glicoamilases (EC 3.2.1.3) foram reconhecidas como enzimas com ação exo que catalisam hidrólise de ligações alfa-1,4 e alfa-1,6 glicosídicas de extremidades não redutoras de di, oligo e polissacarídeos que contêm glicose. Glicoamilases são agora descritas no presente como também possuindo atividade hidrolítica para ligações alfa-1,5 glicosilfrutose.
[0033] Hidrólise enzimática é um processo no qual uma enzima possibilita a divisão de ligações em moléculas com adição dos elementos de água. “Hidrólise”, “hidrólise de” ou “atividade hidrolítica para” uma ligação alfa- 1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose no presente designa hidrólise enzimática da ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosídica entre duas moléculas de glicose por uma alfaglicosidase tal como transglicosidase. Essa hidrólise ocorre durante o contato de um dissacarídeo ou oligossacarídeo que contém uma ligação alfa- 1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose com uma alfaglicosidase no presente sob condições apropriadas. “Reação de hidrólise” no presente compreende, portanto, pelo menos (i) um dissacarídeo ou oligossacarídeo que contém uma ou mais ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose e (ii) alfaglicosidase.
[0034] O termo “sacarificação” no presente designa um processo de rompimento de sacarídeo (dissacarídeo ou oligossacarídeo) em seus componentes de monossacarídeo. Sacarídeos podem ser sacarificados em uma reação de hidrólise no presente.
[0035] “Condições apropriadas” para o contato de sacarídeos (dissacarídeos ou oligossacarídeos) que compreendem pelo menos uma ligação alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 gllicosilglicose com alfaglicosidase no presente designam condições (tais como temperatura, pH, tempo) que sustentam a hidrólise de uma ou mais ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose no sacarídeo pela alfaglicosidase. Condições apropriadas podem compreender “condições aquosas”, por exemplo, que compreendem pelo menos 20% em peso de água. Condições aquosas podem caracterizar uma solução ou mistura. A solução ou mistura na qual um sacarídeo que compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6-glicosilglicose é colocada em contato com uma alfaglicosidase, por exemplo, e pode ser denominada reação de alfaglicosidase (por exemplo, reação de transglicosidase ou glicoamilase).
[0036] Enzima “mobilizada” no presente designa enzima que é ligada a um material insolúvel inerte. Métodos de preparação de enzimas imobilizadas são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 5.541.097, que é incorporada ao presente como referência.
[0037] As expressões “glucano” e “polímero de glucano” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam um polissacarídeo de monômeros de glicose ligados por ligações glicosídicas. “Alfaglucano” no presente designa um polímero de glucano que compreende pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de ligações alfaglicosídicas.
[0038] “Glucano insolúvel” no presente designa um polímero de glucano que não é solúvel em condições aquosas. Um exemplo de glucano insolúvel no presente é póli alfa-1,3-glucano com DP de pelo menos 8 ou 9. Reação de glicosiltransferase em certas realizações descritas no presente gera pelo menos um produto de glucano insolúvel.
[0039] As expressões “glucano solúvel”, “alfaglucano solúvel”, “fibra solúvel”, “fibra de glucano solúvel”, “fibra alimentar solúvel” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente para designar um polímero de glucano que é solúvel em condições aquosas. Exemplos de glucano solúvel no presente são certos oligossacarídeos, tais como polialfa-1,3-glucano com DP de menos de 8 e certos oligossacarídeos descritos nos Exemplos fornecidos abaixo. Reação de glicosiltransferase em certas realizações descritas no presente gera pelo menos um produto de glucano solúvel. Outro conjunto de características que caracteriza compostos de alfaglucano solúveis em certas realizações do presente é que eles são (i) oligômeros de glicose hidrossolúveis que possuem grau de polimerização de 3 ou mais; (ii) resistentes à digestão (ou seja, exibem capacidade de digestão muito lenta ou ausente) com pouca ou nenhuma absorção no intestino delgado humano e (iii) ao menos parcialmente fermentável no trato gastrointestinal inferior. A capacidade de digestão de uma composição de fibra de glucano solúvel pode ser medida utilizando, por exemplo, o método AOAC 2009.01.
[0040] As expressões “polímero de póli alfa-1,3-glucano” e “alfa- 1,3-glucano” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Póli alfa-1,3- glucano é um polímero que compreende unidades monoméricas de glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas, em que pelo menos cerca de 50% das ligações glicosídicas são ligações alfa-1,3-glicosídicas. A expressão “ligação alfa-1,3-glicosídica”, da forma utilizada no presente, designa o tipo de ligação covalente que liga moléculas de alfa-D-glicose entre si através dos carbonos 1 e 3 sobre anéis de alfa-D-glicose adjacentes.
[0041] O “peso molecular” de glucano no presente pode ser representado como peso molecular numérico médio (Mn) ou como peso molecular ponderal médio (Mw). Alternativamente, peso molecular pode ser representado em Daltons, gramas/mol, DPw (grau de polimerização médio em peso) ou DPn (grau de polimerização numérico médio). Vários meios são conhecidos na técnica para calcular medições de peso molecular tais como cromatografia de líquidos sob alta pressão (HPLC), cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) ou cromatografia de permeação de gel (GPC).
[0042] As expressões “enzima de glicosiltransferase”, “enzima gtf”, “catalisador de enzima gtf”, “gtf”, “glucano sucrase” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente. A atividade de enzima gtf no presente catalisa a reação de substrato de sacarose para elaborar os produtos glucano e frutose. Outros produtos (subprodutos) de uma reação gtf podem incluir glicose (resulta da hidrólise de glicose a partir do complexo intermediário de enzima glicosil-gtf), vários oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2- DP7) e leucrose (resulta da ligação de glicose do complexo intermediário de enzima glicosil-gtf a frutose). Formas do tipo selvagem de enzimas glicosiltransferase geralmente contêm (na direção N-terminal para C-terminal) um peptídeo de sinal, domínio variável, domínio catalítico e domínio de ligação de glucano. Glicosiltransferase no presente é classificada sob a família de glicosídeo hidrolase 70 (GH70) de acordo com o banco de dados CAZy (Enzimas Ativas de Carboidrato) (Cantarel et al, Nucleic Acids Res. 37: D233-238, 2009).
[0043] O termo “sacarose” no presente designa um dissacarídeo não redutor composto de uma molécula de alfa-D-glicose e uma molécula de beta-D-frutose ligada por uma ligação alfa-1,2-glicosídica. Sacarose é comumente conhecida como açúcar de cozinha.
[0044] As expressões “reação de síntese de glucano”, “reação de glucano”, “reação gtf” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam uma reação que é realizada por uma enzima glicosiltransferase. Reação de síntese de glucano utilizada no presente designa geralmente uma solução que compreende pelo menos uma enzima glicosiltransferase ativa em uma solução que compreende sacarose e água e, opcionalmente, outros componentes. Outros componentes que podem apresentar-se em uma reação de síntese de glucano no presente incluem, por exemplo, frutose, glicose, leucrose, oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7) e produto(s) de glucano solúvel(is). Além disso, uma ou mais enzimas de alfaglucano-hidrolase podem ser compreendidas em uma reação de síntese de glucano em alguns aspectos. Compreender-se-ia que certos produtos de glucano, tais como póli alfa-1,3-glucano com grau de polimerização (DP) de pelo menos 8 ou 9, são insolúveis em água e, portanto, não são dissolvidos em uma reação de síntese de glucano, mas sim podem estar presentes fora de solução.
[0045] Os termos “alfaglucano-hidrolase” e “glucano-hidrolase” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam uma enzima capaz de hidrolisar um oligômero de alfaglucano. Alfaglucano-hidrolase pode ser definida pela sua atividade de endo-hidrólise para certas ligações alfa-D- glicosídicas. Exemplos de enzimas alfaglucano-hidrolase no presente incluem dextranases (EC 3.2.1.11; capazes de endo-hidrolisar ligações glicosídicas alfa-1,6-ligadas), mutanases (EC 3.2.1.59; capazes de endo-hidrolisar ligações glicosídicas alfa-1,3-ligadas) e alternanases (EC 3.2.1, capazes de dividir alternan endo-hidroliticamente). Vários fatores, incluindo, mas sem limitações, nível de ramificação, tipo de ramificação e o comprimento de ramo relativo em certos alfaglucanos, podem prejudicar a capacidade de alfaglucano-hidrolase de endo-hidrolisar algumas ligações glicosídicas.
[0046] O “percentual de sólidos secos” de reação de síntese de glucano designa o percentual em peso de todos os açúcares em uma reação de síntese de glucano. O percentual de sólidos secos de uma reação gtf pode ser calculado, por exemplo, com base na quantidade de sacarose utilizada para preparar a reação.
[0047] “Fração” de uma reação de síntese de glucano no presente designa uma parte de solução líquida de uma reação de síntese de glucano. Fração pode ser uma parte ou toda a solução líquida de uma reação de síntese de glucano e foi separada de um produto de glucano solúvel ou insolúvel sintetizado na reação. Fração pode ser opcionalmente denominada “líquido original” em realizações nas quais o produto é um produto de glucano insolúvel (sólido). Um exemplo de fração é um filtrado de uma reação de síntese de glucano. Como uma fração pode conter açúcares dissolvidos tais como sacarose, frutose, glicose, leucrose, oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7), uma fração pode também ser denominada “solução de açúcar misturado” derivada de uma reação de síntese de glucano. “Fração hidrolisada” no presente designa uma fração que foi tratada com uma alfaglicosidase no presente para hidrolisar leucrose e/ou oligossacarídeos presentes na fração.
[0048] As expressões “filtrado”, “filtrado de reação de glucano”, “filtrado de glucano” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam uma fração que foi retirada por meio de filtragem de um produto de glucano sólido sintetizado em uma reação de síntese de glucano. “Filtrado hidrolisado” no presente designa um filtrado que tenha sido tratado com uma alfaglicosidase no presente para hidrolisar leucrose e/ou oligossacarídeos presentes no filtrado.
[0049] As expressões “percentual em volume” “volume percentual”, “% vol”, “% v/v” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente. O percentual em volume de um soluto em uma solução pode ser determinado utilizando a fórmula: [(volume de soluto)/(volume de solução)] x 100%.
[0050] As expressões “percentual em peso”, “percentual em peso (% peso)”, “percentual em peso-peso (% p/p)” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente. Percentual em peso designa o percentual de um material com base em massa conforme compreendido em uma composição, mistura ou solução. Todos os percentuais do presente são percentuais em peso, a menos que indicado em contrário.
[0051] Da forma utilizada no presente, “índice de polidispersão”, “PDI”, “índice de heterogeneidade”, “dispersão” e similares designam uma medida de distribuição de massa molecular em uma dada amostra de polímero (por exemplo, oligômero de glicose tal como alfaglucano solúvel) e pode ser calculado dividindo-se o peso molecular ponderal médio pelo peso molecular numérico médio (PDI = Mw/Mn).
[0052] Os termos “aumento”, “ampliação” e “aprimoramento” são utilizados de forma intercambiável no presente. Estes termos designam quantidade ou atividade maior, tal como quantidade ou atividade levemente maior que a quantidade ou atividade original ou quantidade ou atividade em grande excesso em comparação com a quantidade ou atividade original, incluindo todas as quantidades ou atividades entre elas. Alternativamente, esses termos podem designar, por exemplo, quantidade ou atividade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% maior que a quantidade ou atividade com a qual a quantidade ou atividade maior está sendo comparada.
[0053] As expressões “identidade de sequências” ou “identidade”, da forma utilizada no presente com relação a sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, designam os resíduos de aminoácidos ou bases de ácidos nucleicos em duas sequências que são idênticas quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Desta forma, “percentual de identidade de sequências” ou “percentual de identidade” indica o valor determinado por meio da comparação de duas sequências alinhadas idealmente ao longo de uma janela de comparação, em que a parte da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, intervalos) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições nem exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado por meio de determinação da quantidade de posições em que o resíduo de aminoácido ou base de ácido nucleico idêntico ocorre nas duas sequências para gerar o número de posições coincidentes, dividindo-se o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se os resultados por cem para gerar o percentual de identidade de sequências.
[0054] O algoritmo Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico (BLAST), que é disponível online no website do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI), pode ser utilizado, por exemplo, para medir o percentual de identidade entre duas ou mais das sequências de polinucleotídeos (algoritmo BLASTN) ou sequências de polipeptídeos (algoritmo BLASTP) descritas no presente. Alternativamente, o percentual de identidade entre sequências pode ser realizado utilizando um algoritmo Clustal (por exemplo, ClustalW ou ClustalV). Para diversos alinhamentos utilizando o método de alinhamento Clustal, os valores padrão podem corresponder a PENALIDADE DO INTERVALO = 10 e PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 10. Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando método Clustal podem ser COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros podem ser COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4. Ainda alternativamente, o percentual de identidade entre sequências pode ser realizado utilizando um algoritmo EMBOSS (por exemplo, agulha), com parâmetros tais como ABERTURA DE INTERVALO = 10, EXTENSÃO DE INTERVALO = 0,5, PENALIDADE DE FINAL DE INTERVALO = falso, ABERTURA DE FINAL DE INTERVALO = 10, EXTENSÃO DE FINAL DE INTERVALO = 0,5 utilizando uma matriz BLOSUM (por exemplo, BLOSUM62).
[0055] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeos são descritas no presente como características de certas realizações. Podem ser utilizadas variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70-85%, 85-90% ou 90-95% idênticas às sequências descritas no presente. Alternativamente, sequências de aminoácidos variantes podem ter pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência descrita no presente. Uma sequência de aminoácido variante do presente possui a mesma função/atividade da sequência descrita ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função/atividade de uma sequência descrita.
[0056] O termo “isolado”, da forma utilizada em certas realizações, designa qualquer componente celular que é completamente separado da sua fonte nativa (por exemplo, molécula de polipeptídeo ou polinucleotídeo isolada). Em alguns casos, uma molécula de polipeptídeo ou polinucleotídeo isolada é parte de uma composição maior, sistema tampão ou mistura de reagentes. A molécula de polipeptídeo ou polinucleotídeo isolada pode ser compreendida, por exemplo, em uma célula ou organismo de forma heteróloga. Outro exemplo é uma alfaglicosidase isolada (por exemplo, glicoamilase, transglicosidase) ou enzima glicosiltransferase. As reações de enzima (por exemplo, reação de alfaglicosidase, reação de glicosiltransferase) descritas no presente são processos sintéticos e não de ocorrência natural.
[0057] Realizações da presente invenção referem-se a um método de hidrólise de uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo que compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose. O sacarídeo é dissacarídeo ou oligossacarídeo. Este método compreende o contato do sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas. Na etapa de contato, a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo. Devido a essa hidrólise, a quantidade do sacarídeo é reduzida em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato. Este método de hidrólise pode, portanto, ser alternativamente denominado método de redução da quantidade de sacarídeos em composições.
[0058] Significativamente, acredita-se que seja anteriormente desconhecido que enzimas alfaglicosidase podem hidrolisar ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose. Reações de alfaglicosidase após esse método de hidrólise podem ser utilizadas, portanto, para remover subprodutos de oligossacarídeos que contêm ligações de glicose-glicose de uma reação de síntese de glucano e/ou uma fração dela obtida. Essa remoção representa aprimoramento sobre processos químicos de remoção de subprodutos, tais como hidrólise ácida, que podem resultar em degradação de produto glucano. Por fim, uma fração de reação de glucano que é tratada de acordo com o método de hidrólise acima é mais adequada para aplicações posteriores tais como fermentação, por exemplo, pois o nível de monossacarídeos de glicose aumenta na fração. Monossacarídeos são geralmente mais tratáveis para processos posteriores em comparação com subprodutos de oligossacarídeos.
[0059] Alfaglicosidase (EC 3.2.1.20) é utilizada em realizações do presente para hidrolisar ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo que compreende pelo menos uma dessas ligações. Reconheceu-se anteriormente que enzimas alfaglicosidase catalisam a liberação hidrolítica de resíduos de alfa-D-glicose (1,4)-ligados não redutores terminais de substratos de oligossacarídeos (por exemplo, dissacarídeos) e polissacarídeos. Estas enzimas são agora descritas no presente como também apresentando, por exemplo, atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose.
[0060] Alfaglicosidase pode ser de qualquer fonte (tal como planta, animal, micróbio tal como bactéria ou fungo/levedura), por exemplo, tal como as fontes descritas abaixo, das quais pode ser derivada uma transglicosidase e/ou glicoamilase. Alfaglicosidase, por exemplo, pode ser alfaglicosidase fúngica. Outros exemplos de alfaglicosidases apropriadas no presente incluem as descritas nas Patentes Norte-Americanas n° 6.355.467, 5.922.580, 5.795.766, 5.763.252 e 8.633.006, todas as quais são incorporadas ao presente como referência.
[0061] Uma enzima alfaglicosidase, em certas realizações do presente, pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou a de DIAZYME RDF ULTRA (DuPont Industrial Biosciences). Alternativamente, uma enzima alfaglicosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID N° 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou à sequência de aminoácidos de DIAZYME RDF ULTRA e possui atividade hidrolítica para ligações de alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose em sacarídeos. Várias das sequências acima, por exemplo, são alfaglicosidases maduras que não contêm um peptídeo de sinal N-terminal. Para essas sequências, compreender-se-ia que uma metionina inicial N- terminal seria tipicamente adicionada (se necessário) (diretamente ou por meio de uma sequência de aminoácidos heterólogos interveniente tal como um epítopo) caso a expresse sem utilizar um peptídeo de sinal (tal como com um sistema de expressão no qual a enzima é expressa de forma intracelular e obtida de um lisato celular).
[0062] Transglicosidase (EC 2.4.1.24; 1,4-alfaglucano 6- alfaglicosiltransferase) pode ser utilizada em certas realizações do presente como alfaglicosidase para hidrolisar ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo que compreende pelo menos uma dessas ligações. Esta classe de enzimas foi reconhecida anteriormente como enzimas D-glicosiltransferase que catalisam reações hidrolíticas e de transferência mediante incubação com certos alfa-D-glico-oligossacarídeos. Transglicosidases são agora descritas no presente como também apresentando atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose.
[0063] Enzima transglicosidase no presente pode ser derivada de qualquer fonte microbiana, tal como bactéria ou fungo. Exemplos de transglicosidases fúngicas incluem, mas sem limitações, as de espécies de Trichoderma (por exemplo, T. reesei), espécies de Aspergillus e espécies de Neosartorya (por exemplo, N. fischeri). Exemplos de espécies de Aspergillus das quais pode-se derivar uma transglicosidase incluem, mas sem limitações, A. niger, A. awamori, A. oryzae, A. terreus, A. clavatus, A. fumigatus e A. nidulans. Outros exemplos de enzimas transglicosidase úteis no presente são descritos em Barker et al (1953, J. Chem. Soc. 3588-3593); Pazur et al (1986, Carbohydr. Res. 149: 137-147), Nakamura et al (1997, J. Biotechnol. 53: 75-84) e Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514, todos os quais são incorporados ao presente como referência. Ainda outros exemplos de enzimas transglicosidase úteis no presente são as termoestáveis; a Patente Norte-Americana n° 4.689.296, que é incorporada ao presente como referência, descreve um processo de produção de transglicosidase termoestável. Ainda outros exemplos de enzimas transglicosidase úteis no presente podem ser quaisquer do banco de dados GENBANK (NCBI), tais como os números de acesso: D45356 (GID: 2645159, A. niger), BAD06006.1 (GID: 4031328, A. awamori), BAA08125.1 (GID: 1054565, A. oryzae), XP_001210809.1 (GID: 115492363, A. terreus), XP_001216899.1 (GID: 115433524, A. terreus), XP_001271891.1 (GID: 121707620, A. clavatus), XP_751811.1 (GID: 70993928, A. fumigatus), XP_659621.1 (GID: 67523121, A. nidulans), XP_001266999.1 (GID: 119500484, N. fischeri) e XP_001258585.1 (GID: 119473371, N. fischeri), todos os quais são incorporados ao presente como referência. Alternativamente, transglicosidase no presente pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de transglicosidase descritas acima e possui atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose em sacarídeos. Todas as transglicosidases acima, quando utilizadas em uma reação de hidrólise no presente, encontram-se preferencialmente em forma madura que não possui um peptídeo de sinal N- terminal.
[0064] Enzima transglicosidase em certas realizações do presente pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1 (TG L-2000), que é uma transglicosidase de A. niger (Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514). Alternativamente, transglicosidase pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 ou 99% idêntica a SEQ ID N° 1 e possui atividade hidrolítica para ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose em sacarídeos. Qualquer um dentre SEQ ID N° 1 ou suas variantes pode ser produzido seguindo as descrições do Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514, por exemplo, que é expressamente incorporado ao presente como referência. SEQ ID N° 1 é uma transglicosidase madura que não contém um peptídeo de sinal N-terminal. Como SEQ ID N° 1 não começa com um resíduo de metionina, compreender-se-ia que uma metionina inicial N- terminal seria tipicamente adicionada a SEQ ID N° 1 (diretamente ou por meio de uma sequência de aminoácidos heterólogos interveniente tal como um epítopo) caso a expresse sem utilizar um peptídeo de sinal (tal como com um sistema de expressão no qual a enzima é expressa de forma intracelular e obtida de um lisato celular).
[0065] Glicoamilase (EC 3.2.1.3; alfa-1,4-glucano glico-hidrolase) pode ser utilizada em certas realizações do presente como alfaglicosidase. Glicoamilase pode ser incluída, por exemplo, com transglicosidase em cada uma das condições/configurações de reação de hidrólise descritas no presente. Neste contexto, pode-se utilizar glicoamilase para hidrolisar (i) uma ligação alfa-1,5 glicosilfrutose e/ou (ii) uma ligação alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose presente em um sacarídeo que contém qualquer um desses tipos de ligação. Esta classe de enzimas foi reconhecida anteriormente como enzimas com ação exo que catalisam hidrólise de ligações alfa-1,4 e alfa-1,6 glicosídicas de extremidades não redutoras de di, oligo e polissacarídeos que contêm glicose. Glicoamilases são agora descritas no presente como também apresentando atividade hidrolítica para ligações alfa-1,5 glicosilfrutose. Em certas realizações, alfaglicosidase não é glicoamilase.
[0066] Enzima glicoamilase no presente pode ser derivada de qualquer fonte microbiana, tal como bactéria ou fungo. Exemplos de glicoamilases bacterianas incluem, mas sem limitações, as de espécies de Bacillus (por exemplo, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis e B. thuringiensis) e espécies de Streptomyces (por exemplo, S. lividans). Exemplos de glicoamilases fúngicas incluem, mas sem limitações, as de espécies de Trichoderma (por exemplo, T. reesei, T. longibrachiatum, T. strictipilis, T. asperellum, T. konilangbra e T. hazianum), espécies de Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. clavatus, A. nidulans, A. kawachi e A. awamori), espécies de Rhizopus (por exemplo, R. oryzae e R. niveus), espécies de Talaromyces (por exemplo, T. emersonii, T. thermophilus e T. duponti), espécies de Mucor, espécies de Hypocrea (por exemplo, H. gelatinosa, H. orientalis, H. vinosa e H. citrina), espécies de Fusarium (por exemplo, F. oxysporum, F. roseum e F. venenatum), espécies de Neurospora (por exemplo, N. crassa), espécies de Humicola (por exemplo, H. grisea, H. insolens e H. lanuginose), espécies de Penicillium (por exemplo, P. notatum e P. chrysogenum) e espécies de Saccharomycopsis (por exemplo, S. fibuligera). Exemplos dessas glicoamilases bacterianas e fúngicas para uso no presente são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2013/0102035, que é incorporado ao presente como referência. Outros exemplos de enzimas glicoamilase úteis no presente são descritos em Svensson et al (1983, Carlsberg Res. Commun. 48: 529-544), Boel et al (1984, EMBO J. 3: 1097-1102); Hayashida et al (1989, Agric. Biol. Chem. 53: 923-929); Patente Norte-Americana n° 5.024.941, Patente Norte-Americana n° 4.794.175, Patente Norte-Americana n° 4.247.637, Patente Norte-Americana n° 6.255.084, Patente Norte-Americana n° 6.620.924, Ashikari et al (1986, Agric. Biol. Chem. 50: 957-964), Ashikari et al (1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 129-133), Patente Norte-Americana n° 4.863.864; Patente Norte-Americana n° 4.618.579, Houghton-Larsen et al (2003, Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 210-217) e Patente Norte-Americana n° 7.413.887, todos os quais são incorporados ao presente como referência. Alternativamente, glicoamilase no presente pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de glicoamilase descritas acima e possui atividade hidrolítica para (i) ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e/ou (ii) ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose. Todas as glicoamilases acima, quando utilizadas em uma reação de hidrólise no presente, encontram-se preferencialmente em forma madura que não possui um peptídeo de sinal N- terminal. Glicoamilases disponíveis comercialmente e úteis no presente incluem, por exemplo, OPTIDEX L-400, GC 147, GC 321, G ZYME G990 4X, OPTIMAX 7525, DEXTROZYME, DISTILLASE e GLUCZYME.
