MX2010012952A - Composiciones y metodos para producir carbohidratos fermentables en plantas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan en la presente métodos para producir azúcar fermentable obtenida de un tejido vegetal. Los métodos incluyen proporcionar un material vegetal transgénico que comprende uno o más carbohidratos cerrados y poner en contacto material vegetal con una enzima capaz de convertir el carbohidrato cerrado en un azúcar fermentable. Los métodos son útiles para proporcionar azúcar o precursores de azúcar para diversos fines industriales, incluida la producción de etanol. La invención también comprende plantas y partes de plantas que producen una enzima de cierre para proporcionar un carbohidrato cerrado, con la consecuencia de acumular el carbohidrato cerrado en la planta. La invención también comprende proporcionar una enzima llave capaz de convertir los carbohidratos cerrados en azúcares fermentables. Las enzimas llave pueden ser proporcionadas por plantas o partes de plantas transgénicas, microbios transgénicos, levadura transgénica, microbios o levadura.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA PRODUCIR CARBOHIDRA FERMENTABLES EN PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la biología al, particularmente a métodos y composiciones d s plantas para obtener un material vegetal do, particularmente para la producción de etanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La biomasa vegetal está compuesta por azú senta la mayor fuente de hidrocarburos renovabl a. A diferencia de otras fuentes de energía, l convertirse directamente en combustibles líqui ipos más comunes de biocombustibles son etanol co) y biodiésel . El etanol es un alcohol q cirse fermentando cualquier biomasa alta en carb les alimenticios y tubérculos, tales como tos . Los cultivos que contienen azúcar, ta acha azucarera, caña de azúcar y el sorgo dulce, an utilizarse para la producción de etanol. El a sin refinar y refinada, o como azúcar en mel ere pre-hidrólisis (a diferencia del almidón de la fermentación. Por lo tanto, el pr cción de etanol a partir de azúcar es más simpl rsión de almidón de maíz en etanol.

El rendimiento y la concentración de los carb dos en plantas son determinantes clave de la v ca y económica de los procesos industriales pos embargo, las redes metabólicas de las plantas ntesis de azúcares muestran una sustancial iguadora y redundancia, con la consecuencia d ación a un gen clave en el metabolismo de u nversión de un carbohidrato endógeno en un car tivo. La invención comprende plantas y partes de producen una o más enzimas metabolizad hidratos para proporcionar un carbohidrato cerr onsecuencia de aumentar el contenido de car do en la planta. También se proporcionan líticas (enzimas llave) ; para convertir el car do en un azúcar fermentable. Las azúcares fermen zan para una variedad de fines industriales, in cción de etanol .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la actividad de alfa-l,6-gl ID NO: 5) medida utilizando sacarosa como sustra La figura 2 muestra la transferencia de g cen etanol entre cepas de levadura (Rendimiento r de Isomaltulosa y Glucosa) . ujo de azúcares y, por lo tanto, la acumulación imitada en muchas plantas. Las plantas tores internos y receptores externos unidos a monitorear la biosíntesis, el transporte y la zúcar (reseñado en Lalonde et al. (1999) Pí 7-726) . Los receptores intracelulares modu sos metabólicos tales como la fotosíntes tores extracelulares perciben concentraciones ex r con el fin de controlar el influjo de az nte circundante. De este modo, las células veget es de mantener niveles suficientes de sacarosa gulación de los procesos metabólicos y la capt r .

Se proporciona en la presente un método para hidratos de almacenamiento cerrados en plantas ue no puedan ser metaboldzados por la planta. Lo enzima capaz de convertir el azúcar endógen hidrato cerrado (al que se hace referencia en la una "enzima de cierre") en una planta perm lación de los carbohidratos cerrados en la plañ estos carbohidratos cerrados son metabolizados as, es probable que se sometan a "ciclos fút dación y síntesis en los tejidos de almac os, que tienen el potencial de disminuir la e lmacenamiento y el rendimiento cosechable. Mucho sacáridos, polisacáridos o monosacáridos también ecanismos de detección de carbohidrato de la pí la detección de sacarosa, de forma tal que la si hidratos nativos y no nativos puede ocur nsar las reducciones de carbohidratos endógeno desviado en la vía de almacenamiento de carb dos . da renovable atractivo para la elabora rfactantes y polímeros biocompatibles (Lich ) Accounts Chem. Res. 35:728-737).

La invención también comprende la expresión de líticas capaces de hidrolizar los carbohidratos úcares fermentables . Se hace referencia a estas presente como "enzimas llave" . Estas enzimas p igen vegetal, bacteriano, fúngico, arqueal u otr rcionarse exógenamente en una preparación de n expresarse en una línea separada de plantas de de plantas, o en levadura u otros microbios, rcionarse en microbios que se usan en un ntativo que convierte azúcares ferm hidratos o sacáridos di, tri, oligo o polimé ctos de fermentación útiles. Las azúcares fer arbohidratos que pueden metabolizarse mediante o Las aplicaciones comerciales de la invención inc cción de caña de azúcar, remolacha azucarera as capaces de producir carbohidratos cerrados. E idades, la acumulación de los carbohidr enamiento normal (por ejemplo, sacarosa) no se plantas. Estas plantas o sus extractos se trat preparaciones de enzimas o con microbios o m ales que expresan enzimas llave capaces de hidro hidratos cerrados en azúcar fermentable. Estas an utilizarse entonces en la fermentación par , incluida la producción de etanol y otro pro és .

De este modo, los métodos de la invención encue cular en la integración de prácticas actuales vo de plantas de cosecha con el fin de ob ial vegetal comercialmente deseado con mayor ac antas, incluidas, a modo no taxativo, maíz, trig a, soja, algodón, sorgo, avena, tabaco, frutill nthus, césped de pradera, árboles, frijoles en /canola, alfalfa, lino, girasol, cártamo, mijo, de azúcar, remolacha azucarera, cacao, té, on, café, boniato, maní, trébol; verduras ta ga, tomate, cucurbitáceas, mandioca, papa, z o, arveja, lentejas, repollo, coliflor, brócoli, uselas, pimientos y ananá; frutos de árbol, ta cos, manzanas, peras, duraznos, damascos, ate, banana y coco; y flores tales como o les y rosas.

