JP2017518026A - アルファ−グルコシダーゼ酵素を用いた二糖およびオリゴ糖の酵素性加水分解 - Google Patents

アルファ−グルコシダーゼ酵素を用いた二糖およびオリゴ糖の酵素性加水分解 Download PDF

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Abstract

ロイクロースなどの糖（二糖またはオリゴ糖）においてアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解するための方法が開示される。この方法は、糖をトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼなどのアルファ−グルコシダーゼ酵素と適切な条件下で接触させることを含み、その接触工程中に酵素が糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する。この方法は、例えばグルカン合成反応から単離されるろ液中のロイクロースの量を減少させるのに有用である。

Description

本願は、全てそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／９４５，２３３号明細書（２０１４年２月２７日提出）、同第６１／９４５，２４１号明細書（２０１４年２月２７日提出）、同第６２／００４，２９０号明細書（２０１４年５月２９日提出）、同第６２／００４，３０８号明細書（２０１４年５月２９日提出）、同第６２／００４，３１２号明細書（２０１４年５月２９日提出）、同第６２／００４，３００号明細書（２０１４年５月２９日提出）、同第６２／００４，３１４号明細書（２０１４年５月２９日提出）および同第６２／００４，３０５号明細書（２０１４年５月２９日提出）の利益を主張する。
本発明は、小型の糖ポリマーの酵素性加水分解の分野にある。具体的には、本発明は、アルファ−グルコシダーゼ酵素で１つ以上のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む二糖およびオリゴ糖を加水分解することに関する。
電子提出する配列リストに対する参照
配列リストの正式なコピーが、２０１５年２月１０日に作成され、２６６キロバイトのサイズを有するＣＬ６１１５ＵＳＮＰ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルにより、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列リストとしてＥＦＳ−ウェブを介して電子提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３、アルファ−１，４−グルカングルコヒドロラーゼ）は、グルコース含有二糖、オリゴ糖および多糖の非還元末端からのアルファ−１，４およびアルファ−１，６グリコシド結合の両方の加水分解を触媒し、一度に１つずつグルコース単位を放出させるエキソ型酵素である（非特許文献１参照）。切断は、酸素でアノマー炭素を連結するグリコシド結合で起こる（非特許文献２）。アルファ−１，４、アルファ−１，６およびアルファ−１，３結合は、グルコアミラーゼによって高速で加水分解される唯一の結合である（非特許文献３）。
グルコアミラーゼはまた、アルファ−１，２（例えばコージビオース）またはアルファ−１，１（例えばトレハロース）により連結される２つのグルコシル単位間のグリコシド結合も加水分解することが可能である。しかし、この酵素活性が起こるのは、アルファ−１，４（マルトース）またはアルファ−１，６（イソマルトース）結合がある二糖に対するグルコアミラーゼ活性と比較して、非常に低速で、より薄い基質濃度で起こる。
グルコアミラーゼは、デンプンから高グルコースシロップを作製するために広く使用されている。高グルコースシロップは、アルコール燃料、高フルクトーストウモロコシシロップ、有機酸、アミノ酸およびビタミンなどの様々な付加価値化合物を作製するための原料として有用である。グルコアミラーゼは、多くの微生物、動物および植物から単離されてきており、微生物の中でも、多くの真菌がこの酵素の良好な供給源となっている。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などの真菌生物中で産生されるグルコアミラーゼは、高グルコースシロップ生産などの商業的応用のために一般的に使用されている。
トランスグルコシダーゼ（ＥＣ．２．４．１．２４、１，４−アルファ−グルカン６−アルファ−グルコシルトランスフェラーゼ）は、アルファ−Ｄ−グルコ−オリゴ糖との温置において加水分解性および転移反応の両方を触媒するＤ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素である（非特許文献４）。マルトースは、この酵素でのトランスグルコシル化反応に対する最も好ましい基質である。転移はＨＯ−６に対して最も高い頻度で起こり、これにより、Ｄ−グルコースからイソマルトースが、またはマルトースからパノース（６−Ｏ−アルファ−グルコシルマルトース）が生成する。トランスグルコシダーゼはまた、グルコシル残基を別のＤ−グルコシル単位のＨＯ−２またはＨＯ−３にも転移させることができ、コージビオースまたはニゲロースが形成される。この酵素はさらに、Ｄ−グルコシル単位をＨＯ−４に転移し戻して、マルトースを再形成させることができる。
トランスグルコシダーゼによるトランスグルコシル化反応の結果として、マルト−オリゴ糖残基が、非還元末端から、アルファ−Ｄ−１，６グリコシド結合により連結されるより高い割合のグルコシル残基を含有するイソマルト−オリゴ糖（ＩＭＯ）に変換される。アジアにおいて、多くの食品および飲料処方物でＩＭＯ糖が使用される。Ｂｒｉｅｒら（特許文献１）は、オオムギ麦芽汁（ｂａｒｌｅｙ ｗｏｒｔ）からＩＭＯを生産するためにトランスグルコシダーゼを使用することを開示した。
Ｐｏｕｌｏｓｅら（特許文献２）は、キサンタンおよびグアーガムなどの多糖を分解するためにトランスグルコシダーゼを使用することを開示した。キサンタンガムは、マンノースおよびグルクロン酸を含有する分枝にグルコースが交互に１，３−結合されるセルロース骨格を含む。グアーガムの骨格は、ガラクトース残基が１つおきのマンノースでアルファ−１，６−結合される、ベータ−１，４−結合マンノース残基を含む。
Ｌａｎｔｅｒｏら（特許文献３）は、スクロース、メレジトースおよびトレハロースを分解するためにトランスグルコシダーゼを使用することを開示した。これらの糖は、１，２−（スクロース）、１，３−（メレジトース）または１，１−（トレハロース）結合を介してフルクトースに連結されるグルコースを含む。
グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼの様々な加水分解活性が開示されているものの、これらの酵素は一般に、２つのグルコシル残基間のアルファ結合を加水分解するそれらの能力を考えると、アルファ−グルコシダーゼであるとみなされる。例えば、グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼの両方とも、マルターゼ活性（マルトースの２つのグルコシル残基間のアルファ−１，４グリコシド結合の加水分解）を有することと関連があり、これはアルファ−グルコシダーゼ活性のタイプである。
前述の開示にもかかわらず、驚くべきことに、トランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）および他のアルファ−グルコシダーゼなどのアルファ−グルコシダーゼが、グルコシル−フルクトースのアルファ−１，５グリコシド結合を加水分解し得ることが今回分かった。アルファ−グルコシダーゼは、グルコシル−アルファ−１，５−フルクトースを含有する二糖およびオリゴ糖を分解するのに有用であるものとして本明細書中で開示される。
米国特許出願公開第２００３／０１６７９２９号明細書 米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書 米国特許第５７７０４３７号明細書
１９６０，Ｐａｚｕｒ ａｎｄ Ａｎｄｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５：２９７−３０２ １９６２，Ｆｌｅｅｔｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗｅｉｇｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ １９６：９８４ １９５７，Ｂａｒｋｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４８６５−４８７１ １９５１，Ｐａｚｕｒ ａｎｄ Ｆｒｅｎｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３：３５３６
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖においてアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法であって、この糖が二糖またはオリゴ糖であり、方法が、適切な条件下で糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素に接触させることを含み、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、糖の量が、接触工程前に存在した糖の量と比較して減少している、方法に関する。
別の実施形態において、加水分解法のアルファ−グルコシダーゼ酵素は固定化されている。
別の実施形態において、加水分解法の糖はロイクロースである。別の実施形態において、接触工程後のロイクロースの濃度は、接触工程前に存在したロイクロースの濃度の５０％未満である。
別の実施形態において、加水分解法の適切な条件は、（ｉ）グルカン合成反応、または（ｉｉ）グルカン合成反応から得られる分画を含み、糖はグルカン合成反応の副産物である。別の実施形態において、グルカン合成反応は、少なくとも１つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる。別の実施形態において、分画はグルカン合成反応のろ液である。別の実施形態において、グルカン合成反応は、（ｉ）グルコシルトランスフェラーゼの生成物、または（ｉｉ）１つ以上のアルファ−１，３−グリコシド結合または１つ以上のアルファ−１，６−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物である、少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる。グルカン合成反応が少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる別の実施形態において、この分画はグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である。
別の実施形態において、アルファ−グルコシダーゼ酵素はトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼである。別の実施形態において、（ｉ）トランスグルコシダーゼは、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）グルコアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、本発明は、糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることにより生成される組成物であって、糖が二糖またはオリゴ糖であり、かつ少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含み、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、組成物が、接触工程前に存在した糖の量と比較して減少した量の糖を含む、組成物に関する。
別の実施形態において、組成物の糖はロイクロースである。組成物中のロイクロースの濃度は、例えば、接触前に存在したロイスクロースの濃度の５０％未満である。
別の実施形態において、組成物の糖は（ｉ）グルカン合成反応、または（ｉｉ）グルカン合成反応から得られる分画にあり、この糖はグルカン合成反応の副産物である。別の実施形態において、この分画は、グルカン合成反応のろ液またはグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である。
別の実施形態において、本発明は、グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法であって、（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、（ｂ）工程（ａ）の分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得るために、工程（ａ）の加水分解分画からフルクトースを分離することとを含む、方法に関する。
別の第１３の実施形態において、本発明は、（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、（ｂ）生成物を得るために微生物を用いて工程（ａ）の分画を発酵させることであって、発酵が、工程（ａ）の後または工程（ａ）と同時に行われ得る、発酵させることと、（ｃ）任意選択により（ｂ）の生成物を単離することとを含み、（ｂ）の生成物の収率が、アルファ−グルコシダーゼ酵素と接触していないグルカン合成反応の分画を発酵させる生成物の収率と比較して上昇している、発酵方法に関する。
ＮＯＶＯ１８８酵素での加水分解処理前（出発物質）および後（処理済み物質）のグルカン反応ろ液物質の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである（実施例２〜３参照）。 ＴＧ Ｌ−２０００トランスグルコシダーゼでの加水分解処理前（出発物質）および後（処理済み物質）のグルカン反応ろ液物質の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである（実施例２〜３参照）。
引用される全ての特許および非特許文献の開示は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中で使用される場合、「発明」または「開示される発明」という用語は、限定するものではなく、特許請求の範囲で定義されるかまたは本明細書中に記載される本発明の何れかに一般に適用されるものである。これらの用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
「糖」、「糖分子」および「炭水化物」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、別段の指示がない限り、二糖またはオリゴ糖を指す。本明細書中での「二糖」は、グリコシド結合により連結される２個の単糖を有する炭水化物を指す。本明細書中での「オリゴ糖」は、例えばグリコシド結合により連結される２〜９個の単糖からなる炭水化物を指す。オリゴ糖は本明細書中で「オリゴマー」とも呼ばれ得る。二糖またはオリゴ糖内に含まれる単糖は、例えば「単糖単位」または「モノマー単位」とも呼ばれ得る。本明細書中での好ましい単糖はフルクトースおよびグルコースである。
「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ）」および「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、炭水化物分子を別の炭水化物分子と連結する共有結合のタイプを指す。
本明細書中での「アルファ−１，３グルコシル−グルコース結合」、「アルファ−１，３グルコース−グルコース結合」および「グルコース−アルファ１，３−グルコース」という用語は、２つのアルファ−Ｄ−グルコース分子間のアルファ−１，３−グリコシド結合を指す。本明細書中での「アルファ−１，６グルコシル−グルコース結合」、「アルファ−１，６グルコース−グルコース結合」および「グルコース−アルファ１，６−グルコース」という用語は、２つのアルファ−Ｄ−グルコース分子間のアルファ−１，６−グリコシド結合を指す。本明細書中でのアルファ−１，３グルコシル−グルコース結合および／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合は、ある一定の実施形態において二糖またはオリゴ糖内に含まれる。
本明細書中での「アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合」、「アルファ−１，５グルコース−フルクトース結合」および「グルコース−アルファ−１，５−フルクトース」という用語は、アルファ−Ｄ−グルコース分子とフルクトース分子との間のアルファ−１，５−グリコシド結合を指す。本明細書中でのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合は、ある一定の実施形態において、二糖またはオリゴ糖内に含まれる。
本明細書中での「アルファ−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」も指し得る。
アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有する二糖は、本明細書中で、ロイクロースと呼ぶ。「ロイクロース」および「Ｄ−グルコピラノシル−アルファ（１−５）−Ｄ−フルクトピラノース」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。ロイクロースは次の構造：
を有する。
「アルファ−グルコシダーゼ」、「アルファ−１，４−グルコシダーゼ」および「アルファ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）（「ＥＣ」は酵素番号（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）を指す）は、これまでオリゴ糖（例えば二糖）および多糖基質からの末端の非還元（１，４）−結合アルファ−Ｄ−グルコース残基の加水分解性放出を触媒する酵素として認識されてきた。今回、アルファ−グルコシダーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性およびアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性も有することが本明細書中で開示される。トランスグルコシダーゼおよびグルコアミラーゼ酵素は、このような活性があるアルファ−グルコシダーゼの例である。
「トランスグルコシダーゼ」（ＴＧ）、「トランスグルコシダーゼ酵素」および「１，４−アルファ−グルカン６−アルファ−グルコシルトランスフェラーゼ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。トランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）は、これまで、ある種のアルファ−Ｄ−グルコ−オリゴ糖との温置において、加水分解性および転移反応の両方を触媒するＤ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素として認識されてきた。今回、トランスグルコシダーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性およびアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性も有することが本明細書中で開示される。
「グルコアミラーゼ」（ＧＡ）、「グルコアミラーゼ酵素」および「アルファ−１，４−グルカングルコヒドロラーゼ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）は、これまで、グルコース含有二糖、オリゴ糖および多糖の非還元末端からのアルファ−１，４およびアルファ−１，６グリコシド結合の両方の加水分解を触媒するエキソ型酵素として認識されてきた。今回、グルコアミラーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性も有することが本明細書中で開示される。
酵素性加水分解は、酵素が、水の構成要素の付加による分子における結合の切断を促進するプロセスである。本明細書中でのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合「を加水分解する」、「の加水分解」または「に対する加水分解活性」は、アルファ−グルコシダーゼ、例えばグルコアミラーゼまたはトランスグルコシダーゼなどによる、グルコースとフルクトースとの間のアルファ−１，５グリコシド結合の酵素性加水分解を指す。このような加水分解は、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有する二糖またはオリゴ糖を本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼと適切な条件下で接触させた際に起こる。したがって、本明細書中での「加水分解反応」は、少なくとも（ｉ）アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有する二糖またはオリゴ糖および（ｉｉ）アルファ−グルコシダーゼを含む。
本明細書中で「糖化」という用語は、糖（二糖またはオリゴ糖）をその単糖成分に分解するプロセスを指す。糖は本明細書中で加水分解反応において糖化され得る。
少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖（二糖またはオリゴ糖）を本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼと接触させるための「適切な条件」は、アルファ−グルコシダーゼによる、糖における１つ以上のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合の加水分解を支える条件（例えば温度、ｐＨ、時間）を指す。適切な条件は、例えば少なくとも２０ｗｔ％の水を含む「水性条件」を含み得る。水性条件は、溶液または混合物を特徴付け得る。少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖をアルファ−グルコシダーゼと接触させる溶液または混合物は、例えばアルファ−グルコシダーゼ反応（例えばトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ反応）と呼ばれ得る。
本明細書中での「固定化」酵素は、不活性、不溶性材料に付着させられている酵素を指す。固定化酵素を調製するための方法が、例えば参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５５４１０９７号明細書で開示される。
「グルカン」および「グルカンポリマー」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、グリコシド結合により連結されるグルコースモノマーの多糖を指す。本明細書中での「アルファ−グルカン」は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アルファ−グリコシド結合を含むグルカンポリマーを指す。
本明細書中での「不溶性グルカン」は、水性条件で可溶性ではないグルカンポリマーを指す。本明細書中での不溶性グルカンの例は、ＤＰが少なくとも８または９であるポリアルファ−１，３−グルカンである。今回開示されるようなある一定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つの不溶性グルカン生成物を生成させる。
「可溶性グルカン」、「可溶性アルファ−グルカン」、「可溶性繊維」、「可溶性グルカン繊維」、「可溶性食物繊維」などの用語は、本明細書中で交換可能に使用され、水性条件で可溶性であるグルカンポリマーを指す。本明細書中での可溶性グルカンの例は、ある種のオリゴ糖、例えばＤＰが８未満のポリアルファ−１，３−グルカンなど、および下記で提供される実施例において開示されるある種のオリゴ糖である。今回開示されるようなある一定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つの可溶性グルカン生成物を生成させる。本明細書中でのある一定の実施形態における可溶性アルファ−グルカン化合物を特徴付ける別の一連の特性は、それらが（ｉ）重合度が３以上である水溶性グルコースオリゴマー、（ｉｉ）ヒト小腸で殆どまたは全く吸収されない消化抵抗性（すなわち消化性が非常に遅いかまたは全くない）および（ｉｉｉ）下部消化管において少なくとも部分的に発酵性であることである。可溶性グルカン繊維組成物の消化性は、例えばＡＯＡＣ法２００９．０１を用いて測定することができる。
「ポリアルファ−１，３−グルカン」および「アルファ−１，３−グルカンポリマー」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。ポリアルファ−１，３−グルカンは、グリコシド結合により一緒に連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、ここでこのグリコシド結合の少なくとも約５０％がアルファ−１，３−グリコシド結合である。「アルファ−１，３−グリコシド結合」という用語は、本明細書中で使用される場合、隣接するアルファ−Ｄ−グルコース環において炭素１および３を通じてアルファ−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合のタイプを指す。
本明細書中でのグルカンの「分子量」は、数平均分子量（Ｍｎ）または重量平均分子量（Ｍｗ）として表すことができる。あるいは、分子量は、ダルトン、グラム／モル、ＤＰｗ（重合の重量平均度）またはＤＰｎ（重合の数平均度）として表すことができる。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるなど、これらの分子量測定を計算するために、様々な手段が当技術分野で公知である。
「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ｇｔｆ酵素」、「ｇｔｆ酵素触媒」、「ｇｔｆ」、「グルカンスクラーゼ」などの用語は本明細書中で交換可能に使用される。本明細書中でのｇｔｆ酵素の活性は、生成物をグルカンおよびフルクトースにするスクロース基質の反応を触媒する。ｇｔｆ反応の他の生成物（副産物）は、グルコース（グルコースがグルコシル−ｇｔｆ酵素中間体複合体から加水分解される場合からの結果）、様々な可溶性オリゴ糖（例えばＤＰ２〜ＤＰ７）およびロイクロース（グルコシル−ｇｔｆ酵素中間体複合体のグルコースがフルクトースに連結される場合からの結果）を含み得る。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野生型形態は一般に、（Ｎ末端からＣ末端方向で）シグナルペプチド、可変ドメイン、触媒性ドメインおよびグルカン結合ドメインを含有する。本明細書中でのグルコシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙ（糖質関連酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ））データベースによりグリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）（Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８、２００９）下で分類される。
本明細書中での「スクロース」という用語は、アルファ−１，２−グリコシド結合により連結されるアルファ−Ｄ−グルコース分子およびベータ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖を指す。スクロースは砂糖として一般に知られる。
「グルカン合成反応」、「グルカン反応」、「ｇｔｆ反応」などの用語は、本明細書中で交換可能に使用され、グルコシルトランスフェラーゼ酵素により行われる反応を指す。グルカン合成反応は、本明細書中で使用される場合、一般に、スクロースおよび水、および任意選択により他の成分を含む溶液中で少なくとも１つの活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む溶液を指す。本明細書中でグルカン合成反応中にあり得る他の成分としては、例えば、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性オリゴ糖（例えばＤＰ２〜ＤＰ７）および可溶性グルカン生成物が挙げられる。また、１つ以上のアルファ−グルカノヒドロラーゼ酵素は、いくつかの態様においてグルカン合成反応中に含まれ得る。ある種のグルカン生成物、例えば重合（ＤＰ）度が少なくとも８または９であるポリアルファ−１，３−グルカンなどは水に不溶性であり、したがってグルカン合成反応において溶解されないが、むしろ溶液から出現し得ることが理解される。
「アルファ−グルカノヒドロラーゼ」および「グルカノヒドロラーゼ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、アルファ−グルカンオリゴマーを加水分解することが可能な酵素を指す。アルファ−グルカノヒドロラーゼは、ある一定のアルファ−Ｄ−グリコシド結合に対するそのエンド型加水分解活性によって定義され得る。本明細書中でのアルファ−グルカノヒドロラーゼ酵素の例としては、デキストラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１１；アルファ−１，６−結合グリコシド結合をエンド型加水分解可能）、ムタナーゼ（ＥＣ３．２．１．５９；アルファ−１，３−結合グリコシド結合をエンド型加水分解可能）およびアルテルナナーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．−；アルテルナンをエンド型加水分解性に切断可能）が挙げられる。ある種のアルファ−グルカン内の、分岐レベル、分岐のタイプおよび相対的な分岐の長さを含むが限定されない様々な要因は、一部のグリコシド結合をエンド型加水分解する、アルファ−グルカノヒドロラーゼの能力に悪影響を及ぼし得る。
グルカン合成反応の「パーセント乾燥固体」は、グルカン合成反応における糖全てのｗｔ％を指す。ｇｔｆ反応のパーセント乾燥固体は、例えば反応を準備するために使用したスクロースの量に基づいて計算することができる。
本明細書中でのグルカン合成反応の「分画」は、グルカン合成反応の溶液部分を指す。分画は、グルカン合成反応からの溶液の一部または全てであり得、反応で合成された可溶性または不溶性グルカン生成物から分離されている。分画は、任意選択により、生成物が不溶性（固形）グルカン生成物である実施形態において「母液」とも呼ばれ得る。分画の例はグルカン合成反応のろ液である。分画は溶解された糖、例えばスクロース、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性オリゴ糖（例えばＤＰ２〜ＤＰ７）を含有し得るため、分画はまた、グルカン合成反応由来の「混合糖溶液」とも呼ばれ得る。本明細書中での「加水分解分画」は、分画中に存在するロイクロースおよび／またはオリゴ糖を加水分解するために本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼで処理されている分画を指す。
「ろ液」、「グルカン反応ろ液」、「グルカンろ液」などの用語は、本明細書中で交換可能に使用され、グルカン合成反応で合成される固形グルカン生成物からろ過して分離されている分画を指す。本明細書中での「加水分解ろ液」は、ろ液中に存在するロイクロースおよび／またはオリゴ糖を加水分解するために本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼで処理されているろ液を指す。
「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「ｖｏｌ％」、「ｖ／ｖ％」などの用語は、本明細書中で交換可能に使用される。溶液中の溶質の体積によるパーセントは、式：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％を用いて決定することができる。
「重量によるパーセント」、「重量パーセント（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などの用語は、本明細書中で交換可能に使用される。重量によるパーセントは、それが組成物、混合物または溶液中に含まれる場合の、質量ベースでの物質のパーセンテージを指す。本明細書中での全てのパーセンテージは、別段の指示がない限り、重量パーセントである。
本明細書中で使用される場合、「多分散指標」、「ＰＤＩ」、「不均一性指標」、「分散度」などは、あるポリマー（例えばグルコースオリゴマー、例えば可溶性アルファ−グルカンなど）試料中の分子量の分布の目安を指し、数平均分子量によって重量平均分子量を除することによって計算することができる（ＰＤＩ＝Ｍｗ／Ｍｎ）。