[0067] Enzimas glicoamilase em certas realizações no presente podem compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 2 (GC 321), que é uma glicoamilase de T. reesei. Alternativamente, glicoamilase pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 ou 99% idêntica a SEQ ID N° 2 e possui atividade hidrolítica para (i) ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e/ou (ii) ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose. Qualquer um dentre SEQ ID N° 2 ou suas variantes pode ser produzido seguindo as descrições da Patente Norte-Americana n° 7.413.887 ou do Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2013/0102035, por exemplo, que são expressamente incorporados ao presente como referência. SEQ ID N° 2 é uma glicoamilase madura que não contém um peptídeo de sinal N-terminal. Como SEQ ID N° 2 não começa com um resíduo de metionina, compreender-se-ia que uma metionina inicial N-terminal seria tipicamente adicionada a SEQ ID N° 2 (diretamente ou por meio de uma sequência de aminoácidos heterólogos interveniente tal como um epítopo) caso a expresse sem utilizar um peptídeo de sinal (tal como com um sistema de expressão no qual a enzima é expressa de forma intracelular e obtida de um lisato celular).
[0068] Enzimas alfaglicosidase do presente, tais como transglicosidase ou glicoamilase, podem ser de uma fonte comercial (por exemplo, DuPont Industrial Biosciences/Genencor, Estados Unidos; Megazyme International, Irlanda; Amano Enzyme Inc., Japão). Alternativamente, essa enzima pode ser produzida por qualquer meio conhecido na técnica, tal como conforme descrito no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514, Patente Norte-Americana n° 7.413.887 ou Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2013/0102035, que são incorporados ao presente como referência. Alfaglicosidase pode ser produzida de forma recombinante, por exemplo, em um sistema de expressão heterólogo, tal como um sistema de expressão heterólogo microbiano ou fúngico. Exemplos de sistemas de expressão heterólogos incluem sistemas bacterianos (por exemplo, E. coli, Bacillus sp) e eucarióticos. Sistemas eucarióticos podem empregar, por exemplo, sistemas de expressão de leveduras (por exemplo, Pichia sp e Saccharomyces sp) ou fúngica (por exemplo, Trichoderma sp, tal como T. reesei, espécies de Aspergillus, tais como A. niger). A transglicosidase de SEQ ID N° 1, glicoamilase de SEQ ID N° 2 e suas variantes podem ser expressas, por exemplo, em um hospedeiro de T. reesei.
[0069] As enzimas alfaglicosidase, quando utilizadas em uma reação de hidrólise no presente, encontram-se preferencialmente em forma madura que não possui um peptídeo de sinal N-terminal. Um sistema de expressão para produzir uma enzima alfaglicosidase madura no presente pode empregar um polinucleotídeo codificador de enzima que compreende adicionalmente uma sequência que codifica um peptídeo de sinal N-terminal para dirigir secreção extracelular. O peptídeo de sinal nessas realizações é dividido da enzima durante o processo de secreção. O peptídeo de sinal pode ser nativo ou heterólogo para a transglicosidase ou glicoamilase. Alternativamente, uma enzima alfaglicosidase em forma madura pode ser fornecida por meio da sua expressão sem utilizar um peptídeo de sinal, tal como com um sistema de expressão em que a enzima é expressa de forma intracelular e obtida de lisato celular. Em qualquer cenário (secreção ou expresso de forma intracelular), uma sequência de aminoácidos heteróloga tal como um epítopo pode ser opcionalmente incluída no terminal N da alfaglicosidase.
[0070] Uma enzima alfaglicosidase em certas realizações pode ser fornecida em uma reação de hidrólise no presente por meio do uso direto de células que expressam a(s) enzima(s). Em outras palavras, alfaglicosidase que é colocada em contato com um sacarídeo pode estar presente em virtude da sua expressão a partir de uma célula colocada nas condições apropriadas para hidrólise. Essa célula poderá, portanto, ser utilizada no lugar da adição de preparação de alfaglicosidase isolada para a reação de hidrólise. Uma célula para este propósito pode ser, por exemplo, uma célula bacteriana, de levedura ou fúngica. Exemplos de levedura incluem as dos gêneros Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae), Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera e Schwanniomyces. Outros sistemas de expressão úteis no presente são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2013/0323822, que é incorporado ao presente como referência.
[0071] Sacarídeo no presente compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose. Dependendo, portanto, do comprimento do sacarídeo, ele pode conter, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito ligações alfa-1,5 glicosilglicose. O sacarídeo contém preferencialmente uma, duas ou três ligações deste tipo. Sacarídeo, em outras realizações preferidas, contém apenas ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose. Em outras realizações, sacarídeo pode conter uma ou mais ligações alfa-1,5 glicosilfrutose.
[0072] Como sacarídeo no presente compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose, o sacarídeo compreende pelo menos duas unidades de glicose. Em certas realizações, o sacarídeo do presente compreende apenas unidades de glicose, ou unidades de glicose e frutose. Essa composição pode caracterizar os subprodutos de dissacarídeo e oligossacarídeo de uma reação de síntese de glucano. Alternativamente, sacarídeo no presente pode conter outros monossacarídeos além de glicose e frutose, tais como galactose, ribose e xilose.
[0073] Sacarídeo hidrolisado em certas realizações da presente invenção pode ser um oligossacarídeo. Oligossacarídeo no presente pode conter, por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove unidades de monossacarídeos. Como será compreendido na técnica, oligossacarídeo no presente pode ser indicado com relação ao seu número de grau de polimerização (DP), que especifica a quantidade de unidades monoméricas no oligossacarídeo. Um oligossacarídeo DP3 contém, por exemplo, três unidades monoméricas. O oligossacarídeo pode, portanto, ser, por exemplo, um oligossacarídeo DP3, DP4, DP5, DP6, DP7, DP8 ou DP9. O DP de um sacarídeo em certas realizações é de 3 a 7 (ou seja, DP 3-7).
[0074] Oligossacarídeo no presente com três ou mais unidades de monossacarídeos, por exemplo, pode compreender outras ligações além de pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose. Pode haver também, por exemplo, uma ou mais ligações alfa-1,5 glicosilfrutose no oligossacarídeo, que também são susceptíveis a hidrólise por alfaglicosidases conforme exibido no presente.
[0075] Um oligossacarídeo compreende, em certas realizações, somente monômeros de glicose ligados por ligações glicosídicas alfa-1,3 e/ou alfa-1,6. Esses oligossacarídeos compreendem apenas, portanto, ligações alfa- 1,3 glicosilglicose e/ou alfa-1,6-glicosilglicose. Exemplos desse oligossacarídeo contêm apenas ligações alfa-1,3 ou ligações alfa-1,6. Um oligossacarídeo pode compreender pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de ligações glicosilglicose em certas realizações. Em outras realizações, pode haver cerca de 75-85% de ligações alfa-1,3 glicosilglicose e cerca de 15-25% de ligações alfa-1,6 glicosilglicose em oligossacarídeos do presente. Alternativamente, os oligossacarídeos do presente podem compreender qualquer percentual (qualquer valor inteiro de 1% a 99%) de ligações alfa-1,3 glicosilglicose e qualquer percentual (qualquer valor inteiro de 1% a 99%) de ligações alfa-1,6 glicosilglicose, desde que o total desses percentuais seja de não mais de 100%. Qualquer um desses oligossacarídeos pode encontrar-se em uma fração de reação de síntese de glucano que produz (i) um alfaglucano insolúvel (por exemplo, póli alfa-1,3- glucano) ou (ii) um produto de alfaglucano solúvel, por exemplo. Esse teor de ligação pode caracterizar (i) cada oligossacarídeo individualmente ou (ii) um grupo de oligossacarídeos (ou seja, teor médio de ligação). Oligossacarídeos que compreendem apenas monômeros de glicose ligados por ligações glicosídicas alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 podem ser, por exemplo, DP2-DP7 ou DP3- DP7. Dever-se-á compreender que a distribuição exata de ligações em oligossacarídeos pode variar dependendo das condições da reação de síntese de glucano (por exemplo, enzima gtf) que gera subprodutos de oligossacarídeos. Dever-se-á compreender adicionalmente que a distribuição de ligação exata não é fundamental para os métodos descritos no presente.
[0076] Os Exemplos do presente demonstram que alfaglicosidases (por exemplo, enzimas transglicosidase e glicoamilase) podem hidrolisar (i) leucrose, que compreende uma ligação alfa-1,5 glicosilfrutose; e (ii) oligossacarídeos que compreendem apenas ligações alfa-1,3 glicosilglicose e/ou alfa-1,6 glicosilglicose. Pode-se utilizar, portanto, uma alfaglicosidase, por exemplo, em reação de hidrólise de ligações alfa-1,5 glicosilfrutose, ligações alfa-1,3-glicosilglicose e/ou ligações alfa-1,6-glicosilglicose.
[0077] Pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo do presente pode ser hidrolisada por uma alfaglicosidase no presente. Alternativamente, acredita-se, por exemplo, que duas, três, quatro, cinco ou mais dessas ligações em um sacarídeo possam ser hidrolisadas por uma alfaglicosidase. A hidrólise de pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose pode ocorrer na extremidade não redutora do sacarídeo em certas realizações.
[0078] A quantidade de sacarídeo é reduzida no método de hidrólise descrito em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato. Essa redução resulta da divisão hidrolítica de pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose no sacarídeo. A quantidade (por exemplo, concentração) de sacarídeo após a etapa de contato em um método de hidrólise do presente pode ser de menos de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% (ou qualquer valor inteiro de 1% a 90%) da quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato (antes do contato de alfaglicosidase com um sacarídeo sob condições apropriadas).
[0079] A quantidade de sacarídeo é reduzida no método de hidrólise descrito em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato. Compreender-se-á que essa comparação pode ser realizada em qualquer número de formas. A concentração de sacarídeo pode ser medida, por exemplo, antes e depois da realização do método de hidrólise. Alternativamente, a comparação pode ser realizada com relação a uma reação de controle que possui as mesmas condições, exceto pela ausência de adição de alfaglicosidase conforme descrito no presente à reação controle.
[0080] Alfaglicosidase em certas realizações do presente pode ser imobilizada. A enzima pode ser imobilizada utilizando qualquer método e/ou meio conhecido na técnica, tal como os descritos nas Patentes Norte- Americanas n° 5.541.097 e 4.713.333, ambas as quais são incorporadas ao presente como referência. Uma ou mais enzimas podem ser imobilizadas, por exemplo, por meio de contato da(s) enzima(s) com uma solução de material reativo para amina (por exemplo, glutaraldeído) para formar um aduto (por exemplo, aduto de enzima e glutaraldeído), após o quê o aduto é ligado a um veículo sólido que tenha sido tratado com poliamina (por exemplo, polietilenoimina, tal como EPOMIN P-1050).
[0081] Um veículo sólido (suporte sólido) ao qual uma enzima alfaglicosidase pode ser imobilizada em certas realizações pode ser um material orgânico ou inorgânico. Esses materiais incluem, por exemplo, gama- alumina, titânia, carvão granular ativado, terra diatomácea granular, esferas de vidro, vidro poroso, pedra pomes, sílica gel, óxido metálico e óxido de alumínio.
[0082] Pode-se utilizar poliamina para tratar um veículo sólido, de tal forma que a exposição subsequente do veículo sólido a um aduto que compreende uma enzima e material reativo a amina gera ligação da enzima ao veículo sólido. Exemplos de poliaminas úteis no presente incluem polietilenodiamina, polietilenoimina (por exemplo, polidietilenotriamina, politrietilenotetramina, polipentaetileno-hexamina, póli-hexametilenodiamina), polimetilenodiciclo-hexilamina, polimetilenodianilina, politetraetilenopentamina, polifenilenodiamina e misturas de dois ou mais desses compostos de poliamina. Poliaminas preferidas são hidrossolúveis e/ou possuem peso molecular de cerca de 500 a 100.000 Daltons. Polietilenoimina tal como EPOMIN P-1050 pode ser utilizada em certas realizações.
[0083] Material reativo para amina útil para preparar um aduto que compreende uma enzima no presente pode ser, por exemplo, um aldeído, haleto orgânico, anidrido, composto azo, isotiocianato e/ou isocianato. Exemplos desses materiais reativos para amina incluem glutaraldeído, succinodialdeído, tereftaldeído, ácido bisdiazobenzidino-2,2’-dissulfônico, 4,4’- difluoro-3,3’-dinitrodifenilsulfona, ácido difenil-4,4’-ditiocianato-2,2’-dissulfônico, 3-metoxidifenilmetano-4,4’-di-isocianato, tolueno-2-isocianato-4-isotiocianato, tolueno-2,4-di-isotiocianato, diazobenzidina, diazobenzidino-3,3’-dianisidina, N,N’-hexametileno bisiodoacetamida, di-isocianato de hexametileno, cloreto cianúrico e/ou 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno. Preferencialmente, o material reativo para amina é um aldeído tal como glutaraldeído.
[0084] Uma enzima alfaglicosidase em adução com um composto reativo para amina pode ser colocada em contato com um veículo sólido tratado com poliamina, de forma a imobilizar a enzima sobre o veículo sólido. Uma enzima imobilizada no presente pode ser empregada em diversos sistemas reatores, tal como em uma coluna (por exemplo, coluna embalada) ou reator de tanque agitado, para realizar reação de hidrólise conforme descrito no presente.
[0085] Condições apropriadas para contato de um sacarídeo do presente com uma alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase) são as condições que sustentam a hidrólise de uma ou mais ligações alfa-1,3 ou alfa- 1,6 glicosilglicose no sacarídeo pela alfaglicosidase. Exemplos de condições apropriadas são descritos nos Exemplos abaixo. Condições (por exemplo, temperatura, pH, hora) de contato de alfaglicosidase com um substrato de açúcar também são descritas no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2008/0229514, Patente Norte-Americana n° 7.413.887 e no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2013/0102035 (todos os quais são incorporados ao presente como referência) e podem também ser aplicáveis ao método de hidrólise descrito.
[0086] Os dissacarídeos e oligossacarídeos no método de hidrólise descrito são tipicamente solúveis em água ou solução aquosa. O contato de sacarídeo no presente com uma alfaglicosidase é, portanto, preferencialmente realizado sob condições apropriadas que são aquosas, nas quais o sacarídeo é dissolvido. Condições aquosas podem caracterizar uma solução ou mistura que compreende pelo menos cerca de 20% em peso de água. Alternativamente, as condições aquosas do presente são, por exemplo, pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 ou 95% em peso de água (ou qualquer valor inteiro de 20 a 95% em peso). Condições aquosas podem compreender adicionalmente um tampão, por exemplo, tal como tampão ácido, neutro ou alcalino, em concentração apropriada e selecionado com base na faixa de pH fornecida pelo tampão. Exemplos de tampões/agentes tampão incluem citrato, acetato (por exemplo, acetato de sódio), KH2PO4, MOPS, CHES, borato, carbonato de sódio e bicarbonato de sódio.
[0087] O pH de uma reação de hidrólise do presente pode ser, por exemplo, de cerca de 3,0 a 9,0. O pH de reação de hidrólise pode ser, por exemplo, de cerca de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0. Alternativamente, o pH pode ser de cerca de 4-5. Os métodos de definição de pH incluem o uso de tampões, álcalis e/ou ácidos, por exemplo, e são bem conhecidos na técnica.
[0088] A temperatura de uma reação de hidrólise do presente pode ser, por exemplo, de cerca de 20 °C a cerca de 80 °C. A temperatura da reação de hidrólise pode ser, por exemplo, de cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou 80 °C (ou qualquer valor inteiro de 20 a 80 °C). Prefere-se temperatura de hidrólise de cerca de 60 °C, 65 °C ou 60-65 °C em certas realizações.
[0089] Reação de hidrólise no presente pode ser realizada, por exemplo, por um período de pelo menos cerca de dez minutos a cerca de noventa horas. O tempo de uma reação de hidrólise pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 ou 90 horas (ou qualquer número inteiro de 0,5 a 72 horas). Em certas realizações, pode-se realizar, por exemplo, reação de hidrólise em menos de quatro horas (por exemplo, 0,5-4 horas). O período de tempo necessário para atingir nível desejado de hidrólise variará com base nas condições exatas utilizadas e seria compreendido pelos técnicos no assunto. Aumento da quantidade de enzima adicionada a uma reação ou imobilizada sobre um suporte sólido utilizado em uma reação reduzirá o tempo de contato.
[0090] Uma ou mais enzimas alfaglicosidase do presente podem ser utilizadas em uma reação de hidrólise em certas realizações. Transglicosidase e glicoamilase, por exemplo, podem ser utilizadas em reações. A quantidade de alfaglicosidase em uma reação de hidrólise do presente pode ser, por exemplo, de mais/menos 10% a 20% (ou 5% a 10%) de qualquer uma das quantidades utilizadas nos Exemplos abaixo (por exemplo, Exemplo 2). Alternativamente, cerca de 0,1-0,5% em volume ou 0,1-1,0% em volume de alfaglicosidase podem ser utilizados em uma reação de hidrólise. Ainda alternativamente, alfaglicosidase no presente pode ser utilizada a cerca de, ou pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 ppm em uma reação de hidrólise. Uma unidade de transglicosidase (TGU) pode ser definida, por exemplo, como a quantidade de uma enzima transglicosidase que produzirá um micromol de panose por minuto sob as condições do teste a seguir. A atividade de transglicosidase pode ser testada, por exemplo, conforme segue: transglicosidase é trazida em 100 mM de tampão acetato de sódio, pH 4,5, contendo 4 mM de paranitrofenilalfaglicosídeo e 1 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA). Após trinta minutos de incubação a 30 °C, a reação é encerrada por meio da adição de volume igual de 1 M de carbonato de sódio e OD405 é registrado. Uma unidade de glicoamilase (GAU) pode ser definida, por exemplo, como a quantidade de enzima glicoamilase que produzirá 1 g de açúcar redutor, calculado na forma de glicose por hora a partir de um substrato de amido solúvel (4% DS (grau de substituição)) sob pH 4,2 e 60 °C.
[0091] A concentração inicial de sacarídeo em reação de hidrólise em certas realizações da presente invenção pode ser, por exemplo, de cerca de 1% em peso a 50% em peso. A concentração de leucrose pode ser, por exemplo, de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40% em peso (ou qualquer valor inteiro de 5 a 40% em peso). Como outro exemplo, a concentração de um ou mais oligossacarídeos (por exemplo, DP2, DP3, DP4, DP2-DP7, DP3-DP7) em uma reação de hidrólise do presente pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15% em peso. Os técnicos no assunto reconheceriam que a concentração total de açúcares (que inclui dissacarídeos e oligossacarídeos) pode apresentar impacto sobre a atividade de enzimas alfaglicosidase; concentrações preferidas de açúcares totais em uma reação de hidrólise para maximizar a atividade de enzimas pode ser de menos de 50% em peso de sólidos secos (DS), com concentração de preferência superior de 20-35% em peso DS em alguns aspectos.
[0092] Condições apropriadas em certas realizações para contato de um sacarídeo com uma alfaglicosidase do presente podem compreender (i) reação de síntese de glucano ou (ii) uma fração obtida de uma reação de síntese de glucano, em que o sacarídeo é um subproduto da reação de síntese de glucano. Em outras palavras, reação de hidrólise no presente pode ser conduzida no contexto de reação de síntese de glucano ou uma fração de reação de síntese de glucano, embora seja tipicamente conduzida nesta última. Reação de síntese de glucano no presente pode gerar, por exemplo, um ou mais produtos de alfaglucano solúveis e/ou insolúveis. Reação de síntese de glucano pode ser caracterizada em algumas realizações do presente, por exemplo, como "reação de síntese de alfaglucano".
[0093] Reação de síntese de glucano designa geralmente uma solução que compreende pelo menos sacarose, água e uma enzima de glicosiltransferase ativa e, opcionalmente, outros componentes. Outros componentes que podem apresentar-se em uma reação de síntese de glucano incluem frutose, glicose, leucrose, oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7) e produto(s) de glucano solúvel(is). Além disso, uma ou mais enzimas de alfaglucano-hidrolase podem ser compreendidas em uma reação de síntese de glucano em alguns aspectos. Compreender-se-ia que certos produtos de glucano, tais como póli alfa-1,3-glucano com DP de pelo menos 8 ou 9, podem ser insolúveis em água e, portanto, não são dissolvidos em uma reação de síntese de glucano, mas sim podem estar presentes fora de solução. Glucano produzido por meio de reação de síntese de glucano no presente pode, portanto, ser insolúvel. Enzima alfaglicosidase do presente pode ser adicionada a uma reação de síntese de glucano em qualquer de seus estágios, tal como durante a preparação inicial da reação ou quando a reação estiver próxima do término (por exemplo, 80 a 90% completa) ou no seu término, em que estes dois últimos momentos são preferidos.
[0094] Reação de síntese de glucano no presente pode ser aquela que, além de gerar um produto de glucano, gera subprodutos tais como leucrose e/ou oligossacarídeos solúveis. Glucano, em alguns aspectos, é um póli alfaglucano. Reação de síntese de glucano no presente pode destinar-se, portanto, à produção de póli alfa-1,3-glucano ou mutano, por exemplo, que são tipicamente coproduzidos com pelo menos subprodutos de oligossacarídeos e/ou leucrose em uma reação de síntese de glucano.
[0095] Reação de síntese de glucano em certas realizações compreende uma enzima glicosiltransferase que produz um póli alfaglucano tal como póli alfa-1,3-glucano. Exemplos dessas enzimas de glicosiltransaferase úteis no presente são descritos na Patente Norte-Americana n° 7.000.000 e nos Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados n° 2013/0244288, 2013/0244287 e 2004/0087431, todos os quais são incorporados ao presente como referência.
[0096] Enzima glicoasiltransferase no presente pode ser derivada de qualquer fonte microbiana, tal como bactéria ou fungo. Exemplos de enzimas glicosiltransferase bacterianas são as derivadas de uma espécie de Streptococcus, espécie de Leuconostoc ou espécie de Lactobacillus. Exemplos de espécies de Streptococcus incluem S. salivarius, S. sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus e S. sanguinis. Exemplos de espécies de Leuconostoc incluem L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum e L. fructosum. Exemplos de Lactobacillus incluem L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum e L. reuteri.
[0097] Uma enzima glicosiltransferase do presente pode ser independente de primer ou dependente de primer. Enzimas glicosiltransferase independentes de primer não necessitam da presença de primer para realizar síntese de glucano. Enzimas glicosiltransferase dependentes de primer necessitam da presença de uma molécula iniciadora na solução de reação para agir como primer para a enzima durante a síntese de polímero glucano. O termo “primer”, da forma utilizada no presente, designa qualquer molécula que pode agir como iniciador para uma enzima de glicosiltransferase. Os primers que podem ser utilizados em certas realizações incluem dextran e outros primers com base em carboidratos, tais como glucano hidrolisado, por exemplo. O Pedido Norte-Americano publicado n° 2013/0244287, que é incorporado ao presente como referência, descreve a preparação de glucano hidrolisado utilizando póli alfa-1,3-glucano como material de partida. Dextran para uso como primer pode ser, por exemplo, dextran T10 (ou seja, dextran que possui peso molecular de 10 kD).
[0098] Uma enzima glicosiltransferase para reação de síntese de glucano no presente pode ser produzida por qualquer meio conhecido na técnica. Enzima de glicosiltransferase pode ser produzida de forma recombinante em um sistema de expressão heterólogo, tal como um sistema de expressão heterólogo microbiano. Exemplos de sistemas de expressão heterólogos incluem sistemas bacterianos (por exemplo, E. coli, tal como TOP10 ou MG1655; Bacillus sp) e sistemas de expressão eucarióticos (por exemplo, leveduras como Pichia sp e Saccharomyces sp).
[0099] Uma enzima glicosiltransferase descrita no presente pode ser utilizada em qualquer estado de purificação (por exemplo, puro ou não puro). Uma enzima glicosiltransferase pode ser purificada e/ou isolada antes do seu uso. Exemplos de enzimas glicosiltransferase que são impuras incluem aquelas na forma de lisato celular. Extrato ou lisato celular pode ser preparado a partir de uma bactéria (por exemplo, E. coli) utilizada para expressar a enzima de forma heteróloga. A bactéria pode ser submetida a rompimento, por exemplo, utilizando uma célula de pressão francesa. Em realizações alternativas, bactérias podem ser homogeneizadas com um homogeneizador (por exemplo, APV, Rannie, Gaulin). Uma enzima glicosiltransferase é tipicamente solúvel nesses tipos de preparações. Um lisato, extrato ou homogeneizado de células bacterianas no presente pode ser utilizado a cerca de 0,15-0,3% (v/v), por exemplo, em uma solução de reação para produzir póli alfaglucano tal como póli alfa-1,3-glucano a partir de sacarose.
[00100] A temperatura de reação de síntese de glucano no presente pode ser controlada, se desejado. Em certas realizações, a temperatura da reação é de cerca de 5 °C a cerca de 50 °C. A temperatura em algumas outras realizações é de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C.