Tal como se utilizan en la presente, las exp e de planta" o "tejido vegetal" incluye ales, protoplastos vegetales, cultivos de ares vegetales a partir de los cuales nto" significa uno o más elementos. En toda la iptiva, se entenderá que la expresión "que comp ciones tales como "comprende" o "comprenden" , i sión del elemento, número entero o etapa cita de elementos, números enteros o etapas, per sión de cualquier otro elemento, número entero o upo de elementos, números enteros o etapas .

"Aislado" significa alterado "por el hombre" de al; es decir, si se produce en la naturaleza, ado o retirado de su ambiente original, o am ío, un polinucleótido natural o un polipéptido aímente presente en un animal vivo en su estado tá "aislado", pero el mismo polinucleótido o po ado de los materiales con los que coexiste en s al está "aislado", de acuerdo con el uso del té esente. Por ejemplo, con respecto a los polinuc ero (crecimiento y almacenamiento) en las plant rincipal producto de almacenamiento en dét as tales como la caña de azúcar y la remolacha a lantas tienen sensores y transportadores muy sacarosa, pero generalmente se considera q res y transportadores de sacarosa no son ca nder del mismo modo a los carbohidratos cerrado ., Plant Physiol 123: 939-948 (2000); Sinha et a ol 128: 1480-1489 (2002)). En marcado contrast osa, las plantas son incapaces de metaboliz hidratos cerrados como una fuente de carbono y a et al . , 2002) .

Si bien no están restringidas por ninguna ismo en particular, las alteraciones específic olismo, que implican la conversión de un car lmente detectado por la planta en el carbohidrat un azúcar endógena de una planta puede ser n otra. Cuando el azúcar es no nativa para un cular, la planta es candidata para la producci hidrato cerrado utilizando los métodos de la i s, un carbohidrato no nativo también puede refer hidrato que normalmente no es producido rtimiento subcelular particular, o en una parte cular de la planta nativa. En esta modal rtimiento subcelular o la parte de planta ño capaz de metabolizar o transportar fu rtimiento o parte de planta cualquier carbohi o producido allí. De este modo, es esencial d s carbohidratos son producidos de forma endógen a o parte de planta elegida para deducir de e s carbohidratos son no nativos para la planta y zima metabolizadora de carbohidratos que podría da (es decir, azúcar que no puede ser metaboliza a) .

Los tipos de carbohidratos producidos de manera plantas pueden determinarse utilizando méto idos por los expertos en la técnica. Estos yen la separación de azúcares o derivados d nte técnicas de electroforesis o cromatogra ía tografía de papel, cromatografía en cap tografía de gas, cromatografía de gas-lí tografía líquida de alto rendimiento) . Los co ados generalmente se identifican mediante la co erfiles de separación con estándares de idos o mediante técnicas analíticas tal trometría de masas y espectroscopia de r tica nuclear. Ver, por ejemplo, Robinson 1 ic Constituents of Higher Plants, Cordus Pres s de azúcar, amino azúcares u otras variantes t iazúcares, metil azúcares y similares. Eje acáridos incluyen compuestos de fórmula (0?20) más pero adecuadamente menos de 10; incluidos c comprenden tetrosas (por ejemplo, eritrosa, ulosa) , pentosas (por ejemplo, ribosa, arabinosa, a, ribulosa, xilulosa) ,¦ hexosas (por ejemplo, sa, glucosa, mañosa, gulosa, idosa, galactosa, sa, fructosa, sorbosa, tagatosa) y moléculas má como sedoheptulosa o manoheptulosa. Los oligos se forman ligando dos o más unidades monosac s de enlaces glucosídicos , pueden selecció áridos (por ejemplo, maltosa, lactosa, ge iosa, trehalosa, soforosa, primoverosa, osa, isomaltulosa, trehalulosa, turanosa, m osa, 2-ceto-sacarosa) y oligómeros más largos t dextri'nas, lactosa, verbascosa, amilosa y ramnosa Isomaltulosa y trehalulosa En determinadas modalidades, el carbohidrato ce omero del carbohidrato endógeno. En un ejemplo idad, el azúcar endógena es sacarosa y l olizadora de azúcar es una isomerasa de sacar erte la sacarosa mediante isomerización en u da seleccionada de isomaltulosa y trehalul ltulosa . alfa . -D-glucopiranosil-1 , 6-D-fruct ién denominada palatinosa) es un disacárido nutr dulce y volumen similar a sacarosa, terísticas hacen a la isomaltulosa ventajosa con sacarosa para algunas aplicaciones en la nticia: 1) no cariogénica (no causa caries); e glicémico (útil para diabéticos); 3) tiva de crecimiento de bifidobacterias beneficio idos los productos de reacción de disacári rción de monosacáridos tales como glucosa y fru roductos de reacción, las propiedades cinética as, las condiciones óptimas de reacción y la sen enzima a las variaciones de las condiciones nese y Perlot, Enzyme . Microb. Technol 24: ) ) . Un aislado de Pantoea dispersa designado cionalmente eficiente en la actividad de isom osa (Wu y Birch (2004) J. Appl . Microbiol . 97: ejemplo de isomerasa de sacarosa se ha aislado d ovora (No. de acceso GENBANK YP049947) .

Dextranos y fmetanos La presente invención también comprende la trans antas con uno o más genes involucrados en la sí años o dextranos. Estos genes pueden provenir d ales, bacterianas o fúngicas y deberían cata caña de azúcar y remolacha azucarera, se propor o para secuestrar carbohidratos en una forma q olizable para la planta. Los compuestos pueden e ismos de detección de sacarosa de la planta de m ueden acumularse para una posterior hidrólisis e obtener azúcares fermentables .