「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「促進される（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」および「改善される（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、より大きい量または活性、例えば元の量もしくは活性よりも僅かに大きい量もしくは活性、または元の量もしくは活性と比較してそれを大きく超える量もしくは活性などを指し、その間の全ての量または活性を含む。あるいは、これらの用語は、例えば、増大した量または活性が比較されている量または活性よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％大きい量または活性を指し得る。
「配列同一性」または「同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本明細書中で使用される場合、指定される比較枠にわたり最大の一致となるように並べた場合に同じである２つの配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」または「パーセント同一性」は、比較枠にわたり２つの最適に並べられた配列を比較することにより決定される値を指し、ここで比較枠中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに対して、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、一致する位置の数を得るために両配列で同一である核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較枠中の位置の総数で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト上でオンラインで利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、例えば本明細書中で開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間でパーセント同一性を測定し得る。あるいは、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を用いて行い得る。アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法を用いた多重アライメントの場合、初期設定値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当し得る。ペアワイズアライメントおよびＣｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のパーセント同一性の計算のための初期設定パラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。あるいはさらに、配列間のパーセント同一性は、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばニードル）を用いて、パラメーター、例えばＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５で、ＢＬＯＳＵＭマトリクス（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて行い得る。
様々なポリペプチドアミノ酸配列が、ある一定の実施形態の特性として本明細書中で開示される。本明細書中で開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％または９０％〜９５％同一であるこれらの配列の変異体を使用することができる。あるいは、変異体アミノ酸配列は、本明細書中で開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し得る。本明細書中での変異体アミノ酸配列は、開示される配列の同じ機能／活性、または開示される配列の、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の機能／活性を有する。
「単離される」という用語は、ある一定の実施形態において使用される場合、そのネイティブの起源から完全に分離されている何らかの細胞成分を指す（例えば、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子）。一部の例において、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きい組成物、緩衝液系または試薬混合液の一部である。例えば、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、不均質に細胞または生物内に含まれ得る。別の例は、単離アルファ−グルコシダーゼ（例えばグルコアミラーゼ、トランスグルコシダーゼ）またはグルコシルトランスフェラーゼ酵素である。本明細書中で開示される酵素反応（例えば、アルファ−グルコシダーゼ反応、グルコシルトランスフェラーゼ反応）は、合成、非天然のプロセスである。
開示される本発明の実施形態は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法に関する。糖は二糖またはオリゴ糖である。この方法は、適切な条件下で糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることを含む。接触工程において、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する。この加水分解ゆえに、糖の量は、接触工程前に存在した糖の量と比較して減少する。したがって、この加水分解法は、あるいは組成物中の糖の量を減少させる方法とも呼び得る。
重要なこととして、アルファ−グルコシダーゼ酵素がアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解できることは以前には知られていなかったと考えられる。したがって、この加水分解法後のアルファ−グルコシダーゼ反応は、グルカン合成反応および／またはそれから得られる分画からアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有するロイクロースおよび他のオリゴ糖副産物を除去するために使用することができる。このような除去は、結果としてグルカン生成物を分解することができる酸加水分解など、副産物除去の化学的プロセスを上回る改善に相当する。最終的に、上記加水分解法に従い処理されるグルカン反応分画は、発酵などの下流の適用により良好に適しており、これは例えばグルコースおよびフルクトース単糖のレベルが分画中で上昇するからである。単糖は、一般にロイクロースおよびオリゴ糖副産物と比較して、下流のプロセスに対してより扱い易い。
アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）は、本明細書中の実施形態において、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解するために使用される。アルファ−グルコシダーゼ酵素は、オリゴ糖（例えば二糖）および多糖基質からの末端の非還元（１，４）−結合アルファ−Ｄ−グルコース残基の加水分解性放出を触媒することが以前は認識されていた。今回、これらの酵素は、例えばアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有することも本明細書中で開示される。
アルファ−グルコシダーゼは、何らかの起源由来（例えば植物、動物、微生物、例えば細菌または真菌／酵母など）、例えばトランスグルコシダーゼおよび／またはグルコアミラーゼが由来し得る以下で開示される供給源などからのものであり得る。例えばアルファ−グルコシダーゼは真菌アルファ−グルコシダーゼであり得る。本明細書中での適切なアルファ−グルコシダーゼの他の例としては、全て参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第６３５５４６７号明細書、同第５９２２５８０号明細書、同第５７９５７６６号明細書、同第５７６３２５２号明細書および同第８６３３００６号明細書で開示されるものが挙げられる。
本明細書のある一定の実施形態において、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、配列番号５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８の、またはＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡ（ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、アミノ酸配列を含み得る。あるいは、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、配列番号５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８と、またはＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡのアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得、糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有する。前述の配列のいくつかは、例えば、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟アルファ−グルコシダーゼである。このような配列に対して、一般的には、シグナルペプチドを使用せずにそれを発現させる場合、Ｎ末端開始メチオニンが（直接的にまたはエピトープなどの介在する異種アミノ酸配列を介して）（必要に応じて）付加されるであろうことが理解される（酵素が細胞内で発現され、細胞溶解液から得られる発現系によってなど）。
本明細書中のある一定の実施形態において、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼとしてトランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４；１，４−アルファ−グルカン６−アルファ−グルコシルトランスフェラーゼ）を使用することができる。このクラスの酵素は、これまで、ある種のアルファ−Ｄ−グルコ−オリゴ糖との温置時に加水分解性および転移反応を触媒するＤ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素として認識されてきた。今回本明細書中で開示されるようなトランスグルコシダーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性も有する。
本明細書中のトランスグルコシダーゼ酵素は、細菌または真菌などの何らかの微生物起源由来であり得る。真菌トランスグルコシダーゼの例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）およびネオサルトリア属（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｎ．フィシェリ（Ｎ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ））のものが挙げられるが限定されない。トランスグルコシダーゼが由来し得るアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ａ．フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）およびＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられるが限定されない。本明細書中で有用なトランスグルコシダーゼ酵素の他の例は、全て参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９５３，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３５８８−３５９３）；Ｐａｚｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１４９：１３７−１４７）、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３：７５−８４）および米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書に記載されている。本明細書中で有用なトランスグルコシダーゼ酵素のさらに他の例は、熱安定性であるものであり；参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第４６８９２９６号明細書は、熱安定性のトランスグルコシダーゼを生成させるためのプロセスを開示する。本明細書中で有用なトランスグルコシダーゼ酵素のまたさらなる例は、ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（ＮＣＢＩ）にあるものの何れか、例えば、全て参照により本明細書中に組み込まれる、受入番号Ｄ４５３５６（ＧＩＤ：２６４５１５９、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、ＢＡＤ０６００６．１（ＧＩＤ：４０３１３２８、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））、ＢＡＡ０８１２５．１（ＧＩＤ：１０５４５６５、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））、ＸＰ＿００１２１０８０９．１（ＧＩＤ：１１５４９２３６３、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ））、ＸＰ＿００１２１６８９９．１（ＧＩＤ：１１５４３３５２４、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ））、ＸＰ＿００１２７１８９１．１（ＧＩＤ：１２１７０７６２０、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ））、ＸＰ＿７５１８１１．１（ＧＩＤ：７０９９３９２８、Ａ．フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ＸＰ＿６５９６２１．１（ＧＩＤ：６７５２３１２１、Ａ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、ＸＰ＿００１２６６９９９．１（ＧＩＤ：１１９５００４８４、Ｎ．フィシェリ（Ｎ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ））およびＸＰ＿００１２５８５８５．１（ＧＩＤ：１１９４７３３７１、Ｎ．フィシェリ（Ｎ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ））などにおけるものの何れかであり得る。あるいは、本明細書中でのトランスグルコシダーゼは、前述の開示されるトランスグルコシダーゼ配列の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有し得、糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有し得る。前述のトランスグルコシダーゼは全て、本明細書中での加水分解反応で使用される場合、好ましくはＮ末端シグナルペプチドを欠く成熟型である。
本明細書中のある一定の実施形態において、トランスグルコシダーゼ酵素は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）トランスグルコシダーゼである、配列番号１のアミノ酸配列（トランスグルコシダーゼＬ−２０００）を含み得る（米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書）。あるいは、トランスグルコシダーゼは、配列番号１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得、糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有し得る。例えば参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書の開示に従い、配列番号１またはそれらの変異体の何れかを生成させることができる。配列番号１は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟トランスグルコシダーゼである。配列番号１はメチオニン残基で開始しないため、一般的には、シグナルペプチドを使用せずにそれを発現させる場合（酵素が細胞内で発現され、細胞溶解液から得られる発現系によってなど）、配列番号１に（直接的にまたはエピトープなどの介在する異種アミノ酸配列を介して）Ｎ末端開始メチオニンが付加されることが理解される。
グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３；アルファ−１，４−グルカングルコヒドロラーゼ）は本明細書中のある一定の実施形態において、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解するために、アルファ−グルコシダーゼとして使用することができる。このクラスの酵素は、これまで、グルコース含有二糖、オリゴ糖および多糖の非還元末端からのアルファ−１，４およびアルファ−１，６グリコシド結合の両方の加水分解を触媒するエキソ型酵素として認識されてきた。今回、本明細書中で開示されるようなグルコアミラーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性も有する。ある一定の実施形態において、アルファ−グルコシダーゼはグルコアミラーゼではない。
本明細書中でのグルコアミラーゼ酵素は、何らかの微生物起源、例えば細菌または真菌など由来であり得る。細菌グルコアミラーゼの例としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．リシェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．スリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ））のものが挙げられるが限定されない。真菌グルコアミラーゼの例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ロンギブラキアツム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ストリクチピリス（Ｔ．ｓｔｒｉｃｔｉｐｉｌｉｓ）、Ｔ．アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、Ｔ．コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、Ｔ．ハジアヌム（Ｔ．ｈａｚｉａｎｕｍ））、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ａ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｒ．ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ））、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｔ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．デュポンチ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ））、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｈ．ゲラチノサ（Ｈ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｈ．オリエンタリス（Ｈ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｈ．ビノサ（Ｈ．ｖｉｎｏｓａ）、Ｈ．シトリナ（Ｈ．ｃｉｔｒｉｎａ））、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＦ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ロセウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノース（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ））、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、Ｐ．ノタツム（Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ）、Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））およびサッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えばＳ．フィブリゲラ（Ｓ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ））のものが挙げられるが限定されない。本明細書中での使用のためのこれらの細菌および真菌グルコアミラーゼの例は、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１０２０３５号明細書で開示されている。本明細書中で有用なグルコアミラーゼ酵素の他の例は、全て参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５２９−５４４）、Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１０９７−１１０２）；Ｈａｙａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３−９２９）；米国特許第５０２４９４１号明細書、米国特許第４７９４１７５号明細書、米国特許第４２４７６３７号明細書、米国特許第６２５５０８４号明細書、米国特許第６６２０９２４号明細書、Ａｓｈｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７−９６４）、Ａｓｈｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１２９−１３３）、米国特許第４８６３８６４号明細書；米国特許第４６１８５７９号明細書、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ−Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：２１０−２１７）および米国特許第７４１３８８７号明細書に記載されている。あるいは、本明細書中でのグルコアミラーゼは、前述の開示されるグルコアミラーゼ配列の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有し得、糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有し得る。前述のグルコアミラーゼは全て、本明細書中での加水分解反応で使用される場合、好ましくはＮ末端シグナルペプチドを欠く成熟型である。本明細書中で有用な市販のグルコアミラーゼとしては、例えばＯＰＴＩＤＥＸ Ｌ−４００、ＧＣ１４７、ＧＣ３２１、Ｇ ＺＹＭＥ Ｇ９９０ ４Ｘ、ＯＰＴＩＭＡＸ７５２５、ＤＥＸＴＲＯＺＹＭＥ、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥおよびＧＬＵＣＺＹＭＥが挙げられる。
本明細書中のある一定の実施形態において、グルコアミラーゼ酵素は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼである、配列番号２（ＧＣ３２１）のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、グルコアミラーゼは、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得、糖中のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に対する加水分解活性を有し得る。例えば参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７４１３８８７号明細書または米国特許出願公開第２０１３／０１０２０３５号明細書の開示に従い、配列番号２またはその変異体の何れかを生成させることができる。配列番号２は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟グルコアミラーゼである。配列番号２はメチオニン残基で開始しないため、一般的に、シグナルペプチドを使用せずにそれを発現させる場合（酵素が細胞内で発現され、細胞溶解液から得られる発現系によってなど）、Ｎ末端開始メチオニンが（直接的にまたはエピトープなどの介在する異種アミノ酸配列を介して）配列番号２に付加されることが理解される。
トランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼなどの本明細書中のアルファ−グルコシダーゼ酵素は市販のものであり得る（例えば、ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，ＵＳＡ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ；Ａｍａｎｏ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）。あるいは、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書、米国特許第７４１３８８７号明細書または米国特許出願公開第２０１３／０１０２０３５号明細書に記載されるものなど、当技術分野で公知の何らかの手段によって、このような酵素を生成させ得る。例えば、アルファ−グルコシダーゼは、異種発現系、例えば微生物または真菌異種発現系などで組み換え産生させ得る。異種発現系の例としては、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．））および真核系が挙げられる。真核系は、例えば、酵母（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．））または真菌（例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）、例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）など、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）など）発現系を使用し得る。例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主において、配列番号１のトランスグルコシダーゼおよび配列番号２のグルコアミラーゼおよびそれらの変異体を発現させることができる。
本明細書中の加水分解反応で使用される場合、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、好ましくはＮ末端シグナルペプチドを欠く成熟型である。本明細書中の成熟アルファ−グルコシダーゼ酵素を産生させるための発現系は、細胞外分泌を指示するためのＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む、酵素をコードするポリヌクレオチドを使用し得る。このような実施形態でのシグナルペプチドは、分泌プロセス中に酵素から切り出される。シグナルペプチドは、トランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼに対して、ネイティブまたは異種の何れかであり得る。あるいは、成熟型のアルファ−グルコシダーゼ酵素は、酵素が細胞内で発現され、細胞溶解液から得られる発現系によってなど、シグナルペプチドを用いることなくそれを発現させることによって提供され得る。何れかのシナリオ（分泌または細胞内発現）において、エピトープなどの異種アミノ酸配列がアルファ−グルコシダーゼのＮ末端に任意選択により含まれ得る。
ある一定の実施形態において、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、その酵素を発現する細胞の直接的な使用により、本明細書中での加水分解反応において提供され得る。言い換えると、糖と接触させるアルファ−グルコシダーゼは、加水分解に対して適切な条件に置かれた細胞からのその発現によって存在し得る。したがって、このような細胞は、加水分解反応に単離アルファ−グルコシダーゼ標品を添加する代わりに使用し得る。この目的のための細胞は、例えば細菌、酵母または真菌細胞であり得る。酵母の例としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属およびシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属からのものが挙げられる。本明細書中で有用な他の発現系は、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０３２３８２２号明細書で開示されている。
本明細書中での糖は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む。したがって、糖の長さに依存して、これは例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含有し得る。糖は、好ましくは１、２または３個のこのタイプの結合を含有する。
本明細書中での糖は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含むため、この糖は、少なくとも１つのグルコース単位および少なくとも１つのフルクトース単位を含む。ある一定の実施形態において、本明細書中での糖は、グルコースおよびフルクトース単位のみを含む。このような組成物は、グルカン合成反応の二糖およびオリゴ糖副産物を特徴付け得る。あるいは、本明細書中での糖は、グルコースおよびフルクトースに加えて、ガラクトース、リボースおよびキシロースなどの他の単糖を含有し得る。
開示される本発明のある一定の実施形態において、加水分解される糖はオリゴ糖であり得る。本明細書中でのオリゴ糖は、例えば、２、３、４、５、６、７、８または９個の単糖単位を有し得る。当技術分野で理解されるように、本明細書中でのオリゴ糖は、オリゴ糖中のモノマー単位の数を規定する、その重合（ＤＰ）度数に関して言及され得る。ＤＰ３オリゴ糖は、例えば３個のモノマー単位を有する。したがって、オリゴ糖は、例えばＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５、ＤＰ６、ＤＰ７、ＤＰ８またはＤＰ９オリゴ糖であり得る。ある一定の実施形態において、糖のＤＰは３〜７（すなわちＤＰ３〜７）である。
３単位以上の単糖単位がある本明細書中でのオリゴ糖は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合に加えて、他の結合を含み得る（２単糖単位のオリゴ糖、すなわち二糖は、本明細書中での加水分解法において糖が少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を有する場合、ロイクロースであることに留意されたい）。例えば、オリゴ糖中に、本明細書中で示されるようなアルファ−グルコシダーゼによってまた加水分解され易い、アルファ−１，３、アルファ−１，６および／またはアルファ−１，４結合もあり得る。