[00101] A concentração inicial de sacarose em uma reação de síntese de glucano no presente pode ser, por exemplo, de cerca de 20 g/l a cerca de 400 g/l. Alternativamente, a concentração inicial de sacarose pode ser de cerca de 75 g/l a cerca de 175 g/l ou cerca de 50 g/l a cerca de 150 g/l. Ainda alternativamente, a concentração inicial de sacarose pode ser, por exemplo, de cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ou 160 g/l (ou qualquer número inteiro de 40 a 160 g/l). “Concentração inicial de sacarose” designa a concentração de sacarose em uma solução de reação gtf pouco depois da adição de todos os componentes da solução de reação (pelo menos água, sacarose e enzima gtf).
[00102] Sacarose utilizada em uma reação de síntese de glucano no presente pode ter alta pureza (>99,5%) ou qualquer outro grau ou pureza. Sacarose pode ter, por exemplo, pureza de pelo menos 99,0% ou pode ser sacarose em grau de reagente. Como outro exemplo, pode-se utilizar sacarose incompletamente refinada. Sacarose incompletamente refinada no presente designa sacarose que não tenha sido processada em sacarose refinada branca. Sacarose incompletamente refinada pode, portanto, ser completamente não refinada ou parcialmente refinada. Exemplos de sacarose não refinada são “sacarose bruta” (“açúcar bruto”) e suas soluções. Exemplos de sacarose parcialmente refinada não passaram através de uma, duas, três ou mais etapas de cristalização. A ICUMSA (Comissão Internacional de Métodos Uniformes de Análise de Açúcar) de sacarose incompletamente refinada no presente pode ser, por exemplo, de mais de 150. Sacarose no presente pode ser derivada de qualquer fonte de açúcar renovável, tal como cana de açúcar, beterraba, mandioca, sorgo doce ou milho. Formas apropriadas de sacarose úteis no presente são, por exemplo, forma cristalina ou não cristalina (por exemplo, xarope, caldo de cana, caldo de beterraba). Formas apropriadas adicionais de sacarose incompletamente refinada são descritas no Pedido Norte-Americano n° 61/969.958.
[00103] Métodos de determinação de valores ICUMSA para sacarose são bem conhecidos na técnica e descritos pela Comissão Internacional de Métodos Uniformes de Análise de Açúcar em ICUMSA Methods of Sugar Analysis: Official and Tentative Methods Recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis (ICUMSA) (Ed. H. C. S. de Whalley, Elsevier Pub. Co., 1964), por exemplo, que é incorporado ao presente como referência. ICUMSA pode ser medido, por exemplo, por meio do Método ICUMSA GS1/3-7 conforme descrito por R. J. McCowage, R. M. Urquhart e M. L. Burge (Determination of the Solution Colour of Raw Sugars, Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0 - Official, Verlag Dr. Albert Bartens, revisão de 2011), que é incorporado ao presente como referência.
[00104] O pH de uma reação de síntese de glucano em certas realizações pode ser de cerca de 4,0 a cerca de 8,0. Alternativamente, o pH pode ser de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0. O pH pode ser ajustado ou controlado por meio da adição ou incorporação de um tampão apropriado, incluindo, mas sem limitações: fosfato, tris, citrato ou uma de suas combinações. Concentração de tampão em reação de síntese de glucano pode ser, por exemplo, de 0 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 10, 20 ou 50 mM.
[00105] Póli alfa-1,3-glucano produzido em uma reação de síntese de glucano no presente pode conter pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (ou qualquer número inteiro de 50% a 100%) de ligações glicosídicas que são alfa-1,3. Consequentemente, nessas realizações, póli alfa-1,3-glucano contém menos de cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0% (ou qualquer número inteiro de 0% a 50%) de ligações glicosídicas que não são alfa-1,3.
[00106] Póli alfa-1,3-glucano no presente possui preferencialmente uma cadeia principal que é linear/não ramificada. Em certas realizações, o póli alfa-1,3-glucano não possui pontos de ramificação ou possui menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de pontos de ramificação como percentual das ligações glicosídicas no polímero. Exemplos de pontos de ramificação incluem pontos de ramificação alfa-1,6.
[00107] O peso molecular de póli alfa-1,3-glucano produzido em uma reação de síntese de glucano no presente pode ser representado como peso molecular numérico médio (Mn) ou como peso molecular ponderal médio (Mw). Alternativamente, o peso molecular pode ser medido em Daltons ou gramas/mol. Pode também ser útil referir-se ao DPw (grau de polimerização médio em peso) ou DPn (grau de polimerização numérico médio) do polímero póli alfa-1,3-glucano.
[00108] O Mn ou Mw de póli alfa-1,3-glucano no presente pode ser de pelo menos cerca de 1000. Alternativamente, Mn ou Mw pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 1000 a cerca de 600.000 (ou qualquer número inteiro de 1000 a 600.000). Ainda alternativamente, póli alfa-1,3- glucano pode ter peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 100 ou pelo menos cerca de 100 a 1000 (ou qualquer número inteiro de 100 a 1000).
[00109] Uma fração de reação de síntese de glucano pode constituir condições apropriadas para contato de um sacarídeo com uma alfaglicosidase conforme descrito no presente. Uma fração pode ser uma parte ou toda a solução líquida de uma reação de síntese de glucano. Tipicamente, uma fração foi separada de produto(s) de glucano solúvel(is) ou insolúvel(is) sintetizado(s) na reação. Uma fração pode ser separada, por exemplo, de um ou mais produtos de glucano que são insolúveis em água (por exemplo, póli alfa-1,3-glucano) que saem da solução durante a sua síntese. Uma fração em certas realizações preferidas da presente invenção é de uma reação de síntese de póli alfa-1,3-glucano.
[00110] O volume de fração (antes da diluição opcional ou concentração da fração, vide abaixo) em certas realizações pode ser de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% (ou qualquer número inteiro de 10% a 90%) do volume da reação de síntese de glucano da qual é obtida. Tipicamente, em reações de síntese de glucano produtoras de glucano insolúvel (tal como póli alfa-1,3-glucano), a fração será uma parte do componente de solução líquido (não toda) da reação. Uma fração pode ser obtida em qualquer etapa de uma reação de síntese de glucano, mas é preferencialmente obtida perto do término (por exemplo, mais de 80% ou 90% completo) ou após o término da reação.
[00111] Exemplos de uma fração de reação de síntese de glucano em certas realizações incluem filtrados e sobrenadantes. Nas realizações nas quais um produto de glucano insolúvel é sintetizado, portanto, uma fração de acordo com o presente pode ser obtida (separada) por meio de uma reação de síntese de glucano utilizando um funil, filtro (por exemplo, filtro de prensa), centrífuga ou qualquer outro método ou equipamento conhecido na técnica que permita a remoção de alguns ou todos os líquidos dos sólidos. A filtragem pode ser realizada, por exemplo, por meio de gravidade, vácuo ou filtragem por pressão. A filtragem preferencialmente remove, no todo ou na sua maior parte, um glucano insolúvel; pode-se utilizar qualquer material de filtro (por exemplo, papel-filtro) com tamanho médio de poros (por exemplo, cerca de 40 a 50 micra) suficiente para remover sólidos de líquidos. Uma fração tipicamente retém, no todo ou na sua maior parte, seus componentes dissolvidos, tais como subprodutos da reação de síntese de glucano.
[00112] Uma fração de acordo com o presente pode ser opcionalmente diluída ou concentrada, se desejado. A concentração de uma fração pode ser realizada utilizando qualquer outro método ou equipamento conhecido na técnica, apropriado para a concentração de soluções. Uma fração pode ser concentrada por meio de evaporação, por exemplo, tal como com um evaporador giratório (por exemplo, definido à temperatura de cerca de 40-50 °C). Uma fração em alguns aspectos do presente pode ser concentrada até um volume que seja de cerca de 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% do volume de fração original. Uma fração concentrada (por exemplo, filtrado concentrado) pode ser opcionalmente denominada xarope.
[00113] Uma fração, em alguns aspectos, pode compreender água que substitui a água que estava presente na composição da qual foi obtida a fração. Subproduto(s) de sacarídeos de uma reação de síntese de glucano pode(m) ser separado(s), por exemplo, em certos métodos cromatográficos nos quais o solvente original é substituído por outro solvente (subprodutos de sacarídeos que são ligados a uma coluna (removida do solvente original), por exemplo, podem ser eluídos em um novo solvente).
[00114] Uma fração em alguns aspectos podem ser tratados de forma a ter qualquer uma das condições apropriadas (por exemplo, temperatura, pH e hora) descritas acima para contato de um sacarídeo com uma alfaglicosidase. Uma fração pode ser modificada, por exemplo, para ter pH de cerca de 4 a 5 antes da adição de alfaglicosidase à fração. Como outro exemplo, a temperatura de uma reação de hidrólise com uma fração pode ser de cerca de 55-65 °C (por exemplo, cerca de 60 °C). Uma fração que tenha sido concentrada em xarope pode ser utilizada em uma reação de hidrólise em ainda outro exemplo.
[00115] Uma fração em certas realizações preferidas do presente é de uma reação de síntese de póli alfa-1,3-glucano; essa fração é preferencialmente um filtrado. Uma fração de reação de síntese de póli alfa- 1,3-glucano no presente compreende pelo menos água, frutose e um ou mais tipos de sacarídeo (leucrose e/ou oligossacarídeos tais como DP2-DP7). Outros componentes que podem encontrar-se neste tipo de fração incluem, por exemplo, sacarose (ou seja, sacarose residual não consumida na reação gtf), uma ou mais enzimas gtf, glicose, tampão, sais, FermaSure®, boratos, hidróxido de sódio, ácido clorídrico, componentes de lisato celular, proteínas e/ou ácidos nucleicos. No mínimo, os componentes de uma fração de uma reação de síntese de póli alfa-1,3-glucano incluem, por exemplo, água, frutose, glicose, um ou mais tipos de sacarídeo (leucrose e/ou oligossacarídeos tais como DP2-DP7) e, opcionalmente, sacarose. Compreender-se-ia que a composição de uma fração depende, em parte, das condições da reação de síntese de glucano da qual é obtida a fração. Nessas frações que contêm uma ou mais enzimas gtf, é preferível que essas uma ou mais enzimas gtf sejam desativadas (por exemplo, desativadas a quente) antes do uso da fração em uma reação de hidrólise de acordo com o presente.
[00116] Dever-se-á compreender que a distribuição exata de subprodutos de açúcar gerados por meio da polimerização de sacarose em uma reação de síntese de glucano pode variar com base nas condições de reação e enzima gtf utilizadas, especialmente sobre a temperatura e a concentração de sacarose. Dever-se-á também compreender que a composição exata de açúcares em uma fração de reação de síntese de glucano não é fundamental para o processo de hidrólise descrito. Geralmente, à medida que aumenta a quantidade de sacarose, aumentará a seletividade da reação para leucrose e oligossacarídeos. Por outro lado, à medida que a temperatura aumenta, a seletividade da reação para leucrose tende a cair, enquanto a seletividade para oligossacarídeos, em grande parte, não é afetada. Dever-se-á também compreender que a razão entre açúcares e água, ou seja, o percentual em peso de sólidos secos (DS), que é calculado dividindo-se a massa de açúcar pelo peso total da solução, pode ser ajustado por meio de evaporação de água, preferencialmente sob temperaturas abaixo de 50 °C a vácuo, ou adição de água, sem impacto significativo para a distribuição relativa de açúcares em uma fração de uma reação de síntese de glucano. Também é possível aumentar o percentual de sacarose em uma fração suspendendo-se a reação de gtf antes de atingir-se conversão completa (em glucano), seja por meio de redução do pH abaixo da faixa ativa para a enzima gtf ou de desativação térmica da enzima gtf.
[00117] Em certas realizações, reação de síntese de glucano no presente pode gerar um ou mais produtos de alfaglucano solúveis. Produto de alfaglucano solúvel (“fibra solúvel”, alternativamente) pode ser (i) um produto de glicosiltransferase ou (ii) um produto da ação concertada de glicosiltransferase e alfaglicano-hidrolase capaz de hidrolisar polímeros de glucano que contêm uma ou mais ligações alfa-1,3-glicosídicas ou uma ou mais ligações alfa-1,6-glicosídicas.
[00118] Alfaglucano solúvel no presente pode compreender, por exemplo: a. pelo menos 75% de ligações alfa-1,3-glicosídicas; b. menos de 25% de ligações alfa-1,6-glicosídicas; c. menos de 10% de ligações alfa-1,3,6-glicosídicas; d. Mw de menos de 5000 Daltons; e. viscosidade de menos de 0,25 Pascal segundo (Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C; f. equivalência em dextrose (DE) na faixa de 4 a 40; g. capacidade de digestão de menos de 10% conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC); h. solubilidade de pelo menos 20% (p/p) em água a 25 °C sob pH 7; e i. índice de polidispersão (PDI) de menos de 5.
[00119] Esse alfaglucano solúvel pode ser produzido conforme descrito no Pedido Norte-Americano n° 62/004.290.
[00120] Como exemplo, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, de maior preferência pelo menos 85%, de preferência ainda maior pelo menos 90% e, de preferência superior, pelo menos 95% de ligações alfa-(1,3) glicodsídicas.
[00121] Como outro exemplo, além das realizações de ligação alfa-(1,3) glicosídica descritas acima, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender adicionalmente menos de 25%, preferencialmente menos de 10%, de maior preferência 5% ou menos e, de preferência ainda maior, menos de 1% de ligações alfa-(1,6) glicosídicas.
[00122] Como outro exemplo, além das realizações de teor de ligação alfa-(1,3) e alfa-(1,6) glicosídica descritas acima, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender adicionalmente menos de 10%, preferencialmente menos de 5% e, de preferência superior, menos de 2,5% de ligações alfa-(1,3,6) glicosídicas.
[00123] Como outro exemplo, composições de fibra de alfaglucano solúveis podem compreender 93 a 97% de ligações alfa-(1,3) glicosídicas e menos de 3% de ligações alfa-(1,6) glicosídicas e possuem peso molecular ponderal médio correspondente a uma mistura com DP de 3 a 7. Em uma realização adicional, composições de fibra de alfaglucano solúveis podem compreender cerca de 95% de ligações alfa-(1,3) glicosídicas e cerca de 1% de ligações alfa-(1,6) glicosídicas e possuem peso molecular ponderal médio correspondente a uma mistura com DP de 3 a 7. Em um aspecto adicional da realização acima, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender adicionalmente 1 a 3% de ligações alfa-(1,3,6) ou, preferencialmente, cerca de 2% de ligações alfa-(1,3,6).
[00124] Como outro exemplo, além das realizações de teor de ligação glicosídica mencionadas acima, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender adicionalmente menos de 5%, preferencialmente menos de 1% e, de preferência superior, menos de 0,5% de ligações alfa-(1,4) glicosídicas.
[00125] Como outro exemplo, além das realizações de teor de ligação glicosídica mencionadas acima, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender peso molecular ponderal médio (Mw) de menos de 5000 Daltons, preferencialmente menos de 2500 Daltons, de maior preferência de 500 a 2500 Daltons e, de preferência superior, cerca de 500 a cerca de 2000 Daltons.
[00126] Como outro exemplo, além de qualquer das características acima, composições de fibra de alfaglucano solúveis podem compreender viscosidade de menos de 250 centipoise (0,25 Pa^s), preferencialmente menos de 10 cP (0,01 Pa^s), preferencialmente menos de 7 cP (0,007 Pa^s), de maior preferência menos de 5 cP (0,005 Pa^s), de maior preferência menos de 4 cP (0,004 Pa^s) e, de preferência superior, menos de 3 cP (0,003 Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C.
[00127] Uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode ter, em certas realizações, capacidade de digestão de menos de 10% ou, preferencialmente, menos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%, conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC). Em outro aspecto, o nível relativo de capacidade de digestão pode ser alternativamente determinado utilizando AOAC 2011.25 (Teste de Fibra Alimentar Total Integrada) (McCleary et al, 2012, J. AOAC Int., 95 (3), 824-844).
[00128] Além de qualquer uma das realizações acima, composições de fibra de alfaglucano solúveis podem ter solubilidade de pelo menos 20% (p/p), preferencialmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em água a 25 °C sob pH 7.
[00129] Em uma realização, uma composição de fibra de alfaglucano solúvel pode compreender um teor de açúcar redutor de menos de 10% em peso, preferencialmente menos de 5% em peso e, de preferência superior, 1% em peso ou menos.
[00130] Em uma realização, composições de fibra de alfaglucano solúveis podem compreender teor calórico de menos de 4 kcal/g, preferencialmente menos de 3 kcal/g, de maior preferência menos de 2,5 kcal/g e, de preferência superior, cerca de 2 kcal/g ou menos.
[00131] Como outro exemplo, alfaglucano solúvel no presente pode compreender: a. 10% a 30% de ligações alfa-1,3-glicosídicas; b. 65% a 87% de ligações alfa-1,3-glicosídicas; c. menos de 5% de ligações alfa-1,3,6-glicosídicas; d. peso molecular ponderal médio (Mw) de menos de 5000 Daltons; e. viscosidade de menos de 0,25 Pascal segundo (Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C; f. equivalência em dextrose (DE) na faixa de 4 a 40, preferencialmente 10 a 40; g. capacidade de digestão de menos de 10% conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC); h. solubilidade de pelo menos 20% (p/p) em água a 25 °C sob pH 7; e i. índice de polidispersão (PDI) de menos de 5.
[00132] Esse alfaglucano solúvel pode ser produzido conforme descrito no Pedido Norte-Americano n° 62/004.308.
[00133] Como outro exemplo, alfaglucano solúvel no presente pode compreender: a. 25-35 ligações alfa-1,3-glicosídicas; b. 55-75% ligações alfa-1,6-glicosídicas; c. 5-15% ligações alfa-1,3,6-glicosídicas; d. peso molecular ponderal médio de menos de 5000 Daltons; e. viscosidade de menos de 0,25 Pascal segundo (Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C; f. equivalência em dextrose (DE) na faixa de 4 a 40; g. capacidade de digestão de menos de 10% conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC); h. solubilidade de pelo menos 20% (p/p) em água a 25 °C; e i. índice de polidispersão de menos de 5.
[00134] Esse alfaglucano solúvel pode ser produzido conforme descrito no Pedido Norte-Americano n° 62/004.312.
[00135] Como outro exemplo, alfaglucano solúvel no presente pode compreender: a. pelo menos 95% de ligações alfa-1,6-glicosídicas; b. 1% ou menos de ligações alfa-1,3-glicosídicas; c. menos de 2% de ligações alfa-1,3,6-glicosídicas; d. menos de 1,5% de ligações alfa-1,4-glicosídicas; e. peso molecular ponderal médio de menos de 20000 Daltons; f. viscosidade de menos de 0,25 Pascal segundo (Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C; g. equivalência em dextrose (DE) na faixa de 1 a 30; h. capacidade de digestão de menos de 10% conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC); i. solubilidade de pelo menos 20% (p/p) em água a 25 °C sob pH 7; e j. índice de polidispersão de menos de 5.
[00136] Esse alfaglucano solúvel pode ser produzido conforme descrito no Pedido Norte-Americano n° 62/004.314.
[00137] Como outro exemplo, alfaglucano solúvel no presente pode compreender: a. i. ii. uma faixa de: 1% a 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas; ou mais de 10%, mas menos de 40% de ligações alfa-1,4- glicosídicas; ou iii. qualquer combinação de (i) e (ii); b. 1 a 50% de ligações alfa-1,2-glicosídicas; c. 0-25% ligações alfa-1,3,6-glicosídicas; d. menos de 98% de ligações alfa-1,6-glicosídicas; e. peso molecular ponderal médio de menos de 300 kDa; f. viscosidade de menos de 0,25 Pascal segundo (Pa^s) a 12% em peso em água a 20 °C; g. capacidade de digestão de menos de 20% conforme medido por meio do método 2009.01 da Associação de Comunidades Analíticas (AOAC); h. solubilidade de pelo menos 20% (p/p) em água a 25 °C sob pH 7; e i. índice de polidispersão de menos de 26, preferencialmente menos de 5.
[00138] Esse alfaglucano solúvel pode ser produzido conforme descrito no Pedido Norte-Americano n° 62/004.305.
[00139] Em certas realizações, alfaglucano solúvel é um produto direto de glicosiltransferase. Essa glicosiltransferase e condições de seu uso em uma reação de síntese de glucano apropriada podem ser conforme descrito no presente, ou conforme descrito, por exemplo, em qualquer dos Pedidos de Patente Norte-Americanos n° 62/004.290, 62/004.308, 62/004.312, 62/004.314 e/ou 62/004.305.
[00140] Alfaglucano solúvel pode ser alternativamente um produto, por exemplo, da ação concertada de glicosiltransferase e alfaglicano- hidrolase capaz de hidrolisar polímeros de glucano que contêm uma ou mais ligações alfa-1,3-glicosídicas ou uma ou mais ligações alfa-1,6-glicosídicas. Em alguns aspectos, reação de síntese de glucano para gerar um produto de alfaglucano solúvel pode compreender pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos uma alfaglucano-hidrolase. Em outros aspectos, reação de síntese de glucano pode compreender inicialmente uma ou mais glicosiltransferases como o(s) único(s) componente(s) de enzimas. Essa reação gera um primeiro produto de alfaglucano que ainda não foi submetido a modificação por uma alfaglucano-hidrolase. Em seguida, pelo menos uma alfaglucano-hidrolase é adicionada à reação por um período de tempo adequado para permitir a modificação do primeiro produto em um produto de alfaglucano solúvel. Existem, portanto, diferentes formas de síntese de um produto de alfaglucano solúvel por meio da ação concertada de glicosiltransferase e alfaglucano- hidrolase. Condições de realização de uma reação de síntese de glucano na qual são incluídas uma ou mais enzimas de alfaglucano-hidrolase durante a reação de síntese de glucano e/ou após a síntese de glucano podem ser conforme descrito no presente ou conforme descrito, por exemplo, em qualquer dos Pedidos de Patente Norte-Americanos n° 62/004.290, 62/004.308, 62/004.312, 62/004.314 e/ou 62/004.305.
[00141] Alfaglucano-hidrolase no presente pode ser, por exemplo, dextranase (capaz de hidrólise de ligações glicosídicas ligadas por alfa-1,6; E. C. 3.2.1.11), mutanase (capaz de hidrolisar ligações glicosídicas ligadas por alfa-1,3; E. C. 3.2.1.59), micodextranase (capaz de endo-hidrólise de ligações (1-4)-alfa-D-glicosídicas em alfa-D-glucanos contendo ligações (1-3) e (1-4); EC 3.2.1.61); glucano 1,6-alfaglicosidase (EC 3.2.1.70) e alternanase (capaz de dividir alternan endo-hidroliticamente; EC 3.2.1; vide a Patente Norte- Americana n° 5.786.196).
[00142] Mutanase que compreende SEQ ID N° 47 pode ser utilizada em certos aspectos. Alternativamente, mutanase pode compreender uma sequência de aminoácidos que seja, por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID N° 47 e possua atividade de mutanase.
[00143] Reação de síntese de glucano conforme descrito no presente para gerar um ou mais produtos de alfaglucano solúveis pode servir diretamente como condições apropriadas nas quais é realizada uma reação de hidrólise no presente, em que uma alfaglicosidase é utilizada para hidrolisar uma ligação de alfa-1,5 glucosilfrutose. Essa hidrólise pode ser realizada seguindo qualquer uma das condições descritas acima com relação, por exemplo, ao tratamento hidrolítico de uma reação de síntese de glucano que produz polialfa-1,3-glucano. Alternativamente, uma fração (por exemplo, fração cromatográfica) de uma reação de síntese de glucano para gerar um ou mais produtos de alfaglucano solúveis pode ser utilizada como condições apropriadas nas quais é realizada hidrólise mediada por alfaglicosidase de ligações de alfa-1,5 glicosilfrutose.
[00144] Uma fração em certas realizações do presente pode ser uma fração cromatográfica de uma reação de síntese de glucano. Uma fração pode ser, por exemplo, uma fração cromatográfica de uma reação de síntese de glucano que gera um ou mais produtos de alfaglucano solúveis conforme descrito no presente. Essa reação pode incluir opcionalmente uma ou mais alfaglucano-hidrolases durante a síntese de glucano e/ou após o término da síntese de glucano. Uma fração em qualquer um desses tipos de realizações foi tipicamente obtida com o propósito de separar todo ou a maior parte (por exemplo, pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%) de um produto de alfaglucano solúvel de uma composição de reação da qual foi produzido. Uma vez separada de um produto de alfaglucano solúvel, no todo ou em sua maior parte, uma fração pode ser submetida a qualquer um dos processos de hidrólise de alfa-1,5-glicosilfrutose descritos no presente, utilizando uma ou mais alfaglucanases.
[00145] Uma fração cromatográfica do presente pode ser tipicamente obtida utilizando um tipo apropriado de cromatografia de líquidos. Cromatografia de líquidos pode ser realizada utilizando, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC), cromatografia de coluna, cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC), cromatografia de troca de íons, cromatografia de afinidade, ultrafiltragem, microfiltragem ou diálise.