Dextrano es el nombre colectivo para polímeros molecular compuestos por unidades de D-glucosa c nlaces alfa-1,6 y varias cantidades de cadenas s con alfa-1,2, alfa-1,3 o alfa-1,4 a sus pr as. Las enzimas que sintetizan estos glucanos a osa son conocidas mediante el término ansacarasa (1, 6-alfa-D-glucan-6-alfa-glucosiltra .1.5.)· La biosíntesis de dextrano se ha demos osas bacterias, especialmente en Streptococcus nostoc mesenteroides ssp. mesenteroides y Le al)--J. H . WEIL--Masson, 6ta edición- - 1990 - -p . 17 Enzimas dextransacarasa ejemplares incluyen (a ivo) : la dextransacarasa de Streptococcus dow (Gilmore et al. (1990) Infect . Immun. 58 (8) , 2 de acceso GENBANK P29336) ; la dextransaca tococcus mutans, gen gtfl, produce dextranos sol glucosa (Shiroza et al. (1987) J. Bacteriol . 4270; No. de .acceso GENBANK P08987) ; y la dextra reptococcus mutans gen gtfD, proteína gtfS (Tera ) FEMS Microbiol. Lett . 161 (2), 331-336; No. NK P49331) .

No hay una clase común de enzimas identific asas de leucrosa" . En cambio, la leucrosa [ piranosil- (1 5) -D-fructopiranósido] es genera oducto de la actividad enzimática de dextransac .5). Estas enzimas actúan como glucosiltransf rties and Structure of the Disaccharide Leucrose e American Chemical Society, Stodola et . al ; (1 seguida de purificación química .

Las dextransacarasas pueden mutarse para prod osa y/o turanosa. Esto se ha demostrado ansacarasa de Streptococcus oralis (Engineer nsucrase GTFR Enzyme Reaction and Glycosid ficity: Toward Tailor-Made Polymer and Oligos cts, Biochemistry 2008, 47, 6678-6684, Hendrik al) . Dado que las dextransacarasas pueden muta cir leucrosa, es razonable asumir que otras ionadas (por ejemplo, amilosacarasas EC 2.4 as no relacionadas que también producen isó osa pueden mutarse para producir leucrosa. La ntasa de leucrosa se atribuye a una enzima que osa mediante cualquier mecanismo, es s arreglos de enlaces en las moléculas de carb determinarse mediante metilación y acetila osa seguida de GC MS, o directamente troscopia de NMR si las muestras son de s dad y pureza.

Sacarosa : sacarosa fructosiltransferasa (SS .99) , 1- fructosiltransferasa de 1 , 2 - ß-fructano ( .100) , l-fructosiltransferasa de 2^-fructano ( .100), sacarasa de glucano y sacarasa de le .10) son enzimas dentro de la clase más g osiltrans erasas. Las enzimas de fructosiltr izan la formación de fructanos compuestos de a por enlaces de ß(2?1) y/o ß(2?6) glucós osiltrasferasas pueden identificarse y aisl es vegetales, bacterianas o fúngicas . Estas n expresarse en plantas para acumular fructa a unidad de glucosa, que están ligadas entre sí laces .beta. (2-1) fructosil-fructosa .

Las moléculas de inulina se sintetizan mediante rtada de dos enzimas: sacarosa : sacar osiltransferasa (abreviada enzima 1-SST o simpl indistintamente) y fructano : fructan osiltransferasa (abreviada enzima 1-FFT o simpl indistintamente) (Koops y Jonker, J of Exp y 45: 1623-1631 (1994); y Koopos y Jonker, Plan 1167-1175 (1996)). Tanto la 1-SST como la 1 as durante el período de síntesis y acumul na. La 1-SST cataliza la reacción inicial ntesis de inulina, la conversión de sacaros ula de inulina más pequeña, el trisacárido cesto FFT cataliza la redistribución de unidades de f nales (-F) entre moléculas de inulina, lo cual r ferasas, trans-cetolasas, fosfatasas, xilasas, deshidrogenasas e hidrolasas. Una amil iar incluye la enzima producida por acharea (No. de acceso GENBAN Q9ZEU2) , que cat rsión de sacarosa en un glucano ligado a alfa- 1, Alternarlo El alternano es un polisacárido que consiste en glucosilo ligados por enlaces alfa- (1-3 ) /a nativos. Este polímero es altamente soluble y viscosidad. La acumulación de este polisacárido zúcar u otras plantas puede permitir la acumul hidratos en exceso.

La alternansacarasa es una enzima que cat rsión de sacarosa en alternano. La alternansaca icada por el gen Asr de Leuconostoc mese ito en Jeannes et al. (1954) Am Chem Soc 76:5041 rcionarse en microbios que se usan en un ntativo para convertir los carbohidratos cer res fermentables . La levadura o microbios usad SO fermentativo también pueden identificarse o convertir los carbohidratos cerrados en smo, los carbohidratos cerrados pueden converti r fermentable mediante métodos químicos, por nte uno o más productos químicos capaces de con hidrato cerrado en un azúcar fermentable. Los cos pueden agregarse antes de la fermentación o oceso de fermentación.

Las enzimas llave pueden aislarse de, produc de, o ser proporcionadas por una amplia gama de n diseñarse organismos recombinantes tales como bios o levadura para expresar una enzima 1 ismo recombinante puede utilizarse directament cionada del grupo que consiste en planta transgé sa una o más enzimas, microbio recombinante que más enzimas llave, levadura transgénica que exp enzimas llave, microbio que expresa una o más y levadura que expresa uno o más enzimas llave.

La isomaltulosa y trehalulosa pueden hid nte enzimas de alfa-1 , 6-glucosidasa . Las en sidasa ejemplares se indican en SEQ ID NO:l- nte. Secuencias adicionales se describen en la P stados Unidos 5.786.140 y en Bórnke et al. (2001) cteriology 183 (8) : 2425-2430 , cada uno de los c pora en la presente a modo de referencia en su t Las enzimas que degradan dextrano forman un dive arbohidrasas y transferasas diferentes. Estas e o se han clasificado en endo- y exodextranasas e de acción y comúnmente « se han denominado dextr sa; es decir, la hidrólisis es acompañada sión en carbono- 1 de forma tal que se libere os reductores en la configuración alfa. Se co as bacterias y levaduras producen glucodextran dextranasa extracelular inducible por dext ntra en las cepas 142 y T-3044 de Art formis (Oguma y Kobayashi (1996) J. Appl . -78; Oguma et al. (1999) Biosci. Biotechnol . 74-2182) .

Las glucosidasas de dextrano intracelulares (EC3. cen alfa-D-glucosa de dextrano existen en varias tococcus mitis (Linder y Sund (1981) Caries Res.