ある一定の実施形態において、オリゴ糖は、アルファ−１，３および／またはアルファ−１，６グリコシド結合により連結されるグルコースモノマーのみを含む。したがって、このようなオリゴ糖は、アルファ−１，３グルコシル−グルコースおよび／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合のみを含む。このようなオリゴ糖の例は、アルファ−１，３結合またはアルファ−１，６結合のみを含有する。オリゴ糖は、ある一定の実施形態において、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％グルコシル−グルコース結合を含み得る。その他の実施形態において、本明細書中でのオリゴ糖中に約７５〜８５％のアルファ−１，３グルコシル−グルコース結合および約１５〜２５％のアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合があり得る。あるいは、本明細書中でのオリゴ糖は、これらのパーセンテージの合計が１００％以下である限り、何れかのパーセンテージ（１％〜９９％の何れかの整数値）のアルファ−１，３グルコシル−グルコース結合および何れかのパーセンテージ（１％〜９９％の何れかの整数値）のアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を含み得る。これらのオリゴ糖の何れも、例えば（ｉ）不溶性アルファ−グルカン（例えばポリアルファ−１，３−グルカン）または（ｉｉ）可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるグルカン合成反応からの分画中にあり得る。この結合含量は、（ｉ）個々に各オリゴ糖を、または（ｉｉ）オリゴ糖群（すなわち平均結合含量）を特徴付けることができる。アルファ−１，３および／またはアルファ−１，６グリコシド結合により連結されるグルコースモノマーのみを含むオリゴ糖は、例えばＤＰ２〜ＤＰ７またはＤＰ３〜ＤＰ７であり得る。オリゴ糖中の結合の厳密分布は、オリゴ糖副産物を生成させるグルカン合成反応の条件（例えばｇｔｆ酵素）によって変動し得ることが理解されよう。厳密な結合分布が今回開示される方法に対して重要ではないことがさらに理解されよう。
本明細書中での実施例は、アルファ−グルコシダーゼ（例えばトランスグルコシダーゼおよびグルコアミラーゼ酵素）が（ｉ）アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含むロイクロースおよび（ｉｉ）アルファ−１，３グルコシル−グルコースおよび／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合のみを含むオリゴ糖の両方を加水分解し得ることを明らかにする。したがって、例えばアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合、アルファ−１，３グルコシル−グルコース結合および／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を加水分解するための反応において、アルファ−グルコシダーゼを使用することができる。
本明細書中での糖中の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合は、本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼによって加水分解され得る。あるいは、例えばアルファ−グルコシダーゼによって、糖中の２、３、４、５またはそれを超えるアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合が加水分解され得ると考えられる。少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合の加水分解は、ある一定の実施形態において糖の非還元末端で起こり得る。例えば、糖が二糖、ロイクロースである場合、非還元末端グルコースがフルクトースから切り出され、遊離グルコースおよびフルクトースが得られる。別の例として、糖が、フルクトースにアルファ−１，５結合される非還元末端グルコースを有するオリゴ糖である場合、このグルコースは切り出され得、オリゴ糖の非還元末端にフルクトース残基が残り得ると考えられる。
接触工程前に存在した糖の量と比較して、開示される加水分解法において糖の量が減少する。この減少は、糖中の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合の加水分解切断によるものである。本明細書中での加水分解法における接触工程後の糖の量（例えば濃度）は、接触工程前に存在した糖の量（適切な条件下で糖と本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼを接触させる前）の、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％（または１％〜９０％の何れかの整数値）未満であり得る。
開示される本発明のある一定の実施形態において加水分解される糖は、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を有する二糖であるロイクロースである。本明細書中での加水分解法における接触工程後のロイクロースの濃度は、接触工程前に存在したロイクロースの濃度（適切な条件下でロイクロースと本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼを接触させる前）の、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％（または１％〜９０％の何れかの整数値）未満であり得る。本明細書中でのいくつかの態様における加水分解法は、あるいは、組成物中のロイクロースの量を減少させる方法と呼ぶことができる。
本明細書中での加水分解法において、例えば配列番号１を含むものなどのトランスグルコシダーゼ（トランスグルコシダーゼＬ−２０００）とロイクロースを接触させることができる。このような方法を完了した後のロイクロースの濃度は、ある一定の実施形態において、元のロイクロース濃度の約１〜３％未満であり得る。
接触工程前に存在した糖の量と比較して、開示される加水分解法において糖の量は減少する。あらゆる方法でこのような比較を行い得ることが理解されよう。例えば、加水分解法を行う前後両方で糖濃度を測定することができる。あるいは、今回開示されるようなアルファ−グルコシダーゼを対照反応に添加しないことを除き、同じ条件を有する対照反応に対して比較を行うことができる。
本明細書中でのある一定の実施形態において、アルファ−グルコシダーゼは、固定化され得る。酵素は、両方とも参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５５４１０９７号明細書および同第４７１３３３３号明細書で開示されるものなど、当技術分野で公知のあらゆる方法および／または手段を用いて固定化し得る。例えば、付加体（例えば酵素−グルタルアルデヒド付加体）を形成させるためにアミン反応性物質（例えばグルタルアルデヒド）の溶液と酵素を接触させ、その後、ポリアミン（例えばＥＰＯＭＩＮ Ｐ−１０５０などのポリエチレンイミン）で処理された固形担体に付加体を結合させることによって、１つ以上の酵素を固定化することができる。
ある一定の実施形態においてアルファ−グルコシダーゼ酵素を固定化することができる固形担体（固形支持体）は、無機または有機物質であり得る。このような物質としては、例えばガンマ−アルミナ、チタニア、粒状活性炭素、粒状珪藻土、ガラスビーズ、多孔質ガラス、軽石、シリカゲル、金属酸化物および酸化アルミニウムが挙げられる。
固形担体を処理するために、酵素およびアミン反応性物質を含む付加物への固形担体のその後の曝露によって、固形担体への酵素の付着が導かれるように、ポリアミンを使用することができる。本明細書中で有用なポリアミンの例としては、ポリエチレンジアミン、ポリエチレンイミン（例えば、ポリジエチレントリアミン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタエチレンヘキサミン、ポリヘキサメチレンジアミン）、ポリメチレンジシクロへキシルアミン、ポリメチレンジアニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、ポリフェニレンジアミンおよびこれらのポリアミン化合物の２種類以上の混合物が挙げられる。好ましいポリアミンは、水溶性であり、および／または約５００〜１００，０００ダルトンの分子量を有する。ある一定の実施形態においてＥＰＯＭＩＮ Ｐ−１０５０などのポリエチレンイミンを使用することができる。
本明細書中での酵素を含む付加体を調製するのに有用なアミン反応性物質は、例えば、アルデヒド、有機ハロゲン化物、無水物、アゾ化合物、イソチオシアネートおよび／またはイソシアネートであり得る。これらのアミン反応性物質の例としては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、テレフトアルデヒド（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、ビス−ジアゾベンジジン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、ジフェニル−４，４’−ジチオシアネート−２，２’−ジスルホン酸、３−メトキシジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアネート、トルエン−２−イソシアネート−４−イソチオシアネート、トルエン−２，−４−ジイソチオシアネート、ジアゾベンジジン、ジアゾベンジジン−３，３’−ジアニシジン、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスヨードアセトアミド、ヘキサメチレンジイソシアネート、塩化シアヌルおよび／または１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンが挙げられる。好ましくは、アミン反応性物質はグルタルアルデヒドなどのアルデヒドである。
アミン反応性化合物が付加したアルファ−グルコシダーゼ酵素をポリアミン処理固形担体と接触させることがき、それによって酵素を固形担体上に固定化する。本明細書中での固定化酵素は、本明細書中で開示されるような加水分解反応を行うために、カラム（例えば充填カラム）または撹拌タンクリアクター中など、様々なリアクター系で使用することができる。
本明細書中での糖を本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼ（例えばトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）と接触させるための適切な条件は、アルファ−グルコシダーゼによる糖中の１つ以上のアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合の加水分解を支持する条件である。適切な条件の例は、下記の実施例で開示される。本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼを糖基質と接触させるための条件（例えば温度、ｐＨ、時間）はまた、米国特許出願公開第２００８／０２２９５１４号明細書、米国特許第７４１３８８７号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０１０２０３５号明細書（これらは全て参照により本明細書中に組み込まれる）でも開示されており、開示される加水分解法に適用可能でもあり得る。
開示される加水分解法中の二糖およびオリゴ糖は、一般的には、水または水溶液中で可溶性である。したがって、本明細書中での糖をアルファ−グルコシダーゼと接触させることは、好ましくは、糖が溶解される、水性である適切な条件下で行われる。水性条件は、少なくとも約２０ｗｔ％の水を含む溶液または混合物を特徴付け得る。あるいは、本明細書中での水性条件は、例えば少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０または９５ｗｔ％の水（または２０〜９５ｗｔ％の何れかの整数値）である。水性条件は、適切な濃度であり、緩衝液により提供されるｐＨ範囲に基づき選択される、例えば酸性、中性またはアルカリ緩衝液などの緩衝液をさらに含み得る。緩衝液／緩衝剤の例としては、クエン酸、酢酸（例えば酢酸ナトリウム）、ＫＨ２ＰＯ４、ＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ホウ酸、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムが挙げられる。
本明細書中での加水分解反応のｐＨは、例えば約３．０〜９．０であり得る。加水分解反応ｐＨは、例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０であり得る。あるいは、ｐＨは約４〜５であり得る。ｐＨを設定するための技術には、例えば緩衝液、アルカリおよび／または酸の使用が含まれ、当技術分野で周知である。
本明細書中での加水分解反応の温度は、例えば約２０℃〜約８０℃であり得る。加水分解反応温度は、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０℃（または２０〜８０℃の何れかの整数値）であり得る。ある一定の実施形態において、約６０℃、６５℃または６０〜６５℃の加水分解温度が好ましい。
本明細書中での加水分解反応は、少なくとも例えば約１０分〜約９０時間にわたり行われ得る。加水分解反応の時間は、例えば少なくとも約０．５、１、２、３、４、８、１２、１６、２０、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４または９０時間（または０．５〜７２時間の何れかの整数値）であり得る。ある一定の実施形態において、ロイクロースを加水分解するためなど、例えば４時間未満（例えば０．５〜４時間）、加水分解反応を行うことができる。所望のレベルの加水分解を達成するために必要とされる時間は、使用される正確な条件により変動し、当業者により理解される。例えば反応に添加されるかまたは反応で使用される固形支持体に固定化される酵素の量を増加させると、接触時間は短縮される。
ある一定の実施形態において、加水分解反応において、本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼ酵素のうち１つ以上を使用し得る。例えば反応において、トランスグルコシダーゼおよびグルコアミラーゼの両方を使用することができる。本明細書中での加水分解反応におけるアルファ−グルコシダーゼの量は、例えば下記の実施例（例えば実施例２）で使用される量の何れかから±１０％〜２０％（または５％〜１０％）であり得る。あるいは、約０．１〜０．５ｖｏｌ％または０．１〜１．０ｖｏｌ％のアルファ−グルコシダーゼを加水分解反応において使用することができる。あるいはまた、加水分解反応において約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｐｐｍで本明細書中のアルファ−グルコシダーゼを使用することができる。トランスグルコシダーゼ単位（ＴＧＵ）は、例えば、次のアッセイ条件下で１分あたりに１マイクロモルのパノースを生成させるトランスグルコシダーゼ酵素の量として定義することができる。トランスグルコシダーゼ活性を例えば次のようにアッセイすることができる：４ｍＭパラ−ニトロフェニル−アルファ−グルコシドおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５中でトランスグルコシダーゼを合わせる。３０℃で３０分間温置後、等体積の１Ｍ炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止させ、ＯＤ４０５を記録する。グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）は、例えばｐＨ４．２および６０℃で可溶性デンプン基質（４％ＤＳ［置換度］）からグルコース／時間として計算される、１ｇの還元糖を生成させるグルコアミラーゼ酵素の量として定義することができる。
開示される本発明のある一定の実施形態において、加水分解反応中の糖の初濃度は、例えば約１ｗｔ％〜５０ｗｔ％であり得る。例えば、ロイクロースの濃度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ｗｔ％（または５〜４０ｗｔ％の何れかの整数値）であり得る。別の例として、本明細書中での加水分解反応中の１つ以上のオリゴ糖（例えば、ＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ２〜ＤＰ７、ＤＰ３〜ＤＰ７）の濃度は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｗｔ％であり得る。当業者は、糖の合計の濃度（二糖およびオリゴ糖を含む）がアルファ−グルコシダーゼ酵素の活性に影響があり得ることを認識し；酵素活性を最大化するための加水分解反応中の好ましい糖の合計濃度は、５０ｗｔ％乾燥固体（ＤＳ）未満であり得、いくつかの態様においては最も好ましい濃度は２０〜３５ｗｔ％ＤＳであり得る。
糖を本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼと接触させるためのある一定の実施形態における適切な条件は、（ｉ）グルカン合成反応、または（ｉｉ）グルカン合成反応から得られる分画を含み得、ここで糖はグルカン合成反応の副産物である。言い換えると、本明細書中での加水分解反応は、グルカン合成反応またはグルカン合成反応の分画という状況で行われ得るが、一般的には後者で行われる。本明細書中でのグルカン合成反応によって、例えば１つ以上の不溶性および／または可溶性アルファ−グルカン生成物が生成し得る。したがって、グルカン合成反応は、「アルファ−グルカン合成反応」として本明細書中のいくつかの実施形態において特徴付けられ得る。
グルカン合成反応は一般に、少なくともスクロース、水および１つの活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素および任意選択により他の成分を含む溶液を指す。グルカン合成反応中にあり得る他の成分としては、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性オリゴ糖（例えばＤＰ２〜ＤＰ７）および可溶性グルカン生成物が挙げられる。また、１つ以上のアルファ−グルカノヒドロラーゼ酵素は、いくつかの態様においてグルカン合成反応に含まれ得る。ＤＰが少なくとも８または９の、ポリアルファ−１，３−グルカンなどのある種のグルカン生成物は水に不溶性であり得、したがってグルカン合成反応中で溶解せず、むしろ溶液から出現し得ると理解されよう。したがって、本明細書中でのグルカン合成反応により生成したグルカンは不溶性であり得る。本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼ酵素は、反応の最初の準備中または反応終了近く（例えば８０〜９０％完了）または反応終了時など、その何れかの段階でグルカン合成反応に添加され得、後者の２つの時点が好ましい。
本明細書中でのグルカン合成反応は、グルカン生成物を生成させることに加えて、ロイクロースおよび／または可溶性オリゴ糖などの副産物を生成させるものであり得る。グルカンは、いくつかの態様において、ポリアルファ−グルカンである。したがって、本明細書中でのグルカン合成反応は、例えば、グルカン合成反応において一般的には少なくともロイクロースおよび／またはオリゴ糖副産物と同時生成されるポリアルファ−１，３−グルカンまたはムタンを生成させるためのものであり得る。
ある一定の実施形態において、グルカン合成反応は、ポリアルファ−１，３−グルカンなどのポリアルファ−グルカンを生成させるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。本明細書中で有用なこのようなグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、米国特許第７００００００号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８８号明細書、同第２０１３／０２４４２８７号明細書および同第２０１４／００８７４３１号明細書（全て参照により本明細書中に組み込まれる）で開示されている。
本明細書中でのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、何らかの微生物起源、例えば細菌または真菌など由来であり得る。細菌グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来のものである。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリチクス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチヌム（Ｌ．ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニクム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）およびＬ．フルクトスム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の例としては、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブルエッキ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブクネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンツム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
本明細書中でのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、プライマー非依存性またはプライマー依存性であり得る。プライマー非依存性グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカン合成を行うためにプライマーの存在を必要としない。プライマー依存性グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカンポリマー合成中に酵素に対してプライマーとして作用するための開始分子が反応溶液中に存在することを必要とする。「プライマー」という用語は、本明細書中で使用される場合、グルコシルトランスフェラーゼ酵素に対する開始剤として作用し得る何らかの分子を指す。ある一定の実施形態において使用することができるプライマーとしては、例えばデキストランおよび他の炭水化物に基づくプライマー、例えば加水分解グルカンなどが挙げられる。参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８７号明細書は、出発物質としてポリアルファ−１，３−グルカンを用いた加水分解グルカンの調製を開示する。プライマーとしての使用のためのデキストランは、例えばデキストランＴ１０（すなわち分子量が１０ｋＤのデキストラン）であり得る。
本明細書中でのグルカン合成反応のためのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当技術分野で公知の何らかの手段によって生成させ得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、異種発現系、例えば微生物異種発現系などで組み換え産生させ得る。異種発現系の例としては、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えばＴＯＰ１０またはＭＧ１６５５など；バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．））および真核（例えば酵母、例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）など）発現系が挙げられる。
本明細書中に記載のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、何らかの精製状況（例えば純粋または純粋でない）で使用し得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素をその使用前に精製し、および／または単離し得る。純粋でないグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、細胞溶解液の形態のものが挙げられる。酵素を異種発現させるために使用される細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））から細胞溶解液または抽出物を調製し得る。例えば、細菌をフレンチプレスセルを用いて破壊し得る。代替的な実施形態において、ホモジェナイザー（例えばＡＰＶ、Ｒａｎｎｉｅ、Ｇａｕｌｉｎ）で細菌をホモジェナイズ処理し得る。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、これらのタイプの調製物中で一般的に可溶性である。本明細書中での細菌細胞溶解液、抽出物またはホモジェネートは、スクロースからポリアルファ−１，３−グルカンなどのポリアルファ−グルカンを生成させるために、例えば反応溶液中約０．１５〜０．３％（ｖ／ｖ）で使用し得る。
本明細書中でのグルカン合成反応の温度は、必要に応じて調節することができる。ある一定の実施形態において、反応の温度は、約５℃〜約５０℃である。ある一定の他の実施形態における温度は約２０℃〜約４０℃である。
本明細書中でのグルカン合成反応におけるスクロースの初濃度は、例えば約２０ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌであり得る。あるいは、スクロースの初濃度は、約７５ｇ／Ｌ〜約１７５ｇ／Ｌまたは約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌであり得る。あるいはまた、スクロースの初濃度は、例えば約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１６０ｇ／Ｌ（または４０〜１６０ｇ／Ｌの何れかの整数値）であり得る。「スクロースの初濃度」は、反応溶液成分全て（少なくとも水、スクロース、ｇｔｆ酵素）が添加された直後のｇｔｆ反応溶液中のスクロース濃度を指す。
本明細書中でのグルカン合成反応において使用されるスクロースは非常に純度が高いか（≧９９．５％）または何らかの他の純度またはグレードであり得る。例えば、スクロースの純度は少なくとも９９．０％であり得るか、または試薬グレードのスクロースであり得る。別の例として、不完全精製スクロースを使用することができる。本明細書中での不完全精製スクロースは、白色精製スクロースに処理加工されていないスクロースを指す。したがって、不完全精製スクロースは、完全に未精製であるかまたは部分的に精製されたものであり得る。未精製スクロースの例は、「粗スクロース」（「粗糖」）およびその溶液である。部分精製スクロースの例は、１、２、３またはそれを超える結晶化工程を経ていない。本明細書中での不完全精製スクロースのＩＣＵＭＳＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は例えば１５０より大きいものであり得る。本明細書中でのスクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、サトウモロコシまたはトウモロコシなど、何らかの再生可能な糖の起源に由来し得る。本明細書中で有用な適切な形態のスクロースは、例えば結晶形態または非結晶形態（例えば、シロップ、サトウキビ汁、ビート汁）である。不完全精製スクロースのさらなる適切な形態は、米国特許出願第６１／９６９，９５８号明細書で開示される。
スクロースに対してＩＣＵＭＳＡ値を決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ ａｎｄ Ｔｅｎｔａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＣＵＭＳＡ）（Ｅｄ．Ｈ．Ｃ．Ｓ．ｄｅ Ｗｈａｌｌｅｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９６４）において、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓにより開示されている。ＩＣＵＭＳＡは、例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｒ．Ｊ．ＭｃＣｏｗａｇｅ，Ｒ．Ｍ．Ｕｒｑｕｈａｒｔ ａｎｄ Ｍ．Ｌ．Ｂｕｒｇｅ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｏｕｒ ｏｆ Ｒａｗ Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｒｏｗｎ Ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｅｄ Ｓｙｒｕｐｓ ａｔ ｐＨ７．０−Ｏｆｆｉｃｉａｌ，Ｖｅｒｌａｇ Ｄｒ Ａｌｂｅｒｔ Ｂａｒｔｅｎｓ，２０１１ ｒｅｖｉｓｉｏｎ）により記載されるような、ＩＣＵＭＳＡ法ＧＳ１／３−７によって測定することができる。
ある一定の実施形態において、グルカン合成反応のｐＨは、約４．０〜約８．０であり得る。あるいは、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５または８．０であり得る。ｐＨは、リン酸、トリス、クエン酸またはそれらの組み合わせを含むが限定されない、適切な緩衝液の添加または組み込みによって調整または調節され得る。グルカン合成反応における緩衝液濃度は、例えば０ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約１０、２０または５０ｍＭであり得る。
本明細書中でのグルカン合成反応において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンは、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（または５０％〜１００％の何れかの整数値）の、アルファ−１，３であるグリコシド結合を有し得る。したがって、このような実施形態において、ポリアルファ−１，３−グルカンは、アルファ−１，３ではないグリコシド結合の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％または０％（または０％〜５０％の何れかの整数値）未満である。
本明細書中でのポリアルファ−１，３−グルカンは、好ましくは、直鎖状／非分岐状である骨格を有する。ある一定の実施形態において、ポリアルファ−１，３−グルカンは、ポリマー中のグリコシド結合のパーセントとして、分岐点なしであるか、または約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の分岐点を有する。分岐点の例としては、アルファ−１，６−分岐点が挙げられる。
本明細書中でのグルカン合成反応において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンの分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）または重量平均分子量（Ｍｗ）として測定され得る。あるいは、分子量は、ダルトンまたはグラム／モルで測定され得る。ポリアルファ−１，３−グルカンポリマーのＤＰｗ（重量平均の重合度）またはＤＰｎ（数平均の重合度）を参照することも有用であり得る。
本明細書中でのポリアルファ−１，３−グルカンのＭｎまたはＭｗは少なくとも約１０００であり得る。あるいは、ＭｎまたはＭｗは、例えば少なくとも約１０００〜約６０００００（または１０００〜６０００００の何れかの整数値）であり得る。あるいはまた、ポリアルファ−１，３−グルカンの分子量はＤＰｎまたはＤＰｗで少なくとも約１００または少なくとも約１００〜１０００（または１００〜１０００の何れかの整数値）であり得る。
グルカン合成反応の分画は、糖を今回開示されるようなアルファ−グルコシダーゼに接触させるために適切な条件を構築し得る。分画は、グルカン合成反応からの溶液の一部または全てであり得る。一般的には、分画は、反応において合成された溶解性または不溶性グルカン生成物から分離されている。例えば、水中で不溶性である１つ以上のグルカン生成物（例えばポリアルファ−１，３−グルカン）から、それらの合成中の溶液から落ちる分画を分離することができる。本開示のある一定の好ましい実施形態における分画は、ポリアルファ−１，３−グルカン合成反応由来である。
分画の体積（任意選択により分画を希釈または濃縮する前、下記参照）は、ある一定の実施形態において、それが得られるグルカン合成反応の体積の、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％（または１０％〜９０％の何れかの整数値）であり得る。一般的には、不溶性グルカン（例えばポリアルファ−１，３−グルカン）を生成させるグルカン合成反応において、分画は、反応の溶液成分の一部（全てではない）であろう。分画はグルカン合成反応の何れかの段階で得ることができるが、好ましくは反応完了近く（例えば８０または９０％超完了）または反応完了後に得られる。
グルカン合成反応の分画の例は、ある一定の実施形態において、ろ液および上清を含む。したがって、不溶性グルカン生成物が合成される実施形態において、漏斗、フィルター、（例えばプレスフィルター）、遠心または、固形物から一部または全液体を除去することを可能にする当技術分野で公知の何らかの他の方法または機器を用いて、グルカン合成反応から本明細書中の分画を得る（分離する）ことができる。ろ過は、例えば重力、真空または加圧ろ過によるものであり得る。ろ過は、好ましくは不溶性グルカンの全てまたは殆どを除去し；液体から固形物を除去するのに十分な平均孔径（例えば約４０〜５０ミクロン）を有する何らかのフィルター材料（例えばろ紙）を使用することができる。分画は一般に、その溶解成分、例えばグルカン合成反応の副産物などの全てまたは殆どを保持する。ロイクロースは、本明細書中でのろ液中の好ましい糖である。