[00146] A presente invenção também se refere a uma composição produzido por meio de contato de um sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase), em que (i) o sacarídeo é um dissacarídeo ou oligossacarídeo que compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6-glicosilglicose e (ii) a alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo. A composição produzida dessa forma compreende uma quantidade reduzida do sacarídeo em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes do contato. Exemplos da composição incluem qualquer uma das descritas no presente, tais como um filtrado hidrolisado de uma reação de síntese de gluicano ou uma fração hidrolisada de uma reação de síntese de glucano utilizada para produzir alfaglucano solúvel. Qualquer uma das características descritas acima e nos Exemplos com relação a um método de hidrólise e seus produtos pode caracterizar a composição. As características da composição a seguir são exemplos.
[00147] Uma enzima alfaglicosidase, em certas realizações da composição, pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID N° 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou à de DIAZYME RDF ULTRA (DuPont Industrial Biosciences). Transglicosidase em certas realizações da composição pode compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 1. Alternativamente, qualquer uma das alfaglicosidases descritas no presente pode ser utilizada para produzir a composição descrita.
[00148] Em certas realizações, o sacarídeo da composição possui grau de polimerização antes da hidrólise de 3 a 7.
[00149] Uma composição produzida por meio de um método de hidrólise de acordo com o presente pode conter, por exemplo, concentração de sacarídeo que é menos de 50% da concentração do sacarídeo que estava presente antes do contato do sacarídeo com alfaglicosidase.
[00150] Uma composição produzida por meio de um método de hidrólise em certas realizações do presente pode ser uma reação de síntese de glucano ou uma de suas frações, em que um subproduto de sacarídeo da reação de síntese de glucano é colocado em contato com alfaglicosidase. Fração, nesta realização, pode ser um filtrado da reação de síntese de glucano ou uma fração de reação de síntese de glucano utilizada, por exemplo, para produzir alfaglucano solúvel. O sacarídeo nesta realização pode ter, por exemplo, grau de polimerização de 3 a 7 antes da hidrólise.
[00151] Os técnicos no assunto compreenderiam que as realizações descritas no presente são úteis, em parte, para sacarificar dissacarídeos e oligossacarídeos que, de outra forma, podem ser dificilmente rompidas. Esta característica pode ser utilizada, por exemplo, para realizar métodos aprimorados de (i) enriquecimento de frutose e (ii) fermentação.
[00152] O Exemplo 6 abaixo demonstra que o enriquecimento de frutose por meio de cromatografia aumenta ao utilizar-se um filtrado de glucano hidrolisado por alfaglicosidase (transglicosidase), em comparação com o uso de um filtrado que não foi hidrolisado.
[00153] A presente invenção refere-se adicionalmente, portanto, a um método de enriquecimento de frutose que se encontra presente em uma fração de reação de síntese de glucano. Este método compreende (a) contato de uma fração obtida de uma reação de síntese de glucano com uma alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase) sob condições apropriadas, em que a enzima hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendida na fração; e (b) separação de frutose da fração hidrolisada da etapa (a) para obter uma composição que possui concentração mais alta de frutose em comparação com a concentração de frutose da fração da etapa (a).
[00154] As características do método de enriquecimento de frutose descrito com relação a enzimas alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase) e frações de uma reação de síntese de glucano, por exemplo, podem ser de acordo com qualquer das descrições fornecidas no presente com relação a cada uma dessas características.
[00155] A etapa (b) de separação de frutose pode ser realizada por qualquer meio conhecido na técnica. Cromatografia pode ser empregada, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos abaixo ou seguindo a revelação da Patente Europeia publicada n° EP2292803B1, que é incorporada ao presente como referência.
[00156] Uma composição (por exemplo, solução de frutose ou xarope de frutose) que contém concentração mais alta de frutose resultante do método de enriquecimento descrito pode conter pelo menos cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% em peso de frutose.
[00157] Um método de enriquecimento de frutose de acordo com o presente pode apresentar melhor desempenho que um que utiliza um filtrado que não foi hidrolisado com alfaglicosidase conforme descrito no presente. Esse desempenho aprimorado pode ser medido em termos de percentual de recuperação de frutose de pelo menos 40%, 45% ou 50%.
[00158] A presente invenção refere-se ainda a um método de fermentação que compreende (a) contato de uma fração obtida de uma reação de síntese de glucano com uma enzima alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase ou glicoamilase) sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,5 glicosilfrutose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendido na fração; (b) fermentação da fração da etapa (a) com um micróbio para gerar um produto; e (c) opcionalmente, isolamento do produto de (b). A etapa de fermentação de (b) pode ser realizada após a etapa (a) ou simultaneamente com a etapa (a). Significativamente, este método pode ser utilizado para produzir etanol, por exemplo, por meio de fermentação de um filtrado hidrolisado de uma reação de síntese de glucano. A produção de etanol por meio desse processo é mais alta que a produção de etanol obtida ao fermentar-se um filtrado de glucano que não tenha sido hidrolisado.
[00159] As características do método de fermentação descrito com relação a enzimas alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase ou glicoamilase), dissacarídeos e oligossacarídeos, frações de uma reação de síntese de glucano e condições de contato apropriadas, por exemplo, podem referir-se, de acordo com qualquer das revelações fornecidas no presente, a cada uma dessas características.
[00160] Micróbios para uso em métodos de fermentação de acordo com o presente podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras ou fungos. Exemplos de bactérias úteis no presente incluem espécies de Lactobacillus, espécies de Streptococcus, espécies de Bifidobacterium, espécies de Leuconostoc, espécies de Escherichia (por exemplo, E. coli) e espécies de Bacillus. Exemplos de leveduras úteis no presente incluem espécies de Saccharomyces, tais como S. cerevisiae e S. bayanus.
[00161] Métodos de fermentação de acordo com a presente invenção podem gerar um produto tal como etanol ou ácido (por exemplo, ácido láctico). Acredita-se, entretanto, que outros produtos podem ser gerados, se desejado. Os técnicos no assunto compreenderiam que a elaboração de certos produtos utilizando um método de fermentação conforme descrito dependeria de várias condições, tais como o(s) micróbio(s) utilizado(s) na fermentação. As condições de fermentação do presente podem ser conforme descrito nos Exemplos abaixo ou conforme descrito em El-Mansi et al (2006, Fermentation Microbiology and Biotechnology, segunda edição, CRC Press) e Stanbury et al (1999, Principles of Fermentation Technology, segunda edição, Butterworth-Heinemann), por exemplo, ambos incorporados ao presente como referência.
[00162] O rendimento de um produto em certas realizações de um método de fermentação de acordo com o presente é mais alto que o rendimento de produto obtido ao fermentar-se um filtrado de glucano que não tenha sido hidrolisado com uma alfaglicosidase de acordo com o presente. Essa comparação pode ser realizada com relação a fermentação de controle, por exemplo, que utilizou fração não hidrolisada de uma reação de síntese de glucano. O rendimento de produto de fermentação de acordo com o presente pode aumentar, por exemplo, em pelo menos cerca de 10%, 20%, 40%, 60%, 80% ou 100% (ou qualquer valor inteiro de 10% a 100%). Além disso, a velocidade de formação de produto por meio de fermentação de acordo com a presente invenção pode aumentar.
[00163] O Exemplo 7 abaixo demonstra que leucrose pode ser fermentada em etanol por levedura para fornecer alimentação que compreende filtrado de glucano que não havia sido hidrolisado. É adicionalmente descrito no presente, portanto, um método de uso de micróbios para fermentar leucrose em um produto (por exemplo, etanol). Esse método pode compreender a fermentação de um filtrado de glucano que (i) foi ou (ii) não foi hidrolisado com uma alfaglicosidase conforme descrito no presente. Independentemente se a leucrose for fornecida em um filtrado de glucano ou de outra forma (por exemplo, forma enriquecida ou semipurificada), métodos de fermentação de leucrose podem compreender a adaptação de micróbios (por exemplo, levedura tal como S. cerevisiae) utilizando leucrose. Essa adaptação pode compreender o cultivo de micróbios na presença de leucrose e opcionalmente outros açúcares, ao longo de pelo menos dois ou três ciclos de crescimento, por exemplo, após o quê o micróbio utiliza mais leucrose para fermentar um produto. Em certas realizações, micróbios podem ser (i) cultivados em primeira alimentação que compreende leucrose (um ciclo completo), (ii) removidos da primeira alimentação, (iii) cultivados em segunda alimentação que compreende leucrose (dois ciclos completos), (iv) opcionalmente removidos da segunda alimentação e (v) opcionalmente cultivados em terceira alimentação (três ciclos completos). Micróbios adaptados desta forma podem ter maior capacidade de fermentação de leucrose em certas realizações.
[00164] O Exemplo 9 abaixo demonstra que quase toda (por exemplo, >98% ou >99%) a leucrose presente em um filtrado de glucano pode ser utilizada para fermentação por levedura quando o filtrado de glucano for hidrolisado com uma transglicosidase enquanto, ao mesmo tempo, é fermentado com levedura. Métodos de fermentação aprimorada de leucrose de acordo com o presente podem compreender, portanto, hidrólise de leucrose com uma alfaglicosidase (por exemplo, transglicosidase ou glicoamilase), fermentando simultaneamente a leucrose com micróbios.
[00165] Exemplos não limitadores de composições e métodos descritos no presente incluem: 1. Método de hidrólise de uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose em um sacarídeo que compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose, em que o sacarídeo é um dissacarídeo ou oligossacarídeo e o método compreende: - contato do sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo; e em que a quantidade do sacarídeo é reduzida em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes da etapa de contato; 2. Método de acordo com a realização 1, em que a enzima alfaglicosidase é imobilizada; 3. Método de acordo com qualquer das realizações 1 ou 2, em que o grau de polimerização do sacarídeo antes da hidrólise é de 3 a 7; 4. Método de acordo com qualquer das realizações 1, 2 ou 3, em que a concentração do sacarídeo após a etapa de contato é de menos de 50% da concentração do sacarídeo que estava presente antes do contato; 5. Método de acordo com qualquer das realizações 1, 2, 3 ou 4, em que as condições apropriadas compreendem (i) uma reação de síntese de glucano; ou (ii) uma fração obtida da reação de síntese de glucano; em que o sacarídeo é um subproduto da reação de síntese de glucano; 6. Método de acordo com a realização 5, em que a reação de síntese de glucano gera pelo menos um produto de alfaglucano insolúvel; 7. Método de acordo com a realização 6, em que a fração é um filtrado da reação de síntese de glucano; 8. Método de acordo com a realização 5, em que a reação de síntese de glucano gera pelo menos um produto de alfaglucano solúvel que é: i. um produto de glicosiltransferase; ou ii. um produto da ação concertada de glicosiltransferase e alfaglicano-hidrolase capaz de hidrolisar polímeros de glucano que contêm uma ou mais ligações alfa-1,3-glicosídicas ou uma ou mais ligações alfa- 1,6-glicosídicas. 9. Método de acordo com a realização 8, em que a fração é uma fração cromatográfica da reação de síntese de glucano; 10. Método de acordo com qualquer das realizações 1 a 9, em que a enzima alfaglicosidase é uma transglicosidase; 11. Composição produzida por meio de contato de sacarídeo com uma enzima alfaglicosidase; em que o sacarídeo é um dissacarídeo ou oligossacarídeo e compreende pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose; em que a enzima hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo; e em que a composição compreende uma quantidade reduzida do sacarídeo em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes do contato; 12. Composição de acordo com a realização 11, em que o grau de polimerização do sacarídeo antes da hidrólise é de 3 a 7; 13. Composição de acordo com qualquer das realizações 11 ou 12, em que o sacarídeo encontra-se em (i) uma reação de síntese de glucano; ou (ii) uma fração obtida a partir da reação de síntese de glucano; em que o sacarídeo é um subproduto da reação de síntese de glucano; 14. Método de enriquecimento de frutose presente em uma fração de reação de síntese de glucano, que compreende: a. contato de uma fração obtida a partir de reação de síntese de glucano com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendido na fração; e b. separação de frutose da fração hidrolisada da etapa (a) para obter uma composição que possui concentração mais alta de frutose em comparação com a concentração de frutose da fração da etapa (a); 15. Método de fermentação que compreende: a. contato de uma fração obtida a partir de reação de síntese de glucano com uma enzima alfaglicosidase sob condições apropriadas, em que a enzima alfaglicosidase hidrolisa pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose de um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendido na fração; b. fermentação da fração da etapa (a) com um micróbio para gerar um produto, em que a fermentação é realizada após a etapa (a) ou simultaneamente com a etapa (a); e c. isolamento opcional do produto de (b); em que o rendimento do produto de (b) aumenta em comparação com o rendimento de produto de fermentação de uma fração da reação de síntese de glucano que não foi colocada em contato com a enzima alfaglicosidase.
EXEMPLOS
[00166] A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem certos aspectos preferidos da presente invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições.
ABREVIAÇÕES
[00167] O significado de algumas das abreviações utilizadas no presente é o seguinte: “g” indica grama(s), “h” indica hora(s), “ml” indica mililitro(s), “psi” indica libra(s) por polegada quadrada, “% em peso” indica percentual em peso, “μm” indica micrômetro(s), "%" indica por cento, "°C" indica graus Celsius, "mg" indica miligrama(s), “mm” indica milímetro(s), “ml/min” indica mililitros por minuto, “m” indica metro(s), “μl” indica microlitro(s), “mmol” indica milimol(s), “min” indica minuto(s), “% mol” indica percentual molar, “M” indica molar, “mg/g” indica miligramas por grama, “rpm” indica revoluções por minuto e “MPa” indica megaPascals.
MÉTODOS GERAIS
[00168] Todos os reagentes foram obtidos por meio da Sigma- Aldrich (St. Louis MO), a menos que indicado em contrário. Sacarose foi obtida por meio da VWR (Radnor PA).
PREPARAÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS DE ENZIMAS GLICOSILTRANSFERASE (GTF)
[00169] A enzima gtfJ de Streptococcus salivarius (SEQ ID N° 3) foi expressa em linhagem DH10B de E. coli utilizando um sistema de expressão induzido por isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG). SEQ ID N° 3 possui exclusão de 42 resíduos N-terminal em comparação com a sequência de aminoácidos gtfJ de S. salivarius no número de identificação GENBANK 47527, mas inclui uma metionina inicial. Resumidamente, células DH10B de E. coli foram transformadas para expressar SEQ ID N° 3 de uma sequência de DNA otimizada por códons para expressar a enzima gtfJ em E. coli. Essa sequência de DNA estava contida no vetor de expressão, pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park CA). As células transformadas foram inoculadas até densidade óptica inicial (OD a 600nm) de 0,025 em meio LB (10 g/l de Triptona; 5 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de NaCl) e mantidas em crescimento a 37 °C em um incubador mediante agitação a 250 rpm. Os cultivos foram induzidos por meio da adição de 1 mM IPTG quando atingiram OD600 de 0,8-1,0. Cultivos induzidos foram mantidos sobre o agitador e colhidos três horas após a indução.
[00170] Enzima GtfJ (SEQ ID N° 3) foi colhida por meio de centrifugação de células cultivadas (25 °C, 16000 rpm) em uma centrífuga Eppendorf®, nova suspensão das células em 5,0 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) e resfriamento a 4 °C sobre gelo. As células foram rompidas utilizando um batedor de esferas com esferas de sílica de 0,1 mm e centrifugadas em seguida a 16000 rpm e 4 °C para peletizar as células não rompidas e fragmentos celulares. O extrato bruto (que contém enzima GtfJ solúvel, SEQ ID N° 3) foi separado da pelota e analisado por meio de teste de proteína Bradford para determinar a concentração de proteína (mg/ml).
[00171] A enzima C150 gtf-S de Streptococcus sp (SEQ ID N° 40) foi preparada conforme segue. SG1184 é uma linhagem de expressão de Bacillus subtilis que expressa uma versão truncada da glicosiltransferase Gtf-S (“GTF0459”) de Streptococcus sp C150 (GENBANK® GI: 321278321). O gene (SEQ ID N° 41) que codifica uma proteína truncada N-terminal GTF0459 (SEQ ID N° 42) do plasmídeo de expressão de E. coli pMP79 foi clonado nos locais NheI e HindIII do plasmídeo de expressão integral de Bacillus subtilis p4JH sob o promotor aprE e fundido com o peptídeo de sinal AprE de B. subtilis sobre o vetor. A construção foi transformada em primeiro lugar em E. coli DH10B e selecionada sobre LB com placas de ampicilina (100 μg/ml). A construção pDCQ984 confirmada que expressa GTF0459 foi transformada em seguida em B. subtilis BG6006 que contém nove exclusões de protease (amyE::xylRPxylAcomK-ermC, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501 , ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) e selecionada sobre placas LB com cloranfenicol (5 μg/ml). As colônias cultivadas sobre placas LB com 5 μg/ml de cloranfenicol foram riscadas várias vezes sobre placas LB com 25 μg/ml de cloranfenicol. A linhagem de expressão de B. subtilis resultante, SG1184, foi cultivada em primeiro lugar sobre meio LB com 25 μg/ml de cloranfenicol e subcultivada em seguida em meio GrantsII que contém 25 μg/ml de cloranfenicol cultivado a 30 °C por dois a três dias. Os cultivos foram centrifugados a 15000 g por trinta minutos a 4 °C e o sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,22 μm. O sobrenadante filtrado foi parcelado e congelado a -80 °C.
[00172] Linhagem SG1184 de B. subtilis, que expressa GTF0459 (SEQ ID N° 42), foi cultivada sob condição submersa aeróbica por meio de fermentação em bateladas alimentadas convencional. Utilizou- se um meio nutriente que contém 0-0,25% sólidos de milhocina (Roquette), 5-25 g/l de fosfato de sódio e potássio, solução de 0,3-0,6 M sulfato ferroso, cloreto de manganês e cloreto de cálcio, 0,5-4 g/l de sulfato de magnésio e uma solução de 0,01 -3,7 g/l de sulfato de zinco, sulfato cuproso, ácido bórico e ácido cítrico. Adicionou-se um agente antiespumante, FOAMBLAST 882, a 2-4 ml/l, para controlar a formação de espuma. Alimentou-se fermentação de 10 l com alimentação de glicose a 50% (p/p) quando a glicose inicial em bateladas não era detectável. A velocidade de alimentação de glicose foi elevada ao longo de várias horas. A fermentação foi controlada a 30 °C e 20% DO e em agitação inicial de 750 rpm. O pH foi controlado em 7,2 utilizando 50% (v/v) hidróxido de amônio. Parâmetros de fermentação tais como pH, temperatura, fluxo de ar e %DO foram monitorados ao longo de toda a condução de fermentação por dois dias. O caldo de cultivo foi colhido ao final da condução e centrifugado para obter sobrenadante. O sobrenadante contendo GTF0459 (SEQ ID N° 42) foi armazenado em seguida congelado a -80 °C.
[00173] A enzima MT-4239 gtf-C de S. mutans (SEQ ID N° 43) foi preparada conforme segue. Um gene que codifica uma versão truncada de uma enzima glicosiltransferase (gtf) identificada em GENBANK® como GI: 3130088 (SEQ ID N° 43; gtf-C de S. mutans MT-4239) foi sintetizado utilizando códons otimizados para expressão em Bacillus subtilis e sintetizado por meio de GenScript. O gene (SEQ ID N° 44) que codifica GTF0088BsT1 com truncagem N-terminal e truncagem T1 C-terminal (SEQ ID N° 45) foi amplificado a partir do plasmídeo GENSCRIPT e clonado nos locais NheI e HindIII do plasmídeo de expressão integrante Bacillus subtilis p4JH sob o promotor aprE e fundido com o peptídeo de sinal AprE de B. subtilis sobre o vetor. A construção foi transformada em primeiro lugar em E. coli DH10B e selecionada sobre LB com placas de ampicilina (100 μg/ml). A construção confirmada pDCQ1021 confirmada que expressa GTF0088BsT1 foi transformada em seguida em B. subtilis BG6006 que contém nove exclusões de protease (amyE::xylRPxylAcomK-ermC, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) e selecionada sobre as placas LB com cloranfenicol (5 μg/ml). As colônias cultivadas sobre placas LB com 5 μg/ml de cloranfenicol foram riscadas várias vezes sobre placas LB com 25 μg/ml de cloranfenicol. A linhagem de expressão de B. subtilis resultante, SG1221, foi cultivada em primeiro lugar sobre meio LB com 25 μg/ml de cloranfenicol e subcultivada em seguida em meio GrantsII que contém 25 μg/ml de cloranfenicol cultivado a 30 °C por dois a três dias. Os cultivos foram centrifugados a 15000 g por trinta minutos a 4 °C e o sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,22 μm. O sobrenadante filtrado foi parcelado e congelado a -80 °C.
[00174] Linhagem SG1221 de B. subtilis, que expressa GTF0088BsT1 (SEQ ID N° 45), foi cultivada sob condição submersa aeróbica por meio de fermentação em bateladas alimentadas convencional. Utilizou-se um meio nutriente que contém 0-0,25% sólidos de milhocina (Roquette), 5-25 g/l de fosfato de sódio e potássio, solução de 0,3-0,6 M sulfato ferroso, cloreto de manganês e cloreto de cálcio, 0,5-4 g/l de sulfato de magnésio e uma solução de 0,01-3,7 g/l de sulfato de zinco, sulfato cuproso, ácido bórico e ácido cítrico. Adicionou-se um agente antiespumante, FOAMBLAST 882, a 2-4 ml/l, para controlar a formação de espuma. Alimentou-se fermentação de 2 l com alimentação de glicose a 50% (p/p) quando a glicose inicial em bateladas não era detectável. A velocidade de alimentação de glicose foi elevada ao longo de várias horas. A fermentação foi controlada a 30 °C e 20% DO e em agitação inicial de 400 rpm. O pH foi controlado em 7,2 utilizando 50% (v/v) hidróxido de amônio. Parâmetros de fermentação tais como pH, temperatura, fluxo de ar e %DO foram monitorados ao longo de toda a condução de fermentação por dois dias. O caldo de cultivo foi colhido ao final da condução e centrifugado para obter sobrenadante. O sobrenadante contendo GTF088BsT1 (SEQ ID N° 45) foi armazenado em seguida congelado a -80 °C.
DETERMINAÇÃO DA GLICOSILTRANSFERASE GTF0459 E DA ATIVIDADE DE GTF0088BST1
[00175] Realizou-se teste da atividade de glicosiltransferase por meio de incubação de 1-10% (v/v) extrato de proteína bruta que contém enzima GTF com 200 g/l de sacarose em 25 mM ou 50 mM tampão acetato de sódio sob pH 5,5 na presença ou ausência de 25 g/l de dextran (peso molecular de cerca de 1500, Sigma-Aldrich, Cat. n° 31394) a 37 °C e agitação orbital de 125 rpm. Uma parcela de mistura de reação foi retirada após uma, duas e três horas e aquecida a 90 °C por cinco minutos para desativar o GTF. O material insolúvel foi removido por meio de centrifugação a 13.000 xg por cinco minutos, seguido por filtragem através de membrana de 0,2 μm de RC (celulose regenerada). O filtrado resultante foi analisado por meio de HPLC utilizando duas séries de colunas AMINEX HPX-87C a 85 °C (Bio-Rad, Hercules CA) para quantificar a concentração de sacarose. A concentração de sacarose em cada momento foi plotada contra o tempo de reação e a velocidade de reação inicial foi determinada a partir da inclinação da plotagem linear. Uma unidade de atividade de GTF foi definida como a quantidade de enzima necessária para consumir um micromol de sacarose em um minuto sob as condições de teste.
PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO BRUTO DE ALFA-(1,3)-GLUCANO-HIDROLASE (MUTANASE)
[00176] Gene que codifica a mutanase de Penicillium marneffei ATCC® 18224® identificada em GENBANK® como GI:212533325 foi sintetizado pela GenScript (Piscataway NJ). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 46) que codifica sequência de proteínas (MUT3325; SEQ ID N° 47) foi subclonada no plasmídeo pTrex3 em locais de restrição SacII e AscI, um vetor projetado para expressar o gene de interesse em Trichoderma reesei, sob controle do promotor e terminal CBHI, com acetamidase de Aspergillus niger para seleção. O plasmídeo resultante foi transformado em T. reeseii por meio de injeção biolística. O método detalhado de transformação biolística é descrito no Pedido de Patente PCT Internacional publicado WO 2009/126773 A1, que é incorporado ao presente como referência. Um batoque de agar de 1 cm2 com esporos de um clone estável, TRM05-3, foi utilizado para inocular os meios de produção (descritos abaixo). O cultivo cresceu em frascos de agitação por quatro a cinco dias a 28 °C e 220 rpm. Para colher as proteínas secretadas, a massa celular foi removida em primeiro lugar por meio de centrifugação a 4000 g por dez minutos e o sobrenadante foi filtrado através de filtros estéreis de 0,2 μm. A expressão de mutanase MUT3325 (SEQ ID N° 47) foi confirmada por meio de SDS-PAGE.