Walker y Pulkownik (1973) Carbohydr. Res. 29:1-1 kownik (1974) Carbohydr. Res. 36:53-66).

La isomaltodextranasa T6 de la bacteria del formis (EC3.2.1.94; isomaltohidrolasa de 1, a tuvo una especificidad estricta para el enl D-glucosídico en los puntos de ramificación de contienen 12 a 34% de enlaces 1,2-alfa) y poli ionados que producen D-glucosa libre como la úni tora .

Una lista de enzimas hidrolizantes de bianas ejemplares adicionales y las especificid ato y los productos de, hidrólisis se proporc kova et al. (2005) Microbiology and Molecular ws 2005:306-325, que se incorpora en la present eferencia dado que describe y enumera varias lizantes de dextrano.

Las fructanasas son fructosidasas que cata lisis de enlaces fructosídicos en fructan tegrar el fructano en moléculas de azúcar más fructanos pueden hidrolizarse en azúcares ferme idad exo, que catalizan la hidrólisis de ando unidades de fructosilo terminal (D- fructosa) Los altérnanos pueden hidrolizarse para formar ntables mediante la actividad de una alfa-l,6-gl a-1 , 3-glucosidasa . os Se proporcionan en la presente métodos para me miento de carbohidrato en plantas mediante la a enzima capaz de convertir carbohidrato end hidrato cerrado. Los carbohidratos cerrados acum plantas descritas en la presente pueden conver hidratos fermentables utilizando una o más enzi se divulgan en la presente, que pueden utiliza materias primas de fermentación para etanol, ol u otro alcohol combustible, bebidas que l (tal como bebidas malteadas y bebidas aleonó ínas enzima llave también podrían incorporars so de producción de etanol posterior a la ia prima. Se prevé que los carbohidratos cerrado harse y, en el proceso de modalidad de etanol, se agrega durante el proceso de producc ínas enzimas llave también podrían incorporar so de producción de etanol posterior a la ia prima. Se prevé que los carbohidratos cerrado varse y, en el proceso de modalidad de etanol, se agrega durante el proceso de producción.

En una modalidad, el uso de los métodos divulga nte resulta en un sustrato que produce rendimi de etanol en comparación con el rendimiento de ial vegetal que no acumula carbohidratos ce to del rendimiento de etanol puede ser de imadamente 1%, al menos aproximadamente 2%, imadamente 200% veces, al menos aproximadamente aproximadamente 400%, al menos aproximadament Aun pequeños aumentos en el rendimiento de e cirán en grandes volúmenes de etanol producido o en un proceso de fermentación a escala comerc as en la producción de etanol podrían result to significativo en las ganancias para el prod l.

En una modalidad, el uso de los métodos divulga nte resulta en un sustrato que produce rendimie de carbohidrato en comparación con el rendim hidrato de material vegetal que no acumula carb dos . El aumento del rendimiento de carbohidrato menos aproximadamente 1%, al menos aproximada ños aproximadamente 3%, al menos aproximadament aproximadamente 5%, al menos aproximadamente Aun pequeños aumentos en el rendimiento de car aducirán en grandes volúmenes de etanol producid o en un proceso de fermentación a escala comer hidrato puede ser sacarosa o una combinación de azúcar cerrada.

En otra modalidad, las plantas que acumulan carb dos pueden utilizarse' en varios otros riores, además de la producción de etan hidratos cerrados pueden convertirse en ntables que se utilizan en muchos proc ntación comerciales, incluido el crecimiento de binante que produce importantes productos químic insulina, anticuerpos o enzimas. La isomalt * za actualmente para fabricar alcoholes de azúca meri como edulcorantes bajos en calorías no cari uctosa también tiene valor como edulcorante en permo de maíz o expresarse en microbios. L icada podría utilizarse para producir fructanos, ernanos .

Los productos vegetales más dulces pueden sando en plantas una combinación de enzimas que ten la acumulación de fructanos en la planta erten los fructanos directa o indirectamente en presión de invertasa (isomerasa de glucosa) en cumulan fructanos provocará un índice más alto en la planta.

En otra modalidad, las plantas que acumulan carb dos como se describe en la presente son úti ger a la planta contra enfermedades . Si bien ingidas por ninguna teoría o mecanismo en partic as que acumulan azúcares cerradas pueden antes o resistentes a la 1 infección microbiana de zima llave agregada de manera exógena puede sin menté o puede aislarse de un organismo que ex a antes de la adición de la enzima al material ontiene carbohidratos cerrados.

Una preparación purificada o semi-purificada d ndrá al menos una clase de enzima llave, pero contener una o más enzimas adicionales de la mi distinta clase. La preparación también puede c o más enzimas adicionales útiles en el m rsión de almidón, tal como amilasa o glucoamil ración de enzima "semi-purificada" contendrá u as llave, una o más enzimas adicionales útil so de conversión de almidón o puede conten iones amortiguadoras o agentes estabilizant ío, glicerol) . Asimismo, la preparación de enzi icada también puede ser sobrenadante de c fección para un organismo particular de inter ntes para un experto en la técnica.

En una modalidad, células bacterianas, tales Streptomyces, Bacillus subtilis; y varias o de los géneros Escherichia, Pseudomona , tomyces, Corynebacterium, Brevibacterium, bacterium y Staphylococcus pueden utilizar dero para expresar una o más clases de enzim endidas en la presente. Los métodos de transfor deroes bacterianos se describen, por ejemplo cación de Patente de los Estados Unidos No. 2003 En otra modalidad, pueden utilizarse ho cos, tales como células hospedero fungicas que p géneros Aspergí1lus, Rhizopus, Trichoderma, Ne , Penicillium, etc., tales como levadura que pe éneros Kluyveromyces, Saecharomyces, Schizosacch merican Type Culture Collection (http://www.a a las líneas celulares de una amplia variedad d hos de estos cultivos pueden utilizarse para ge . celular transgénica capaz de expresar un óloga. Se encuentran disponibles comercialmente ansformación apropiados para células eucariótic pXTl, pSG5 (Stratagene) pSVK3 , pBPV, p SG y macia) . Las técnicas para la transformación y élulas eucarióticas transgénicas se conocen bi ca. También se describen otros ejemplos de mé partes de la presente.