本明細書中の分画は、必要に応じて任意選択により希釈または濃縮することができる。分画の濃縮は、溶液を濃縮するのに適切な当技術分野で公知の何らかの他の方法または機器を用いて行うことができる。例えば、蒸発によって、例えばロータリーエバポレーター（例えば約４０〜５０℃の温度に設定）を用いることなどによって分画を濃縮することができる。分画は、本明細書中でのいくつかの態様において、元の分画体積の約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である体積まで濃縮することができる。濃縮分画（例えば濃縮ろ液）は、任意選択によりシロップと呼ばれ得る。
分画は、いくつかの態様において、分画が得られた組成物中に存在した水に代わる水を含み得る。例えば、グルカン合成反応からの糖副産物は、元の溶媒が別の溶媒で置き換えられるある種のクロマトグラフィー法において分離することができる（例えば、カラムに結合する糖副産物［したがって、元の溶媒から除去される］を新しい溶媒に溶出することができる）。
分画は、いくつかの態様において、糖をアルファ−グルコシダーゼと接触させるために上記で開示される適切な条件（例えば、温度、ｐＨおよび時間）の何れかを有するように処理し得る。例えば、アルファ−グルコシダーゼを分画に添加する前に約４〜５のｐＨを有するように分画を修飾することができる。別の例として、分画との加水分解反応の温度は約５５〜６５℃（例えば約６０℃）であり得る。また別の例において、加水分解反応においてシロップまで濃縮されている分画を使用することができる。
分画は、本明細書中のある一定の好ましい実施形態において、ポリアルファ−１，３−グルカン合成反応由来であり；このような分画は好ましくはろ液である。本明細書中でのポリアルファ−１，３−グルカン合成反応の分画は、少なくとも水、フルクトースおよび１つ以上のタイプの糖（ロイクロースおよび／またはオリゴ糖、例えばＤＰ２〜ＤＰ７など）を含む。このタイプの分画中にあり得る他の成分は、例えば、スクロース（すなわち、ｇｔｆ反応で消費されなかった残留スクロース）、１つ以上のｇｔｆ酵素、グルコース、緩衝液、塩、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）、ホウ酸、水酸化ナトリウム、塩酸、細胞溶解液成分、タンパク質および／または核酸を含む。最低限、ポリアルファ−１，３−グルカン合成反応からの分画の成分は、例えば水、フルクトース、グルコース、１つ以上のタイプの糖（ロイクロースおよび／またはオリゴ糖、例えばＤＰ２〜ＤＰ７など）および任意選択によりスクロースを含む。分画の組成は、一部、分画が得られるグルカン合成反応の条件に依存することが理解される。１つ以上のｇｔｆ酵素を含有する分画において、本明細書中での加水分解反応において分画を使用する前に、このような１つ以上のｇｔｆ酵素が不活性化（例えば熱不活性化）されることが好ましい。
グルカン合成反応におけるスクロースの重合を介して生成される糖副産物の厳密分布は、使用される反応条件およびｇｔｆ酵素、特に温度およびスクロース濃度に基づいて変動し得ることを理解されたい。グルカン合成反応の分画中の糖の厳密な組成は開示される加水分解プロセスに対して重要ではないことも理解されたい。一般に、スクロースの量が増加すると、ロイクロースおよびオリゴ糖の両方に対する反応の選択性が向上する。逆に、温度が上昇すると、ロイクロースに対する反応の選択性が低下する傾向があり、一方でオリゴ糖に対する選択性は大きく影響を受けない。糖と水との比率、すなわち総溶液重量に対して糖の質量を除することによって計算されるｗｔ％乾燥固体（ＤＳ）は、好ましくは真空下で５０℃を下回る温度で水を蒸発させるか、または水を添加するかの何れかによって、グルカン合成反応の分画における糖の相対分布に顕著な影響を与えずに調整し得ることも理解されたい。ｇｔｆ酵素に対する活性範囲を下回るようにｐＨを低下させることによるかまたはｇｔｆ酵素の熱不活性化によるかの何れかで（グルカンへの）完全な変換が達成される前にｇｔｆ反応を停止させることによって、分画中のスクロースのパーセンテージを上昇させることも可能である。
ある一定の実施形態において、本明細書中でのグルカン合成反応は、１つ以上の可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させることができる。可溶性アルファ−グルカン生成物（あるいは「可溶性繊維」）は、（ｉ）グルコシルトランスフェラーゼの直接生成物、または（ｉｉ）１つ以上のアルファ−１，３−グリコシド結合もしくは１つ以上のアルファ−１，６−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物であり得る。
本明細書中での可溶性アルファ−グルカンは、例えば次のものを含み得る：
ａ）少なくとも７５％のアルファ−１，３−グリコシド結合；
ｂ）２５％未満のアルファ−１，６−グリコシド結合；
ｃ）１０％未満のアルファ−１，３，６−グリコシド結合；
ｄ）５０００ダルトン未満のＭｗ；
ｅ）２０℃の水中１２ｗｔ％で０．２５パスカル秒（Ｐａ・ｓ）未満の粘度；
ｆ）４〜４０の範囲のデキストロース当量（ＤＥ）；
ｇ）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の１０％未満の消化性；
ｈ）２５℃でｐＨ７の水中少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の溶解度；および
ｉ）５未満の多分散指標（ＰＤＩ）。
このような可溶性アルファ−グルカンは、米国特許出願第６２／００４，２９０号明細書で開示されるように生成させることができる。
例として、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアルファ−（１，３）グリコシド結合を含み得る。
別の例として、上記のアルファ−（１，３）グリコシド結合実施形態に加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％以下、さらにより好ましくは１％未満のアルファ−（１，６）グリコシド結合をさらに含み得る。
別の例として、上記のアルファ−（１，３）およびアルファ−（１，６）グリコシド結合含量の実施形態に加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、１０％未満、好ましくは５％未満、最も好ましくは２．５％未満のアルファ−（１，３，６）グリコシド結合をさらに含み得る。
別の例として、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、９３〜９７％アルファ−（１，３）グリコシド結合および３％未満のアルファ−（１，６）グリコシド結合を含み得、３〜７のＤＰの混合物に対応する重量平均分子量を有する。さらなる実施形態において、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、約９５％のアルファ−（１，３）グリコシド結合および約１％のアルファ−（１，６）グリコシド結合を含み得、３〜７のＤＰの混合物に対応する重量平均分子量を有する。上記実施形態のさらなる態様において、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、１〜３％のアルファ−（１，３，６）結合または好ましくは約２％のアルファ−（１，３，６）結合をさらに含み得る。
別の例として、上述のグリコシド結合含量の実施形態に加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、５％未満、好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満のアルファ−（１，４）グリコシド結合をさらに含み得る。
別の例として、上述のグリコシド結合含量の実施形態に加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、５０００ダルトン未満、好ましくは２５００ダルトン未満、より好ましくは５００〜２５００ダルトン、最も好ましくは約５００〜約２０００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）を含み得る。
別の例として、上記特性の何れかに加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、２０℃の水中１２ｗｔ％で、２５０センチポアズ（０．２５Ｐａ・ｓ）未満、好ましくは１０ｃＰ（０．０１Ｐａ・ｓ）未満、好ましくは７ｃＰ（０．００７Ｐａ・ｓ）未満、より好ましくは５ｃＰ（０．００５Ｐａ・ｓ）未満、より好ましくは４ｃＰ（０．００４Ｐａ・ｓ）未満、最も好ましくは３ｃＰ（０．００３Ｐａ・ｓ）未満の粘度を含み得る。
可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、ある一定の実施形態において、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の１０％未満の消化性、または好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の消化性を有し得る。別の態様において、消化性の相対レベルは、あるいはＡＯＡＣ ２０１１．２５（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ Ａｓｓａｙ）（ＭｃＣｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．，９５（３），８２４−８４４）を用いて決定され得る。
上記実施形態の何れかに加えて、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、２５℃でｐＨ７の水中、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％または７０％の溶解度を有し得る。
一実施形態において、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、１０ｗｔ％未満、好ましくは５ｗｔ％未満、最も好ましくは１ｗｔ％以下の還元糖含量を含み得る。
一実施形態において、可溶性アルファ−グルカン繊維組成物は、４ｋｃａｌ／ｇ未満、好ましくは３ｋｃａｌ／ｇ未満、より好ましくは２．５ｋｃａｌ／ｇ未満、最も好ましくは約２ｋｃａｌ／ｇ以下のカロリー含量を含み得る。
別の例として、本明細書中での可溶性アルファ−グルカンは、次のものを含み得る：
ａ）１０％〜３０％のアルファ−１，３−グリコシド結合；
ｂ）６５％〜８７％のアルファ−１，６−グリコシド結合；
ｃ）５％未満のアルファ−１，３，６−グリコシド結合；
ｄ）５０００ダルトン未満の重量平均分子量（Ｍｗ）；
ｅ）２０℃の水中１２ｗｔ％で０．２５パスカル秒（Ｐａ・ｓ）未満の粘度；
ｆ）４〜４０、好ましくは１０〜４０の範囲のデキストロース当量（ＤＥ）；
ｇ）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の１０％未満の消化性；
ｈ）２５℃でｐＨ７の水中、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の溶解度；および
ｉ）５未満の多分散指標（ＰＤＩ）。
このような可溶性アルファ−グルカンは、米国特許出願第６２／００４，３０８号明細書で開示されるように生成させることができる。
別の例として、本明細書中での可溶性アルファ−グルカンは、次のものを含み得る：
ａ）２５〜３５のアルファ−１，３−グリコシド結合；
ｂ）５５〜７５％のアルファ−１，６−グリコシド結合；
ｃ）５〜１５％のアルファ−１，３，６−グリコシド結合；
ｄ）５０００ダルトン未満の重量平均分子量；
ｅ）２０℃の水中１２ｗｔ％で０．２５パスカル秒（Ｐａ・ｓ）未満の粘度；
ｆ）４〜４０の範囲のデキストロース当量（ＤＥ）；
ｇ）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の１０％未満の消化性；
ｈ）２５℃で水中、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の溶解度；および
ｉ）５未満の多分散指標。
このような可溶性アルファ−グルカンは、米国特許出願第６２／００４，３１２号明細書で開示されるように生成させることができる。
別の例として、本明細書中での可溶性アルファ−グルカンは、次のものを含み得る：
ａ）少なくとも９５％のアルファ−１，６−グリコシド結合；
ｂ）１％以下のアルファ−１，３−グリコシド結合；
ｃ）２％未満のアルファ−１，３，６−グリコシド結合；
ｄ）１．５％未満のアルファ−１，４−グリコシド結合；
ｅ）２００００ダルトン未満の重量平均分子量；
ｆ）２０℃の水中１２ｗｔ％で０．２５パスカル秒（Ｐａ・ｓ）未満の粘度；
ｇ）１〜３０の範囲のデキストロース当量（ＤＥ）；
ｈ）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の１０％未満の消化性；
ｉ）２５℃でｐＨ７の水中、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の溶解度；および
ｊ）５未満の多分散指標。
このような可溶性アルファ−グルカンは、米国特許出願第６２／００４，３１４号明細書で開示されるように生成させることができる。
別の例として、本明細書中での可溶性アルファ−グルカンは、次のものを含み得る：
ａ）一連の、
ｉ）１％〜５０％のアルファ−１，３−グリコシド結合；または
ｉｉ）１０％より大きいが４０％未満のアルファ−１，４−グリコシド結合；または
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の何らかの組み合わせ；
ｂ）１〜５０％のアルファ−１，２−グリコシド結合；
ｃ）０〜２５％のアルファ−１，３，６−グリコシド結合；
ｄ）９８％未満のアルファ−１，６−グリコシド結合；
ｅ）３００ｋＤａ未満の重量平均分子量；
ｆ）２０℃の水中１２ｗｔ％で０．２５パスカル秒（Ｐａ・ｓ）未満の粘度；
ｇ）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＯＡＣ）法２００９．０１により測定した場合の２０％未満の消化性；
ｈ）２５℃でｐＨ７の水中、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の溶解度；および
ｉ）２６未満、好ましくは５未満の多分散指標。
このような可溶性アルファ−グルカンは、米国特許出願第６２／００４，３０５号明細書で開示されるように生成させることができる。
ある一定の実施形態において、可溶性アルファ−グルカンはグルコシルトランスフェラーゼの直接生成物である。このようなグルコシルトランスフェラーゼおよび適切なグルカン合成反応におけるその使用のための条件は、本明細書中で開示されるとおりであり得るか、または例えば米国特許出願第６２／００４，２９０号明細書、同第６２／００４，３０８号明細書、同第６２／００４，３１２号明細書、同第６２／００４，３１４号明細書および／または同第６２／００４，３０５号明細書の何れかで開示されるとおりであり得る。
可溶性アルファ−グルカンは、あるいは、例えば１つ以上のアルファ−１，３−グリコシド結合または１つ以上のアルファ−１，６−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物であり得る。いくつかの態様において、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるためのグルカン合成反応は、少なくとも１つのグルコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも１つのアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方を含み得る。他の態様において、グルカン合成反応は、最初に、唯一の酵素成分として１つ以上のグルコシルトランスフェラーゼを含み得る。このような反応は、アルファ−グルカノヒドロラーゼによる修飾に未だ供されていない第一のアルファ−グルカン生成物を生成させる。そして、可溶性アルファ−グルカン生成物に対する第一の生成物の修飾を可能にするのに適切な時間にわたり、少なくとも１つのアルファ−グルカノヒドロラーゼを反応に添加する。このように、グルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用を通じて可溶性アルファ−グルカン生成物を合成するための様々な方法がある。グルカン合成反応中および／またはグルカン合成後に１つ以上のアルファ−グルカノヒドロラーゼ酵素が含まれるグルカン合成反応を行うための条件は、本明細書中で開示されるとおりであり得るか、または例えば米国特許出願第６２／００４，２９０号明細書、同第６２／００４，３０８号明細書、同第６２／００４，３１２号明細書、同第６２／００４，３１４号明細書および／または同第６２／００４，３０５号明細書の何れかで開示されるとおりであり得る。
本明細書中でのアルファ−グルカノヒドロラーゼは、例えばデキストラナーゼ（アルファ−１，６−結合グリコシド結合を加水分解可能；Ｅ．Ｃ．３．２．１．１１）、ムタナーゼ（アルファ−１，３−結合グリコシド結合を加水分解可能；Ｅ．Ｃ．３．２．１．５９）、ミコデキストラナーゼ（（１−３）−および（１−４）−結合の両方を含有するアルファ−Ｄ−グルカン中の（１−４）−アルファ−Ｄ−グルコシド結合をエンド型加水分解可能；ＥＣ３．２．１．６１）、グルカン１，６−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７０）およびアルテルナナーゼ（アルテルナンをエンド型加水分解性に切断可能；Ｅ．Ｃ．３．２．１．−；米国特許第５７８６１９６号明細書を参照）であり得る。
配列番号４７を含むムタナーゼは、ある一定の態様において使用することができる。あるいは、ムタナーゼは、配列番号４７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得、例えばムタナーゼ活性を有し得る。
１つ以上の可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるための今回開示されるようなグルカン合成反応は、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼを使用する、本明細書中での加水分解反応を行うための適切な条件として直接役立ち得る。このような加水分解は、例えばポリアルファ−１，３−グルカンを生成させるグルカン合成反応の加水分解処理に関して上記で開示される条件の何れかに従い行うことができる。あるいは、１つ以上の可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるためのグルカン合成反応の分画（例えばクロマトグラフィー分画）は、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合のアルファ−グルコシダーゼ介在性の加水分解を行うための適切な条件として使用することができる。
分画は、本明細書中のある一定の実施形態において、グルカン合成反応のクロマトグラフィー分画であり得る。例えば、分画は、本明細書中で開示されるような１つ以上の可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画であり得る。このような反応は、任意選択により、グルカン合成中および／またはグルカン合成完了後に１つ以上のアルファ−グルカノヒドロラーゼを含み得る。実施形態のこれらのタイプの何れかでの分画は、一般的に、それが生成された反応組成物からの可溶性アルファ−グルカン生成物の全てまたは殆ど（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）を分離する目的で得られてきた。可溶性アルファ−グルカン生成物の全てまたは殆どから分離したら、１つ以上のアルファ−グルカナーゼを用いて、分画を本明細書中で開示されるアルファ−１，５グルコシル−フルクトース加水分解プロセスの何れかに供することができる。
本明細書中でのクロマトグラフィー分画は一般に、適切なタイプの液体クロマトグラフィーを用いて得ることができる。液体クロマトグラフィーは、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外ろ過、精密ろ過または透析を用いて行うことができる。
本開示はまた、糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素（例えば、トランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）に接触させることによって生成される組成物にも関し、ここで、（ｉ）糖は、少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む二糖またはオリゴ糖であり、かつ（ｉｉ）アルファ−グルコシダーゼ酵素は、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する。このようにして生成される組成物は、接触前に存在した糖の量と比較して減少した量の糖を含む。組成物の例としては、本明細書中で開示されるものの何れか、例えばグルカン合成反応からの加水分解ろ液または可溶性アルファ−グルカンを生成させるために使用したグルカン合成反応の加水分解分画が挙げられる。加水分解法に関して上記および実施例で開示される特性およびその生成物の何れも、組成物を特徴付け得る。組成物の次の特性は例である。
アルファ−グルコシダーゼ酵素は、組成物のある一定の実施形態において、配列番号５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８またはＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡ（ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。トランスグルコシダーゼは、組成物のある一定の実施形態において、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。グルコアミラーゼは、組成物のある一定の実施形態において、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、開示される組成物を生成させるために、本明細書中で開示されるアルファ−グルコシダーゼ酵素の何れかを使用することができる。
本明細書中での加水分解方法により生成される組成物は、例えば、糖をアルファ−グルコシダーゼと接触させる前に存在したロイクロースの濃度の５０％未満のロイクロースなどの糖の濃度を有し得る。
本明細書中のある一定の実施形態における加水分解法により生成される組成物はグルカン合成反応またはその分画であり得、グルカン合成反応の糖副産物をアルファ−グルコシダーゼと接触させる。この実施形態における分画は、例えば、グルカン合成反応のろ液または可溶性アルファ−グルカンを生成させるために使用されるグルカン合成反応の分画であり得る。この実施形態における糖は、例えばロイクロースであり得る。
今回開示される実施形態が、一部分において、さもなければ分解が困難であり得る二糖およびオリゴ糖を糖化するために有用であることが当業者によって理解されよう。この特性は、例えば（ｉ）フルクトース濃縮および（ｉｉ）発酵の促進方法を行うために利用することができる。
下記の実施例６は、加水分解されなかったろ液を使用した場合と比較して、アルファ−グルコシダーゼ（トランスグルコシダーゼ）によって加水分解したグルカンろ液を使用した場合に、クロマトグラフィーによるフルクトース濃縮が促進されることを明らかにする。
したがって、開示される本発明は、グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法にさらに関する。この方法は、（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素（例えば、トランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）と接触させることであって、酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、（ｂ）工程（ａ）の分画のフルクトース濃度と比較してより高濃度のフルクトースを有する組成物を得るために、工程（ａ）の加水分解分画からフルクトースを分離することとを含む。
例えばアルファ−グルコシダーゼ（例えばトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）酵素に関する開示されるフルクトース濃縮法の特性およびグルカン合成反応の分画は、これらの各特性に関して本明細書中で提供される開示の何れかに従い得る。
フルクトースを分離する工程（ｂ）は、当技術分野で公知の何れかの手段により行うことができる。例えば、下記実施例で開示されるように、または参照により本明細書中に組み込まれる欧州特許公開欧州特許第２２９２８０３Ｂ１号明細書の開示に従うことによって、クロマトグラフィーを使用することができる。
開示される濃縮法から得られるフルクトース濃度がより高い組成物（例えば、フルクトース溶液またはフルクトースシロップ）は、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９ｗｔ％フルクトースを有し得る。
本明細書中でのフルクトース濃縮法は、今回開示されるようなアルファ−グルコシダーゼで加水分解されていないろ液を使用するものよりも良好に行うことができる。このような性能向上は、少なくとも４０％、４５％または５０％のパーセントフルクトース回収に関して測定することができる。
本開示は、（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素（例えばトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）と接触させることであって、このアルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合で加水分解する、接触させることと、（ｂ）生成物を得るために微生物を用いて工程（ａ）の分画を発酵させることと、（ｃ）任意選択により（ｂ）の生成物を単離することとを含む、発酵方法にさらに関する。（ｂ）の発酵工程は、工程（ａ）の後または工程（ａ）と同時に行うことができる。重要なこととして、この方法は、例えばグルカン合成反応の加水分解ろ液を発酵させることによってエタノールを生成させるために使用することができる。このようなプロセスからのエタノール収率は、加水分解されていないグルカンろ液を発酵させる場合に得られるエタノール収率よりも高い。
アルファ−グルコシダーゼ（例えば、トランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）酵素に関する開示される発酵方法、二糖およびオリゴ糖、グルカン合成反応の分画および適切な接触条件の特性は、例えば、これらの各特性に関して本明細書中で提供される開示の何れかに従い得る。
本明細書中での発酵方法での使用のための微生物は、例えば細菌、酵母または真菌であり得る。本明細書中で有用な細菌の例としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）が挙げられる。本明細書中で有用な酵母の例としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＳ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）などが挙げられる。
本明細書中での発酵方法は、エタノールまたは酸（例えば乳酸）などの生成物を生じさせ得る。しかし、必要に応じて他の生成物を産生させることができると考えられる。開示されるような発酵方法を用いたある種の生成物の産生が、発酵で使用される微生物などの様々な条件に依存することは、当業者により理解されよう。本明細書中での発酵のための条件は、下記実施例で開示されるとおり、または例えば、両方とも参照により本明細書中に組み込まれる、Ｅｌ−Ｍａｎｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）およびＳｔａｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ）で開示されるとおりであり得る。
本明細書中での発酵方法のある一定の実施形態における生成物の収率は、本明細書中でのアルファ−グルコシダーゼで加水分解されていないグルカンろ液を発酵させる場合に得られる生成物収率よりも高い。この比較は、例えばグルカン合成反応の非加水分解分画を使用した対照発酵に対するものであり得る。本明細書中での発酵の生成物収率は、例えば少なくとも約１０％、２０％、４０％、６０％、８０％または１００％（または１０％〜１００％の何れかの整数値）、向上させることができる。さらに、本明細書中での発酵による生成物形成の速度を向上させることができる。
下記の実施例７は、加水分解されていないグルカンろ液を含むフィードを提供された酵母によってロイクロースを発酵させてエタノールにし得ることを明らかにする。したがって、ロイクロースを発酵させて生成物（例えばエタノール）を生成させるために微生物を用いる方法が本明細書中でさらに開示される。このような方法は、本明細書中で開示されるようなアルファ−グルコシダーゼで（ｉ）加水分解されているかまたは（ｉｉ）加水分解されていないグルカンろ液を発酵させることを含み得る。グルカンろ液中でまたは別の形態（例えば半精製または濃縮形態）でロイクロースが提供されるか否かにかかわらず、ロイクロースを発酵させるための方法は、ロイクロースを使用するために微生物（例えば酵母、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）を順応させることを含み得る。このような順応は、例えば、少なくとも２または３回の増殖サイクルにわたり、ロイクロースおよび任意選択により他の糖の存在下で微生物を増殖させ、その後、生成物を発酵させるために微生物がより多くのロイクロースを使用することを含み得る。ある一定の実施形態において、微生物は、（ｉ）ロイクロースを含む第一のフィード中で増殖させ（１サイクル完了）、（ｉｉ）第一のフィードから回収し、（ｉｉｉ）ロイクロースを含む第二のフィード中で増殖させ（２回のサイクル完了）、（ｉｖ）任意選択により第二のフィードから除去し、および（ｖ）任意選択により第三のフィード中で増殖させ得る（３回のサイクル完了）。このように順応させた微生物は、ある一定の実施形態におけるロイスクロース発酵能が向上し得る。
下記実施例９は、同時に酵母で発酵させながら、グルカンろ液がトランスグルコシダーゼで加水分解される場合、酵母による発酵に対してグルカンろ液中に存在する殆ど全て（例えば＞９８％または＞９９％）のロイクロースを使用し得ることを明らかにする。したがって、本明細書中でのロイクロース発酵方法の促進は、微生物でロイクローを発酵させながら同時にアルファ−グルコシダーゼ（例えばトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼ）でロイクロースを加水分解することを含み得る。
本明細書中で開示される組成物および方法の非限定例は次のものを含む：
１．少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖においてアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法であって、糖が二糖またはオリゴ糖であり、方法が、適切な条件下で糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることを含み、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、糖の量が、接触前に存在した糖の量と比較して減少している、方法。
２．アルファ−グルコシダーゼ酵素が固定化されている、実施形態１に記載の方法。
３．糖がロイクロースである、実施形態１に記載の方法。
４．接触工程後のロイクロースの濃度が、接触前に存在したロイクロースの濃度の５０％未満である、実施形態３に記載の方法。
５．適切な条件が、
（ｉ）グルカン合成反応、または
（ｉｉ）グルカン合成反応から得られる分画
を含み、糖がグルカン合成反応の副産物である、実施形態１、２、３または４に記載の方法。
６．グルカン合成反応が、少なくとも１つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、実施形態５に記載の方法。
７．分画がグルカン合成反応のろ液である、実施形態６に記載の方法。
８．グルカン合成反応が、
（ｉ）グルコシルトランスフェラーゼの生成物、または
（ｉｉ）１つ以上のアルファ−１，３−グリコシド結合または１つ以上のアルファ−１，６−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物である、少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、実施形態５に記載の方法。