[00177] O componente de meio de produção encontra-se relacionado abaixo. DEFINIDO POR LACTOSE RICA EM NREL-T
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ELEMENTOS DE TRAÇO DE T. REESEI
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[00178] Cultivo de semente de fermentação foi preparado por meio da inoculação de 0,5 l de meio mínimo em um frasco de dois litros com membrana com 1,0 ml de suspensão de esporos congelados da linhagem de expressão de MUT3325 TRM05-3 (o meio mínimo foi composto de 5 g/l de sulfato de amônio, 4,5 g/l de fosfato de potássio monobásico, 1,0 g/l de hepta-hidrato sulfato de magnésio, 14,4 g/l de ácido cítrico anidro, 1 g/l de di-hidrato cloreto de cálcio, 25 g/l de glicose e elementos de traço, incluindo 0,4375 g/l de ácido cítrico, 0,5 g/l de hepta- hidrato sulfato ferroso, 0,04 g/l de hepta-hidrato sulfato de zinco, 0,008 g/l de penta-hidrato sulfato cúprico, 0,0035 g/l de mono-hidrato sulfato de manganês e 0,002 g/l de ácido bórico; o pH foi 5,5). O cultivo cresceu a 32 °C e 170 rpm por 48 horas antes de ser transferido para 8 l do meio de produção em um fermentador de 14 litros. O meio de produção foi composto de 75 g/l de glicose, 4,5 g/l de fosfato de potássio monobásico, 0,6 g/l de desidrato cloreto de cálcio, 1,0 g/l de hepta-hidrato sulfato de magnésio, 7,0 g/l de sulfato de amônio, 0,5 g/l de ácido cítrico anidro, 0,5 g/l de hepta-hidrato sulfato ferroso, 0,04 g/l de hepta-hidrato sulfato de zinco, 0,00175 g/l de penta-hidrato sulfato cúprico, 0,0035 g/l de mono- hidrato sulfato de manganês, 0,002 g/l de ácido bórico e 0,3 ml/l de FOAMBLAST 882.
[00179] A fermentação foi conduzida em primeiro lugar com crescimento de bateladas sobre glicose a 34 °C e 500 rpm por 24 horas. Ao final de 24 horas, a temperatura foi reduzida para 28 °C e a velocidade de agitação aumentou para 1000 rpm. O fermentador foi alimentado em seguida com uma mistura de glicose e soforose (62% p/p) em velocidade de alimentação específica de 0,030 g de sólidos de glicose-soforose/g de biomassa/h. Ao final da condução, a biomassa foi removida por meio de centrifugação e o sobrenadante contendo a mutanase MUT3325 (SEQ ID N° 47) foi concentrada cerca de dez vezes por meio de ultrafiltragem utilizando cartucho de ultrafiltragem Cut-Off com peso molecular de 10 kD (UFP-10-E-35; GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Grã-Bretanha). A proteína concentrada foi armazenada a -80 °C.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ALFAGLUCANO-HIDROLASE (MUTANASE)
[00180] Polímeros de mutano insolúveis necessários para determinar a atividade de mutanase foram preparados utilizando enzimas secretadas produzidas por Streptococcus sobrinus ATCC® 33478®. Especificamente, um conjunto de padrão de glicerol de S. sobrinus ATCC® 33478® foi riscado sobre uma placa agar BHI (agar de Infusão no Coração e Cérebro, Teknova, Hollister CA) e a placa foi incubada a 37 °C por dois dias. Algumas colônias foram retiradas utilizando um circuito para inocular 2X 100 ml meio líquido BHI na garrafa de meio original da Teknova e o cultivo foi incubado a 37 °C e mantido estático por 24 horas. As células resultantes foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante resultante foi filtrado através de um filtro estéril de 0,2 μm; 2X 101 ml de filtrado foram coletados. Ao filtrado, foram adicionados 2X 11,2 ml de 200 g/l de sacarose (20 g/l de sacarose final). A reação foi incubada a 37 °C sem agitação por 67 horas. Os polímeros de polissacarídeos resultantes foram coletados por meio de centrifugação a 5000xg por dez minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente decantado. Os polímeros insolúveis foram lavados quatro vezes com 40 ml de água estéril. Os polímeros de mutano resultantes foram liofilizados por 48 horas. Polímero de mutano (390 mg) foi suspenso em 39 ml de água estéril para compor uma suspensão de 10 mg/ml. A suspensão de mutano foi homogeneizada por meio de sonicação (40% de amplitude até o desaparecimento de conjuntos grandes, cerca de dez minutos no total). A suspensão homogeneizada foi parcelada e armazenada a 4 °C.
[00181] Teste de mutanase foi iniciado por meio da incubação de uma quantidade apropriada de enzima com 0,5 mg/ml de polímero mutano (preparado conforme descrito acima) em 25 mM de tampão KOAc sob pH 5,5 a 37 °C. Em diversos momentos, uma parcela de mistura de reação foi retirada e resfriada com volume igual de 100 mM de tampão de glicina (pH 10). O material insolúvel em cada amostra resfriada foi removido por meio de centrifugação a 14000xg por cinco minutos. As extremidades redutoras de polímero de oligossacarídeo e polissacarídeo produzido em cada momento foram quantificadas por meio de teste de solução de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PAHBAH) (Lever, M., Anal. Biochem. (1972) 47: 273-279) e a velocidade inicial foi determinada a partir da inclinação da plotagem linear dos primeiros três ou quatro momentos do transcurso. O teste de PAHBAH foi realizado por meio da adição de 10 μl de sobrenadante de amostra de reação a 100 μl de solução de trabalho de PAHBAH, aquecida a 95 °C por cinco minutos. A solução de trabalho foi preparada por meio da mistura de uma parte de reagente A (0,05 g/ml de hidrazida de ácido p-hidróxi benzoico e 5% em volume de ácido clorídrico concentrado) e quatro partes de reagente B (0,05 g/ml de NaOH, 0,2 g/ml de tartarato de potássio e sódio). A absorção a 410 nm foi registrada e a concentração das extremidades redutoras foi calculada por meio da subtração de absorção de fundo apropriada e utilizando uma curva padrão gerada com várias concentrações de glicose como padrões.
ANÁLISE DE PERFIS DE REAÇÃO POR MEIO DE HPLC
[00182] Amostras periódicas de reações foram retiradas e analisadas utilizando HPLC Agilent® 1260 equipado com um detector de índice de refração. Uma coluna Aminex® HP-87C (BioRad, Hercules CA) que contém água deionizada em velocidade de fluxo de 0,6 ml/min e 85 °C foi utilizada para quantificar o nível de sacarose, glicose, leucrose e frutose em reações gtf. Uma coluna Aminex® HP-42A (BioRad) que contém água deionizada em velocidade de fluxo de 0,6 ml/min e 85 °C foi utilizada para quantificar subprodutos de oligossacarídeo solúveis (DP2-DP7) em reações gtf.
[00183] HPLC Dionex® UltiMate® 3000 (Thermo Scientific) equipado com um detector de índice de refração foi utilizado para amostras que envolvem enzimas imobilizadas (Exemplo 4). Uma coluna de monossacarídeo de cálcio Phenomenex® Rezex® que contém água deionizada em velocidade de fluxo de 0,3 ml/min e 85 °C foi utilizada para analisar os açúcares.
ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS POR MEIO DE NMR
[00184] Dados de NMR foram obtidos sobre um espectrômetro Agilent DD2 em operação a 500 MHz para 1H utilizando uma sonda de gradiente de campo pulsado (PFG) com ressonância tripla criogênica de 5 mm. Obteve-se supressão de água colocando-se cuidadosamente a frequência transmissora observada sobre ressonância para o sinal de água residual em um experimento “presat” e, em seguida, utilizando a primeira fatia de um experimento NOESY com um ciclo de fase total (múltiplo de 32) e tempo de mistura de 10 ms. Espectros de 1H unidimensionais foram obtidos com largura de espectro de 6410 Hz, tempo de obtenção de 5,1 s, 65536 pontos de dados, saturação prévia a 4 s e pulso a 90 graus de 5,85 μs. A temperatura da amostra foi mantida a 25 °C. Amostras foram preparadas por meio da adição de 50 μl a um tubo de NMR de 5 mm em conjunto com 450 μl de D2O e 60 μl de D2O contendo 12,4 mM de referência interna DSS (sal de sódio de ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1- sulfônico) com ressonância metila definida em 0 ppm. Atribuições de alteração química para diferentes ligações anoméricas foram retiradas de: Goffin et al (2009, Bull Korean Chem. Soc. 30: 2535-2541. Atribuições de pico foram 5,35 ppm para ligações alfa(1,3), 5,1 ppm para leucrose e 4,95 para ligações alfa(1,6). Extremidades redutoras (RE) foram atribuídas como 5,2 para alfa RE e 4,65 para beta RE.
EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE XAROPE DE AÇÚCAR POR MEIO DE POLIMERIZAÇÃO DE SACAROSE
[00185] Este exemplo descreve a forma geral na qual foi produzida uma mistura de açúcares solúveis por meio da polimerização de sacarose com uma enzima gtf em uma reação de síntese de glucano. Especificamente, foi preparado um filtrado de reação de síntese de glucano, que foi concentrado em seguida em um xarope.
[00186] Adicionou-se sacarose (3000 g) a um balde de polietileno limpo de 19 litros. Adicionou-se água (18,1 l) e Fermasure® (10 ml) ao balde e o pH foi ajustado em 7,0 por meio da adição de 5% em volume de NaOH e 5% em volume de H2SO4. O volume final foi de cerca de 20 l e a concentração inicial de sacarose conforme medido por meio de HPLC foi de 152,5 g/l. A reação de polimerização de glucano foi iniciada por meio da adição de 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruta (SEQ ID N° 3) preparado conforme descrito no capítulo de Métodos Gerais. Este extrato continha cerca de 2,9 mg/ml de proteína. Forneceu-se agitação à solução de reação utilizando um motor mecânico superior equipado com uma haste de vidro e pá de PTFE.
[00187] Após 48 horas, análise de HPLC revelou que 96% da sacarose haviam sido consumidos e a reação foi considerada completa. O produto de polialfa-1,3-glucano insolúvel da reação foi removido por meio de filtragem com um funil de filtro Buchner utilizando peneira de aço de 325 mesh e papel filtro de 40 micra. O líquido mãe (filtrado) foi concentrado em seguida utilizando um evaporador giratório (temperatura de banho de 40-50 °C) até concentração total de açúcar de cerca de 320 g/l de açúcares. A composição do filtrado concentrado é fornecida na Tabela 2. TABELA 2 COMPOSIÇÃO DE FILTRADO CONCENTRADO DE REAÇÃO DE SÍNTESE DE GLUCANO
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[00188] A Tabela 2 indica que o filtrado concentrado da reação de síntese de glucano contém sacarose, frutose, glicose, leucrose e oligossacarídeos de DP2-DP7.
EXEMPLO 2 EFEITO DE ENZIMAS SOBRE A HIDRÓLISE DE AÇÚCARES EM FITRADO DE REAÇÃO DE SÍNTESE DE GLUCANO
[00189] Este exemplo mede a atividade de várias enzimas glicoamilase (EC 3.2.1.3), transglicosidase (EC 2.4.1.24), betaglicosidase (EC 3.2.1.21), alfa-amilase (EC 3.2.1.1) e glicosidase (EC 3.2.1) para fins de redução da concentração de subprodutos de leucrose e/ou oligossacarídeo em um filtrado concentrado de uma reação de síntese de glucano. Certas enzimas tais como DIAZYME RDF ULTRA, transglicosidase (EC 2.4.1.24) e glicoamilase (EC 3.2.1.3), que são todas alfaglicosidase, foram consideradas particularmente eficazes na redução da quantidade desses subprodutos, resultando em aumento correspondente de monossacarídeos (glicose e frutose) no filtrado tratado.
[00190] Um filtrado de reação de síntese de glucano foi preparado em primeiro lugar e concentrado em um xarope de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A composição desse filtrado concentrado é fornecida na Tabela 3. Análise de NMR revelou que a razão entre ligações alfa(1,3) e alfa(1,6) presentes no xarope era de 78:22. Tabela 3 COMPOSIÇÃO DE FILTRADO CONCENTRADO DE REAÇÃO DE SÍNTESE DE GLUCANO
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[00191] O xarope da Tabela 3 foi utilizado para testar a atividade hidrolítica de várias enzimas contra subprodutos de leucrose e oligossacarídeos da reação de síntese de glucano. Não era óbvio no início desses experimentos qual enzima poderia ser utilizada para hidrolisar esses dois subprodutos, considerando que leucrose contém uma ligação habitual [alfa(1,5)-glicosil frutose] e que os oligossacarídeos compreendem principalmente ligações alfa(1,3) e alfa(1,6) glicosilglicose. Enzimas com várias atividades foram selecionadas para essa análise (Tabela 4). TABELA 4 ENZIMAS AVALIADAS PARA DETERMINAÇÃO DE HIDRÓLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS E LEUCROSE
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a DuPont Industrial Biosciences
[00192] Condições de tratamento do xarope da Tabela 3 com cada uma das enzimas acima são fornecidas na Tabela 5 (carga de enzima, tempo, temperatura, pH e concentração de açúcar). O xarope foi diluído com água para atingir a concentração de açúcar usada em cada reação de hidrólise. A Tabela 5 fornece adicionalmente o percentual de hidrólise da leucrose e oligossacarídeos DP3+ (pelo menos DP3-DP7) por cada enzima. O percentual de hidrólise de DP3+ foi calculado como (1 - (% em peso de oligossacarídeos DP3+ no xarope final) / (% em peso de oligossacarídeos DP3+ no xarope inicial)). De forma similar, o percentual de hidrólise de leucrose foi calculado como (1 - (% em peso de leucrose no xarope final) / (% em peso de leucrose no xarope inicial)). TABELA 5 HIDRÓLISE DE LEUCROSE E OLIGOSSACARÍDEOS EM FILTRADO CONCENTRADO POR VÁRIAS ENZIMAS
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a Concentração de açúcar (concentração total de sacarose, glicose, frutose, leucrose e oligossacarídeos) medida por meio de HPLC; os valores relatados são arredondados até os 10 g/l mais próximos b DP3+ contém DP3-DP7, mas pode também conter oligossacarídeos solúveis maiores que possuem alta razão entre ligações alfa- 1,6 e ligações alfa-1,3, quando produzidos utilizando certas enzimas gtf.
[00193] A Tabela 5 indica que 1,4-alfaglicosidase e 1,6- alfaglicosidase exibiram alguma (Exemplo 2.1) ou muito pouca (Exemplo 2.2) hidrólise de leucrose, mas liberaram alguma glicose dos oligossacarídeos. O uso de alfa-amilase (Exemplo 2.3 e Exemplo 2.4) exibiu muito pouca atividade contra os compostos de interesse. De forma similar, o uso de pululanase (Exemplo 2.5) exibiu muito pouca atividade.
[00194] Celulases (Exemplos 2.14 e 2.15) foram, em grande parte, ineficazes na hidrólise de leucrose, mas hidrolisaram alguns dos oligossacarídeos.
[00195] Embora os oligossacarídeos não contivessem ligações beta, surpreendentemente, enzimas betaglicosidase também exibiram faixa de conversão hidrolítica de muito baixa (ACCELERASE BG, Exemplo 2.9) a muito alta (NOVO 188, Exemplos 2.10 e 2.11). A eficácia relativa dessas enzimas variou muito dramaticamente. Em alguns casos, a quantidade de oligossacarídeo que foi hidrolisada excedeu em muito (Exemplo 2.11) ou foi próxima (Exemplo 2.12) do percentual de leucrose que foi hidrolisado. Em outros casos, leucrose foi altamente hidrolisada por betaglicosidase, enquanto os oligossacarídeos foram moderadamente hidrolisados (Exemplo 2.13). A alta disparidade entre os resultados observados com betaglicosidase sugere que a presença de outras enzimas nas formulações de betaglicosidase testadas, tais como glicoamilase ou outro tipo de alfaglicosidase, poderá ser responsável pela atividade observada.
[00196] Por outro lado, os resultados da Tabela 5 indicam que transglicosidase (TG L-2000, Exemplo 2.6) exibiu atividade muito alta na hidrólise dos oligossacarídeos e leucrose. Hidrólise de leucrose por transglicosidase pareceu quantitativa sob certas circunstâncias e mais de 95% do material DP3+ foram hidrolisados em glicose e DP2 em altas cargas de enzima (Exemplo 2.7). Uso de versão purificada de transglicosidase revelou atividade similar (Exemplo 2.8), o que indica que a hidrólise observada deve-se à enzima transglicosidase e não à atividade de fundo.
[00197] Glicoamilases (Exemplos 2.16-2.18) exibiram uma faixa de atividade contra leucrose e os oligossacarídeos. Apenas uma glicoamilase testada (Exemplo 2.18) gerou menos de 30% de hidrólise da leucrose e oligossacarídeos.
[00198] Os resultados da Tabela 5 indicam que alfaglicosidases tais como DIAZYME RDF ULTRA, glicoamilase e transglicosidase podem hidrolisar o subproduto leucrose presente em um filtrado de reação de glucano. A capacidade de alfaglicosidases de hidrolisar leucrose indica que essas enzimas podem hidrolisar ligações alfa-1,5 glicosilfrutose. Embora essa atividade tenha sido exibida acima utilizando leucrose como substrato, acredita- se que essa atividade possa também ser estendida para oligossacarídeos que compreendem ligações alfa-1,5 glicosilfrutose.
[00199] Os resultados da Tabela 5 indicam que alfaglicosidases tais como glicoamilase e transglicosidase podem hidrolisar subprodutos de oligossacarídeos presentes em um filtrado de reação de glucano. Como esses oligossacarídeos são principalmente compostos de unidades de monômeros de glicose ligadas por ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 (Exemplo 3), os dados da Tabela 5 indicam que enzimas alfaglicosidase podem hidrolisar alfa-1,3 glicosilglicose e/ou ligações alfa-1,6 glicosilglicose.
[00200] Como enzimas alfaglicosidase foram geralmente eficazes na hidrólise de subprodutos de leucrose e/ou oligossacarídeo de uma reação de síntese de glucano, essas enzimas podem ser utilizadas isolamente ou em combinação para reduzir o tempo de processamento necessário para gerar xarope com alto teor de pureza de um filtrado de reação de glucano que contém quantidade mais alta de monossacarídeos e quantidade reduzida de subprodutos de açúcar. Um exemplo de combinação de enzimas eficaz poderá ser uma transglicosidase tal como TG L-2000 para hidrólise de leucrose e uma enzima glicoamilase (por exemplo, GC 321) que hidrolisa eficientemente subprodutos de oligossacarídeos.
[00201] Enzimas alfaglicosidase podem, portanto, hidrolisar individualmente (i) ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e (ii) ligações alfa-1,3 e alfa- 1,6 glicosilglicose em certos sacarídeos.
EXEMPLO 3 COMPARAÇÃO DE DISTRIBUIÇÕES DE LIGAÇÃO DE COMPONENTES DE FILTRADO DE REAÇÃO DE GLUCANO ANTES E DEPOIS DA HIDRÓLISE DE ENZIMAS
[00202] Este exemplo mede a atividade hidrolítica de enzimas transglicosidase (EC 2.4.1.24) e betaglicosidase (EC 3.2.1.21) contra subprodutos de leucrose e oligossacarídeos presentes em um filtrado concentrado de uma reação de síntese de glucano. Concluiu-se que transglicosidase reduz a quantidade desses subprodutos, o que resulta em aumento correspondente de monossacarídeos (glicose e frutose) no filtrado tratado.
[00203] Os subprodutos de oligossacarídeos presentes no filtrado da reação de síntese de glucano acima compreendem mais de 90% de ligações glicose-glicose, conforme determinado por meio de NMR (Métodos Gerais). Das ligações de glicose-glicose, cerca de 78% representam ligações alfa-1,3 e cerca de 22% representam ligações alfa-1,6.
[00204] Utilizou-se NMR para determinar o perfil de ligação de material gerado no Exemplo 2.11 acima após hidrólise. Conforme exibido na Figura 1, o pico correspondente a ligações alfa-1,3 foi reduzido em 86%, o pico correspondente a ligações alfa-1,6 foi reduzido em apenas 2,3% e o pico correspondente a picos de leucrose foi reduzido em 21%. Embora a sacarose fosse quase quantitativamente hidrolisada por essa enzima, Novo 188 aparentemente não é capaz de hidrolisar ligações alfa-1,6.
[00205] NMR foi utilizado de forma similar para determinar o perfil de ligação de material gerado utilizando transglicosidase TG L-2000 (SEQ ID N° 1) (Figura 2). 210 μl de filtrado concentrado do material da Tabela 3, 300 μl de D2O e 90 μl de D2O contendo 12,4 mM de DSS como referência interna foram misturados em um tubo NMR para gerar concentração total de açúcar de 300 g/l e aquecidos a 60 °C. Espectro de tempo zero (material de partida na Figura 2) foi obtido após equilíbrio térmico a 60 °C e, em seguida, adicionou-se 0,5% vol de enzima. A amostra foi novamente equilibrada na sonda a 60 °C, calçada e foram tomadas medições em poucos minutos de análise. Após dez horas de tratamento com enzima TG L-2000 (material tratado na Figura 2), os picos correspondentes a ligações alfa-1,3 foram reduzidos em 41%, os picos correspondentes a ligações alfa-1,6 foram reduzidos em 36% e o pico correspondente a leucrose foi reduzido em mais de 95% (Figura 2). Observou-se aumento dos picos de extremidade redutora alfa e extremidade redutora beta, que corresponde a aumento de frutose e glicose (Figura 2).
[00206] Estes resultados demonstram que transglicosidase pode converter oligossacarídeos que contêm ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 em glicose e pode converter leucrose em frutose e glicose. Transglicosidase pode, portanto, hidrolisar (i) ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e (ii) ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose em certos sacarídeos.
EXEMPLO 4 HIDRÓLISE DE LEUCROSE E OLIGOSSACARÍDEOS EM FILTRADO DE REAÇÃO DE GLUCANO UTILIZANDO ENZIMAS IMOBILIZADAS
[00207] Este Exemplo descreve o uso de glicoamilase imobilizada (EC 3.2.1.3) e transglicosidase (EC 2.4.1.24) para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em filtrado obtido de uma reação de síntese de glucano. Foi especificamente estudado o efeito de transglicosidade imobilizada TG L-2000 (SEQ ID N° 1, obtido por meio da Genencor/DuPont Industrial biosciences) e glicoamilase imobilizada GC-147 (obtida por meio da Genencor/DuPont Industrial Biosciences) sobre a hidrólise de leucrose e oligossacarídeos DP2, DP3 e HS (açúcares superiores, DP4+) em um filtrado de reação de síntese de glucano.
[00208] A imobilização das enzimas glicoamilase e transglicosidase foi conduzida de acordo com o método descrito na Patente Norte-Americana n° 5.541.097, que é incorporada ao presente como referência.
[00209] Em um processo típico de imobilização da glicoamilase ou transglicosidase, duas bateladas de cerca de 8,0 g/batelada de terra diatomácea granular porosa (EP Minerals, Reno NV) foram hidratadas com água destilada e transferidas em seguida para um reator de coluna de vidro com 1,5 cm de diâmetro e 30 cm de altura. Bombeou-se água acima do fluxo a cerca de 6-7 ml/min para remover os finos de todas as três colunas. Geralmente, em até uma hora, o efluente de água foi livre de finos. Água foi drenada da coluna para o topo dos leitos de terra diatomácea granular e substituída por 0,1% p/v de solução aquosa de polietilenoimina (PEI, EPOMIN P-1050). 3500 ml da solução de PEI foram bombeados em seguida fluxo acima e o efluente foi reciclado através dos leitos por duas horas. Os leitos de terra diatomácea granular foram lavados em seguida fluxo acima com água destilada por duas horas para remover PEI livre à temperatura ambiente. Desta forma, foram obtidos veículos de PEI e terra diatomácea granular.
[00210] Enquanto isso, 3,5 ml de glicoamilase GC-147 que possui atividade definida na Tabela 4 foram adicionados a 315 ml de 0,02 M tampão de acetato (pH 4,5). 1,575 g de glutaraldeído a 50% p/p (Protectol® GA-50) foram lentamente adicionados em seguida à solução aquosa de glicoamilase com suave mistura e o glutaraldeído foi mantido em reação com a solução aquosa de glicoamilase por quatro horas à temperatura de 20-25 °C com suave agitação, o que resultou na formação de aduto de enzima e glutaraldeído tratado que contém glicoamilase tratada. Separadamente, essas etapas foram repetidas utilizando a transglicosidase TG L-2000 que possui afinidade definida na Tabela 4 em vez da glicoamilase, de forma a resultar na formação de um aduto de enzima e glutaraldeído tratado que contém transglicosidase tratada.
[00211] Cada um dos adutos de enzima e glutaraldeído tratados circulou em seguida por quatro horas (20-25 °C) na sua própria coluna preparada conforme acima, que contém veículo de PEI e terra diatomácea granular. O excesso de aduto tratado foi lavado em seguida para fora dos veículos com água. Foram preparadas desta forma colunas com glicoamilase ou transglicosidase imobilizada.