En otra modalidad, las enzimas llave pueden ais ganismo que expresa de manera endógena la enzi ismo que expresa la enzima puede utilizarse en s de fermentación sin necesidad de purificar o a del organismo. as transgénicas En una modalidad de la presente invención, el al que contiene carbohidratos comprende partes adas de al menos una variedad de una planta tr xpresa al menos un polinucleótido que codifica u erre. En otra modalidad, el material vegetal tr sa más de una enzima de cierre, lo que resul lación de más de un tipo de carbohidrato cerrado, idad adicional, tanto las enzimas de cierre as llave se expresan en el material vegetal. C rcionan como material vegetal transgénico t as de cierre como las enzimas llave, cada clase expresarse en la misma variedad de planta sarse en diferentes variedades de plantas.

Como se utiliza en la presente, el término "tra efiere a plantas que incluyen un polinucleótido ción de ADN, bombardeo de microproyectiles y ac rticulas. Ver, por ejemplo, los documentos EP 295 1. Como se utilizan en la presente, las ex rial vegetal" o "parte de planta" incluyen ales, protoplastos vegetales, cultivos de ares vegetales a partir de los cuales pueden re lantas, callos vegetales, acúmulos vegetales y ales que están intactas en plantas o partes de como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, , frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, s, puntas de raíces, anteras, tubérculos, r ares .

Cuando tanto las enzimas de cierre como las enzi proporcionadas por material vegetal transgénic ario que el material vegetal que expresa la enz 00% transgénico para la enzima llave. Sin emba imadamente 0,1% del material "cerrado que hidratos cerrados expresa la enzima llave, o imadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadam imadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadam imadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadam imadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadam imadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadam imadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadam imadamente 19%, o aproximadamente 20%, del al. Sin embargo, se contempla que el porce ial vegetal que expresa la enzima llave pueda incluido, por ejemplo, aproximadament imadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadam imadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadam imadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadam imadamente 95%, o aproximadamente 99% del ío domesticus) , banana (Musa, por ejemplo ac (tales como grosella, por ejemplo rubrum) , s como cereza dulce, Prunus, por ejemplo avium) mis, por ejemplo sativus) , uva (Vitis, por era) , limón (Citrus limón) , melón (Cucumis meló) (tales como la nuez, Juglans, por ejemplo regi is hypoaeae) , naranja (Citrus, por ejemplo no (Prunus, por ejemplo pérsica) , pera (Pyra, po nis) , pimiento (Solanum, por ejemplo capsicum) , us, por ejemplo domestica), frutilla (Fraga ío moschata) , tomate (Lycopersicon, por entum) ; hojas,' tales como alfalfa (Medicago, po a), caña de azúcar {Saccharum) , repollos (ta ica olerácea) , endibia (Cichoreum, por ejemplo o (Allium, por ejemplo porrum) , lechuga (Lact ío sativa) , espinaca (Spinacia por ejemplo ol eum, por ejemplo vulgare) , maíz (Zea, por ejempl (Oryza, por ejemplo sativa) ; pastos, tales com nthus ( iscanthus , por ejemplo, giganteus) y c ra (Panicum, por ejemplo virgatum) ; árboles ta (Populus, por ejemplo trémula) , pino {Pínus) ; como algodón (por ejemplo, Gossypium hirs eulos, tales como colirrábano (Brassica, por ceae) , papa (Solanum, por ejemplo tubero ares .

La planta que contiene carbohidratos cerrados comprender una o más variedades de plantas qu bilidad genética natural que resulta en un metab on alterado. Muchas de las plantas portan mutac que codifican isoformas de síntesis de almidón gradacion de almidón. Por ejemplo, las plantas ificadas como heterocigóticas u homocigóticas pa nzimas de cierre tales como dos isomerasas de ue produce predominante isomaltulosa, y una que minantemente trehalulosa, de modo que ambos iso osa pueden acumularse, en la misma planta. La r posee una capacidad excesiva de sínt hidratos . Sin embargo, hay un "ciclo fútil" con sis de sacarosa y desintegración en caña de nte la desviación de carbohidratos en una forma olizada por la planta, estos carbohidratos narse del ciclo fútil, y la planta puede comp da produciendo más sacarosa. El hecho de que Wu visto a la isomaltulosa acumularse al mismo niv osa, sin reducir la cantidad de sacarosa, sug capacidad en exceso de la caña de azúcar para la úcar no se ha agotado. Modificando genéticamente úcar con dos o más enzimas de cierre que produc aproximadamente 125%, al menos aproximadamente aproximadamente 200%, al menos aproximadamente aproximadamente 400% o más, en comparación con dad de planta que no acumula carbohidratos cer do con los métodos de la invención.

Las enzimas de isomerasa de sacarosa que ipalmente isomaltulosa incluyen, por ejemplo, 1 de P. dispersa descrita en la Patente de los s No. 7.250.282, que se incorpora en la present eferencia en su totalidad. Otras enzimas que ipalmente trehalulosa incluyen, por ejemplo, la osca blanca caracterizada por Salvucci (200 em. Physiol. B 135:385-395. Si bien no está lim na teoría, la enzima de la mosca blanca puede re sa de trehalulosa de enzima de cierre.

Objetivo subcelular as de endospermo de maíz. Alternativamente, diri asto es otra forma de lograr la conversión de sa res cerradas tales como almidón o isomaltu as tales como maíz, la sacarosa se acumula en l ansportada a la espiga durante el rellenado de g roporciona un sumidero de carbono.

En una modalidad, la enzima de cierre se d plasto, donde el carbohidrato cerrado puede acum zima llave (cuando se expresa en la misma pi e al apoplasto. Puede dirigirse la enzima asto utilizando, por ejemplo, la secuencia nal de gamma zeína de maíz, que confiere un ífico de apoplastos de proteínas. La enzima d estar dirigida al amiloplasto, por ejemplo, n con el péptido que está dirigido a amiloplast gen et al., 1986) o a un gránulo de almidón. Por cto con su sustrato mediante el proceso de ración física de la integridad celular) o calent as o tejidos vegetales para alterar la integrida s células vegetales u órganos que contengan la jemplo, la enzima llave puede estar dirigida al retículo endoplasmático de forma tal que no cto con el carbohidrato cerrado en el amilopl o del grano afectará la integridad del grano y 1 se pondrá entonces en contacto con los grá on. De este modo, pueden evitarse los potenciale ivos de la localización conjunta de una enzi hidrato cerrado.