９．分画がグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である、実施形態８に記載の方法。
１０．アルファ−グルコシダーゼ酵素がトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼである、実施形態１〜９の何れか１つに記載の方法。
１１．糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることにより生成される組成物であって、糖が二糖またはオリゴ糖であり、かつ少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含み、酵素が、糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、組成物が、接触前に存在した糖の量と比較して減少した量の糖を含む、組成物。
１２．糖がロイクロースである、実施形態１１に記載の組成物。
１３．糖が（ｉ）グルカン合成反応、または（ｉｉ）グルカン合成反応から得られる分画にあり、糖がグルカン合成反応の副産物である、実施形態１１または１２に記載の組成物。
１４．グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法であって、
（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）の分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得るために、工程（ａ）の加水分解分画からフルクトースを分離することとを含む、方法。
１５．（ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、アルファ−グルコシダーゼ酵素が、分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
（ｂ）生成物を得るために微生物を用いて工程（ａ）の分画を発酵させることであって、発酵が、工程（ａ）の後または工程（ａ）と同時に行われる、発酵せせることと、
（ｃ）任意選択により（ｂ）の生成物を単離することと
を含み、（ｂ）の生成物の収率が、アルファ−グルコシダーゼ酵素と接触していないグルカン合成反応の分画を発酵させる生成物収率と比較して上昇している、発酵方法。
開示される本発明は、次の実施例でさらに定義される。これらの実施例は、本発明のある一定の好ましい態様を示しながら、単なる説明のために与えられることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の基本的な特徴を確かめることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件にそれを順応させるために本発明の様々な変更形態および改変形態をなし得る。
略語
本明細書中で使用される略語の一部の意味は次のとおりである：「ｇ」はグラムを意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「％」はパーセントを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「ｍ」はメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｍｏｌ％」はモルパーセントを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｇ／ｇ」はミリグラム／グラムを意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「ＭＰａ」はメガパスカルを意味する。
一般的方法
別段の断りがない限り、試薬は全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。スクロースはＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から得た。
グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素の粗製抽出物の調製
イソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導発現系を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０Ｂにおいてストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素（配列番号３）を発現させた。配列番号３は、ＧＥＮＢＡＮＫ認識番号４７５２７のＳ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪアミノ酸配列と比較するとＮ末端に４２個の残基欠失があるが、開始メチオニンを含む。簡潔に述べると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｇｔｆＪ酵素を発現させるためにコドン最適化されたＤＮＡ配列から配列番号３を発現させるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。このＤＮＡ配列は、発現ベクター、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）中に含有された。形質転換細胞をＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン；５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で０．０２５の初期光学密度（６００ｎｍでのＯＤ）になるように接種し、２５０ｒｐｍで振盪させながらインキュベーター中で３７℃で増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．８〜１．０に到達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによって、培養物に対して誘導を行った。誘導した培養物を振盪器に置き、誘導後３時間で回収した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）遠心機において培養細胞を遠心（２５℃、１６０００ｒｐｍ）することによって、ＧｔｆＪ酵素（配列番号３）を回収し、５．０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で細胞を再懸濁し、氷上で４℃に冷却した。０．１ｍｍシリカビーズとともにビーズビーターを用いて細胞を破壊し、次いで４℃で１６０００ｒｐｍで遠心して、破壊されていない細胞および細胞残屑をペレット化した。粗製抽出物（可溶性ＧｔｆＪ酵素、配列番号３を含有）をペレットから分離し、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を決定するためにブラッドフォードタンパク質アッセイによって分析した。
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｃ１５０ｇｔｆ−Ｓ酵素（配列番号４０）を次のように調製した。ＳＧ１１８４は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｃ１５０（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＧＩ：３２１２７８３２１）からのグリコシルトランスフェラーゼＧｔｆ−Ｓの短縮型（「ＧＴＦ０４５９」）を発現するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現株である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドｐＭＰ７９からのＮ末端短縮タンパク質ＧＴＦ０４５９（配列番号４２）をコードする遺伝子（配列番号４１）をａｐｒＥプロモーター下のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）組み込み発現プラスミドｐ４ＪＨのＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ベクター上でＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥシグナルペプチドと融合させた。コンストラクトを最初に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに形質転換し、アンピシリン（１００ｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレート上で選択した。次いで、９個のプロテアーゼ欠失（ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ、Δｖｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ、ΔｎｐｒＢ）を含有するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６に、ＧＴＦ０４５９を発現する、確認されたコンストラクトｐＤＣＱ９８４を形質転換し、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレート上で選択した。５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＬＢプレート上で増殖させたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＬＢプレート上に数回画線した。得られたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現株、ＳＧ１１８４を最初に２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で増殖させ、次いで２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＧｒａｎｔｓＩＩ培地に継代培養し、３０℃で２〜３日間増殖させた。培養物を４℃で３０分間、１５，０００ｇで回転させ、０．２２μｍフィルターに通して上清をろ過した。ろ過した上清を分注し、−８０℃で凍結させた。
従来の流加発酵によって、ＧＴＦ０４５９（配列番号４２）を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＧ１１８４株を有酸素の液内条件下で増殖させた。０〜０．２５％コーンスティープ固形物（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｓｏｌｉｄ）（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、５〜２５ｇ／Ｌリン酸ナトリウムおよびカリウム、０．３〜０．６Ｍ硫酸第一鉄の溶液、塩化マンガンおよび塩化カルシウム、０．５〜４ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムおよび０．０１〜３．７ｇ／Ｌ硫酸亜鉛の溶液、硫酸銅（Ｉ）、ホウ酸およびクエン酸を含有する栄養培地を使用した。泡形成を調節するために２〜４ｍＬ／Ｌで消泡剤、ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ８８２を添加した。バッチ中の初期グルコースが検出不可能であった場合、１０Ｌ発酵に５０％（ｗ／ｗ）グルコースフィードを与えた。グルコースフィード速度を数時間にわたり徐々に変化させた。３０℃および２０％ＤＯで、かつ７５０ｒｐｍの初期撹拌で発酵を調節した。５０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．２に調節した。２日間の発酵実施全体にわたり、ｐＨ、温度、気流およびＤＯ％などの発酵パラメーターを監視した。発酵実施の最後に培養ブロスを回収し、遠心して上清を得た。次いで、ＧＴＦ０４５９（配列番号４２）を含有する上清を−８０℃で凍結保存した。
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＭＴ−４２３９ｇｔｆ−Ｃ酵素（配列番号４３）を次のように調製した。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現のために最適化されたコドンを使用して、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）でＧＩ：３１３００８８（配列番号４３；Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＭＴ−４２３９からのｇｔｆ−Ｃ）として同定されるグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素の短縮型をコードする遺伝子を合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。Ｎ末端短縮化およびＣ末端Ｔ１短縮化を有するＧＴＦ００８８ＢｓＴ１（配列番号４５）をコードする遺伝子（配列番号４４）をＧＥＮＳＣＲＩＰＴプラスミドから増幅させ、ａｐｒＥプロモーター下のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）組み込み発現プラスミドｐ４ＪＨのＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ベクター上でＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥシグナルペプチドと融合させた。コンストラクトを最初に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）入りのＬＢ上で選択した。次いで、９個のプロテアーゼ欠失（ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、Δｅｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ、Δｖｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ、ΔｎｐｒＢ）を含有するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６にＧＴＦ００８８ＢｓＴ１を発現する、確認されたコンストラクトｐＤＣＱ１０２１を形質転換し、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）入りのＬＢプレート上で選択した。５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＬＢプレート上で増殖させたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＬＢプレート上に数回画線した。得られたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現株ＳＧ１２２１を最初に２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りのＬＢ培地で増殖させ、次いで２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＧｒａｎｔｓＩＩ培地に継代培養し、３０℃で２〜３日間増殖させた。培養物を４℃で３０分間、１５，０００ｇで回転させ、０．２２μｍフィルターに通して上清をろ過した。ろ過した上清を分注し、−８０℃で凍結させた。
従来の流加発酵によって、ＧＴＦ００８８ＢｓＴ１（配列番号４５）を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＧ１２２１株を有酸素の液内条件下で増殖させた。０〜０．２５％コーンスティープ固形物（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、５〜２５ｇ／Ｌリン酸ナトリウムおよびカリウム、０．３〜０．６Ｍ硫酸第一鉄の溶液、塩化マンガンおよび塩化カルシウム、０．５〜４ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムおよび０．０１〜３．７ｇ／Ｌ硫酸亜鉛の溶液、硫酸銅（Ｉ）、ホウ酸およびクエン酸を含有する栄養培地を使用した。泡形成を調節するために２〜４ｍＬ／Ｌで消泡剤、ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ８８２を添加した。バッチ中の初期グルコースが検出不可能であった場合、２Ｌ発酵に５０％（ｗ／ｗ）グルコースフィードを与えた。グルコースフィード速度を数時間にわたり徐々に変化させた。３０℃および２０％ＤＯで、かつ４００ｒｐｍの初期撹拌で発酵を調節した。５０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウムを用いてｐＨを７．２に調節した。２日間の発酵実施全体にわたり、ｐＨ、温度、気流およびＤＯ％などの発酵パラメーターを監視した。発酵実施の最後に培養ブロスを回収し、遠心して上清を得た。次いで、ＧＴＦ０８８ＢｓＴ１（配列番号４５）を含有する上清を−８０℃で凍結保存した。
グルコシルトランスフェラーゼＧＴＦ０４５９およびＧＴＦ００８８ＢｓＴ１活性の決定
２５ｇ／Ｌデキストラン（ＭＷ 約１５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃３１３９４）の存在下または非存在下で、３７℃および１２５ｒｐｍオービタル振盪で、ｐＨ５．５の２５ｍＭまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の２００ｇ／ＬスクロースとともにＧＴＦ酵素を含有する１〜１０％（ｖ／ｖ）粗製タンパク質抽出物を温置することによって、グルコシルトランスフェラーゼ活性アッセイを行った。反応混合物の１アリコートを１時間、２時間および３時間の時点で採取し、９０℃で５分間加熱してＧＴＦを不活性化させた。１３，０００×ｇで５分間の遠心によって不溶性物質を除去し、続いて０．２μｍＲＣ（再生セルロース）膜に通してろ過した。８５℃で２本のＡＭＩＮＥＸ ＨＰＸ−８７Ｃカラムシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ＨＰＬＣによって、得られたろ液を分析して、スクロース濃度を定量した。各時点でのスクロース濃度を反応時間に対してプロットし、直線プロットの傾きから反応初速度を決定した。ＧＴＦ活性１単位は、アッセイ条件下で１分間に１マイクロモルのスクロースを消費するために必要とされる酵素の量として定義した。
アルファ−（１，３）−グルカノヒドロラーゼ（ムタナーゼ）の粗製抽出物の調製
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）においてＧＩ：２１２５３３３２５として特定されるペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）ＡＴＣＣ（登録商標）１８２２４（商標）ムタナーゼをコードする遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成した。選択のためのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）アセトアミダーゼを用いて、ＣＢＨＩプロモーターおよびターミネーターの調節下で、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）中の関心のある遺伝子を発現させるために設計されたベクターであるプラスミドｐＴｒｅｘ３にＳａｃＩＩおよびＡｓｃＩ制限部位に、タンパク質配列（ＭＵＴ３３２５；配列番号４７）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）をサブクローニングした。得られたプラスミドをＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）に遺伝子銃注入によって形質転換した。遺伝子銃形質転換の詳細な方法は、参照により本明細書中に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開国際公開第２００９／１２６７７３Ａ１号パンフレットに記載されている。安定なクローンＴＲＭ０５−３からの胞子がある１ｃｍ２寒天プラグを使用して、産生培地（下記）に接種した。２８℃および２２０ｒｐｍで４〜５日間、振盪フラスコ中で培養物を増殖させた。分泌されたタンパク質を回収するために、４０００ｇで１０分間の遠心によって細胞塊を最初に除去し、０．２μｍ滅菌フィルターに通して上清をろ過した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってムタナーゼＭＵＴ３３２５（配列番号４７）の発現を確認した。
産生培地の成分を以下に列挙する。
ＭＵＴ３３２５発現株ＴＲＭ０５−３の１．０ｍＬ凍結胞子懸濁液を２Ｌのバッフル付きフラスコ中で０．５Ｌの最少培地に接種することによって、発酵種培養物を調製した（最少培地は、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、４．５ｇ／Ｌ一塩基性リン酸カリウム、１．０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、１４．４ｇ／Ｌクエン酸無水物、１ｇ／Ｌ塩化カルシウム二水和物、０．４３７５ｇ／Ｌクエン酸を含む２５ｇ／Ｌグルコースおよび微量元素、０．５ｇ／Ｌ硫酸第一鉄七水和物、０．０４ｇ／Ｌ硫酸亜鉛七水和物、０．００８ｇ／Ｌ硫酸銅五水和物、０．００３５ｇ／Ｌ硫酸マンガン一水和物および０．００２ｇ／Ｌホウ酸から構成された。ｐＨは５．５であった）。３２℃および１７０ｒｐｍで４８時間、培養物を増殖させ、その後、１４Ｌ発酵槽中の８Ｌの産生培地に移した。産生培地は、７５ｇ／Ｌグルコース、４．５ｇ／Ｌ一塩基性リン酸カリウム、０．６ｇ／Ｌ塩化カルシウム無水物、１．０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、７．０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．５ｇ／Ｌクエン酸無水物、０．５ｇ／Ｌ硫酸第一鉄七水和物、０．０４ｇ／Ｌ硫酸亜鉛七水和物、０．００１７５ｇ／Ｌ硫酸銅五水和物、０．００３５ｇ／Ｌ硫酸マンガン一水和物、０．００２ｇ／Ｌホウ酸および０．３ｍＬ／Ｌ ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ８８２から構成された。
グルコース上、３４℃、５００ｒｐｍで２４時間、最初にバッチ増殖で発酵を行った。２４時間の最後に、温度を２８℃に低下させ、撹拌速度を１０００ｒｐｍに上昇させた。次に、０．０３０ｇグルコース−ソホロース固形物／ｇバイオマス／ｈｒの特定のフィード速度で発酵槽にグルコースおよびソホロース（６２％ｗ／ｗ）の混合物を入れた。発酵実施の終了時に、遠心によってバイオマスを除去し、１０ｋＤ分子量カットオフ限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１０−Ｅ−３５；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いた限外ろ過によってＭＵＴ３３２５ムタナーゼ（配列番号４７）を含有する上清を約１０倍濃縮した。濃縮タンパク質を−８０℃で保存した。
アルファ−グルカノヒドロラーゼ（ムタナーゼ）活性の決定
ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３３４７８（商標）により産生された分泌酵素を用いて、ムタナーゼ活性を決定するために必要とされる不溶性ムタンポリマーを調製した。具体的に、Ｓ．ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３３４７８（商標）のグリセロール保存物の１ループをＢＨＩ寒天プレート（ブレインハートインフュージョン寒天、Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）上に画線し、３７℃で２日間プレートを温置した。ループを用いて数個のコロニーを拾い、Ｔｅｋｎｏｖａからのオリジナル培地ボトル中２×１００ｍＬ ＢＨＩ液体培地に接種し、培養物を３７℃で温置し、２４時間にわたり静置した。得られた細胞を遠心によって除去し、得られた上清を０．２μｍ滅菌フィルターに通してろ過し；２×１０１ｍＬのろ液を回収した。ろ液に２×１１．２ｍＬの２００ｇ／Ｌスクロースを添加した（最終スクロース２０ｇ／Ｌ）。反応物を３７℃で撹拌せずに６７時間温置した。得られた多糖ポリマーを５０００×ｇで１０分間の遠心によって回収した。上清を慎重にデカントした。不溶性ポリマーを４０ｍＬの滅菌水で４回洗浄した。得られたムタンポリマーを４８時間、凍結乾燥した。ムタンポリマー（３９０ｍｇ）を３９ｍＬの滅菌水中で懸濁して、１０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を得た。超音波処理によってムタン懸濁液をホモジェナイズした（大きい塊が消失するまで４０％振幅。全部で約１０分）。ホモジェナイズした懸濁液を分注し、４℃で保存した。
ｐＨ５．５の２５ｍＭ ＫＯＡｃ緩衝液中で３７℃で適切な量の酵素を０．５ｍｇ／ｍＬムタンポリマー（上記のように調製）とともに温置することによって、ムタナーゼアッセイを開始した。様々な時間点で反応混合物のアリコートを採取し、等体積の１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０）で不活性化した。１４，０００×ｇで５分間の遠心によって各不活性化試料中の不溶性物質を除去した。ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド溶液（ＰＡＨＢＡＨ）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９７２）４７：２７３−２７９）によって、各時間点で生成したオリゴ糖および多糖ポリマーの還元末端を定量し、タイムコースの最初の３または４つの時間点の直線プロットの傾きから、初速度を決定した。１００μＬのＰＡＨＢＡＨ希釈標準溶液に１０μＬの反応試料上清を添加し、９５℃で５分間加熱することによって、ＰＡＨＢＡＨアッセイを行った。１部の試薬Ａ（０．０５ｇ／ｍＬ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドおよび５体積％の濃塩酸）および４部の試薬Ｂ（０．０５ｇ／ｍＬ ＮａＯＨ、０．２ｇ／ｍＬ酒石酸カリウムナトリウム）を混合することによって希釈標準溶液を調製した。４１０ｎｍでの吸収を記録し、適切なバックグラウンド吸収を差し引き、標準としてグルコースの様々な濃度で作成した標準曲線を使用することによって、還元末端の濃度を計算した。
ＨＰＬＣによる反応プロファイルの分析
反応物から定期的に試料を採取し、屈折率検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１２６０ＨＰＬＣを用いて分析した。０．６ｍＬ／分の流速および８５℃の脱イオン水を有するＡｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰ−８７Ｃカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ｇｔｆ反応におけるスクロース、グルコース、ロイクロースおよびフルクトースレベルを定量した。０．６ｍＬ／分の流速および８５℃の脱イオン水を有するＡｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰ−４２Ａカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ｇｔｆ反応における可溶性オリゴ糖副産物（ＤＰ２〜ＤＰ７）を定量した。
固定化酵素を含む試料に対して、屈折率検出器を備えるＤｉｏｎｅｘ（登録商標）ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した（実施例４）。０．３ｍＬ／分の流速および８５℃の脱イオン水を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）Ｒｅｚｅｘ（商標）カルシウム単糖カラムを使用して糖を分析した。
ＮＭＲによるオリゴ糖結合の分析
５ｍｍ低温三重共鳴パルスフィールド勾配（ＰＦＧ）プローブを用いて、１Ｈに対して５００ＭＨｚで作動するＡｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２分光計上でＮＭＲデータを得た。「ｐｒｅｓａｔ」実験において残留水シグナルに対する共鳴上にオブザーブ送信機周波数（ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を慎重に置き、次いで全位相サイクル（３２の倍数）および１０ｍｓの混合時間でＮＯＥＳＹ実験の最初のスライスを使用することによって、水抑制を得た。６４１０Ｈｚのスペクトル幅、５．１ｓの捕捉時間、６５５３６個のデータ点、４ｓプレサチュレーションおよび５．８５μｓの９０°パルスで、１次元１Ｈスペクトルを得た。試料温度を２５℃に維持した。メチル共鳴を０ｐｐｍに設定して、４５０μＬのＤ２Ｏおよび１２．４ｍＭ ＤＳＳ（４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸ナトリウム塩）内部参照を含有する６０μＬのＤ２Ｏとともに、５ｍｍＮＭＲ管に５０μＬを添加することによって、試料を調製した。異なるアノマー結合に対する化学シフト割り当ては、Ｇｏｆｆｉｎら（２００９，Ｂｕｌｌ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３０：２５３５−２５４１から得た。ピーク割り当ては、アルファ（１，３）結合に対して５．３５ｐｐｍ、ロイクロースに対して５．１ｐｐｍ、およびアルファ（１，６）結合に対して４．９５であった。還元末端（ＲＥ）は、アルファＲＥに対して５．２、およびベータＲＥに対して４．６５を割り当てた。
実施例１
スクロースの重合による糖シロップの生成
この実施例は、グルカン合成反応におけるｇｔｆ酵素を用いたスクロースの重合によって可溶性糖の混合物を生成させた一般的方法を開示する。具体的には、グルカン合成反応のろ液を調製し、次いでこれを濃縮してシロップにした。
清潔な５ガロンのポリエチレンバケツにスクロース（３０００ｇ）を添加した。このバケツに水（１８．１Ｌ）およびＦｅｒｍａｓｕｒｅ（商標）（１０ｍＬ）を添加し、５ｖｏｌ％ＮａＯＨおよび５ｖｏｌ％Ｈ２ＳＯ４を添加することによって、ｐＨを７．０に調整した。最終体積は約２０Ｌであり、ＨＰＬＣにより測定した場合のスクロースの初濃度は１５２．５ｇ／Ｌであった。一般的方法セクションに記載のとおり調製した０．３ｖｏｌ％の粗製ｇｔｆ酵素（配列番号３）抽出物を添加することによって、グルカン重合反応を開始させた。この抽出物は、約２．９ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有した。ガラスシャフトおよびＰＴＦＥブレードを備えたオーバーヘッド型の機械式モーターを使用して、反応溶液に対する撹拌を行った。
４８時間後、ＨＰＬＣ分析によって、スクロースの９６％が消費されたことが明らかになり、反応が完結したとみなした。３２５メッシュスチールスクリーンおよび４０ミクロンろ紙を用いてブフナーフィルター漏斗でのろ過によって、反応物の不溶性ポリ−アルファ−１，３−グルカン生成物を除去した。次いで、ロータリーエバポレーター（浴槽温度４０〜５０℃）を用いて母液（ろ液）を濃縮して、約３２０ｇ／Ｌの糖の総糖濃度とした。濃縮ろ液の組成を表２に示す。
表２は、グルカン合成反応の濃縮ろ液がスクロース、フルクトース、グルコース、ロイクロースおよびＤＰ２〜ＤＰ７のオリゴ糖を含有することを示す。
実施例２
グルカン合成反応のろ液中での糖の加水分解における酵素の効果
この実施例は、グルカン合成反応の濃縮ろ液中のロイクロースおよび／またはオリゴ糖副産物の濃度を低下させるための、様々なグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、トランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）、ベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）およびグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１）酵素の活性を測定する。全てアルファ−グルコシダーゼであるＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡ、トランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）およびグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）などのある種の酵素は、これらの副産物の量を減少させることにおいて特に有効であり、その結果、処理済みろ液中で単糖（グルコースおよびフルクトース）の対応する増加が起こることが分かった。