[00212] Filtrado de glucano que possui a composição definida na Tabela 3 foi diluído em 180 g/l, ajustado em pH 4,5 e passado através de uma coluna que contém uma enzima imobilizada. A temperatura da coluna foi controlada em 60 °C. Após 16 horas de equilíbrio de coluna, foram retiradas amostras periodicamente em diferentes velocidades de fluxo. Composições de açúcar de produtos da reação de hidrólise foram determinadas por meio de HPLC (Tabela 6). A cada vez em que a configuração de velocidade de fluxo era alterada, permitiu-se o reequilíbrio da coluna por pelo menos um a dois volumes de leito antes da amostragem. O grau de hidrólise de leucrose e oligossacarídeos foi calculado utilizando a forma descrita no Exemplo 2. Foram testadas três configurações de coluna: (1) glicoamilase imobilizada; (2) transglicosidase imobilizada; e (3) glicoamilase imobilizada seguida por transglicosidase imobilizada. TABELA 6 APLICAÇÃO DE ENZIMAS TRANSGLICOSIDASE E GLICOAMILASE IMOBILIZADAS PARA HIDROLISAR OLIGOSSACARÍDEOS E LEUCROSE
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[00213] A Tabela 6 indica que, à medida que aumentava o tempo médio de contato (definido como o volume de coluna nominal dividido pela velocidade média de fluxo), o grau de hidrólise de leucrose e oligossacarídeos geralmente aumentava. O uso da transglicosidase imobilizada para hidrolisar leucrose foi particularmente eficaz, pois nenhuma diferença significativa foi observada, mesmo empregando a maior velocidade de fluxo que foi testada. Embora cada coluna individualmente exibisse conversão razoável, a combinação da glicoamilase e transglicosidase gerou hidrólise mais alta de oligossacarídeos.
[00214] O uso de glicoamilase ou transglicosidase imobilizada, ou dos dois tipos de enzimas imobilizadas, representa, portanto, um método eficaz de hidrolisar oligossacarídeos que contêm ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose, bem como leucrose. Estes resultados são consistentes com os do Exemplo 2. A imobilização de outras enzimas alfaglicosidase deverão fornecer resultados similares.
EXEMPLO 5 ENRIQUECIMENTO DE FRUTOSE A PARTIR DE UM FILTRADO DE REAÇÃO DE GLUCANO POR MEIO DE CROMATOGRAFIA
[00215] Este exemplo descreve como frutose, em um filtrado de reação de glucano, pode ser adicionalmente enriquecida por meio de cromatografia.
[00216] Geralmente, ao separar moléculas de açúcar por meio de cromatografia, componentes realizam eluição inversa ao tamanho molecular para que as moléculas maiores realizem eluição em primeiro lugar. Com relação a um filtrado de reação de síntese de glucano, portanto, os oligossacarídeos realizam eluição em primeiro lugar, seguidos por dissacarídeos e, em seguida, monossacarídeos. Separações utilizando uma resina de cátions de sódio não separaram bem frutose e glicose e todos dentre leucrose, sacarose e DP2 realizaram coeluição. É preferido o uso de resinas de troca de íons em que o cátion é cálcio para separar glicose e frutose.
[00217] Um filtrado de reação de síntese de glucano foi preparado em primeiro lugar e concentrado em um xarope de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A composição desse filtrado concentrado é fornecida na Tabela 7. TABELA 7 COMPOSIÇÃO DE FILTRADO CONCENTRADO DE REAÇÃO DE SÍNTESE DE GLUCANO
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[00218] O xarope da Tabela 7 foi filtrado e diluído em 25 g de sólidos secos/100 g de solução com água com íons substituídos e alimentado para uma coluna que contém uma resina de troca de íons ácidos forte reticulada na forma de cálcio. Os parâmetros físicos dessa coluna aparecem na Tabela 8. Xarope diluído (15,8 l) foi alimentado à coluna, que foi mantida a 65 °C, após o quê a coluna foi eluída utilizando água em velocidade de fluxo de 30 l/h. TABELA 8 PARÂMETROS FÍSICOS DA COLUNA
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[00219] Nesta separação, leucrose permaneceu na coluna por mais tempo que sacarose, talvez devido à formação de complexo de leucrose com o cátion de cálcio e, de fato, coeluiu-se com glicose. Foram isoladas duas frações contendo frutose. A fração 5.1 foi eluída entre 47 e 120 minutos e a fração 5.2 eluiu-se entre 120 e 172 minutos. Da frutose alimentada à separação cromatográfica, 95,7% da frutose foram isolados em pureza de mais de 90%. A distribuição de produtos em cada fração (5.1 e 5.2) conforme medido por meio de HPLC aparece na Tabela 9. TABELA 9 DISTRIBUIÇÃO DE PRODUTOS DE FRAÇÕES CROMATOGRÁFICAS CONTENDO QUANTIDADES SIGNIFICATIVAS DE FRUTOSE
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[00220] Como a composição de alimentação para essa separação compreendeu 36,0% de frutose, ao todo, 34,5% do fluxo total foram recuperados na forma de xarope de frutose com >90% em peso de frutose DS. Caso a sacarose na alimentação seja desprezada, 40,7% dos açúcares foram recuperados na forma de xarope de frutose com >90% em peso de frutose DS.
[00221] Frutose em um filtrado de reação de glucano pode, portanto, ser adicionalmente enriquecida por meio de cromatografia. O Exemplo 6 abaixo demonstra que este processo pode ser aprimorado utilizando filtrado de glucano hidrolisado com transglicosidase.
EXEMPLO 6 ENRIQUECIMENTO DE FRUTOSE A PARTIR DE UM FILTRADO DE REAÇÃO DE GLUCANO HIDROLISADO POR MEIO DE CROMATOGRAFIA
[00222] Este exemplo demosntra que o isolamento de frutose de um filtrado de glucano no qual os oligossacarídeos e leucrose foram hidrolisados resulta em aumento da produção de xarope de frutose com alta pureza em comparação com o isolamento de frutose de um filtrado de glucano não hidrolisado.
[00223] Preparou-se um xarope por meio de concentração (vácuo a 50 °C), filtrado de glucano que havia sido tratado com 1% vol de transglicosidase TG L-2000 (SEQ ID N° 1) por 24 horas a 60 °C e pH 4,5. Observou-se alguma formação de oligossacarídeos durante o processo de concentração, o que era esperado, pois enzimas transglicosidase são conhecidas por criarem oligossacarídeos em altas concentrações de monossacarídeos. O xarope possuía a distribuição final de produto descrita na Tabela A. TABELA A COMPOSIÇÃO DE FILTRADO DE GLUCANO CONCENTRADO QUE FOI HIDROLISADO ANTES DA CONCENTRAÇÃO
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[00224] O xarope descrito na Tabela A foi filtrado e diluído a 25,4 g DS/100 g de solução com água com íons substituídos e alimentado para uma coluna que contém uma resina de troca de cátions ácidos forte reticulada na forma de cálcio. Os parâmetros físicos da coluna aparecem na Tabela B. Xarope diluído (169 g) foi alimentado em seguida à coluna, que foi mantida a 65 °C, após o quê a coluna foi eluída utilizando água em velocidade de fluxo de 50 ml/min. TABELA B PARÂMETROS FÍSICOS DA COLUNA
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[00225] Foram isoladas duas frações contendo frutose. A fração 6.1 foi eluída entre 73 e 103 minutos e a fração 6.2 eluiu-se entre 103 e 120 minutos. Da frutose alimentada à separação cromatográfica, 93,0% da frutose alimentada para a coluna foram isolados na fração 6.2 com pureza de mais de 90%. A distribuição de produtos em cada fração (6.1 e 6.2) conforme medido por meio de HPLC aparece na Tabela C. TABELA C DISTRIBUIÇÃO DE PRODUTO DE FRAÇÕES CROMATOGRÁFICAS CONTENDO FRUTOSE DE UM FILTRADO DE GLUCANO HIDROLISADO
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[00226] A eficiência de separação reduzida neste exemplo em comparação com o Exemplo 5 pode ser atribuída a diferenças de escala da coluna e da fração de glicose mais alta da amostra. Ainda assim, purificação cromatográfica deste material resultou em aumento da produção de xarope de frutose com alta pureza em comparação com a atingida no Exemplo 5, pois o xarope foi preparado cromatograficamente a partir de um filtrado de glucano que não havia sido hidrolisado por transglicosidase. Como a composição de alimentação para essa separação compreendeu 47% de frutose (Tabela A), 43,7% do fluxo total foram recuperados na forma de xarope de frutose com >90% em peso de frutose DS. Esta recuperação de 43,7% é significativamente melhor que a recuperação de 34,5% do Exemplo 5.
[00227] Por isso, isolamento de frutose de um filtrado de glucano que foi hidrolisado com transglicosidase resulta em aumento de rendimento de frutose em comparação com o isolamento de frutose de um filtrado de glucano não hidrolisado.
EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DE ETANOL POR MEIO DE FERMENTAÇÃO DE FILTRADO DE UMA REAÇÃO DE SÍNTESE DE GLUCANO
[00228] Este exemplo descreve a fermentação de levedura de filtrado de glucano em etanol.
[00229] Creme de levedura (S. cerevisiae) (moinho Tonon, Brasil) foi lavado por meio de suspensão do creme em água da torneira (2,4 l, densidade óptica de 65 a 600 nm) e, em seguida, centrifugação do creme de levedura por cinco minutos utilizando uma centrífuga LEGEND XTR (Thermo Scientific) a 4500 g. Após a decantação do sobrenadante, as células de levedura foram novamente suspensas e concentradas por meio de centrifugação duas vezes adicionais. Após a terceira lavagem, o pH foi ajustado em 2 por meio da adição de 5% em peso de ácido sulfúrico. A densidade óptica foi medida utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001 (Thermo Scientific) e ajustada em 100 a 600 nm por meio da adição de água da torneira. O creme de levedura ajustado (1,5 l) foi adicionado a um recipiente de fermentador BIOFLO310 de 7,5 l (New Brunswick). O fermentador foi ajustado para manter a temperatura a 30 °C e agitação a 100 rpm. Embora o pH fosse medido durante a fermentação, ele não foi controlado pela adição de soluções ácidas ou básicas.
[00230] Uma solução de alimentação que contém extrato de levedura (10 g/l), peptona (20 g/l) e 200 g/l de açúcares de um filtrado de glucano foi preparada e esterilizada utilizando autoclave PHOENIX AV-250 PLUS a 121 °C por quinze minutos. A solução de alimentação foi mantida em resfriamento a 25 °C (temperatura ambiente) antes do início da fermentação. A solução de alimentação esterilizada (3,5 l) foi adicionada ao fermentador por cerca de cinco horas em velocidade de 684 ml/h e a fermentação foi mantida em processamento por 22 horas.
[00231] Amostras periódicas foram tomadas durante a fermentação e analisadas para determinar a densidade óptica utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001, Brix utilizando um refratômetro PAL-3 (Atago) e concentrações de açúcar e etanol por meio de HPLC (Métodos Gerais). Estes resultados encontram-se resumidos na Tabela 10. TABELA 10 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO PARA A PRIMEIRA FERMENTAÇÃO DE ETANOL
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[00232] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-22 horas).
[00233] Ao término da fermentação, as células de levedura foram separadas por meio de centrifugação utilizando uma centrífuga LEGEND XTR a 4500 g por cinco minutos. Após a decantação do sobrenadante, a levedura foi novamente suspensa e concentrada por meio de centrifugação duas vezes adicionais. Após a terceira lavagem, o pH foi ajustado em 2 por meio da adição de 5% em peso de ácido sulfúrico. A densidade óptica foi medida utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001 e ajustada em 100 a 600 nm por meio da adição de água da torneira. Dois ciclos de fermentação adicionais, cada qual utilizando alimentação nova, foram realizados empregando células de levedura recicladas da fermentação anterior seguindo as mesmas condições descritas acima. Os resultados de fermentação obtidos utilizando levedura reciclada pela primeira e segunda vez são fornecidos nas Tabelas 11 e 12, respectivamente. TABELA 11 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO UTILIZANDO A PRIMEIRA RECICLAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA
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[00234] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-21 horas). TABELA 12 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO UTILIZANDO A SEGUNDA RECICLAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA
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[00235] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-21 horas).
[00236] Muito pouca leucrose foi consumida na primeira fermentação, embora as células de levedura começassem a aclimatar-se e consumir leucrose na segunda reciclagem. Títulos de fermentação de etanol aumentaram de 33 g/l (Tabela 10, 22 horas) para 54 g/l (Tabela 12, 21 hroas) após três ciclos de fermentação com levedura reciclada, embora quantidades significativas de leucrose estivessem presentes no meio, mesmo após o último ciclo.
[00237] Pode-se utilizar, portanto, filtrado de glucano em um processo de fermentação para produzir etanol.
EXEMPLO 8 PRODUÇÃO DE ETANOL POR MEIO DA FERMENTAÇÃO DE FILTRADO DE GLUCANO HIDROLISADO
[00238] Este exemplo demonstra que a fermentação de filtrado de glucano no qual os componentes de subprodutos de leucrose e oligossacarídeo foram sacarificados anteriormente resulta em aumento da produção de etanol.
[00239] Fermentações foram realizadas seguindo o procedimento descrito no Exemplo 7, mas empregando um filtrado de glucano que foi tratado anteriormente com transglicosidase (TG L-2000, SEQ ID N° 1). Filtrado de glucano hidrolisado foi preparado conforme segue. Filtrado de glucano foi ajustado em 300 g de açúcares/l e, em seguida, o pH foi ajustado em 4,0 utilizando 1,0 M de hidróxido de sódio e 5% em peso de ácido sulfúrico. O volume final desta preparação foi de 6,75 l. A solução de filtrado foi esterilizada em seguida utilizando um autoclave PHOENIX AV-250 PLUS a 121 °C por quinze minutos e, em seguida, a temperatura foi ajustada a 60 °C. Extrato de enzima TG L-2000 conforme descrito na Tabela 4 (135 ml) foi misturado com o filtrado esterilizado e a solução foi incubada em um agitador incubador (IKA KS4000) a 60 °C e 100 rpm por 72 horas. Filtrado de glucano hidrolisado foi preparado desta forma.
[00240] Creme de levedura (S. cerevisiae) (moinho Bom Retiro, Brasil) foi lavado por meio de suspensão do creme em água da torneira (2,4 l, densidade óptica de 65 a 600 nm) e, em seguida, centrifugação do creme de levedura por cinco minutos utilizando uma centrífuga LEGEND XTR a 4500 g. Após a decantação do sobrenadante, a levedura foi novamente suspensa e concentrada por meio de centrifugação duas vezes adicionais. Após a terceira lavagem, o pH foi ajustado em 4,5 por meio da adição de 5% em peso de ácido sulfúrico e a densidade óptica foi medida utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001 e ajustada em 100 a 600 nm por meio da adição de água da torneira. O creme de levedura ajustado (1,5 l) foi adicionado a um recipiente de fermentador BIOFLO310 de 7,5 l. O fermentador foi configurado para manter a temperatura a 30 °C, agitação a 100 rpm e pH 4,5 utilizando 4 M hidróxido de amônio aquoso ou 5% em peso de ácido sulfúrico aquoso.
[00241] Uma solução de alimentação contendo extrato de levedura (10 g/l), peptona (20 g/l) e 200 g/l de açúcares do filtrado hidrolisado foi preparada e esterilizada utilizando um autoclave PHOENIX AV-250 Plus a 121 °C por quinze minutos. A solução de alimentação foi mantida em resfriamento a 25 °C (temperatura ambiente) antes do início da fermentação. A solução de alimentação esterilizada (3,5 l) foi adicionada ao fermentador por cerca de cinco horas em velocidade de 684 ml/h e a fermentação foi mantida em processamento por 22 horas.
[00242] Amostras periódicas foram tomadas durante a fermentação e analisadas para determinar a densidade óptica utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001, Brix utilizando um refratômetro PAL-3 e concentrações de açúcar e etanol por meio de HPLC (Métodos Gerais). Estes resultados encontram- se resumidos na Tabela 13. TABELA 13 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO PARA A PRIMEIRA FERMENTAÇÃO DE ETANOL UTILIZANDO FILTRADO DE GLUCANO HIDROLISADO
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[00243] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-22 horas).
[00244] Ao término da fermentação, as células de levedura foram separadas por meio de centrifugação utilizando uma centrífuga LEGEND XTR a 4500 g por cinco minutos. Após a decantação do sobrenadante, as células de levedura foram novamente suspensas e concentradas por meio de centrifugação duas vezes adicionais. Após a terceira lavagem, o pH foi ajustado em 2 por meio da adição de 5% em peso de ácido sulfúrico. A densidade óptica foi medida utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001 e ajustada em 100 a 600 nm por meio da adição de água da torneira. Dois ciclos de fermentação adicionais, cada qual utilizando alimentação nova, foram realizados empregando células de levedura recicladas da fermentação anterior seguindo as mesmas condições descritas acima. Os resultados de fermentação obtidos utilizando células de levedura recicladas pela primeira e pela segunda vez são fornecidos nas Tabelas 14 e 15, respectivamente. TABELA 14 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO UTILIZANDO A PRIMEIRA RECICLAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA COM FILTRADO DE GLUCANO HIDROLISADO
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[00245] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-21 horas). TABELA 15 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO UTILIZANDO A SEGUNDA RECICLAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA COM FILTRADO DE GLUCANO HIDROLISADO
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[00246] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-21 horas).
[00247] Todas as fermentações foram essencialmente encerradas em até cerca de seis horas após o início da fermentação e resultaram em títulos de etanol de 57-60,0 g/l. A comparação dessas fermentações com as do Exemplo 7 demonstra que a hidrólise de um filtrado de glucano antes da sua submissão à fermentação resulta em rendimentos de etanol maiores e mais rápidos que os obtidos com fermentações que utilizam filtrado de glucano não hidrolisado.
[00248] A fermentação de filtrado de glucano no qual os componentes de subprodutos de leucrose e oligossacarídeo foram sacarificados resulta, portanto, em aumento da produção de etanol sob velocidades mais altas. Essa sacarificação pode ser realizada utilizando, por exemplo, transglicosidase.
EXEMPLO 9 SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS DE UMA SOLUÇÃO DE FILTRADO DE GLUCANO
[00249] Este exemplo descreve que a sacarificação e fermentação simultânea de alimentação que contém filtrado de glucano pode resultar em aumento das propriedades de fermentação.
[00250] Creme de levedura (S. cerevisiae) (moinho Bom Retiro, Brasil) foi lavado por meio de suspensão do creme em água da torneira (2,4 l, densidade óptica de 65 a 600 nm) e, em seguida, centrifugação do creme de levedura por cinco minutos utilizando uma centrífuga LEGEND XTR a 4500 g. Após a decantação do sobrenadante, as células de levedura foram novamente suspensas e concentradas por meio de centrifugação duas vezes adicionais. Após a terceira lavagem, o pH foi ajustado em 4,5 por meio da adição de 5% em peso de ácido sulfúrico e a densidade óptica foi medida utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001 e ajustada em 100 a 600 nm por meio da adição de água da torneira. O creme de levedura ajustado (1,5 l) foi adicionado a um recipiente de fermentador BIOFLO310 de 7,5 l. O fermentador foi configurado para manter a temperatura a 30 °C, agitação a 100 rpm e pH 4,5 utilizando 4 M hidróxido de amônio aquoso ou 5% em peso de ácido sulfúrico aquoso.
[00251] Uma solução de alimentação que contém extrato de levedura (10 g/l), peptona (20 g/l) e 200 g/l de açúcares de um filtrado de glucano foi preparada e esterilizada utilizando autoclave PHOENIX AV-250 PLUS a 121 °C por quinze minutos. A solução de alimentação foi mantida em resfriamento a 25 °C (temperatura ambiente) antes do início da fermentação. Extrato de enzima transglicosidase TG L-2000 conforme descrito na Tabela 4 (1% v/v) foi adicionado à solução de alimentação esterilizada imediatamente antes da adição da solução ao fermentador. A solução de alimentação (3,5 l) que contém enzima TG L-2000 foi adicionada ao fermentador por cerca de cinco horas a 684 ml/h e a fermentação foi mantida em processamento por 48 horas.
[00252] Amostras periódicas foram tomadas durante a fermentação e analisadas para determinar a densidade óptica utilizando um espectrofotômetro GENESYS 20 4001, Brix utilizando um refratômetro PAL-3 (Atago) e concentrações de açúcar e etanol por meio de HPLC (Métodos Gerais). Estes resultados encontram-se resumidos na Tabela 16. TABELA 16 PERFIS DE FERMENTAÇÃO AO LONGO DO TEMPO E ALIMENTAÇÃO PARA SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO DE ETANOL SIMULTÂNEAS DE FILTRADO DE GLUCANO
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[00253] São relacionadas as concentrações (g/l) de compostos de açúcar e etanol (EtOH) na alimentação e em diversos momentos de fermentação (0-48 horas).
[00254] A fermentação encerrou-se nominalmente em seis horas, similar às fermentações em que o filtrado foi hidrolisado antes da etapa de fermentação (Exemplo 8), e forneceu título levemente superior de etanol (62 g/l) em comparação com o uso de filtrado não hidrolisado (Exemplo 7). Além disso, quase toda a leucrose foi consumida em seis horas (compare a Tabela 16 com as Tabelas 13-15). Além da adição de uma enzima sacarificadora, tal como TG L-2000, a uma alimentação que contém filtrado de glucano pouco antes da fermentação, resultados similares deverão ser obtidos caso a enzima sacarificadora seja adicionada diretamente à fermentação.
[00255] Sacarificação e fermentação simultâneas de uma alimentação que contém filtrado de glucano podem resultar, portanto, em propriedades de fermentação aprimoradas, tais como aumento (i) do consumo de componentes de filtrado de glucano (por exemplo, leucrose) e (ii) da produção de etanol e da velocidade de produção.
EXEMPLO 10 PREPARAÇÃO DE VÁRIAS ALFAGLICOSIDASES
[00256] Este exemplo descreve a preparação de diversas alfaglicosidases além das alfaglicosidases (transglicosidase, glicoamilase, DIAZYME RDF ULTRA) utilizadas em alguns dos Exemplos acima. Essas alfaglicosidases adicionais foram testadas para determinar a atividade hidrolítica contra oligossacarídeos que compreendem ligações alfa-1,5 glicosilfrutose ou alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose nos Exemplos 11, 12, 15 e 16 fornecidos abaixo.
DESCOBERTA DE ALFAGLICOSIDASE DE ASPERGILLUS CLAVATUS (ACLGLUI)
[00257] Uma linhagem de Aspergillus clavatus foi selecionada como fonte potencial de outras enzimas que podem ser úteis em diversas aplicações industriais. Um dos genes identificados em Aspergillus clavatus codifica uma alfaglicosidase e a sequência desse gene, denominado “Aclglu1”, é fornecida em SEQ ID N° 4. A proteína correspondente codificada por SEQ ID N° 4 é fornecida em SEQ ID N° 5. Aclgu1 pertence à família de glicosil hidrolase 31 com base em pesquisa de PFAM (pfam.sanger.ac.uk). No terminal N, a proteína (SEQ ID N° 5) contém um peptídeo de sinal com comprimento de 19 aminoácidos, conforme previsto por meio de SignalP versão 4.0 (Nordahl Petersen et al, 2011, Nature Methods, 8: 785-786). A presença de uma sequência de sinal sugere que Aclglu1 é uma enzima secretada. A sequência de aminoácidos da forma madura prevista de Aclglu1 é descrita como SEQ ID N° 6.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE ASPERGILLUS CLAVATUS ACLGLUI
[00258] Um gene Aclglu1 sintético foi clonado em vetor de expressão pTrex3gM (descrito no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2011/0136197, incorporado ao presente como referência) e o plasmídeo resultante foi denominado pJG294. A sequência do gene Aclglu1 foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA.
[00259] O plasmídeo pJG294 foi transformado em uma linhagem de Trichoderma reesei com quad excluído (descrita em WO 05/001036) utilizando um método biolístico (Te’o VS et al, J. Microbiol. Methods, 51: 393-9, 2002). A proteína, que se previu compreender SEQ ID N° 6, foi secretada no meio extracelular e utilizou-se meio de cultivo filtrado para realizar SDS-PAGE e testes de atividade da alfaglicosidase para confirmar a expressão da enzima.
DESCOBERTA DE ALFAGLICOSIDASE DE NEOSARTORYA FISCHERI NFIGLUI
[00260] Uma linhagem de Neosartorya fischeri foi selecionada como fonte potencial de outras enzimas que podem ser úteis em diversas aplicações industriais. Um dos genes identificados em Neosartorya fischeri codifica uma alfaglicosidase e a sequência desse gene, denominado “Nfiglu1”, é fornecida em SEQ ID N° 7. A proteína correspondente codificada por SEQ ID N° 7 é fornecida em SEQ ID N° 8. Nfligul pertence à família de glicosil hidrolase 31 com base em pesquisa de PFAM (pfam.sanger.ac.uk). No terminal N, a proteína (SEQ ID N° 8) contém um peptídeo de sinal com comprimento de 19 aminoácidos, conforme previsto por meio de SignalP versão 4.0 (Nordahl Petersen et al, 2011, Nature Methods, 8: 785-786). A presença de uma sequência de sinal sugere que Nfiglu1 é uma enzima secretada. A sequência de aminoácidos da forma madura prevista de Nfiglu1 é descrita como SEQ ID N° 9.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE NEOSARTORYA FISCHERI NFIGLUI
[00261] Um gene Nfiglu1 sintético foi clonado em vetor de expressão pTrex3gM (descrito no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2011/0136197) e o plasmídeo resultante foi denominado pJG295. A sequência do gene Nfiglu1 foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA.