Carbohidratos cerrados como marcadores seleccion La transformación vegetal requiere el uso dores seleccionables positivos para la identifi gación de tejido transformado y la eliminación itutiva del transgén. Además, el uso del produc do como marcador seleccionable puede reducir el que deben transferirse a la planta. Esto red o del ADN-T necesario para la transformación y s a producción de "pilas moleculares" en las cu genes se desean en una única planta transgé , se elimina la necesidad de un gen cionable externo tal como PMI , o genes resis ióticos que son necesarios para la producción d génicas, pero ya no son útiles para la planta d ransformación/selección. Sin embargo, se conte ples marcadores seleccionables pueden utilizars os de la invención, incluidos aquellos u menté para selección.

En una modalidad, una enzima alfa-1 , 6 -glucosida zarse para escindir el enlace alfa-1 , 6-glucosid ica la enzima. Las secuencias de ácido ólogas pueden estar presentes en los constructos es de expresión. "Cassette de expresión", tal za en la presente, significa una molécula ÍCO capaz de dirigir la expresión de una secu ótidos particular en una célula hospedera apropi ende un promotor operativamente ligado a la sec ótidos heteróloga de interés (es decir, enzima llave) que está operativamente ligada a las se nación. También comprende generalmente s arias para la traducción apropiada de la secu ótidos. El cassette de expresión que comprende 1 ierre y/o enzima llave puede ser quimérico, fica que al menos uno de sus componentes es h respecto a al menos uno de sus otros compone tte de expresión también puede ser uno que sea pa particular de desarrollo.

El cassette de expresión puede comprender opci egión de terminación transcripcional y translaci , región de terminación) funcional en plantas. E idades, el cassette de expresión comprende dor selecciónatele que permite la selec formantes estables. Los constructos de expresi ción también pueden comprender una secuencia l ecuencia que permita la expresión de la enzima ve. Ver Guo et al. (2003) Plant J. 34:383-92 y (2003) Plant J. 36:731-40 para ver ejemplos de s ermiten una expresión inducible.

Las secuencias reguladoras del constructo de operativamente ligadas a la secuencia de ácido codifica la enzima de cierre y/o llave. "Opera a" significa un enlace funcional entre una n no estar directamente ligadas.

Promotor Cualquier promotor capaz de conducir la expresi a de interés puede utilizarse en la práctic ción. El promotor puede ser nativo o análogo o ólogo al hospedero vegetal . Los términos "heter eno" , cuando se utilizan en la presente para re ecuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, una N o AR ) o un gen, se refieren a una secuenci na de una fuente ajena a la célula hospedera p i proviene de la misma fuente, se modifica nal . De este modo, un gen heterólogo en un dera incluye un gen que es endógeno para l dera particular pero que no se ha modific ío, mediante el uso de transposición de ADN. Los én incluyen copias múltiples no naturales presión y expresión preferencial celular o tisú ío, cuando se desea la expresión en tejidos u íficos, pueden utilizarse promotores específ os. Por el contrario, cuando se desea la expresi n respuesta a un estímulo, promotores inducibles ntos reguladores de elección. Cuando se d sión continua en todas las células de una pí zan promotores constitutivos. Es una cuestión un experto en la técnica modular la expresió ncía seleccionando adecuadamente y pos tores y otras regiones reguladoras relativa ncía .

Se han descrito una serie de promotores veget s características de expresión. Ejemplos de tores constitutivos que se han descrito inc a de arroz 1 (Wang et ! al., Mol. Cell. Biol . , secuencias potenciadoras . Los promotores que di sión directa específica o mejorada en dét os vegetales serán conocidos para los experto ca a la luz de la presente divulgación. Estos jemplo, el promotor rbcS, específico para teji romotores oes, nos y smas que tiejien mayor acti aíces o tejido de hoja dañada; un promotor 35S a +8) que dirige la expresión mejorada en las r -tubulina que dirige la expresión en raíces y p ados de genes de proteína de almacenamiento de en la expresión en endospermo.

La expresión específica de tejidos puede onalmente introduciendo un gen itutivamente (todos los tejidos) en combinació ntisentido que se expresa solamente en aquello no se desea el producto del gen. te el desarrollo de embriones (tales como Bce4 , ío, EP 255378 y ridl et al., Seed Science (1991) ) . Ejemplos de promotores específicos de e han descrito incluyen la lectina (Vodkin, Pro Res., 138;87 (1983); Lindstrom et al., Der. 0 (1990) ) , deshidrogenasa de alcohol de maíz 1 EMBO J., 11:157 (1989);; Dennis et al., Nucle 12:3983 (1984)), complejo de cosecha leve son, 1986; Bansal et al., Proc. Nati. Acad. S 54 (1992)), proteína de shock de calor de maíz ( Nature, 313: 810 ( 1985 ) ) , ; carboxilasa RuBP de ña de arveja ( (Poulsen et al., Mol. Gen. Genet. ) ) ; Sintasa de manopina de plásmido Ti ( (Lang Cell 34:1015 (1989)), Sintasa de nopalina de pl gridge et al., Cell 34:1015 (1989)), calcona iso ia (vanTunen et al., EMBO J., 7; 1257 (1988)), Genetics, 129:863 (1991)), -tubulin, cab (Sul Mol. Gen. Genet . , 215:431 (1989)), PEPCasa ( (Huc Plant Mo. Bio., 12:579 (1989)), promotores asoc mplejo de genes R (Chandler et al . , Plant Cell ) ) , y promotores de calcona sintasa (Franken et 0:2605 (1991)). Es particularmente útil para la ífica de semillas, el promotor de vicilina d o et al., Mol. Gen. Genet., 235:33 (1992). (Ve atente de los Estados Unidos No. 5.625.136, pora a la presente a modo de referencia. tores útiles para expresión en hojas maduras son se cambian al comienzo de la senescencia, tal tor SAG de Aradibopsis (Gan et al., Science, ) .