グルカン合成反応のろ液を最初に調製し、実施例１で概説される手順に従い濃縮してシロップにした。この濃縮ろ液の組成を表３に示す。ＮＭＲ分析から、シロップ中に存在するアルファ（１，３）とアルファ（１，６）結合との比が７８：２２であったことが明らかになった。
表３のシロップを使用して、グルカン合成反応のロイクロースおよびオリゴ糖副産物に対する様々な酵素の加水分解活性を試験した。ロイクロースが通常とは異なる結合［アルファ（１，５）−グルコシルフルクトース］を含有することおよびオリゴ糖が、主にアルファ（１，３）およびアルファ（１，６）グルコシル−グルコース結合を含むことから考えて、これらの副産物の両方を加水分解するためにどの酵素を使用し得るかは、これらの実験の当初は明らかではなかった。この分析のために様々な活性を有する酵素を選択した（表４）。
上記酵素のそれぞれを用いて表３のシロップを処理するための条件を表５に示す（酵素負荷、時間、温度、ｐＨ、糖濃度）。各加水分解反応で使用する糖濃度になるようにシロップを水で希釈した。表５は、各酵素によるロイクロースおよびＤＰ３＋（少なくともＤＰ３〜ＤＰ７）オリゴ糖のパーセント加水分解をさらに提供する。（１−（最終シロップ中ｗｔ％ＤＰ３＋オリゴ糖）／（最初のシロップ中のｗｔ％ＤＰ３＋オリゴ糖））として、パーセントＤＰ３＋加水分解を計算した。同様に、（１−（最終シロップ中のｗｔ％ロイクロース）／（最初のシロップ中のｗｔ％ロイクロース））として、パーセントロイクロース加水分解を計算した。
表５は、１，４−アルファ−グルコシダーゼおよび１，６−アルファ−グルコシダーゼが、ロイクロースの加水分解が幾分かあるか（実施例２．１）または殆どない（実施例２．２）が、オリゴ糖から幾分かのグルコースを放出したことを示す。アルファ−アミラーゼの使用（実施例２．３および実施例２．４）は、関心のある化合物に対して殆ど活性を示さなかった。同様に、プルラナーゼの使用（実施例２．５）は殆ど活性を示さなかった。
セルラーゼ（実施例２．１４および２．１５）は、ロイクロースを加水分解する点において非常に不良であったが、オリゴ糖を幾分か加水分解した。
オリゴ糖はベータ結合を含有しなかったにもかかわらず、驚くべきことに、ベータ−グルコシダーゼ酵素はまた、非常に低いレベル（アクセレラーゼＢＧ、実施例２．９）から非常に高いレベル（ＮＯＶＯ１８８、実施例２．１０および２．１１）の範囲の加水分解変換も示した。これらの酵素の相対的効力は、非常に劇的に変動した。一部のケースにおいて、加水分解されたオリゴ糖の量は、加水分解されたロイクロースのパーセンテージを大きく上回る（実施例２．１１）か、またはそれと近かった（実施例２．１２）。他のケースにおいて、ロイクロースはベータ−グルコシダーゼによってよく加水分解されたが、一方で、オリゴ糖の加水分解は中程度であった（実施例２．１３）。ベータ−グルコシダーゼを用いて観察された結果間の大きい相違点から、試験したベータ−グルコシダーゼ処方物、例えばグルコアミラーゼまたは別のタイプのアルファ−グルコシダーゼなどの中での他の酵素の存在が、観察された活性の原因であり得ることが示唆される。
逆に、表５の結果は、トランスグルコシダーゼ（ＴＧ Ｌ−２０００、実施例２．６）が、オリゴ糖およびロイクロースの両方を加水分解するという点で非常に高い活性を示したことを示す。トランスグルコシダーゼによるロイクロース加水分解は、ある一定の環境下で定量的であると思われ、高い酵素負荷でＤＰ３＋物質の９５％超がグルコースおよびＤＰ２に加水分解された（実施例２．７）。精製タイプトランスグルコシダーゼの使用から同様の活性（実施例２．８）が明らかになり、これは、観察される活性がトランスグルコシダーゼ酵素によるものであり、バックグラウンド活性ではないことを示す。
グルコアミラーゼ（実施例２．１６〜２．１８）は、ロイクロースおよびオリゴ糖に対するある範囲の活性を示した。ロイクロースおよびオリゴ糖の両方の加水分解が３０％未満であったのは、１つの試験グルコアミラーゼ（実施例２．１８）のみであった。
表５の結果は、ＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡ、グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼなどのアルファ−グルコシダーゼは、グルカン反応ろ液中に存在するロイクロース副産物を加水分解し得ることを示す。アルファ−グルコシダーゼのロイクロース加水分解能は、これらの酵素がアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し得ることを示す。この活性が基質としてロイクロースを用いて上記で示された一方で、この活性は、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含むオリゴ糖にも拡大できると考えられる。
表５における結果は、さらに、グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼなどのアルファ−グルコシダーゼが、グルカン反応ろ液中に存在するオリゴ糖副産物を加水分解し得ることを示す。これらのオリゴ糖は、殆どアルファ−１，３および／またはアルファ−１，６結合により連結されるグルコースモノマー単位から構成されるため（実施例３）、表５のデータは、アルファ−グルコシダーゼ酵素がアルファ−１，３グルコシル−グルコースおよび／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を加水分解し得ることを示す。
アルファ−グルコシダーゼ酵素はグルカン合成反応のロイクロースおよび／またはオリゴ糖副産物を加水分解する点で一般に有効であったため、これらの酵素は、単糖の量が増加し、糖副産物の量が減少したグルカン反応ろ液からの高純度シロップを生成させるために必要な処理時間を短縮するために、単独で、または組み合わせて使用することができる。有効な酵素の組み合わせの例は、ロイクロース加水分解のための、トランスグルコシダーゼ、例えばＴＧ Ｌ−２０００などおよびオリゴ糖副産物を効率的に加水分解するグルコアミラーゼ（例えばＧＣ３２１）酵素であり得る。
したがって、アルファ−グルコシダーゼ酵素は、ある種の糖中の（ｉ）アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合および（ｉｉ）アルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を個別に加水分解することができる。
実施例３
酵素加水分解前後のグルカン反応ろ液成分の結合分布の比較
この実施例は、グルカン合成反応の濃縮ろ液中に存在するロイクロースおよびオリゴ糖副産物に対するトランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）およびベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）酵素の加水分解活性を測定する。トランスグルコシダーゼは、これらの副産物の量を減少させ、その結果、処理済みろ液中で単糖（グルコースおよびフルクトース）の対応する増加が起こることが分かった。
上記グルカン合成反応のろ液中に存在するオリゴ糖副産物は、ＮＭＲ（一般的方法）により測定した場合に、＞９０％グルコース−グルコース結合を含む。グルコース−グルコース結合のうち、約７８％がアルファ−１，３結合に相当し、約２２％がアルファ−１，６結合に相当する。
加水分解後に上記実施例２．１１で生成された物質の結合プロファイルを決定するために、ＮＭＲを使用した。図１に示されるように、アルファ−１，３結合に対応するピークが８６％低下し、アルファ−１，６結合に対応するピークの低下は僅か２．３％であり、ロイクロースピークに対応するピークは２１％低下した。スクロースがこの酵素によりほぼ定量的に加水分解された一方で、Ｎｏｖｏ １８８は、アルファ−１，６結合を加水分解できないと思われる。
ＴＧ Ｌ−２０００（配列番号１）トランスグルコシダーゼを用いて生成された物質の結合プロファイルを決定するために、ＮＭＲを同様に使用した（図２）。表３の物質からの２１０μＬの濃縮ろ液、３００μＬのＤ２Ｏおよび内部参照として１２．４ｍＭ ＤＳＳを含有する９０μＬのＤ２ＯをＮＭＲ管中で混合して、３００ｇ／Ｌの総糖濃度にし、６０℃に加熱した。６０℃での熱平衡後に時間ゼロのスペクトル（図２での出発物質）を得て、次いで０．５ｖｏｌ％の酵素を添加した。試料を６０℃でプローブ中で再平衡化し、調整し（ｓｈｉｍｍｅｄ）、分析数分内に測定を行った。ＴＧ Ｌ−２０００酵素での処理の１０時間後（図２での処理済み物質）、アルファ−１，３結合に対応するピークが４１％低下し、アルファ−１，６結合に対応するピークが３６％低下し、ロイクロースに対応するピークが＞９５％低下した（図２）。アルファ−還元末端およびベータ−還元末端ピークの両方の上昇が観察されたが、これはフルクトースおよびグルコースの増加に対応する（図２）。
これらの結果から、トランスグルコシダーゼは、アルファ−１，３およびアルファ−１，６結合を含有するオリゴ糖をグルコースに変換することができ、ロイクロースをフルクトースおよびグルコースに変換し得ることが明らかになる。したがって、トランスグルコシダーゼは、ある種の糖において、（ｉ）アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合および（ｉｉ）アルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を加水分解することができる。
実施例４
固定化酵素を用いたグルカン反応ろ液中でのロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解
この実施例は、グルカン合成反応から得られたろ液中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するために固定化グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）およびトランスグルコシダーゼ（ＥＣ２．４．１．２４）を使用することを記載する。具体的には、グルカン合成反応のろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖ＤＰ２、ＤＰ３およびＨＳ（高級糖類、ＤＰ４＋）の加水分解における、固定化トランスグルコシダーゼＴＧ Ｌ−２０００（配列番号１、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ／ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手）および固定化グルコアミラーゼＧＣ−１４７（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ／ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手）の効果を調べた。
グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼ酵素の固定化は、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５５４１０９７号明細書に記載の方法に従い行った。
グルコアミラーゼまたはトランスグルコシダーゼを固定化するための典型的なプロセスにおいて、約８．０ｇ／バッチで２バッチの多孔質粒状珪藻土（ＥＰ Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を蒸留水で水和し、次いで直径１．５ｃｍおよび高さ３０ｃｍのガラスカラムリアクターに移した。水を約６〜７ｍＬ／分で上流に汲み上げて、３本のカラム全てから微粒子を除去した。一般に、１時間以内に、水流出液を微粒子不含にした。水をカラムから粒状珪藻土床の上部に排出させ、０．１％ｗ／ｖポリエチレンイミン水溶液（ＰＥＩ，ＥＰＯＭＩＮ Ｐ−１０５０）で置き換えた。次いで３５００ｍＬのＰＥＩ溶液を上流に汲み上げ、２時間にわたり床を通じて流出液を再利用した。次いで、粒状珪藻土床を２時間にわたり蒸留水で上向きに洗浄して室温で遊離ＰＥＩを除去した。このようにして、粒状珪藻土−ＰＥＩ担体を得た。
その間に、表４で定義された活性を有する３．５ｍＬのグルコアミラーゼＧＣ−１４７を３１５ｍＬの０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に添加した。次いで、穏やかに混合しながら１．５７５ｇの５０％ｗ／ｗグルタルアルデヒド（Ｐｒｏｔｅｃｔｏｌ（登録商標）ＧＡ−５０）をグルコアミラーゼの水溶液にゆっくりと添加し、グルタルアルデヒドをグルコアミラーゼ水溶液と２０〜２５℃の温度で４時間、穏やかに撹拌しながら反応させ、その結果、処理済みグルコアミラーゼを含有する処理済み酵素−グルタルアルデヒド付加物が形成された。独立に、グルコアミラーゼの代わりに表４で定義された活性を有するトランスグルコシダーゼＴＧ Ｌ−２０００を使用して、これらの工程を繰り返し、それによって、処理済みトランスグルコシダーゼを含有する処理済み酵素−グルタルアルデヒド付加物が形成された。
次いで、粒状珪藻土−ＰＥＩ担体を含有する上記のように調製したそれ自体のカラム中で、処理済み酵素−グルタルアルデヒド付加物のそれぞれを４時間（２０〜２５℃）にわたり循環させた。次に、過剰な処理済み付加物を担体から水で洗い流した。このようにして固定化グルコアミラーゼまたはトランスグルコシダーゼ入りのカラムを調製した。
表３で定義された組成を有するグルカンろ液を１８０ｇ／Ｌに希釈し、ｐＨ４．５に調整し、固定化酵素を含有するカラムに通過させた。カラム温度を６０℃に調節した。カラム平衡化の１６時間後、異なる流速で試料を定期的に採取した。ＨＰＬＣによって加水分解反応生成物の糖組成を決定した（表６）。毎回、流速設定を変化させ、カラムを試料採取前に少なくとも１〜２ベッド体積にわたり再平衡化させた。実施例２に記載の方法を用いてロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解度を計算した。３本のカラム配置：１）固定化グルコアミラーゼ、２）固定化トランスグルコシダーゼおよび３）固定化グルコアミラーゼ、続いて固定化トランスグルコシダーゼを試験した。
表６は、平均接触時間（名目カラム体積を平均流速で除したものとして定義される）が延長したため、ロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解度が一般に向上したことを示す。試験した最大流速を使用した場合でも顕著な差は認められなかったため、ロイクロースを加水分解するための固定化トランスグルコシダーゼの使用は、特に有効であった。各カラムが個々に合理的な変換を示し、一方で、グルコアミラーゼおよびトランスグルコシダーゼの組み合わせでオリゴ糖の加水分解が最大となった。
したがって、固定化グルコアミラーゼまたはトランスグルコシダーゼまたは両タイプの固定化酵素の使用は、アルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を含有するオリゴ糖ならびにロイクロースを加水分解するための有効な技術に相当する。これらの結果は実施例２の結果と一致する。他のアルファ−グルコシダーゼ酵素の固定化は同様の結果を与えるはずである。
実施例５
クロマトグラフィーによるグルカン反応ろ液からのフルクトースの濃縮
この実施例は、グルカン反応ろ液中のフルクトースがクロマトグラフィーを通じてどのようにさらに濃縮され得るかを開示する。
一般に、クロマトグラフィーにより糖分子を分離する場合、成分は分子サイズと反比例して溶出するため、最大分子が最初に溶出する。したがって、グルカン合成反応のろ液に関しては、オリゴ糖が最初に溶出し、続いて二糖、次に単糖が溶出する。ナトリウム陽イオン樹脂を用いた分離では、フルクトースおよびグルコースがうまく分離されず、ロイクロース、スクロースおよびＤＰ２の全てが同時溶出する。陽イオンがカルシウムであるイオン交換樹脂の使用は、グルコースおよびフルクトースを分離するのに好ましい。
グルカン合成反応のろ液を最初に調製し、実施例１で概説した手順に従い濃縮してシロップにした。この濃縮ろ液の組成を表７に示す。
表７のシロップをろ過し、イオン交換水で２５ｇ乾燥固体／１００ｇ溶液に希釈し、カルシウム型の架橋強酸性イオン交換樹脂を含有するカラムに加えた。このカラムの物理学的パラメーターを表８に示す。希釈シロップ（１５．８Ｌ）をこのカラムに加え、これを６５℃で維持し、その後、流速３０Ｌ／ｈｒで水を用いてカラムを溶出した。
この分離において、おそらくロイクロースがカルシウム陽イオンと複合体を形成するがゆえに、ロイクロースはスクロースより長くカラムに残留し、実際にグルコースと同時に溶出した。フルクトースを含有する２分画を単離した。分画５．１は４７〜１２０分で、および分画５．２は１２０〜１７２分で溶出した。クロマトグラフィー分離に加えられたフルクトースのうち、９５．７％のフルクトースが＞９０％純度で単離された。ＨＰＬＣにより測定した場合の各分画（５．１および５．２）での生成物分布を表９に示す。
この分離のためのフィード組成が３６．０％フルクトースを含んだため、全部で３４．５％のトータルストリーム（ｔｏｔａｌ ｓｔｒｅａｍ）が＞９０ｗｔ％ＤＳフルクトースとともにフルクトースシロップとして回収された。フィード中のスクロースが無視されるため、＞９０ｗｔ％ＤＳフルクトースとともに、糖の４０．７％がフルクトースシロップとして回収された。
したがって、クロマトグラフィーを通じてグルカン反応ろ液中のフルクトースをさらに濃縮することができる。以下の実施例６は、トランスグルコシダーゼで加水分解されたグルカンろ液を使用して、このプロセスを促進し得ることを明らかにする。
実施例６
クロマトグラフィーによる加水分解グルカン反応ろ液からのフルクトースの濃縮
この実施例は、オリゴ糖およびロイクロースが加水分解されたグルカンろ液からのフルクトース単離の結果、非加水分解グルカンろ液からフルクトースを単離した場合と比較して、高純度フルクトースシロップの収率が上昇することを明らかにする。
１ｖｏｌ％のトランスグルコシダーゼＴＧ Ｌ−２０００（配列番号１）によって６０℃およびｐＨ４．５で２４時間にわたり処理したグルカンろ液を（５０℃で真空）濃縮することによってシロップを調製した。濃縮プロセス中に幾分かのオリゴ糖形成が観察されたが、これは、高濃度の単糖でトランスグルコシダーゼ酵素がオリゴ糖を生成させることが知られているからであると予想された。シロップは、表Ａに記載の最終生成物分布となった。
表Ａに記載のシロップをろ過し、イオン交換水で２５．４ｇ ＤＳ／１００ｇ溶液に希釈し、カルシウム型の架橋強酸性陽イオン交換樹脂を含有するカラムを加えた。このカラムの物理学的パラメーターを表Ｂに示す。次いで希釈シロップ（１６９ｇ）をカラムに加え、これを６５℃で維持し、その後、流速５０ｍＬ／分で水を用いてカラムを溶出した。
フルクトースを含有する２つの分画を単離した。７３分〜１０３分で分画６．１が溶出され、１０３分〜１２０分で分画６．２が溶出された。クロマトグラフィー分離に加えられたフルクトースのうち、カラムに加えられたフルクトースの９３．０％が＞９０％純度で分画６．２において単離された。ＨＰＬＣにより測定した場合の各分画（６．１および６．２）における生成物分布を表Ｃに示す。
実施例５と比較してこの実施例で分離効率が低下したことは、カラムのスケールの相違および試料のより高いグルコース分画に起因し得る。そうであったとしても、この物質のクロマトグラフィー精製の結果、トランスグルコシダーゼによって加水分解されていないグルカンろ液からシロップをクロマトグラフィーによって調製した実施例５で達成された収率と比較して、高純度フルクトースシロップの収率が向上した。この分離に対するフィード組成は４７％フルクトースを含んだため（表Ａ）、総ストリームの４３．７％が＞９０ｗｔ％ＤＳフルクトースとともにフルクトースシロップとして回収された。この４３．７％回収率は、実施例５での３４．５％回収率よりも顕著に良好である。
したがって、トランスグルコシダーゼで加水分解されたグルカンろ液からのフルクトース単離の結果、非加水分解グルカンろ液からフルクトースを単離した場合と比較して、フルクトースの収率が向上する。
実施例７
グルカン合成反応のろ液を発酵させることによるエタノールの生成
この実施例は、グルカンろ液のエタノールへの酵母発酵を開示する。
水道水中で酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））クリーム（Ｔｏｎｏｎ ｍｉｌｌ，Ｂｒａｚｉｌ）を懸濁し（２．４Ｌ、６００ｎｍで６５の光学密度）、次いでＬＥＧＥＮＤ ＸＴＲ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５００ｇで５分間酵母クリームを遠心することによって、酵母クリームを洗浄した。上清をデカントした後、酵母細胞を再懸濁し、さらに２回遠心することによって濃縮した。３回目の洗浄後、５ｗｔ％硫酸の添加によってｐＨを２に調整した。ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて光学密度を測定し、水道水の添加によって６００ｎｍで１００に調整した。調整した酵母クリーム（１．５Ｌ）を７．５ＬのＢＩＯＦＬＯ３１０発酵槽容器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）に添加した。３０℃の温度および１００ｒｐｍでの撹拌を維持するように発酵槽を設定した。発酵中にｐＨを測定したものの、酸または塩基溶液の添加による調節は行わなかった。
酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（２０ｇ／Ｌ）およびグルカンろ液からの２００ｇ／Ｌの糖を含有するフィード溶液を調製し、１２１℃で１５分間ＰＨＯＥＮＩＸ ＡＶ−２５０ ＰＬＵＳオートクレーブを用いて滅菌した。フィード溶液を２５℃（室温）に冷ました後、発酵が開始した。およそ５時間にわたり６８４ｍＬ／ｈｒの速度で滅菌フィード溶液（３．５Ｌ）を発酵槽に添加し、発酵を２２時間にわたり進行させた。
発酵中に周期的に試料を採取し、ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計、ＰＡＬ−３屈折計（Ａｔａｇｏ）を用いたＢｒｉｘを用いて光学密度について分析し、ＨＰＬＣ（一般的方法）によって糖およびエタノール濃度を分析した。これらの結果を表１０にまとめる。
発酵が終了したら、４５００ｇで５分間、ＬＥＧＥＮＤ ＸＴＲ遠心機を使用して遠心によって酵母細胞を分離した。上清をデカントした後、酵母を再懸濁し、さらに２回、遠心によって濃縮した。３回目の洗浄後、５ｗｔ％硫酸の添加によってｐＨを２に調整した。ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計を使用して光学密度を測定し、水道水の添加によって６００ｎｍで１００に調整した。上記と同じ条件に従い、前の発酵からの再利用酵母細胞を用いて、それぞれ新鮮なフィードを用いた２回のさらなる発酵サイクルを行った。１回目および２回目の再利用酵母を用いて得られた発酵結果を表１１および１２にそれぞれ示す。
１回目の発酵で消費されたロイクロースは僅かであったが、酵母細胞は２回目の再利用によって順応し、ロイクロースを消費し始めた。再利用酵母を用いた３回の発酵サイクル後、エタノール発酵力価は３３ｇ／Ｌ（表１０、２２時間）から５４ｇ／Ｌ（表１２、２１時間）に上昇したが、最後のサイクル後でさえも培地中にかなりの量のロイクロースが存在した。
したがって、エタノールを生成させるための発酵プロセスにおいてグルカンろ液を使用することができる。
実施例８
加水分解されたグルカンろ液を発酵させることによるエタノールの生成
この実施例は、ロイクロースおよびオリゴ糖副産物成分が予め糖化されたグルカンろ液を発酵させた結果、エタノール収率が上昇することを明らかにする。
実施例７で概説される手順に従い、しかし、予めトランスグルコシダーゼ（ＴＧ Ｌ−２０００、配列番号１）で処理されたグルカンろ液を用いて、発酵を行った。加水分解グルカンろ液を次のように調製した。グルカンろ液を３００ｇ糖／Ｌに調整し、次いで１．０Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｗｔ％硫酸を用いてｐＨを４．０に調整した。この標品の最終体積は６．７５Ｌであった。次いで、ＰＨＯＥＮＩＸ ＡＶ−２５０ ＰＬＵＳオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間、ろ液溶液を滅菌し、次いで温度を６０℃に調整した。表４に記載のようなＴＧ Ｌ−２０００酵素抽出物（１３５ｍＬ）を滅菌ろ液と混合し、溶液をインキュベーター振盪器（ＩＫＡ ＫＳ４０００）中で６０℃および１００ｒｐｍで７２時間、温置した。このようにして加水分解グルカンろ液を調製した。
水道水中で酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））クリーム（Ｂｏｍ Ｒｅｔｉｒｏ ｍｉｌｌ，Ｂｒａｚｉｌ）を懸濁し（２．４Ｌ、６００ｎｍで６５の光学密度）、次いでＬＥＧＥＮＤ ＸＴＲ遠心機を用いて４５００ｇで酵母クリームを５分間遠心することによって、酵母クリームを洗浄した。上清をデカントした後、酵母を再懸濁し、さらに２回、遠心によって濃縮した。３回目の洗浄後、５ｗｔ％硫酸の添加によってｐＨを４．５に調整し、ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計を使用して光学密度を測定し、水道水の添加によって６００ｎｍで１００に調整した。調整した酵母クリーム（１．５Ｌ）を７．５ＬのＢＩＯＦＬＯ３１０発酵槽容器に添加した。３０℃の温度、１００ｒｐｍでの撹拌を維持し、４Ｍ水酸化アンモニウム水溶液または５ｗｔ％硫酸水溶液を用いてｐＨを４．５に維持するように発酵槽を設定した。
酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（２０ｇ／Ｌ）および加水分解ろ液からの２００ｇ／Ｌの糖を含有するフィード溶液を調製し、ＰＨＯＥＮＩＸ ＡＶ−２５０ Ｐｌｕｓオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間、滅菌した。フィード溶液を２５℃（室温）に冷ました後、発酵が開始した。およそ５時間にわたり６８４ｍＬ／ｈｒの速度で滅菌済みフィード溶液（３．５Ｌ）を発酵槽に添加し、発酵を２２時間にわたり進行させた。
発酵中に周期的に試料を採取し、ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計、ＰＡＬ−３屈折計を用いたＢｒｉｘを用いて光学密度について分析し、ＨＰＬＣ（一般的方法）によって糖およびエタノール濃度を分析した。これらの結果を表１３にまとめる。
発酵が終了したら、４５００ｇで５分間、ＬＥＧＥＮＤ ＸＴＲ遠心機を使用して遠心によって酵母細胞を分離した。上清をデカントした後、酵母細胞を再懸濁し、さらに２回、遠心によって濃縮した。３回目の洗浄後、５ｗｔ％硫酸の添加によってｐＨを２に調整した。ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計を使用して光学密度を測定し、水道水の添加によって６００ｎｍで１００に調整した。上記と同じ条件に従い、前の発酵からの再利用酵母細胞を用いて、それぞれ新鮮なフィードを用いた２回のさらなる発酵サイクルを行った。１回目および２回目の再利用酵母を用いて得られた発酵結果を表１４および１５にそれぞれ示す。
全ての発酵が基本的に発酵開始約６時間以内に完了し、エタノール力価が５７〜６０．０ｇ／Ｌとなった。これらの発酵を実施例７の発酵と比較すると、発酵に供する前にグルカンろ液を加水分解することによって、非加水分解グルカンろ液を用いた発酵から得られたものよりも、エタノール生成がより速く、より多くなることが明らかになる。
したがって、ロイクロースおよびオリゴ糖副産物成分が糖化されているグルカンろ液を発酵させることによって、より速い速度でエタノール生成が増加した。この糖化は例えばトランスグルコシダーゼを使用して行うことができる。
実施例９
グルカンろ液溶液の同時糖化および発酵
この実施例は、グルカンろ液を含有するフィードの同時糖化および発酵の結果、発酵特性が向上することを開示する。
水道水中で酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））クリーム（Ｂｏｍ Ｒｅｔｉｒｏ ｍｉｌｌ，Ｂｒａｚｉｌ）を懸濁し（２．４Ｌ、６００ｎｍで６５の光学密度）、次いでＬＥＧＥＮＤ ＸＴＲ遠心機を用いて４５００ｇで酵母クリームを５分間遠心することによって酵母クリームを洗浄した。上清をデカントした後、酵母を再懸濁し、さらに２回、遠心によって濃縮した。３回目の洗浄後、５ｗｔ％硫酸の添加によってｐＨを４．５に調整し、ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計を使用して光学密度を測定し、水道水の添加によって６００ｎｍで１００に調整した。調整した酵母クリーム（１．５Ｌ）を７．５ＬのＢＩＯＦＬＯ３１０発酵槽容器に添加した。３０℃の温度、１００ｒｐｍでの撹拌を維持し、４Ｍ水酸化アンモニウム水溶液または５ｗｔ％硫酸水溶液を用いてｐＨを４．５に維持するように発酵槽を設定した。
酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（２０ｇ／Ｌ）およびグルカンろ液からの２００ｇ／Ｌの糖を含有するフィード溶液を調製し、ＰＨＯＥＮＩＸ ＡＶ−２５０ ＰＬＵＳオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間滅菌した。フィード溶液を２５℃（室温）に冷ました後、発酵が開始した。表４（１％ｖ／ｖ）に記載のようなＴＧ Ｌ−２０００トランスグルコシダーゼ酵素抽出物を滅菌済みフィード溶液に添加し、その後直ちに溶液を発酵槽に添加した。およそ５時間にわたり６８４ｍＬ／ｈｒでＴＧ Ｌ−２０００酵素を含有するフィード溶液（３．５Ｌ）を発酵槽に添加し、発酵を４８時間にわたり進行させた。
発酵中に周期的に試料を採取し、ＧＥＮＥＳＹＳ ２０ ４００１分光光度計、ＰＡＬ−３屈折計（Ａｔａｇｏ）を用いたＢｒｉｘを用いて光学密度について分析し、ＨＰＬＣ（一般的方法）によって糖およびエタノール濃度を分析した。これらの結果を表１６にまとめる。
この発酵は、発酵工程前にろ液を加水分解した発酵（実施例８）と同様、名目上、６時間で完了し、加水分解していないろ液（実施例７）を用いた場合と比較して、エタノール力価が僅かに優れていた（６２ｇ／Ｌ）。さらに、６時間までに殆ど全てのロイクロースが消費された（表１６と表１３〜１５を比較）。発酵直前のグルカンろ液を含有するフィードへのＴＧ Ｌ−２０００などの糖化酵素の添加に加えて、糖化酵素が発酵に直接添加される場合、同様の結果が得られるはずである。
したがって、グルカンろ液を含有するフィードの同時糖化および発酵の結果、（ｉ）グルカンろ液成分（例えばロイクロース）の消費の増加、ならびに（ｉｉ）エタノール収率および生成速度の向上など、発酵特性が向上し得る。
実施例１０
様々なアルファ−グルコシダーゼの調製
この実施例は、前述の実施例のいくつかで使用したこれらのアルファ−グルコシダーゼ（トランスグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、ＤＩＡＺＹＭＥ ＲＤＦ ＵＬＴＲＡ）に加えて、様々なアルファ−グルコシダーゼを調製することを開示する。以下で提供される実施例１１、１２、１５および１６において、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合またはアルファ−１，３および／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合を含むオリゴ糖に対する加水分解活性についてこれらのさらなるアルファ−グルコシダーゼを試験した。
アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）アルファ−グルコシダーゼ（Ａｃｌｇｌｕ１）の発見
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）の株を選択した。アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）において同定された遺伝子の１つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Ａｃｌｇｌｕ１」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号４で提供される。配列番号４によりコードされる対応するタンパク質は配列番号５で提供される。Ａｃｌｇｌｕ１は、ＰＦＡＭ検索（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ ｗｅｂ ｌｉｎｋ）に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー３１に属する。Ｎ末端で、ＳｉｇｎａｌＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予想した場合、タンパク質（配列番号５）は、１９アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Ａｃｌｇｌｕ１が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるＡｃｌｇｌｕ１の成熟型のアミノ酸配列は配列番号６で示される。
アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）アルファ−グルコシダーゼＡｃｌｇｌｕ１の発現
合成Ａｃｌｇｌｕ１遺伝子をｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７号明細書に記載）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＪＧ２９４と名付けた。ＤＮＡ配列決定によってＡｃｌｇｌｕ１遺伝子の配列を確認した。
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ＶＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：３９３−９，２００２）を用いて、プラスミドｐＪＧ２９４を四重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）に形質転換した。配列番号６を含むと予想されたタンパク質が細胞外の培地に分泌され、ろ過した培養液を使用して、酵素発現を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアルファ−グルコシダーゼ活性アッセイを行った。
ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）アルファ−グルコシダーゼＮｆｉｇｌｕ１の発見
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）の株を選択した。ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）において同定された遺伝子の１つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Ｎｆｉｇｌｕ１」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号７で提供される。配列番号７によりコードされる対応するタンパク質は、配列番号８で提供される。Ｎｆｉｇｌｕ１は、ＰＦＡＭ検索（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ ｗｅｂ ｌｉｎｋ）に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー３１に属する。Ｎ末端で、タンパク質（配列番号８）は、ＳｉｇｎａｌＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予想した場合、１９アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Ｎｆｉｇｌｕ１が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるＮｆｉｇｌｕ１の成熟型のアミノ酸配列は配列番号９で示される。
ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）アルファ−グルコシダーゼＮｆｉｇｌｕ１の発現
合成Ｎｆｉｇｌｕ１遺伝子をｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７号明細書に記載）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＪＧ２９５と名付けた。ＤＮＡ配列決定によってＮｆｉｇｌｕ１遺伝子の配列を確認した。
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ＶＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：３９３−９，２００２）を用いて、プラスミドｐＪＧ２９５を四重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）に形質転換した。配列番号９を含むと予想されたタンパク質が細胞外の培地に分泌され、ろ過した培養液を使用して、酵素発現を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアルファ−グルコシダーゼ活性アッセイを行った。
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）アルファ−グルコシダーゼＮｃｒｇｌｕ１の発見
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）の株を選択した。ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）において同定された遺伝子の１つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「Ｎｃｒｇｌｕ１」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号１０で提供される。配列番号１０によりコードされる対応するタンパク質は配列番号１１で提供される。Ｎｃｒｇｌｕ１は、ＰＦＡＭ検索（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ ｗｅｂ ｌｉｎｋ）に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー３１に属する。Ｎ末端で、タンパク質（配列番号１１）は、ＳｉｇｎａｌＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）で予想した場合、２２アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在によって、Ｎｃｒｇｌｕ１が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるＮｃｒｇｌｕ１の成熟型のアミノ酸配列は配列番号１２で示される。
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）アルファ−グルコシダーゼＮｃｒｇｌｕ１の発現
合成Ｎｃｒｇｌｕ１遺伝子をｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７号明細書に記載）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＪＧ２９６と名付けた。Ｎｃｒｇｌｕ１遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ＶＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：３９３−３９９，２００２）を用いて、プラスミドｐＪＧ２９６を四重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）に形質転換した。配列番号１２を含むと予想されたタンパク質は細胞外の培地に分泌され、ろ過した培養液を使用して、酵素発現を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアルファ−グルコシダーゼ活性アッセイを行った。
ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）アルファ−グルコシダーゼＴａｕＳｅｃ０９８の発見
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）の株を選択した。ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）において同定された遺伝子の１つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「ＴａｕＳｅｃ０９８」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号１３で提供される。配列番号１３によりコードされる対応するタンパク質は配列番号１４で提供される。ＴａｕＳｅｃ０９８は、ＰＦＡＭ ｓｅａｒｃｈ（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ ｗｅｂ ｌｉｎｋ）に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー３１に属し、Ｎ末端ＣＢＭ２０ドメインを含有する。Ｎ末端で、タンパク質（配列番号１４）は、ＳｉｇｎａｌＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）に予想されるように２２アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在から、ＴａｕＳｅｃ０９８が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるＴａｕＳｅｃ０９８の成熟型のアミノ酸配列は配列番号１５で示される。
ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）アルファ−グルコシダーゼＴａｕＳｅｃ０９８の発現
Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成ＴａｕＳｅｃ０９８遺伝子をトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（ｐＴＴＴ由来プラスミド）にクローニングし、得られたプラスミドをｐＧＸ２５６−ＴａｕＳｅｃ０９８と名付けた。ＴａｕＳｅｃ０９８遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏら ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３−３９９，２００２）を用いて、プラスミドｐＧＸ２５６−ＴａｕＳｅｃ０９８を四重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）に形質転換した。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換されたコロニー（約５０〜１００個）が約１週間で出現した。アセトアミドプレート上での増殖後、形質転換体の胞子を回収し、新しいアセトアミド寒天プレート上に移した。アセトアミドプレート上での増殖５日後、１×１０８個の胞子を２５０ｍＬ振盪フラスコ中の３０ｍＬグルコース／ソホロース限定培地に接種した。この振盪フラスコを２８℃で５日間、振盪した。これらの培養物からの上清を使用して、発現（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）および成熟ＴａｕＳｅｃ０９８酵素（配列番号１５）の活性を確認した。
ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）アルファ−グルコシダーゼＴａｕＳｅｃ０９９の発見
様々な産業応用において有用であり得る他の酵素の供給源候補として、ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）の株を選択した。ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）において同定された遺伝子の１つは、アルファ−グルコシダーゼをコードし、「ＴａｕＳｅｃ０９９」と呼ばれるこの遺伝子の配列は配列番号１６で提供される。配列番号１６によりコードされる対応するタンパク質は配列番号１７で提供される。ＴａｕＳｅｃ０９９は、ＰＦＡＭ検索（ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ ｗｅｂ ｌｉｎｋ）に基づき、グリコシルヒドロラーゼファミリー３１に属する。Ｎ末端で、ＳｉｇｎａｌＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予想した場合、このタンパク質（配列番号１７）は１７アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在から、ＴａｕＳｅｃ０９９が分泌型酵素であることが示唆される。予想されるＴａｕＳｅｃ０９９の成熟型のアミノ酸配列は配列番号１８で示される。
ラサモソニア・コンポスティコラ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｃｏｍｐｏｓｔｉｃｏｌａ）アルファ−グルコシダーゼＴａｕＳｅｃ０９９の発現
Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成ＴａｕＳｅｃ０９９遺伝子がトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（ｐＴＴＴ由来プラスミド）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＧＸ２５６−ＴａｕＳｅｃ０９９と名付けた。ＴａｕＳｅｃ０９９８遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３−３９９，２００２）を用いて、プラスミドｐＧＸ２５６−ＴａｕＳｅｃ０９９を四重欠失トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載）に形質転換した。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換されたコロニー（約５０〜１００個）が約１週間で出現した。アセトアミドプレート上での増殖後、形質転換体の胞子を回収し、新しいアセトアミド寒天プレート上に移した。アセトアミドプレート上での増殖５日後、１×１０８個の胞子を２５０ｍＬ振盪フラスコ中の３０ｍＬグルコース／ソホロース限定培地に接種した。２８℃で５日間、振盪フラスコを振盪した。これらの培養物からの上清を使用して、発現（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）および成熟ＴａｕＳｅｃ０９９酵素（配列番号１８）の活性を確認した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ１の配列
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）亜種ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）ＪＤＭ３０１からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「ＢｌｏＧｌｕ１」を同定した。ＢｌｏＧｌｕ１遺伝子に対する核酸配列（配列番号１９、ＧＥＮＢＡＮＫ、受入番号ＮＣ０１４１６９．１、位置１４０６００〜１４２４１４の相補配列）および配列番号１９によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２０）がＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＹＰ＿００３６６０４３２．１で見出された。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ１の発現
ＢｌｏＧｌｕ１タンパク質全体（配列番号２０）をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号２１をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ１が得られた。ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ１プラスミドは、最適化ＢｌｏＧｌｕ１配列（配列番号２１）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ１を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｌｏＧｌｕ１タンパク質（配列番号２０）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ２の配列
アルファ−グルコシダーゼ、ＢｌｏＧｌｕ２をビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）から同定した。ＢｌｏＧｌｕ２のアミノ酸配列（配列番号２２）がＮＣＢＩデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＷＰ＿００７０５４６６５．１）で見出された。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ２の発現
ＢｌｏＧｌｕ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号２３をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ２が得られた。配列番号２３は配列番号２４のアミノ酸配列をコードする。ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ２プラスミドは、最適化ＢｌｏＧｌｕ２配列（配列番号２３）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ２を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｌｏＧｌｕ２タンパク質（配列番号２４）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ３の配列
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）亜種ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）Ｆ８からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「ＢｌｏＧｌｕ３」を同定した。ＢｌｏＧｌｕ３遺伝子に対する核酸配列（配列番号２５、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿０２１００８．１、位置２１３０６２７〜２１３２４４１）および配列番号２５によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２６）がＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＹＰ＿００７７６８２４９．１で見出された。
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｌｏＧｌｕ３の発現
ＢｌｏＧｌｕ３タンパク質全体（配列番号２６）をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号２７をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ３が得られた。ｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ３プラスミドは、最適化ＢｌｏＧｌｕ３配列（配列番号２７）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｌｏＧｌｕ３を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｌｏＧｌｕ３タンパク質（配列番号２６）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｐｓＧｌｕ１の配列
ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）からアルファ−グルコシダーゼ、ＢｐｓＧｌｕ１を同定した。ＮＣＢＩデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＷＰ＿０２２８５８４０８．１）においてＢｐｓＧｌｕ１のアミノ酸配列（配列番号２８）が見出された。
ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｐｓＧｌｕ１の発現
ＢｐｓＧｌｕ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号２９をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｐｓＧｌｕ１が得られた。配列番号２９は、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする。ｐ３ＪＭ−ＢｐｓＧｌｕ１プラスミドは、最適化ＢｐｓＧｌｕ１配列（配列番号２９）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｐｓＧｌｕ１を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｐｓＧｌｕ１タンパク質（配列番号３０）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｔｈＧｌｕ１の配列
ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＲＢＬ６７からアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、「ＢｔｈＧｌｕ１」を同定した。ＢｔｈＧｌｕ１遺伝子の核酸配列（配列番号３１、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿０２０５４６．１、位置１５０６９０〜１５２４９５）および配列番号３１によりコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３２）は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＹＰ＿００７５９２８４０．１で見出された。
ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）アルファ−グルコシダーゼＢｔｈＧｌｕ１の発現
ＢｔｈＧｌｕ１タンパク質全体（配列番号３２）をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号３３をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｔｈＧｌｕ１が得られた。ｐ３ＪＭ−ＢｔｈＧｌｕ１プラスミドは、最適化ＢｔｈＧｌｕ１配列（配列番号３３）のプラスミドの発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｔｈＧｌｕ１を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｔｈＧｌｕ１タンパク質（配列番号３２）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）アルファ−グルコシダーゼＢｂｒＧｌｕ２の配列
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）からアルファ−グルコシダーゼ、ＢｂｒＧｌｕ２を同定した。ＢｂｒＧｌｕ２のアミノ酸配列（配列番号３４）がＮＣＢＩデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＷＰ＿００３８２７９７１．１）で見出された。
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）アルファ−グルコシダーゼＢｂｒＧｌｕ２の発現
ＢｂｒＧｌｕ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号３５をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ２が得られた。配列番号３５は、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする。ｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ２プラスミドは、最適化ＢｂｒＧｌｕ２配列（配列番号３５）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ２を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、配列番号３６を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）アルファ−グルコシダーゼＢｂｒＧｌｕ５の配列
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＡＣＳ−０７１−Ｖ−Ｓｃｈ８ｂからアルファ−グルコシダーゼ遺伝子「ＢｂｒＧｌｕ５」を同定した。ＢｂｒＧｌｕ５遺伝子（配列番号３７、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＣ＿０１７２１８．１、位置２２４１０７５〜２２４２８９５の配列の相補体）の核酸配列および配列番号３７によってコードされる仮説的なタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３８）がＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＹＰ＿００５５８３７０１．１で見出された。
ビフィドバクテリウム・ブレブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）アルファ−グルコシダーゼＢｂｒＧｌｕ５の発現
ＢｂｒＧｌｕ５タンパク質全体（配列番号３８）をコードするＤＮＡ配列をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に対して最適化し、次いで合成し（配列番号３９をもたらす）、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．によってｐ３ＪＭプラスミドに挿入され、ｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ５が得られた。ｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ５プラスミドは、最適化ＢｂｒＧｌｕ５配列（配列番号３９）の発現を推進するためのａｐｒＥプロモーターを含有する。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔｎｐｒＢ、Δｖｐｒ、Δｅｐｒ、ΔｓｃｏＣ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｉｓｐＡ、Δｂｐｒ）を形質転換するために、プラスミドｐ３ＪＭ−ＢｂｒＧｌｕ５を使用し、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補給したルリア寒天プレート上に形質転換細胞を播種した。ＰＣＲおよび配列決定により確認した場合に正しい挿入があるコロニーを選択し、ＢｂｒＧｌｕ５タンパク質（配列番号３８）を発現させるために、ＭＢＤ培地（さらなる５ｍＭ ＣａＣｌ２を補給したＭＯＰＳに基づく限定培地）が入った２５０ｍＬ振盪フラスコ中での発酵に供した。
発現培養からのアルファ−グルコシダーゼＡｃｌＧｌｕ１およびＮｃｒＧｌｕ１の精製
２つのクロマトグラフィー工程を使用して、ＡｃｌＧｌｕ１（配列番号６）およびＮｃｒＧｌｕ１（配列番号１２）の両方のアルファ−グルコシダーゼを精製した。各精製に対して、振盪フラスコからの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加し、２Ｍの最終濃度にした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウムで予め平衡化した５０ｍＬフェニルＨＰカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質（配列番号６または配列番号１２）を１Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０でカラムから溶出させた。個々の分画をプールし、濃縮し、ＶＩＶＡＦＬＯＷ ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて緩衝液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に交換した。得られた溶液を、緩衝液Ａで予め平衡化した４０ｍＬ Ｑ ＨＰカラムに適用した。標的タンパク質を緩衝液Ａ中の０．３Ｍ ＮａＣｌでカラムから溶出させた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、１０Ｋ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて濃縮し、使用するまで−２０℃で４０％グリセロール中で保存した。
ＮｆｉＧｌｕ１
２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を使用してＮｆｉＧｌｕ１アルファ−グルコシダーゼ（配列番号９）を精製した。振盪フラスコからの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加し、１Ｍの最終濃度にした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ硫酸アンモニウムで予め平衡化した５０ｍＬフェニルＨＰカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質（配列番号９）はカラムを通過した。フロースルー分画をプールし、その後、硫酸アンモニウムを添加し、２Ｍの最終濃度にした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２Ｍ硫酸アンモニウムで予め平衡化した同じフェニルＨＰカラム上に溶液を載せた。標的タンパク質を１Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０でカラムから溶出させた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、１０Ｋ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて濃縮し、使用するまで−２０℃で４０％グリセロール中で保存した。
ＴａｕＳｅｃ０９８およびＴａｕＳｅｃ０９９
疎水性相互作用クロマトグラフィーを介してＴａｕＳｅｃ０９８（配列番号１５）およびＴａｕＳｅｃ０９９（配列番号１８）の両アルファ−グルコシダーゼを精製した。各精製に対して、７Ｌ発酵槽からの約１８０ｍＬの濃縮粗製ブロスに硫酸アンモニウムを添加し、１Ｍの最終濃度にした。次いでこの溶液を２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０、１Ｍ硫酸アンモニウム（緩衝液Ａ）で予め平衡化した５０ｍＬ ＨＩＰＲＥＰフェニル−ＦＦセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せた。３カラム体積（ＣＶ）で同じ緩衝液で洗浄した後、各３ＣＶを用いて７５％、５０％および０％緩衝液Ａで、続いて２ＣＶのＭＩＬＬＩＱ Ｈ２Ｏでカラムを段階的に溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって全分画を分析した。標的タンパク質（配列番号１５または配列番号１８）はフロースルー分画中に主に存在し、それを濃縮し、１０ＫＤａ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて過剰な硫酸アンモニウムを除去するために緩衝液を交換した。９０％純度を超えた最終生成物を使用するまで−８０℃で４０％グリセロール中で保存した。
ＢｌｏＧｌｕ１、ＢｌｏＧｌｕ２およびＢｌｏＧｌｕ３
ＢｌｏＧｌｕ１（配列番号２０）、ＢｌｏＧｌｕ２（配列番号２４）およびＢｌｏＧｌｕ３（配列番号２６）アルファ−グルコシダーゼを全て３工程で精製した。各精製に対して、１Ｌ ＤＡＳＧＩＰ発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して６０％飽和にした。溶液を４℃で１時間撹拌し、次いで８０００×ｇで３０分間遠心した。得られたペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、１Ｍの最終濃度にし；次いでこの標品を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ硫酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）で予め平衡化した４０ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ（商標）フェニルＦＦカラム上に載せた。洗浄後、各３カラム体積で７５％、５０％および０％緩衝液ＢおよびＨ２Ｏでカラムを段階的に溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、活性アッセイを使用して全分画を分析した。標的タンパク質（配列番号２０、配列番号２４または配列番号２６）を含有する分画をプールし、濃縮し、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌで予め平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム上に載せた。次いで標的タンパク質を含有するフロースルー分画をプールし、１０Ｋ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて濃縮し、使用するまで−２０℃で４０％グリセロール中で保存した。