[00262] O plasmídeo pJG295 foi transformado em uma linhagem de Trichoderma reesei com quad excluído (descrita em WO 05/001036) utilizando um método biolístico (Te’o VS et al, J. Microbiol. Methods, 51: 393-9, 2002). A proteína, que se previu compreender SEQ ID N° 9, foi secretada no meio extracelular e utilizou-se meio de cultivo filtrado para realizar SDS-PAGE e testes de atividade da alfaglicosidase para confirmar a expressão da enzima.
DESCOBERTA DE ALFAGLICOSIDASE DE NEUROSPORA CRASSSA NCRGLUI
[00263] Uma linhagem de Neurospora crassa foi selecionada como fonte potencial de outras enzimas que podem ser úteis em diversas aplicações industriais. Um dos genes identificados em Neurospora crassa codifica uma alfaglicosidase e a sequência desse gene, denominado “Ncrglu1”, é fornecida em SEQ ID N° 10. A proteína correspondente codificada por SEQ ID N° 10 é fornecida em SEQ ID N° 11. Ncrgul pertence à família de glicosil hidrolase 31 com base em pesquisa de PFAM (pfam.sanger.ac.uk). No terminal N, a proteína (SEQ ID N° 11) contém um peptídeo de sinal com comprimento de 22 aminoácidos, conforme previsto por meio de SignalP versão 4.0 (Nordahl Petersen et al, 2011, Nature Methods, 8: 785-786). A presença de uma sequência de sinal sugere que Ncrglu1 é uma enzima secretada. A sequência de aminoácidos da forma madura prevista de Ncrglu1 é descrita como SEQ ID N° 12.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE NEUROSPORA CRASSA NCRGLUI
[00264] Um gene Ncrglu1 sintético foi clonado em vetor de expressão pTrex3gM (descrito no Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° 2011/0136197) e o plasmídeo resultante foi denominado pJG296. A sequência do gene Ncrglu1 foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA.
[00265] O plasmídeo pJG296 foi transformado em uma linhagem de Trichoderma reesei com quad excluído (descrita em WO 05/001036) utilizando um método biolístico (Te’o VS et al, J. Microbiol. Methods, 51: 393- 399, 2002). A proteína, que se previu compreender SEQ ID N° 12, foi secretada no meio extracelular e utilizou-se meio de cultivo filtrado para realizar SDS- PAGE e testes de atividade da alfaglicosidase para confirmar a expressão da enzima.
DESCOBERTA DE ALFAGLICOSIDASE DE RASAMSONIA COMPOSTICOLA TAUSEC098
[00266] Uma linhagem de Rasamsonia composticola foi selecionada como fonte potencial de outras enzimas que podem ser úteis em diversas aplicações industriais. Um dos genes identificados em Rasamsonia composticola codifica uma alfaglicosidase e a sequência desse gene, denominado “TauSec098”, é fornecida em SEQ ID N° 13. A proteína correspondente codificada por SEQ ID N° 13 é fornecida em SEQ ID N° 14. TauSec098 pertence à família de glicosil hidrolase 31 e contém um domínio CBM 20 N-terminal com base em pesquisa de PFAM (pfam.sanger.ac.uk). No terminal N, a proteína (SEQ ID N° 14) contém um peptídeo de sinal com comprimento de 22 aminoácidos, conforme previsto por meio de SignalP versão 4.0 (Nordahl Petersen et al, 2011, Nature Methods, 8: 785-786). A presença de uma sequência de sinal sugere que TauSec098 é uma enzima secretada. A sequência de aminoácidos da forma madura prevista de TauSec098 é descrita como SEQ ID N° 15.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE RASAMSONIA COMPOSTICOLA TAUSEC098
[00267] Um gene TauSec098 sintético foi clonado no vetor de expressão de Trichoderma reesei pGXT (plasmídeo derivado de pTTT) pela Generay Biotech Co. (Xangai, China) e o plasmídeo resultante foi denominado pGX256-TauSec098. A sequência do gene TauSec098 foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA.
[00268] O plasmídeo pGX256-TauSec098 foi transformado em uma linhagem de Trichoderma reesei com quad excluído (descrita em WO 05/001036) utilizando transformação de protoplastas (Te’o et al, J. Microbiol. Methods 51: 393-399, 2002). Os transformadores foram selecionados sobre um meio contendo acetamid como única fonte de nitrogênio (acetamida, 0,6 g/l; cloreto de césio, 1,68 g/l; glicose, 20 g/L; di-hidrogênio fosfato de potássio, 15 g/l; hepta-hidrato sulfato de magnésio, 0,6 g/l; di-hidrato cloreto de cálcio, 0,6 g/l; sulfato de ferro (II), 5 mg/l; sulfato de zinco, 1,4 mg/l; cloreto de cobalto (II), 1 mg/l; sulfato de manganês (II), 1,6 mg/l; agar, 20 g/l; pH 4,25). Colônias transformadas (cerca de 50-100) surgiram em cerca de uma semana. Após crescimento sobre placas de acetamida, os esporos de transformadores foram coletados e transferidos para novas placas de agar de acetamida. Após cinco dias de crescimento sobre placas de acetamida, 1x108 esporos foram inoculados em 30 ml de meios definidos por glicose/soforose em um frasco de agitação de 250 ml. O frasco de agitação foi agitado a 28 °C por cinco dias. Sobrenadantes desses cultivos foram utilizados para confirmar a expressão (SDS PAGE) e atividade de enzima TauSec098 madura (SEQ ID N° 15).
DESCOBERTA DE ALFAGLICOSIDASE DE RASAMSONIA COMPOSTICOLA TAUSEC099
[00269] Uma linhagem de Rasamsonia composticola foi selecionada como fonte potencial de outras enzimas que podem ser úteis em diversas aplicações industriais. Um dos genes identificados em Rasamsonia composticola codifica uma alfaglicosidase e a sequência desse gene, denominado “TauSec099”, é fornecida em SEQ ID N° 16. A proteína correspondente codificada por SEQ ID N° 16 é fornecida em SEQ ID N° 17. TauSec099 pertence à família de glicosil hidrolase 31 com base em pesquisa de PFAM (pfam.sanger.ac.uk). No terminal N, a proteína (SEQ ID N° 17) contém um peptídeo de sinal com comprimento de 17 aminoácidos, conforme previsto por meio de SignalP versão 4.0 (Nordahl Petersen et al, 2011, Nature Methods, 8: 785-786). A presença de uma sequência de sinal sugere que TauSec099 é uma enzima secretada. A sequência de aminoácidos da forma madura prevista de TauSec099 é descrita como SEQ ID N° 18.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE RASAMSONIA COMPOSTICOLA TAUSEC099
[00270] Um gene TauSec099 sintético foi clonado no vetor de expressão de Trichoderma reesei pGXT (plasmídeo derivado de pTTT) pela Generay Biotech Co. (Xangai, China) e o plasmídeo resultante foi denominado pGX256-TauSec099. A sequência do gene TauSec0998 foi confirmada por meio de sequenciamento de DNA.
[00271] O plasmídeo pGX256-TauSec099 foi transformado em uma linhagem de Trichoderma reesei com quad excluído (descrita em WO 05/001036) utilizando transformação de protoplastas (Te’o et al, J. Microbiol. Methods 51: 393-399, 2002). Os transformadores foram selecionados sobre um meio contendo acetamid como única fonte de nitrogênio (acetamida, 0,6 g/l; cloreto de césio, 1,68 g/l; glicose, 20 g/L; di- hidrogênio fosfato de potássio, 15 g/l; hepta-hidrato sulfato de magnésio, 0,6 g/l; di-hidrato cloreto de cálcio, 0,6 g/l; sulfato de ferro (II), 5 mg/l; sulfato de zinco, 1,4 mg/l; cloreto de cobalto (II), 1 mg/l; sulfato de manganês (II), 1,6 mg/l; agar, 20 g/l; pH 4,25). Colônias transformadas (cerca de 50-100) surgiram em cerca de uma semana. Após crescimento sobre placas de acetamida, os esporos de transformadores foram coletados e transferidos para novas placas de agar de acetamida. Após cinco dias de crescimento sobre placas de acetamida, 1x108 esporos foram inoculados em 30 ml de meios definidos por glicose/soforose em um frasco de agitação de 250 ml. O frasco de agitação foi agitado a 28 °C por cinco dias. Sobrenadantes desses cultivos foram utilizados para confirmar a expressão (SDS PAGE) e atividade de enzima TauSec099 madura (SEQ ID N° 18).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLUI
[00272] Um gene de alfaglicosidase, “BloGlu1” foi identificado a partir de Bifidobacterium longum subsp. longum JDM301. A sequência de ácidos nucleicos para o gene BloGlul (SEQ ID N° 19, conta GENBANK n° NC014169.1, sequência complementar das posições 140600 a 142414) e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética (SEQ ID N° 20) codificada por SEQ ID N° 19 foram encontradas na conta GENBANK n° YP_003660432.1.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLUI
[00273] A sequência de DNA que codifica a proteína BloGlu1 completa (SEQ ID N° 20) foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 21) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co. (Xangai, China), resultando em p3JM-BloGlu1. O plasmídeo p3JM-BloGlu1 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência BloGlul otimizada (SEQ ID N° 21).
[00274] O plasmídeo p3JM-BloGlu1 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BloGlu1 (SEQ ID N° 20).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLU2
[00275] Alfaglicosidase, BloGlu2, foi identificada a partir de Bifidobacterium longum. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 22) de BloGlu2 foi encontrada no banco de dados NCBI (conta GENBANK n° WP_007054665.1).
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLU2
[00276] Uma sequência de DNA que codifica proteína BloGlu2 foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 23) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BloGlu2. SEQ ID N° 23 codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 24. O plasmídeo p3JM-BloGlu2 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BloGlu2 otimizada (SEQ ID N° 23).
[00277] O plasmídeo p3JM-BloGlu2 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BloGlu2 (SEQ ID N° 24).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLU3
[00278] Um gene de alfaglicosidase, “BloGlu3” foi identificado a partir de Bifidobacterium longum subsp. longum F8. A sequência de ácidos nucleicos para o gene BloGlu3 (SEQ ID N° 25, conta GENBANK n° NC_021008.1, posições 2130627 a 2132441) e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética (SEQ ID N° 26) codificada por SEQ ID N° 25 foram encontradas na conta GENBANK n° YP_007768249.1.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM BLOGLU3
[00279] A sequência de DNA que codifica a proteína BloGlu3 completa (SEQ ID N° 26) foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 27) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BloGlu3. O plasmídeo p3JM-BloGlu3 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BloGlu3 otimizada (SEQ ID N° 27).
[00280] O plasmídeo p3JM-BloGlu3 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BloGlu3 (SEQ ID N° 26).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM PSEUDOLONGUM BPSGLUI
[00281] Alfaglicosidase, BpsGlu1, foi identificada a partir de Bifidobacterium pseudolongum. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 28) de BpsGluI foi encontrada no banco de dados NCBI (conta GENBANK n° WP_022858408.1).
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM PSEUDOLONGUM BPSGLUI
[00282] Uma sequência de DNA que codifica proteína BpsGlu1 foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 29) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BpsGlu1. SEQ ID N° 29 codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 30. O plasmídeo p3JM-BpsGlu1 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BpsGluI otimizada (SEQ ID N° 29).
[00283] O plasmídeo p3JM-BpsGlu1 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BpsGluI (SEQ ID N° 30).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM THERMOPHILUM BTHGLUI
[00284] Um gene de alfaglicosidase, “BthGlu1” foi identificado a partir de Bifidobacterium thermophilum RBL67. A sequência de ácidos nucleicos do gene BthGlul (SEQ ID N° 31, conta GENBANK n° NC_020546.1, posições 150690 a 152495) e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética (SEQ ID N° 32) codificada por SEQ ID N° 31 foram encontradas na conta GENBANK n° YP_007592840.1.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM THERMOPHILUM BTHGLUI
[00285] A sequência de DNA que codifica a proteína BthGlu1 completa (SEQ ID N° 32) foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 33) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BthGlu1. O plasmídeo p3JM- BthGlu1 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BthGlul otimizada (SEQ ID N° 33).
[00286] O plasmídeo p3JM-BthGlu1 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BthGlu1 (SEQ ID N° 32).
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BREVE BBRGLU2
[00287] Alfaglicosidase, BbrGlu2, foi identificada a partir de Bifidobacterium breve. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 34) de BbrGlu2 foi encontrada no banco de dados NCBI (conta GENBANK n° WP_003827971.1).
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BREVE BBRGLU2
[00288] Uma sequência de DNA que codifica proteína BbrGlu2 foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 35) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BpsGlu2. SEQ ID N° 35 codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 36. O plasmídeo p3JM-BpsGlu2 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BbrGlu2 otimizada (SEQ ID N° 35).
[00289] O plasmídeo p3JM-BbrGlu2 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar SEQ ID N° 36.
SEQUÊNCIAS DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BREVE BBRGLU5
[00290] Gene alfaglicosidase, “BbrGlu5”, foi identificado a partir de Bifidobacterium breve ACS-071-V-Sch8b. A sequência de ácidos nucleicos do gene BbrGlu5 (SEQ ID N° 37, conta GENBANK n° NC_017218.1, complemento de sequência das posições 2241075 a 2242895) e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética (SEQ ID N° 38) codificada por SEQ ID N° 37 foram encontradas na conta GENBANK n° YP_005583701.1.
EXPRESSÃO DE ALFAGLICOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BREVE BBRGLU5
[00291] A sequência de DNA que codifica a proteína BbrGlu5 completa (SEQ ID N° 38) foi otimizada para expressão em B. subtilis, sintetizada em seguida (gerando SEQ ID N° 39) e inserida no plasmídeo p3JM pela Generay Biotech Co., resultando em p3JM-BbrGlu5. O plasmídeo p3JM- BbrGlu5 contém um promotor aprE para dirigir a expressão da sequência de BbrGlu5 otimizada (SEQ ID N° 39).
[00292] O plasmídeo p3JM-BbrGlu5 foi utilizado para transformar células de B. subtilis (degUHy32, ΔnprB, Δvpr, Δepr, ΔscoC, ΔwprA, Δmpr, ΔispA, Δbpr) e as células transformadas foram espalhadas sobre placas Luria Agar suplementadas com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com inserção correta, conforme confirmado por meio de PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida a fermentação em um frasco de agitação de 250 ml com meio MBD (meio definido com base em MOPS suplementado com 5 mM de CaCl2 adicional) para expressar proteína BbrGlu5 (SEQ ID N° 38).
PURIFICAÇÃO DE ALFAGLICOSIDASES DE CULTIVOS DE EXPRESSÃO ACLGLUI E NCRGLUI
[00293] Alfaglicosidases de AclGlu1 (SEQ ID N° 6) e NcrGluI (SEQ ID N° 12) foram purificadas utilizando duas etapas de cromatografia. Para cada purificação, o caldo bruto do frasco de agitação foi concentrado e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até concentração final de 2 M. A solução foi carregada sobre uma coluna de 50 ml de fenil HP previamente equilibrada com 20 mM de Tris, pH 8,0, 2 M sulfato de amônio. A proteína alvo (SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 12) foi eluída a partir da coluna com 1 M sulfato de amônio, 20 mM Tris, pH 8,0. Frações correspondentes foram reunidas, concentradas e seu tampão foi substituído para 20 mM Tris, pH 8,0 (tampão A), utilizando um dispositivo de ultrafiltragem VIVAFLOW 200 (Sartorius Stedim). A solução resultante foi aplicada a uma coluna de 40 ml de Q HP previamente equilibrada com tampão A. A proteína alvo foi eluída da coluna com 0,3 M NaCl em tampão A. As frações que contêm proteína alvo foram reunidas e concentradas em seguida utilizando dispositivos 10K AMICON ULTRA-15 e armazenadas em glicerol a 40% a -20 °C até o uso.
NFIGLUI
[00294] Alfaglicosidase de NfiGlu1 (SEQ ID N° 9) foi purificada utilizando duas etapas de cromatrogafia de interação hidrofóbica. O caldo bruto do frasco de agitação foi concentrado e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até concentração final de 1 M. A solução foi carregada sobre uma coluna de 50 ml de fenil HP previamente equilibrada com 20 mM de Tris, pH 8,0, 1 M sulfato de amônio. A proteína alvo (SEQ ID N° 9) fluiu através da coluna. Frações de fluxo foram reunidas e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até concentração final de 2 M. A solução foi carregada sobre a mesma coluna de fenil HP previamente equilibrada com 20 mM de Tris, pH 8,0 e 2 M de sulfato de amônio. A proteína alvo foi eluída a partir da coluna com 1 M sulfato de amônio, 20 mM Tris, pH 8,0. As frações que contêm proteína alvo foram reunidas e concentradas em seguida utilizando dispositivos 10K AMICON ULTRA-15 e armazenadas em glicerol a 40% a -20 °C até o uso.
TAUSEC098 E TAUSEC099
[00295] Alfaglicosidases de TauSec098 (SEQ ID N° 15) e TauSec099 (SEQ ID N° 18) foram purificadas por meio de cromatografia de interação hidrofóbica. Para cada purificação, adicionou-se sulfato de amônio a cerca de 180 ml de caldo bruto concentrado de um fermentador de sete litros até concentração final de 1 M. Esta solução foi carregada em seguida a uma coluna de 50 ml de HIPREP fenil-FF Sepharose (GE Healthcare) previamente equilibrada com 20 mM de acetato de sódio, pH 5.0, 1 M sulfato de amônio (tampão A). Após lavagem com o mesmo tampão com três volumes de coluna (CVs), a coluna foi eluída em etapas com 75%, 50% e 0% de tampão A utilizando três CVs cada, seguido por dois CVs de H2O MILLIQ. Todas as frações foram analisadas por meio de SDS-PAGE. A proteína alvo (SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N° 18) esteve principalmente presente na fração de fluxo, que foi concentrada e teve seu tampão substituído para remover o excesso de sulfato de amônio utilizando dispositivos 10 kDa AMICON ULTRA-15. O produto final, que apresentou pureza de mais de 90%, foi armazenado em glicerol a 40% a -80 °C até o uso.
BLOGLUI, BLOGLU2 E BLOGLU3
[00296] Alfaglicosidases de BloGlu1 (SEQ ID N° 20), BloGlu2 (SEQ ID N° 24) e BloGlu3 (SEQ ID N° 26) foram todas purificadas em três etapas. Para cada purificação, o caldo bruto de um fermentador DASGIP de 1 l foi concentrado e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até saturação de 60%. A solução foi agitada a 4 °C por uma hora e centrifugada em seguida a 8000 x g por trinta minutos. A pelota resultante foi novamente suspensa em 20 mM de Tris, pH 8,0 (tampão A). Adicionou- se sulfato de amônio à solução resultante até concentração final de 1 M; essa preparação foi equilibrada em seguida sobre uma coluna de 40 ml de HiPrep® Fenil FF previamente equilibrada com 20 mM de Tris, pH 8,0, 1 M sulfato de amônio (tampão B). Após lavagem, a coluna foi eluída em etapas com 75%, 50% e 0% tampão B e H2O em três volumes de coluna cada. Todas as frações foram analisadas utilizando SDS-PAGE e testes de atividade. As frações contendo proteína alvo (SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 24 ou SEQ ID N° 26) foram reunidas, concentradas e carregadas em seguida em uma coluna HiLoad® 26/60 Superdex® 75 previamente equilibrada com 20 mM fosfato de sódio, pH 7,0, 0,15 M de NaCl. As frações de fluxo que contêm a proteína alvo foram reunidas e concentradas em seguida utilizando dispositivos 10K AMICON ULTRA-15 e armazenadas em glicerol a -20 °C até o uso.
BPSGLUI E BTHGLUI
[00297] Alfaglicosidases de BpsGlu1 (SEQ ID N° 30) e BthGlu1 (SEQ ID N° 32) foram purificadas em duas etapas. Para cada purificação, o caldo bruto de um fermentador DASGIP de 1 l foi concentrado e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até saturação de 60%. A solução foi agitada a 4 °C por uma hora e centrifugada em seguida a 8000 x g por trinta minutos. A pelota resultante foi novamente suspensa em 20 mM de Tris, pH 8,0 (tampão A). Adicionou-se sulfato de amônio à solução resultante até concentração final de 1 M; essa preparação foi carregada em seguida sobre uma coluna de 40 ml de HiPrep® Fenil FF previamente equilibrada com 20 mM de Tris, pH 8,0, 1 M sulfato de amônio (tampão B). Após lavagem, a coluna foi eluída em etapas com 75%, 50% e 0% tampão B e H2O em três volumes de coluna cada. Todas as frações foram analisadas utilizando SDS-PAGE e testes de atividade. A proteína alvo (SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 32) estava presente no eluído da etapa de eluição de tampão B a 0%; esse eluído foi reunido e concentrado utilizando dispositivos 10K AMICON ULTRA-15. O produto final, que apresentou pureza de mais de 95%, foi armazenado em glicerol a 40% a -20 °C até o uso.
BBRGLU2 E BBRGLU5
[00298] Alfaglicosidases de BbrGlu2 (SEQ ID N° 36) e BbrGlu5 (SEQ ID N° 38) foram purificadas em quatro etapas. Para cada purificação, o caldo bruto de um fermentador DASGIP de 1 l foi concentrado e, em seguida, adicionou-se sulfato de amônio até saturação de 60%. A solução foi agitada a 4 °C por uma hora e centrifugada em seguida a 8000 x g por trinta minutos. A pelota resultante foi novamente suspensa em 20 mM de HEPES, pH 7,0 (tampão A). Adicionou-se sulfato de amônio à solução resultante até concentração final de 1 M; essa preparação foi carregada em seguida sobre uma coluna de HiPrep® Fenil FF previamente equilibrada com 20 mM de HEPES, pH 7,0, 1 M sulfato de amônio. A proteína alvo (SEQ ID N° 36 ou SEQ ID N° 38) foi eluída da coluna com 0,5 M sulfato de amônio. Frações correspondentes foram reunidas, concentradas e seu tampão foi substituído para tampão A, utilizando um dispositivo de ultrafiltragem VIVAFLOW 200 (Sartorius Stedim). A solução resultante foi aplicada a uma coluna HiPrep® Q FF 16/10 previamente equilibrada com tampão A. A proteína alvo foi eluída da coluna com gradiente linear de 00,5 M NaCl em tampão A. Frações contendo proteína alvo foram reunidas, concentradas e carregadas em seguida sobre uma coluna HiLoad® 26/60 Superdex® 75 previamente equilibrada com 20 mM de HEPES, pH 7,0, 0,15 M de NaCl. As frações que contêm proteína alvo foram reunidas e concentradas em seguida utilizando dispositivos 10K AMICON ULTRA-15 e armazenadas em glicerol a 40% a -20 °C até o uso.
[00299] Foram expressas e purificadas, portanto, diversas alfaglicosidases adicionais. Essas alfaglicosidases adicionais foram testadas para determinar a atividade hidrolítica contra ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e ligações alfa-1,3 e/ou alfa-1,6 glicosilglicose nos Exemplos 11, 12, 15 e 16 fornecidos abaixo.
EXEMPLO 11 TESTE DE ALFAGLICOSIDASES PARA DETERMINAR A ATIVIDADE HIDROLÍTICA CONTRA DIVERSAS LIGAÇÕES GLICOSÍDICAS
[00300] Este exemplo descreve o teste se alfaglicosidases possuem atividade hidrolítica além da anteriormente associada a essa classe de enzimas (EC 3.2.1.20). Demonstrou-se que alfaglicosidases do Exemplo 10 possuem atividade hidrolítica contra ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose.
ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO DE ALFAGLICOSIDASES
[00301] A especificidade de substrato de cada alfaglicosidase descrita no Exemplo 10 foi testada com base na liberação de glicose a partir de um substrato específico (isomaltose, maltose, panose, leucrose ou nigerose) quando o substrato foi incubado com alfaglicosidase. A taxa de liberação de glicose foi medida utilizando um método de glicose oxidase/peroxidase (GOX/HRP) acoplada (1980, Anal. Biochem. 105: 389397). A liberação de glicose foi quantificada como a taxa de oxidação de ácido 2,2’-azinobis 3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico (ABTS) por peróxido que foi gerado de enzimas GOX/HRP acopladas que reagiram com glicose.