En diversas modalidades, la enzima de cierre y/o a en el fruto de la planta. Una clase de p ., Gen. Genet., 200:356 (1985), Slater et al., P , 5:137 (1985)). El promotor del gen de poligala activo en la maduración de frutos. El alacturonasa se describe en la Patente de los s No. 4.535.060, Patente de los Estados Un .061, Patente de los Estados Unidos No. 4.80 te de los Estados Unidos No. 5.107.065 gaciones de incorporan a la presente a encia. El promotor E8 específico de frutos se de an et al. (1988, E BO J. 2: 3315-3320) y Della (1989, Plant Cell 1: 53-63). En otra modalidad zarse promotores que expresan selectivamente s icadoras en tejidos de almacenamiento de sacaro tallos de caña de azúcar y tubérculos de rera) . Por ejemplo, promotores específicos s maduros de caña de azúcar se describen se utilizan en la presente, se refieren a s u órganos que al momento de la cosecha c o orgánico que ha ingresado a las células por e neto en una forma diferente a dióxido de carbon as, los tejidos sumidero incluyen todos los te intéticos, así como también los tejidos fotos na entrada de flujo neto de carbono orgánico fi células fotosintéticas o, de otro modo, obten o entorno circundante por medios diferent ión directa de dióxido de carbono.

Otros ejemplos de promotores específicos, de yen aquellos que dirigen la expresión en células de que la hoja haya sido dañada (por ejem tos masticadores) , en tubérculos (por ejemplo, en de patatina) , y en células de fibras (un ej roteína celular de fibra regulada durante el d ol. Plant Mol. Biol . , 48:89 (1997). Los ejemplos ma represor de tetraciclina, sistema represor mas inducibles por cobre, sistemas inducib ilato (tal como el sistema PRla) , sistemas induc corticoides (Aoyama T. et al. al., N--H Plant 5 (1997)) y sistemas inducibles por ecdison tores inducibles incluyen promotores inducibles r, el promotor del gen de la proteína de unión ob et al., Plant J. , 4:423 (1993)), el promotor icosil-transferasa flavonoide de UDP glucosa (R Genetics, 119:185 (1988)), el promotor de inhi roteinasa (Cordero et al., Plant J. , 6:141 (1994 tor del gen de gliceraldehído-3 - fosfato deshi er et al., Plant Mol. Biol., 29;1293 (1995); Q J. Mol. Evol . , 29:412 (1989); Martínez et al., , 208:551 (1989)). También se incluyen los ocarboxipeptidasa se ha reportado en hojas de pi heridas (Graham et al., Biochem. Biophys . Res 164 (1981) ) . Se ha informado que otros genes inducidos por metil jasmonato, inductores, es , estrés anaeróbico o protectores herbicidas.

Preferiblemente, en el caso de un organismo mult romotor también puede ser específico para un o o etapa particular de desarrollo. Ejemplos tores incluyen, a modo no taxativo, el promotor e maíz Zea y el promotor de gamma zeína de maíz tor de globulina de maíz Zea.

La expresión de un gen en una planta transgéni rse solamente en un determinado período du rollo de la planta. Los tiempos de desarrol entemente correlacionados con la expresión íficos de te idos. Para el ajuste de la expr anamente en el desarrollo, seguido de altos ni osa en etapas posteriores (Schaffer et al. chemistry 26: 1883-1887). En endospermo de rollo, la concentración de sacarosa aumenta de después de la polinización y luego disminuye más 28 días después de la polinización (Tsai et al Phys . 46: 299-306). Adicionalmente , la concent osa en semilla de soja cambia significativament sarrollo a medida que el contenido sacáridos de ta considerablemente/ 53 días después de la i, 1977, Phytochemistry 16: 529-532). En se a, el contenido de sacarosa baja significativa sarrollo continuo (Holl y Vose, Can. 1980, J. P 1109-1114) . Estos ejemplos ilustran que se dese ole el tiempo de la selección de promotor para ífica de un gen enzimático para aprovechar las ierre y/o llave de la presente invención pued tivamente ligadas a las secuencias de polinucleó ican las señales de localización o secuencia señ mo N o C de un polipéptido) , por ejemplo, para nzima a un compartimiento particular dentro de l íos de los objetivos incluyen, a modo no taxa la, retículo endoplasmático, cloroplasto, ami lo de almidón o pared celular, o a un tejido pa ejemplo, semilla. La expresión de un polinucleó ica una enzima de cierre y/o llave que. t ncía señal en una planta, en particular, conj el uso de un promotor específico de tejido o i proporcionar altos niveles de enzima localiza a. Las secuencias -dirigidas o de señal pueden u localizar una enzima de cierre o llave de form nzima no entre en contacto con un sustrato e o de las células de una planta transgénica para roteína al entorno extracelular . Esto general rá uniendo la secuencia de ADN que codifica una ptidos de tránsito o señal a la secuencia codifi en particular. El péptido de tránsito o tante transportará la proteína a un destino p celular o extracelular, respectivamente, y lú nado postraslacionalmente . Los péptidos de tráns actúan facilitando el transporte de proteínas mbranas intracelulares , por ejemplo, vacuola, anas de plástidos y mitocondriales , mientras dos de señal dirigen a las proteínas a travé ana extracelular.

Se conoce que numerosas secuencias de señal in expresión u objetivo de un polinucleótido rtimiento particular o fuera de un compa estar dirigida al amiloplasto, por ejemplo, n con el péptido que está dirigido a amiloplasto gen et al., Mol Gen Genet 203: 237-2441986) IO de almidón. Por ejemplo, el polinucleót ica la enzima de cierre puede estar operativamen ptido de tránsito de cloroplastos (amiloplastos) minio desunión de almidón, por ejemplo, del ge nativamente , la secuencia de péptidos de tránsit l 1_ (Btlts, Sullivan y Kaneko, Planta 196: ) ) puede utilizarse para dirigirse a amilopla modalidades, el contenido total de carbohidrato o el contenido de carbohidratos endógenos de ero se aumenta dirigiendo la enzima metaboliz hidratos a un compartimiento subcelular utiliz enamiento de carbohidratos en las células veget ío, vacuola o espacio apoplásmico) . ciadores Se ha encontrado que numerosas secuencias me sión de genes desde dentro de la unidad transcri secuencias pueden utilizarse conjuntamente con sta invención para aumentar su expresión en génicas .