ＢｐｓＧｌｕ１およびＢｔｈＧｌｕ１
ＢｐｓＧｌｕ１（配列番号３０）およびＢｔｈＧｌｕ１（配列番号３２）の両アルファ−グルコシダーゼを２工程で精製した。各精製に対して、１Ｌ ＤＡＳＧＩＰ発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して６０％飽和にした。溶液を４℃で１時間撹拌し、次いで８０００×ｇで３０分間遠心した。得られたペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、１Ｍの最終濃度にし；次いでこの標品を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ硫酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）で予め平衡化した４０ｍＬ ＨｉＰｒｅｐ（商標）フェニルＦＦカラム上に載せた。洗浄後、それぞれ３カラム体積で、７５％、５０％および０％緩衝液ＢおよびＨ２Ｏでカラムを段階的に溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性アッセイを使用して全分画を分析した。標的タンパク質（配列番号３０または配列番号３２）は０％緩衝液Ｂ溶出工程からの溶出液中に存在し；この溶出液をプールし、１０Ｋ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて濃縮した。９５％純度より高かった最終生成物を使用するまで−２０℃で４０％グリセロール中で保存した。
ＢｂｒＧｌｕ２およびＢｂｒＧｌｕ５
ＢｂｒＧｌｕ２（配列番号３６）およびＢｂｒＧｌｕ５（配列番号３８）の両アルファ−グルコシダーゼを４工程で精製した。各精製に対して、１Ｌ ＤＡＳＧＩＰ発酵槽からの粗製ブロスを濃縮し、その後、硫酸アンモニウムを添加して６０％飽和にした。溶液を４℃で１時間撹拌し、次いで８０００×ｇで３０分間遠心した。得られたペレットを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）中で再懸濁した。得られた溶液に硫酸アンモニウムを添加して、１Ｍの最終濃度にし；次いでこの標品を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１Ｍ硫酸アンモニウムで予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）フェニルＦＦカラム上に載せた。標的タンパク質（配列番号３６または配列番号３８）を０．５Ｍ硫酸アンモニウムでカラムから溶出させた。個々の分画をプールし、濃縮し、ＶＩＶＡＦＬＯＷ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて緩衝液を緩衝液Ａに交換した。得られた溶液を緩衝液Ａで予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）Ｑ ＦＦ１６／１０カラムに適用した。標的タンパク質を緩衝液Ａ中の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線状勾配でカラムから溶出させた。標的タンパク質を含有する分画をプールし、濃縮し、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌで予め平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム上に載せた。次いで標的タンパク質を含有する分画をプールし、１０Ｋ ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ−１５装置を用いて濃縮し、使用するまで−２０℃で４０％グリセロール中で保存した。
このようにして、様々なさらなるアルファ−グルコシダーゼを発現させ、精製した。以下で提供する実施例１１、１２、１５および１６において、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合およびアルファ−１，３および／またはアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性について、これらのアルファ−グルコシダーゼを試験した。
実施例１１
様々なグリコシド結合に対する加水分解活性に対するアルファ−グルコシダーゼの試験
この実施例は、アルファ−グルコシダーゼがこのクラスの酵素（ＥＣ３．２．１．２０）にこれまで関連付けられていたものを超える加水分解活性を有し得るか否かを試験することを開示する。実施例１０からのアルファ−グルコシダーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合およびアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性を有することが示された。
アルファ−グルコシダーゼの基質特異性
アルファ−グルコシダーゼとともに基質を温置した場合の特定の基質（イソマルトース、マルトース、パノース、ロイクロースまたはニゲロース）からのグルコースの放出に基づいて、実施例１０で開示される各アルファ−グルコシダーゼの基質特異性をアッセイした。共役グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）法（１９８０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５：３８９−３９７）を用いてグルコース放出速度を測定した。グルコースと反応した共役ＧＯＸ／ＨＲＰ酵素から生成されたペルオキシドによる２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）の酸化の速度としてグルコース放出を定量した。
１５ｍＬコニカルチューブ中で９ｍＬ基質溶液（水中１％、ｗ／ｖ）を１ｍＬの０．５Ｍ ｐＨ５．０酢酸ナトリウム緩衝液および４０μＬの０．５Ｍ塩化カルシウムと混合することによって、個々の基質溶液を調製した。２．７４ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ、０．１Ｕ／ｍＬ ＨＲＰおよび１Ｕ／ｍＬ ＧＯＸの最終濃度で、ＡＢＴＳ入りの共役酵素（ＧＯＸ／ＨＲＰ）溶液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で調製した。個々のアルファ−グルコシダーゼ試料およびグルコース標準物質の連続希釈液をＭＩＬＬＩＱ水中で調製した。ニゲロースの場合、基質溶液の保存の限界ゆえに１０ｐｐｍの用量のみでアルファ−グルコシダーゼ試料を試験した。５０℃で５分間６００ｒｐｍで予め温置した９０μＬの基質溶液を含有する新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）に各アルファ−グルコシダーゼ試料（１０μＬ）を移した。ＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で振盪（６００ｒｐｍ）しながら、５０℃で１０分間（イソマルトース、マルトース、パノースおよびニゲロース基質の場合）または６０分間（ロイクロース基質の場合）、反応を行った。次いで、１０μＬの各反応混合物ならびにグルコース標準物質の１０μＬの連続希釈液をそれぞれ新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）に素早く移し、次いでこれに９０μＬのＡＢＴＳ／ＧＯＸ／ＨＲＰ溶液を適切に添加した。ＳＯＦＴＭＡＸ ＰＲＯプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４０５ｎｍで１１秒間隔で５分間、反応混合物を含有するマイクロタイタープレートを直ちに測定した。アウトプットは、各酵素濃度に対する反応速度、Ｖｏであった。直線回帰を使用して、プロットＶｏ対酵素用量の傾斜を決定した。式１：
比活性（単位／ｍｇ）＝傾斜（酵素）／傾斜（ｓｔｄ）×１０００（１）
（式中、１単位＝１μｍｏｌグルコース／分）
を用いて、グルコース標準曲線に基づき、各アルファ−グルコシダーゼの特異的な活性を計算した。ニゲロースの場合、酵素活性を示すために、１０ｐｐｍの酵素用量での反応速度の値を直接使用した。
先行する方法を用いて、各アルファ−グルコシダーゼの特異性を各基質に対して測定した。各基質に対するオリゴ−１，６−グルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅより購入、表４参照）およびトランスグルコシダーゼ（ＴＧ Ｌ−２０００、表４参照）の活性も測定した。この分析の結果を表１７に示す。
興味深いことに、アルファ−グルコシダーゼは、アルファ−１，４グルコシル−グルコース結合（マルトース）に対する加水分解活性を示すこと以外に、アルファ−１，６グルコシル−グルコース結合（イソマルトース）、アルファ−１，３グルコシル−グルコース結合（ニゲロース）およびアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合（ロイクロース）に対する加水分解活性も示すことが分かった（表１７）。
したがって、アルファ−グルコシダーゼは、ＥＣ３．２．１．２０酵素にこれまで関連付けられていたものを超える加水分解活性を有する。具体的に、アルファ−グルコシダーゼは、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合およびアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合に対する加水分解活性を有する。
実施例１２
アルファ−グルコシダーゼを用いたグルカン反応ろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解
この実施例は、グルカン合成反応から得られたろ液中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼを使用することを記載する。具体的に、不溶性グルカン（ポリアルファ−１，３−グルカン）合成反応のろ液中のロイクロースおよびオリゴ糖ＤＰ２、ＤＰ３およびＨＳ（高級糖類、ＤＰ４＋）の加水分解における実施例１０で開示されるアルファ−グルコシダーゼの効果を試験した。
アルファ−グルコシダーゼ活性に対して試験するためのオリゴ糖の単離および分析
第一に、グルカン合成反応の濃縮ろ液を実施例１のように調製した。
簡潔に述べると、クロマトグラフィー分離によって、オリゴ糖を濃縮ろ液から単離し、グリコシド結合プロファイルについて分析した。強酸陽イオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィー分離を使用して、濃縮ろ液のオリゴ糖分画を単離した。この分離に使用したカラムの物理学的パラメーターは次のとおりであった：ＦＩＮＥＸ ＣＳ１１ＧＣ、＃２２７樹脂；Ｎａ＋イオン型；５％ジビニルベンゼン（架橋）；０．３４ｍｍ粒径；１．６４ｍベッド長；０．０９３ｍカラム直径。
より詳細には、表３に記載の濃縮糖溶液（すなわち濃縮ろ液）をろ過し、水道水を用いて２５ｇ乾燥固体／１００ｇ溶液に希釈した。この糖溶液をカラム樹脂に添加する前に、樹脂を６ベッド体積（ＢＶ）の塩化ナトリウム溶液（１０ｗｔ％塩化ナトリウムで３ＢＶ、続いて５ｗｔ％塩化ナトリウムで３ＢＶ）で洗浄して、樹脂をナトリウム型に変換した。次いで糖溶液（０．６Ｌ）をカラムに加え、その後、５０ｍＬ／分の流速で水を用いてカラムを溶出した。クロマトグラフィー分離の操作条件を次のとおりまとめる：０．６Ｌフィードサイズ、２５ｇ乾燥固体／１００ｇ溶液、６５℃カラム温度、５０ｍＬ／分流速。１１〜２１分でオリゴ糖溶液が溶出された。伝導度の上昇により示される少量の塩が同時に溶出された。このようにして調製したオリゴ糖分画をＨＰＬＣによって分析して、その生成物分布を決定した。全体で、分画は、３単位以上のヘキソース単位を含有するオリゴ糖＞８９％および１．５％未満の識別可能な単糖および二糖を含有した。薄フィルム蒸発器（ＬＣＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）、続いてＲＯＴＡＶＡＰＯＲ（Ｒ−１５１；Ｂｕｃｈｉ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いたロータリーエバポレーターを使用して、この分画を３１７ｇ／Ｌの総乾燥重量に濃縮した。ＨＰＬＣにより測定した場合の濃縮分画の生成物分布を表１８に示す。
グルカンオリゴマー加水分解におけるアルファ−グルコシダーゼの一次スクリーニング
１１種類の異なるアルファ−グルコシダーゼ（実施例１０）の活性ならびに２種類のベンチマーク酵素、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅより購入）およびトランスグルコシダーゼ（ＴＧ Ｌ−２０００）の活性を上記で調製した精製オリゴ糖分画に対して個々に評価した（表１８）。６０℃でｐＨ５．０のオリゴ糖基質（２．９％乾燥固体）および２ｍＭ塩化カルシウムを含有する溶液中で各アルファ−グルコシダーゼ（１ｍｇ／ｍＬで調薬）を温置した。５０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加することによって、温置２４時間後に各反応を反応停止させた。
停止させた反応物のオリゴ糖／単糖含量を次のように決定した。ＨＰＬＣ分析のために、各反応の試料を水中で５倍希釈した。８５℃にてＡＭＩＮＥＸ ＨＰＸ−４２Ａカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）でＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムを用いてＨＰＬＣ分離を行った。試料（１０μＬ）をＨＰＬＣカラムに適用し、０．６ｍＬ／分の流速で移動相としてＭＩＬＬＩ−Ｑ水の均一勾配で分離した。屈折率検出器を用いてオリゴ糖生成物を検出した。下記表１９に示される数字は、ＤＰ１〜ＤＰ７の合計の分画としての各ＤＰｎのピーク面積パーセンテージの平均（各試料の２つ組から）を反映する。
表１９で影を付したもので示されるように、反応のオリゴ糖含量は、一般的に、酵素がなかった対照反応（「ブランク」）と比較して、より小さいサイズの糖に向かってシフトした。これらの結果から、グルカン合成反応およびその分画内に含まれるオリゴ糖を加水分解するために、アルファ−グルコシダーゼを使用し得ることが示される。また、オリゴ糖の結合プロファイル（実施例３および４）およびアルファ−１，４結合に加えて様々なグリコシド結合に対するアルファ−グルコシダーゼの活性（実施例１１）を考慮すると、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合および／またはアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合があるオリゴ糖を分解するために、アルファ−グルコシダーゼを使用することができると思われる。表１９に示される結果はまた、細菌アルファ−グルコシダーゼと比較して、真菌アルファ−グルコシダーゼが可溶性オリゴ糖に対してより良好な加水分解活性を有することも示唆する。
グルカン合成反応のオリゴ糖生成物に対するアルファ−グルコシダーゼ加水分解活性の確認
１または２種類のアルファ−グルコシダーゼおよびポリアルファ−１，３−グルカン合成反応から得た濃縮ろ液を含む反応物を調製した（表３）。４ｐｐｍの酵素を用いてアルファ−グルコシダーゼ反応を行うか、または混合物の場合、１：１の比で、４ｐｐｍの最終用量で各酵素を使用した。各反応において濃縮ろ液を１０％乾燥固体で載せた。各反応物は、ｐＨ５．０で２ｍＭ塩化カルシウムをさらに含み、６０℃または６５℃で行った。２３時間温置後、５０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加することによって、反応を停止させた。
停止させた反応物のオリゴ糖／単糖含量を次のように決定した。ＨＰＬＣ分析のために、各反応の試料を水中で２５倍希釈した。８５℃にてＡＭＩＮＥＸ ＨＰＸ−４２Ａカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）でＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステムを用いてＨＰＬＣ分離を行った。試料（１０μＬ）をＨＰＬＣカラムに適用し、０．６ｍＬ／分の流速で移動相としてＭＩＬＬＩ−Ｑ水の均一勾配で分離した。屈折率検出器を用いてオリゴ糖生成物を検出した。下記表２０に示される数字は、全体の分画としての各ＤＰｎのピーク面積パーセンテージの平均（各試料の２つ組から）を反映する。表２０に示される結果から、表１９に示された結果に関して上記で論じられるように、一般的にある種のアルファ−グルコシダーゼの活性が確認される。
このように、ポリアルファ−１，３−グルカン合成反応などのグルカン合成反応から得られる分画（例えばろ液）に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するために、アルファ−グルコシダーゼを使用することができる。
実施例１３
ｇｔｆ−Ｓ／ＭＵＴ３３２５反応からのオリゴマー／ロイクロース分画の単離
９．５Ｌの最終総体積中で蒸留脱イオン水中でスクロース（４．５０ｋｇ）を溶解させ、８０℃で５分間で撹拌しながら、得られた溶液を加熱し、次いで４７℃に冷却した。撹拌しながら、０．６ｇ／Ｌのｇｔｆ−Ｓ酵素（ＧＴＦ０４５９、配列番号４２）および１０ｇ／Ｌのムタナーゼ（ＭＵＴ３３２５、配列番号４７）を含有する１５．０ｍＬの粗製抽出物を含有する５００グラムの粗製抽出物を撹拌しながら添加した（酵素調製のための一般的方法を参照）。撹拌しながら３７ｗｔ％ＨＣｌの１：１０（ｖ／ｖ）希釈液をゆっくりと添加することによって、得られた混合物のｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に直ちに調整した。スクロース変換がＨＰＬＣ分析によって＞９５％になるまで、反応温度およびｐＨをそれぞれ４７℃およびｐＨ５．５〜６．０に維持し、その後、反応混合物をｐＨ７．０〜７．５に直ちに調整し、９０℃に２０分間加熱し、次いで粒子および沈殿物を除去するために即時ろ過するため、２５℃に冷却した。次の樹脂および条件：Ｃａ２＋型のＦＩＮＥＸ ＣＳ １１ ＧＣ ＳＡＣ、カラムｉ．ｄ＝９．３ｃｍ、樹脂ベッド高１．５８ｍ、Ｔ＝７０℃、流速＝５１ｍＬ／分、直線的流速＝０．４４ｍ／ｈ、フィードサイズ＝０．６Ｌ＝１７１ｇ、フィードＲＩ−ＤＳ＝２５．１ｇ／１００ｇ、試料間隔＝３分を用いたＩＥＸ／ＳＥＣカラムクロマトグラフィーの前に、得られたろ液を５℃で保持した。３０分〜６７分で回収されたカラム分画を合わせ、６６％溶解固形物になるまで蒸発によって濃縮し、一般的方法に記載のとおりＨＰＬＣにより分析した。表２１は、このようにして調製された単離分画のオリゴ糖および単糖成分を示す。
この実施例において、少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるために、グルカン合成反応を使用した。この可溶性生成物は、両方ともグルコシルトランスフェラーゼ反応中に存在した、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ０４５９、配列番号４２）およびアルファ−グルカノヒドロラーゼ（ＭＵＴ３３２５、配列番号４７）の両方の協奏作用から得られた。この実施例はまた、グルカン合成反応からのクロマトグラフィー分画の調製も明らかにした。以下の実施例１５および１６でこの分画を使用して、それに対するアルファ−グルコシダーゼの活性を試験した。
実施例１４
Ｇｔｆ−Ｃ反応からのオリゴマー／ロイクロース分画の単離
蒸留脱イオン水中でスクロース（４．５０ｋｇ）を溶解させて最終総体積を９．５Ｌにし、得られた溶液を８０℃で５分間、撹拌しながら加熱し、次いで４７℃に冷却した。撹拌しながら、０．４１ｇ／Ｌのｇｔｆ−Ｃ酵素（ＧＴＦ００８８ＢｓＴ１、配列番号４５）を含有する５００グラムの粗製抽出物を撹拌しながら添加した（酵素調製に対する一般的方法を参照）。撹拌しながら３７ｗｔ％ＨＣｌの１：１０（ｖ／ｖ）希釈液をゆっくりと添加することによって、得られた混合物のｐＨをｐＨ５．５〜ｐＨ６．０に直ちに調整した。スクロース変換がＨＰＬＣ分析によって＞９５％になるまで、反応温度およびｐＨをそれぞれ４７℃およびｐＨ５．５〜６．０に維持し、その後、反応混合物を直ちにｐＨ７．０〜７．５に調整し、９０℃に２０分間加熱し、次いで粒子および沈殿物を除去するために即時ろ過するため、２５℃に冷却した。次の樹脂および条件：Ｃａ２＋型のＦＩＮＥＸ ＣＳ １１ ＧＣ ＳＡＣ、カラムｉ．ｄ＝９．３ｃｍ、樹脂ベッド高１．５８ｍ、Ｔ＝７０℃、流速＝５０ｍＬ／分、直線的流速＝０．４４ｍ／ｈ、フィードサイズ＝０．６Ｌ＝１７１ｇ、フィードＲＩ−ＤＳ＝２５．８ｇ／１００ｇ、試料間隔＝３分を用いたＩＥＸ／ＳＥＣカラムクロマトグラフィー前に、得られたろ液を５℃で保持した。３４分〜７２分で回収したカラム分画を合わせ、蒸発により濃縮して６７％溶解固形物にし、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。表２２は、このように調製された単離分画のオリゴ糖および単糖成分を示す。
この実施例において、少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させるために、グルカン合成反応を使用した。この実施例はまた、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応からのクロマトグラフィー分画の調製も明らかにした。以下の実施例１５および１６においてこの分画を使用して、それに対するアルファ−グルコシダーゼの活性を試験した。
実施例１５
Ｇｔｆ−Ｓ／ＭＵＴ３３２５およびＧｔｆ−Ｃ反応からのオリゴマー／ロイクロース分画を用いたアルファ−グルコシダーゼの一次スクリーニング
この実施例は、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応から得られるクロマトグラフィー分画中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためにアルファ−グルコシダーゼを使用することを記載する。具体的に、実施例１３および１４で調製された分画中のロイクロースおよびオリゴ糖の加水分解における、実施例１０で開示されるアルファ−グルコシダーゼの効果について試験を行った。
基質物質としてｇｔｆ−Ｓ／ＭＵＴ３３２５（実施例１３）およびｇｔｆ−Ｃ（実施例１４）反応からのオリゴマー／ロイクロース分画を用いて、全部で１２種類のアルファ−グルコシダーゼおよび２種類のベンチマーク酵素（オリゴ−１，６−グルコシダーゼおよびＴＧ Ｌ−２０００トランスグルコシダーゼ）をスクリーニングした。全酵素（アルファ−グルコシダーゼおよびベンチマーク酵素）を等しいタンパク質濃度で分けた。ｐＨ５．５で４７℃のオリゴマー／ロイクロース基質（１０％乾燥固体）および２ｍＭ塩化カルシウムを含有する溶液中で各アルファ−グルコシダーゼ（１００ｐｐｍで分ける）を温置した。５０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加することによって、温置２１時間後に各反応を停止させた。
停止させた反応のオリゴ糖／単糖含量を次のように決定した。各反応からの試料を遠心し、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のためにそこからの上清を水中で２５倍希釈した。表２３で報告されるパーセンテージは、全体の分画としての各ＤＰｎのピーク面積パーセンテージの平均（各試料の２つ組から）を反映する。結果は、細菌アルファ−グルコシダーゼと比較した場合、真菌アルファ−グルコシダーゼがグルカンオリゴマーに対してより良好な加水分解活性を有したことを示す。
表２３で影を付したもので示されるように、反応のオリゴ糖含量は、一般的に、酵素がなかった対照反応（「ブランク」）と比較して、より小さいサイズの糖に向かってシフトした。これらの結果から、グルカン合成反応およびその分画、特に可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応のクロマトグラフィー分画内に含まれるオリゴ糖を加水分解するために、アルファ−グルコシダーゼを使用し得ることが示される。また、オリゴ糖の結合プロファイル（実施例１３および１４）およびアルファ−１，４結合に加えて様々なグルコシド結合に対するアルファ−グルコシダーゼの活性（実施例１１）を考慮すると、アルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合およびまたおそらくアルファ−１，３およびアルファ−１，６グルコシル−グルコース結合もあるオリゴ糖を分解するために、アルファ−グルコシダーゼを使用することができると思われる。表２３に示される結果はまた、細菌アルファ−グルコシダーゼと比較して、真菌アルファ−グルコシダーゼが可溶性オリゴ糖に対してより良好な加水分解活性を有することも示唆する。
このように、アルファ−グルコシダーゼは、可溶性アルファ−グルカン生成物を合成するものなど、グルカン合成反応から得られる分画（例えばクロマトグラフィー分画）中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するために使用することができる。
実施例１６
Ｇｔｆ−Ｓ／ＭＵＴ３３２５およびＧｔｆ−Ｃ反応からのオリゴマー／ロイクロース分画を用いたアルファ−グルコシダーゼの選択スクリーニング
この実施例は、実施例１５に加えて、可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させたグルカン合成反応から得られるクロマトグラフィー分画中に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するためのアルファ−グルコシダーゼの使用を記載する。
等しいタンパク質濃度で分けられた酵素を含有する反応を引き起こす糖組成物を分析することによって、ｇｔｆ−Ｓ／ＭＵＴ３３２５およびｇｔｆ−Ｃ反応（実施例１５）からのオリゴマー／ロイクロース分画の加水分解に対して最も活性が高かったアルファ−グルコシダーゼの評価を行った。ｐＨ５．５で、２ｍＭ塩化カルシウムの存在下で、それぞれ６０℃および６５℃でアルファ−グルコシダーゼ（４ｐｐｍで分ける；混合物の場合、２つの酵素の比は１：１であり、総用量は４ｐｐｍであった）およびオリゴマー／ロイクロース基質（１０％ｄｓ）の温置を行った。温置２３時間後に５０μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを添加することによって、反応を停止させた。
停止させた反応のオリゴ糖／単糖含量を次のように決定した。各反応からの試料を遠心し、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために、それからの上清を水中で２５倍希釈した。表２４（下記）で報告されるパーセンテージは、全体の分画としての各ＤＰｎのピーク面積パーセンテージの平均（各試料の２つ組から）を反映する。結果から、ＴａｕＳｅｃ０９８がＤＰ２〜ＤＰ７オリゴマーの加水分解に対して効果的であり、ＴａｕＳｅｃ０９９は、６５℃で温置を行った場合、ロイクロース加水分解に対してＴＧ Ｌ−２０００よりも優れていたことが示される。ＴａｕＳｅｃ０９８とＴａｕＳｅｃ０９９（またはＴＧ Ｌ−２０００）との混合物は、ＤＰ１生成のためのオリゴマーおよびロイクロースの加水分解に対して有効であった。
このように、アルファ−グルコシダーゼは、可溶性アルファ−グルカン生成物を合成するものなど、グルカン合成反応から得られる分画（例えばクロマトグラフィー分画）に存在するロイクロースおよび他のオリゴ糖を加水分解するために使用することができる。

Claims (15)

  1. 少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含む糖においてアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する方法であって、前記糖が二糖またはオリゴ糖であり、前記方法が、適切な条件下で前記糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることを含み、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、前記糖の量が、前記接触前に存在した前記糖の量と比較して減少している、方法。
  2. 前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が固定化されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記糖がロイクロースである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記接触工程後のロイクロースの濃度が、前記接触前に存在したロイクロースの濃度の５０％未満である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記適切な条件が、
    （ｉ）グルカン合成反応、または
    （ｉｉ）前記グルカン合成反応から得られる分画
    を含み、前記糖が前記グルカン合成反応の副産物である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記グルカン合成反応が、少なくとも１つの不溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記分画が前記グルカン合成反応のろ液である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記グルカン合成反応が、
    （ｉ）グルコシルトランスフェラーゼの生成物、または
    （ｉｉ）１つ以上のアルファ−１，３−グリコシド結合または１つ以上のアルファ−１，６−グリコシド結合を有するグルカンポリマーを加水分解することが可能なグルコシルトランスフェラーゼおよびアルファ−グルカノヒドロラーゼの両方の協奏作用の生成物である、少なくとも１つの可溶性アルファ−グルカン生成物を生成させる、請求項５に記載の方法。
  9. 前記分画が前記グルカン合成反応のクロマトグラフィー分画である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記アルファ−グルコシダーゼ酵素がトランスグルコシダーゼまたはグルコアミラーゼである、請求項１に記載の方法。
  11. 糖をアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることにより生成される組成物であって、前記糖が二糖またはオリゴ糖であり、かつ少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を含み、前記酵素が、前記糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解し、前記組成物が、前記接触前に存在した前記糖の量と比較して減少した量の前記糖を含む、組成物。
  12. 前記糖がロイクロースである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記糖が（ｉ）グルカン合成反応、または（ｉｉ）前記グルカン合成反応から得られる分画にあり、前記糖が前記グルカン合成反応の副産物である、請求項１１に記載の組成物。
  14. グルカン合成反応の分画に存在するフルクトースを濃縮する方法であって、
    （ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
    （ｂ）工程（ａ）の前記分画のフルクトース濃度と比較してより高いフルクトース濃度を有する組成物を得るために、工程（ａ）の前記加水分解分画からフルクトースを分離することと
    を含む、方法。
  15. （ａ）グルカン合成反応から得られる分画を適切な条件下でアルファ−グルコシダーゼ酵素と接触させることであって、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素が、前記分画内に含まれる二糖またはオリゴ糖の少なくとも１つのアルファ−１，５グルコシル−フルクトース結合を加水分解する、接触させることと、
    （ｂ）生成物を得るために微生物を用いて工程（ａ）の前記分画を発酵させることであって、前記発酵が、工程（ａ）の後または工程（ａ）と同時に行われる、発酵させることと、
    （ｃ）任意選択により（ｂ）の前記生成物を単離することと
    を含み、（ｂ）の前記生成物の収率が、前記アルファ−グルコシダーゼ酵素と接触していない前記グルカン合成反応の分画を発酵させる生成物の収率と比較して上昇している、発酵方法。
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