[00302] Soluções de substratos individuais foram preparadas por meio da mistura de uma solução de 9 ml de substrato (1% em água, p/v) com 1 ml de 0,05 M de tampão acetato de sódio, pH 5,0, e 40 μl de 0,5 M de cloreto de cálcio em um tubo cônico de 15 ml. Solução de enzimas acopladas (GOX/HRP) com ABTS foi preparada em 50 mM de tampão acetato de sódio (pH 5,0), com as concentrações finais de 2,74 mg/ml de ABTS, 0,1 U/ml de HRP e 1 U/ml de GOX. Diluições em série de amostras de alfaglicosidase individuais e padrão de glicose foram preparadas em água MILLIQ. Para nigerose, amostras de alfaglicosidase foram testadas com apenas uma dosagem a 10 ppm devido ao estoque limitado de soluções de substrato. Cada amostra de alfaglicosidase (10 μl) foi transferida para uma nova placa de microtítulos (Corning 3641) contendo 90 μl de solução de substrato previamente incubada a 50 °C por cinco minutos a 600 rpm. As reações foram conduzidas a 50 °C por dez minutos (para substratos de isomaltose, maltose, panose e nigerose) ou por sessenta minutos (para substrato de leucrose) com agitação (600 rpm) em THERMOMIXER (Eppendorf). 10 μl de cada mistura de reação, bem como 10 μl de diluições em série de padrão de glicose, foram rapidamente transferidos para novas placas de microtítulos (Corning 3641), respectivamente, às quais foram adequadamente adicionados 90 μl de solução ABTS/GOX/HRP. As placas de microtítulos contendo misturas de reação foram imediatamente medidas a 405 nm em intervalos de onze segundos por cinco minutos utilizando um leitor de placas SOFTMAX PRO (Molecular Devices). A saída foi a velocidade de reação, Vo, para cada concentração de enzima. Utilizou-se regressão linear para determinar a inclinação da plotagem Vo x dose de enzima. A atividade específica de cada alfaglicosidase foi calculada com base na curva padrão de glicose utilizando a Equação 1: atividade específica (unidade/mg) = inclinação (enzima) / inclinação (padrão) x 1000 (1), em que 1 unidade = 1 μmol de glicose/min.
[00303] Para nigerose, o valor da velocidade de reação com dosagem de enzima a 10 ppm foi utilizado diretamente para indicar a atividade de enzima.
[00304] Utilizando o método acima, a especificidade de cada alfaglicosidase foi determinada contra cada substrato. Também foram medidas as atividades de oligo-1,6-glicosidase (adquirida da Megazyme, vide a Tabela 4) e uma transglicosidase (TG L-2000, vide a Tabela 4) contra cada substrato. Os resultados desta análise são fornecidos na Tabela 17. TABELA 17 ATIVIDADE DE DIVERSAS ALFAGLICOSIDASES CONTRA DIFERENTES SUBSTRATOS
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a Cada enzima foi utilizada em uma dosagem (10 ppm) contra nigerose.
[00305] De forma interessante, descobriu-se que alfaglicosidases, além de exibirem atividade hidrolítica contra ligação alfa- 1,4 glicosilglicose (maltose), também exibem atividade hidrolítica contra ligação alfa-1,6 glicosilglicose (isomaltose), ligação alfa-1,3 glicosilglicose (nigerose) e ligação alfa-1,5 glicosilfrutose (leucrose) (Tabela 17).
[00306] Alfaglicosidases possuem, portanto, atividade hidrolítica além daquela anteriormente associada a enzimas EC 3.2.1.20. Especificamente, alfaglicosidases possuem atividade hidrolítica contra ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose.
EXEMPLO 12 HIDRÓLISE DE LEUCROSE E OLIGOSSACARÍDEOS EM FILTRADO DE REAÇÃO DE GLUCANO UTILIZANDO ALFAGLICOSIDASE
[00307] Este Exemplo descreve o uso de alfaglicosidase para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em filtrado obtido de uma reação de síntese de glucano. Especificamente, o efeito de alfaglicosidases descritas no Exemplo 10 sobre a hidrólise de leucrose e oligossacarídeos DP2, DP3 e HS (açúcares superiores, DP4+) em um filtrado de glucano insolúvel (póli alfa-1,3- glucano), estudou-se a reação de síntese.
ISOLAMENTO E ANÁLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS PARA TESTE DA ATIVIDADE DE ALFAGLICOSIDASE
[00308] Em primeiro lugar, um filtrado concentrado de uma reação de síntese de glucano foi preparado conforme descrito no Exemplo 1.
[00309] Resumidamente, oligossacarídeos foram isolados do filtrado concentrado por meio de separação cromatográfica e analisados para determinar o perfil de ligação glicosídica. Separação cromatográfica que emprega uma forte resina de troca de cátions ácidos foi utilizada para isolar a fração de oligossacarídeo do filtrado concentrado. Os parâmetros físicos da coluna utilizada para esta separação foram os seguintes: FINEX CS11GC, resina n° 227; forma de ions de Na+; 5% divinil benzeno (retícula); tamanho de partículas de 0,34 mm; comprimento de leito de 1,64 m; diâmetro de coluna de 0,093 m.
[00310] Mais detalhadamente, a solução de açúcar concentrada (ou seja, filtrado concentrado) descrita na Tabela 3 foi filtrada e diluída até 25 g de sólidos secos/100 g de solução utilizando água da torneira. Antes da adição dessa solução de açúcar à resina de coluna, a resina foi lavada com seis volumes de leito (BV) de solução de cloreto de sódio (três BV em cloreto de sódio a 10% em peso seguidos por três BV em solução de cloreto de sódio a 5% em peso) para converter a resina na forma de sódio. A solução de açúcar (0,6 l) foi alimentada em seguida à coluna e, em seguida, a coluna foi eluída utilizando água em velocidade de fluxo de 50 ml/min. As condições de condução da separação cromatográfica encontram-se resumidas a seguir: tamanho de alimentação de 0,6 l, 25 g de sólidos secos/100 g de solução, temperatura de coluna de 65 °C e velocidade de fluxo de 50 ml/min. Uma solução de oligossacarídeo foi eluída entre 11 e 21 minutos. Uma pequena quantidade de sais (indicada por aumento da condutividade) foi eluída ao mesmo tempo. A fração de oligossacarídeo preparada desta forma foi analisada por meio de HPLC para determinar a sua distribuição de produto. Ao todo, a fração continha mais de 89% de oligossacarídeos contendo três ou mais unidades de hexose e menos de 1,5% de mono e dissacarídeos identificáveis. Esta fração foi concentrada até peso seco total de 317 g/l utilizando um evaporador de filme fino (LCI Corporation, Charlotte NC) seguido por evaporação giratória com ROTAVAPOR (R- 151; Buchi, New Castle DE). A distribuição de produtos da fração concentrada conforme medido por meio de HPLC aparece na Tabela 18. TABELA 18 DISTRIBUIÇÃO DE PRODUTO DE FRAÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEO CONCENTRADA
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SELEÇÃO PRIMÁRIA DE ALFAGLICOSIDASES SOBRE HIDRÓLISE DE OLIGÔMERO DE GLUCANO
[00311] As atividades de onze alfaglicosidases diferentes (Exemplo 10), bem como as atividades de duas enzimas importantes, oligo-1,6-glicosidase (adquirida da Megazyme) e transglicosidase (TG L-2000), foram avaliadas individualmente contra a fração de oligossacarídeo purificada preparada acima (Tabela 18). Cada alfaglicosidase (dosada a 1 mg/ml) foi incubada em uma solução contendo substratos de oligossacarídeos (2,9% sólidos secos) e 2 mM cloreto de cálcio sob pH 5,0 a 60 °C. Cada reação foi resfriada após 24 horas de incubação por meio da adição de 50 μl de 0,5 M NaOH.
[00312] Os teores de oligossacarídeos e monossacarídeos das reações resfriadas foram determinados conforme segue. Uma amostra de cada reação foi diluída por cinco vezes em água para análise de HPLC. Realizou-se separação de HPLC utilizando um sistema HPLC Agilent série 1200 com uma coluna AMINEX HPX-42A (300 mm x 7,8 m) a 85 °C. A amostra (10 μl) foi aplicada à coluna de HPLC e separada com gradiente isocrático de água MILLI-Q como fase móvel em velocidade de fluxo de 0,6 ml/min. Produtos de oligossacarídeos foram detectados utilizando um detector de índice refrator. Os números fornecidos na Tabela 19 abaixo refletem a média dos percentuais de área de pico (a partir da duplicação de cada amostra) de cada DPn na forma de fração do total de DP1 a DP7. TABELA 19 ANÁLISE DE OLIGOSSACARÍDEOS DE FILTRADO DE GLUCANO APÓS TRATAMENTO COM ALFAGLICOSIDASE
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[00313] Conforme indicado com sombreamento na Tabela 19, o teor de oligossacarídeos das reações geralmente alterou-se para açúcares com tamanho menor, em comparação com a reação controle (“Padrão”), na qual não havia enzima. Estes resultados indicam que alfaglicosidase pode ser utilizada para hidrolisar oligossacarídeos compreendidos em uma reação de síntese de glucano e uma de suas frações. Além disso, configurando o perfil de ligação dos oligossacarídeos (Exemplos 3 e 4) e a atividade de alfaglicosidase contra diversas ligações glicosídicas além de ligações alfa-1,4 (Exemplo 11), é evidente que alfaglicosidase pode ser utilizada para decompor oligossacarídeos com ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e/ou ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose. Os resultados fornecidos na Tabela 19 também sugerem que alfaglicosidases fúngicas possuem melhor atividade hidrolítica para oligossacarídeos solúveis em comparação com as alfaglicosidases bacterianas.
CONFIRMAÇÃO DA ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE ALFAGLICOSIDASE PARA PRODUTOS DE OLIGOSSACARÍDEOS DE REAÇÕES DE SÍNTESE DE GLUCANO
[00314] Foram preparadas reações que compreendem uma ou duas alfaglicosidases e um filtrado concentrado obtido de uma reação de póli alfa-1,3-glucano (Tabela 3). As reações de alfaglicosidase foram dosadas com enzima a 4 ppm ou, para misturas, cada enzima foi utilizada em razão 1:1 com dosagem final de 4 ppm. O filtrado concentrado foi carregado em cada reação em 10% de sólidos secos. Cada reação compreendeu adicionalmente 2 mM de cloreto de cálcio sob pH 5,0 e foi conduzida a 60 °C ou 65 °C. As reações foram resfriadas adicionando-se 50 μl de 0,5 M NaOH após incubação por 23 horas.
[00315] Os teores de oligossacarídeo e monossacarídeo das reações resfriadas foram determinados conforme segue. Uma amostra de cada reação foi diluída por 25 vezes em água para análise de HPLC. Realizou-se separação de HPLC utilizando um sistema HPLC Agilent série 1200 com uma coluna AMINEX HPX-42A (300 mm x 7,8 m) a 85 °C. A amostra (10 μl) foi aplicada à coluna de HPLC e separada com gradiente isocrático de água MILLI-Q como fase móvel em velocidade de fluxo de 0,6 ml/min. Produtos de oligossacarídeos foram detectados utilizando um detector de índice refrator. Os números fornecidos na Tabela 20 abaixo refletem a média dos percentuais de área de pico (a partir da duplicação de cada amostra) de cada DPn como fração do total. Os resultados fornecidos na Tabela 20 geralmente confirmam a atividade de certas alfaglicosidases conforme discutido acima com relação aos resultados fornecidos na Tabela 19. TABELA 20 ANÁLISE DE AÇÚCARES DE FILTRADO DE GLUCANO APÓS TRATAMENTO COM ALFAGLICOSIDASE
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[00316] Pode-se, portanto, utilizar alfaglicosidase para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em uma fração (por exemplo, filtrado) obtida de uma reação de síntese de glucano, tal como uma reação de síntese de póli alfa-1,3-glucano.
EXEMPLO 13 ISOLAMENTO DE FRAÇÃO DE OLIGÔMERO/LEUCROSE A PARTIR DE REAÇÃO DE GTF-S/MUT3325
[00317] Sacarose (4,50 kg) foi dissolvida em água deionizada destilada até volume total final de 9,5 l e a solução resultante foi aquecida com agitação a 80 °C por cinco minutos e resfriada em seguida a 47 °C. Com agitação, 500 gramas de um extrato bruto contendo 0,6 g/l de enzima gtf-S (GTF0459, SEQ ID N° 42) e 15,0 ml de um extrato bruto contendo 10 g/l de mutanase (MUT3325, SEQ ID N° 47) foram adicionados com agitação (vide Métodos Gerais para preparações de enzimas). O pH da mistura resultante foi imediatamente ajustado para pH 5,5 a pH 6,0 por meio de lenta adição de uma diluição 1:10 (v/v) de HCl a 37% em peso com agitação. A temperatura de reação e o pH foram mantidos a 47 °C e pH 5,5-6,0, respectivamente, até conversão de sacarose de >95% por meio de análise de HPLC e, em seguida, a mistura de reação foi imediatamente ajustada em pH 7,0 a 7,5, aquecida a 90 °C por vinte minutos e resfriada em seguida a 25 °C para filtragem imediata para remoção dos particulados e precipitado. O filtrado resultante foi mantido a 5 °C antes da cromatografia de coluna IEX/SEC utilizando as condições e resina a seguir: FINEX CS 11 GC SAC em forma de Ca2+, diâmetro interno da coluna = 9,3 cm, altura do leito de resina 1,58 m, T = 70 °C, velocidade de fluxo = 51 ml/min, velocidade de fluxo linear = 0,44 m/h, tamanho de alimentação = 0,6 l = 171 g, alimentação RI-DS = 25,1 g/100 g, intervalo de amostra = 3 min. As frações de coluna coletadas entre trinta minutos e 67 minutos foram combinadas, concentradas por meio de evaporação a 66% de sólidos dissolvidos e analisadas por meio de HPLC conforme descrito nos Métodos Gerais. A Tabela 21 indica os componentes de oligossacarídeos e monossacarídeos da fração isolada preparada desta forma. TABELA 21 ANÁLISE DE FRAÇÃO DE OLIGÔMERO/LEUCROSE A PARTIR DE REAÇÃO DE GTF-S/MUT3325
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[00318] Neste Exemplo, utilizou-se uma reação de síntese de glucano para gerar pelo menos um produto de alfaglucano solúvel. Este produto solúvel resultou da ação concertada de glicosiltransferase (GTF0459, SEQ ID N° 42) e alfaglucano-hidrolase (MUT3325, SEQ ID N° 47) que estavam presentes na reação de glicosiltransferase. Este Exemplo também demonstrou a preparação de uma fração cromatográfica por meio da reação de síntese de glucano. Esta fração foi utilizada nos Exemplos 15 e 16 abaixo para testar a atividade de alfaglicosidases sobre ela.
EXEMPLO 14 ISOLAMENTO DE FRAÇÃO DE OLIGÔMERO/LEUCROSE A PARTIR DE REAÇÃO DE GTF-C
[00319] Sacarose (4,50 kg) foi dissolvida em água deionizada destilada até volume total final de 9,5 l e a solução resultante foi aquecida com agitação a 80 °C por cinco minutos e resfriada em seguida a 47 °C. Com agitação, 500 gramas de um extrato bruto contendo 0,41 g/l de enzima gtf-C (GTF0088BsT1, SEQ ID N° 45) foram adicionados com agitação (vide Métodos Gerais para preparações de enzimas). O pH da mistura resultante foi imediatamente ajustado para pH 5,5 a pH 6,0 por meio de lenta adição de uma diluição 1:10 (v/v) de HCl a 37% em peso com agitação. A temperatura de reação e o pH foram mantidos a 47 °C e pH 5,5-6,0, respectivamente, até conversão de sacarose de >95% por meio de análise de HPLC e, em seguida, a mistura de reação foi imediatamente ajustada para pH 7,0 a 7,5, aquecida a 90 °C por vinte minutos e resfriada em seguida a 25 °C para filtragem imediata para remoção de particulados e precipitado. O filtrado resultante foi mantido a 5 °C antes da cromatografia de coluna IEX/SEC utilizando as condições e resina a seguir: FINEX CS 11 GC SAC em forma de Ca2+, diâmetro interno da coluna = 9,3 cm, altura do leito de resina 1,58 m, T = 70 °C, velocidade de fluxo = 50 ml/min, velocidade de fluxo linear = 0,44 m/h, tamanho de alimentação = 0,6 l = 171 g, alimentação RI-DS = 25,8 g/100 g, intervalo de amostra = 3 min. As frações de coluna coletadas entre 34 minutos e 72 minutos foram combinadas, concentradas por meio de evaporação até 67% de sólidos dissolvidos e analisadas por meio de HPLC conforme descrito nos Métodos Gerais. A Tabela 22 indica os componentes de oligossacarídeo e monossacarídeo da fração isolada preparada desta forma. TABELA 22 ANÁLISE DE FRAÇÃO DE OLIGÔMERO/LEUCROSE A PARTIR DE REAÇÃO DE GTF-C
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[00320] Neste Exemplo, utilizou-se uma reação de síntese de glucano para gerar pelo menos um produto de alfaglucano solúvel. Este Exemplo também demonstrou a preparação de uma fração cromatográfica por meio da reação de síntese de glucano que gerou um produto de alfaglucano solúvel. Esta fração foi utilizada nos Exemplos 15 e 16 abaixo para testar a atividade de alfaglicosidases sobre ela.
EXEMPLO 15 SELEÇÃO PRIMÁRIA DE ALFAGLICOSIDASES UTILIZANDO FRAÇÕES DE OLIGÔMERO/LEUCROSE DE REAÇÕES DE GTF-S/MUT3325 E GTF-C
[00321] Este Exemplo descreve o uso de alfaglicosidase para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em frações cromatográficas obtidas de reações de síntese de glucano que geraram produto de alfaglucano solúvel. Especificamente, realizou-se estudo sobre o efeito de alfaglicosidases descritas no Exemplo 10 sobre a hidrólise de leucrose e oligossacarídeos nas frações preparadas nos Exemplos 13 e 14.
[00322] Ao todo, doze alfaglicosidases e duas enzimas importantes (oligo-1,6-glicosidase e TG L-2000 transglicosidase) foram selecionadas utilizando frações de oligômero/leucrose de reações de gtf-S/MUT3325 (Exemplo 13) e gtf-C (Exemplo 14) como material de substrato. Todas as enzimas (alfaglicosidases e enzimas importantes) foram dosadas em concentrações iguais de proteína. Cada alfaglicosidase (dosada a 100 ppm) foi incubada em uma solução contendo substratos de oligômero e leucrose (10% sólidos secos) e 2 mM de cloreto de cálcio sob pH 5,5 a 47 °C. Cada reação foi resfriada após 21 horas de incubação por meio da adição de 50 μl de 0,5 M NaOH.
[00323] Os teores de oligossacarídeo e monossacarídeo das reações resfriadas foram determinados conforme segue. Uma amostra de cada reação foi centrifugada e seu sobrenadante foi diluído 25 vezes em água para análise de HPLC (Métodos Gerais). Os percentuais relatados na Tabela 23 refletem a média dos percentuais de área de pico (a partir de análises duplicadas de cada amostra) de cada DPn como fração do total. Os resultados indicam que as alfaglicosidases fúngicas apresentaram melhor atividade hidrolítica para oligômeros de glucano em comparação com as alfaglicosidases bacterianas. TABELA 23 ANÁLISE DE COMPOSIÇÃO DE AÇÚCAR DE SELEÇÃO PRIMÁRIA DE ALFAGLICOSIDASES UTILIZANDO FRAÇÕES DE OLIGÔMERO/LEUCROSE DE REAÇÕES DE GTF-S/MUT3325 E
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[00324] Conforme indicado com sombreamento na Tabela 23, o teor de oligossacarídeos das reações geralmente alterou-se para açúcares com tamanho menor, em comparação com as reações controle (“Padrão”), nas quais não havia enzima. Estes resultados indicam que alfaglicosidase pode ser utilizada para hidrolisar oligossacarídeos compreendidos em uma reação de síntese de glucano e uma de suas frações, particularmente uma fração cromatográfica de uma reação de síntese de glucano que gerou produto de alfaglucano solúvel. Além disso, considerando o perfil de ligação dos oligossacarídeos (Exemplos 13 e 14) e a atividade de alfaglicosidase contra diversas ligações glicosídicas além de ligações alfa-1,4 (Exemplo 11), é evidente que alfaglicosidase pode ser utilizada para decompor oligossacarídeos com ligações alfa-1,5 glicosilfrutose e também provavelmente ligações alfa-1,3 e alfa-1,6 glicosilglicose. Os resultados fornecidos na Tabela 23 também sugerem que alfaglicosidases fúngicas possuem melhor atividade hidrolítica para oligossacarídeos solúveis em comparação com as alfaglicosidases bacterianas.
[00325] Pode-se utilizar alfaglicosidase, portanto, para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em uma fração (por exemplo, fração cromatográfica) obtida de uma reação de síntese de glucano, tal como uma reação de síntese de alfaglucano solúvel.
EXEMPLO 16 SELEÇÃO PRIMÁRIA DE ALFAGLICOSIDASES UTILIZANDO FRAÇÕES DE OLIGÔMERO/LEUCROSE DE REAÇÕES DE GTF-S/MUT3325 E GTF-C
[00326] Este Exemplo é adicional ao Exemplo 15, que descreve o uso de alfaglicosidase para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em frações cromatográficas obtidas de reações de síntese de glucano que geraram produto de alfaglucano solúvel.
[00327] Realizou-se avaliação de alfaglicosidases que foram mais ativas para hidrólise de frações de oligômero/leucrose a partir de reações gtf- S/MUT3325 e gtf-C (Exemplo 15) por meio da análise de composições de açúcar resultantes em reações que contêm enzimas dosadas em concentrações iguais de proteína. Incubações de alfaglicosidases (dosadas a 4 ppm; para misturas, a razão das duas enzimas foi de 1:1 e a dosagem total foi de 4 ppm) e substrato de oligômero/leucrose (10% ds) foram realizadas sob pH 5,5 na presença de 2 mM de cloreto de cálcio a 60 °C e 65 °C, respectivamente. As reações foram resfriadas adicionando-se 50 μl de 0,5 M NaOH após 23 horas de incubação.
[00328] Os teores de oligossacarídeos e monossacarídeos das reações resfriadas foram determinados conforme segue. Uma amostra de cada reação foi centrifugada e seu sobrenadante foi diluído 25 vezes em água para análise de HPLC (Métodos Gerais). Os percentuais relatados na Tabela 24 (abaixo) refletem a média dos percentuais de área de pico (a partir de análises duplicadas de cada amostra) de cada DPn como fração do total. Os resultados indicam que TauSec098 foi eficaz para a hidrólise de oligômeros DP2 em DP7 e TauSec099 apresentou melhor desempenho de TG L-2000 para hidrólise de leucose quando a incubação foi realizada a 65 °C. As misturas de TauSec098 com TauSec099 (ou TG L-2000) foram eficazes para hidrólise de oligômeros e leucrose para produção de DP1.
[00329] Pode-se utilizar alfaglicosidase, portanto, para hidrolisar leucrose e outros oligossacarídeos presentes em uma fração (por exemplo, fração cromatográfica) obtida de uma reação de síntese de glucano, tal como uma reação de síntese de alfaglucano solúvel. TABELA 24 ANÁLISE DE COMPOSIÇÃO DE AÇÚCAR DE SELEÇÃO PRIMÁRIA DE ALFAGLICOSIDASES UTILIZANDO FRAÇÕES DE OLIGÔMERO/LEUCROSE DE REAÇÕES DE GTF-S/MUT3325 E GTF-C
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Claims (12)

1. MÉTODO DE SÍNTESE DE GLUCANO E HIDRÓLISE DE SUBPRODUTO DE SACARÍDEO SOLÚVEL, caracterizado por compreender: (i) realizar uma reação de síntese de glucano para gerar um produto de alfaglucano insolúvel compreendendo pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas, em que a reação de síntese de glucano é realizada utilizando uma enzima glicosiltransferase em uma solução que compreende sacarose e água; (ii) separar uma fração da reação de síntese de glucano do produto de alfaglucano insolúvel, em que a fração compreende um sacarídeo solúvel que é um dissacarídeo ou oligossacarídeo compreendendo pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose (iii) contato do sacarídeo presente na fração, como descrito no item (ii), com uma enzima alfaglicosidase, assim hidrolisando pelo menos uma ligação alfa-1,3 ou alfa-1,6 glicosilglicose do sacarídeo; de modo que a quantidade do sacarídeo é reduzida em comparação com a quantidade do sacarídeo que estava presente antes do mencionado contato.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela enzima alfaglicosidase ser imobilizada.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo grau de polimerização do sacarídeo antes da hidrólise ser de 3 a 7.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo mencionado produto de alfaglucano insolúvel compreender pelo menos 80% de ligações alfa-1,3-glicosídicas.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo mencionado produto de alfaglucano insolúvel compreender pelo menos 90% de ligações alfa-1,3-glicosídicas.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo mencionado produto de alfaglucano insolúvel compreender pelo menos 95% de ligações alfa-1,3-glicosídicas.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela fração ser um filtrado da reação de síntese de glucano.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela fração ser um sobrenadante da reação de síntese de glucano.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela enzima alfaglicosidase ser uma transglicosidase.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela enzima alfaglicosidase ser uma glicoamilase.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela enzima alfa-glicosidade consistir na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 6, 9, 12, 15, 18, 20, 24, 26, 30, 32, 36, ou 38.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender adicionalmente separar a frutose da fração após hidrólise do sacarídeo.
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