Se ha demostrado que diversas secuencias de an la expresión. Por ejemplo, se ha encontrado nes del gen Adhl de maíz mejoran considerable sión del gen tipo silvestre bajo su promotor o se introducen en células de maíz . Se encontr n 1 era particularmente efectivo y mejoraba la onstructos de fusión con el gen de acetiltransf nfenicol (Callis et al., Genes Develop. 1: )). En el mismo sistema experimental, el intrón aíz de bronce 1 tuvo un efecto similar en la e et al. Nucí. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); . Plant Molec. Biol . 15: 65-79 (1990)). Otras s conocidas en la técnica incluyen a modo no es de picomavirus, por ejemplo, líder de EMCV ( icadora 51 de encefalomiocarditis 5') (Elroy-St t, T. R., y Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130 es de potivirus, por ejemplo, líder de TEV (V do de Tabaco) (Allison et al., Virology 1 )); líder de MDMV (Virus del Mosaico Enanizante ogy 154:9-20); líder de la proteína de unión a de inmunoglobulina humana (BiP) , (Macejak, , P., Nature 353: 90-94 (1991); líder no tradu de la proteína de recubrimiento del virus del m fa (AMV ARN 4), (Jobling, S. A., y Gehrke, L. 22-625 (1987) ; líder del .virus del mosaico d , (Gallie, D. R. et al., Molecular Biology uencias de nucleótidos localizadas antes (secue icantes 5'), en o después (secuencias no codific una .secuencia codificante, y que incluyen cripción, procesamiento o estabilidad de ARN o t la secuencia codificante asociada. Las s adoras incluyen potenciadores , promotores, s de traducción, intrones y secuencias de denilación. Estas incluyen secuencias natu ticas así como también secuencias que son una co cuencias sintéticas y naturales.

Una variedad de terminadores transcripciona nible para utilizar en casetes de expresi nsables de la finalización de la transcripción a poliadenilación de ARNm correcta y de trang n de finalización puede ser nativa con la r ación transcripcional , puede ser nativa con la s, puede utilizarse un terminador de transcripci en .

Marcadores seleccionables Generalmente, el cassette de expresión comprende dor selecciónatele para selección de formadas. Los genes marcadores seleccionables se la selección de células o tejidos transforma dores seleccionables también pueden utilizars nte invención para permitir la selección de formadas y tejido vegetal, como se conoce bi ca. Uno puede desear emplear un gen cionable o evaluable como, o además de, el gen d sable. "Genes marcadores" son genes que imp ipo distinto a células que expresan el gen marc odo permiten que las células transformadas se élulas que no tienen el marcador. Los gene En una modalidad, tanto las enzimas de cierre as llave se expresan en la misma planta, y la enzima llave se utiliza como un marcador selec ejemplo, el sistema de selección se basa en la alfa-1 , 6 -glucosidasa en una planta que ltulosa. En el sistema es necesario un me tegrar la isomaltulosa en un sustrato para ferm de proporcionarse en forma de caña de azúcar, rera, etc. plantas diseñadas para expresar una sidasa (isomaltulasa, palatinasa, etc) . El dor seleccionable sería útil en la evalua sión de alto nivel de alfa-1, 6-glucosidasa d s más tempranas de la transformación vegetal, es para identificar eventos de integración que son ente expresados y resistentes al silenciamiento én, este sistema podría utilizarse para selecció acción de anticuerpos, o incluso enzimas secreta n detectarse mediante su actividad catalíti inas secretables están incluidas en una serie de idas proteínas detectables difusibles pequeñ ío mediante ELISA; enzimas activas pequeñas de solución extracelular (por ejemplo, ß-l notricina„acetiltransferasa) ; y proteínas que se rapan en la pared celular (por ejemplo, prote yen una secuencia líder tales como las que se e unidad de expresión de extensina o tabaco PR-S) .

Con respecto a los marcadores secretables selecc o de un gen que codifica una proteína que es se pared celular, la cual incluye un epítopo únic comprendido en la presente . El marcador de tado emplearía idealmente una secuencia epí rcionaría bajos antecedentes en tejido vege nos de biología molecular, expresión y estru ína. Sin embargo, cualquiera de una variedad de red ricas en extensinas y/o glicina (Keller et al, 8:1309 (1989)) podría modificarse mediante l sitio antigénico para crear un marcador evaluab Marcadores seleccionables posibles para útil ión con la presente invención incluyen, a ivo, un gen neo o nptll (Potrykus et al., M ., 199:183 (1985)) que codifica la resist icina y puede seleccionarse para utilizar ka y similares; un gen bar que confiere resisten notricina herbicida; un gen que codifica una pr sintasa alterada (Hinchee et al., Biotech., 6:91 confiere de ese modo resistencia al glifosato; lasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que tencia a la bromoxinila (Stalker et al., Science micina antibiótica; el gen manosa-6-fosfato isom ambién se hace referencia en la presente com rasa de fosfomanosa) , el cual proporciona la cap olizar mañosa (Patentes de los Estados Uni .378 y 5.994.629). Un experto en la técnica es cionar un gen marcador seleccionable adecu zar en la presente invención.

Una modalidad ilustrativa de un gen cionable capaz de utilizarse en sistemas para se formantes son los genes que codifican la e notricinacetiltransferasa, tal como el gen tomyces hygroscopicus o el gen pat de Str ochromogenes . La enzima fosfinotricinacetiltr inactiva el ingrediente activo en el bialafos h notricina (PPT) . PPT inhibe la sintetasa de g kami et al., Mol. Gen. Genet . , 205:42 (1986); e- obtienen de especies de Streptomyces (por ejem 1.705) . Se ha descrito la clonación del gen bar ., Mol. Gen. Genet . , 205:42 (1986); Thompson et al , 6:2519 (1987)) dado que tienen el uso del ge ntexto de plantas que no sean monocotiledóneas ( ., EMBO Journal, 6:2513 (1987); De Block et al ol. , 91:694 (1989) ) .

Marcadores evaluables que pueden emplearse inc no taxativo, un gen de ß-glucuronidasa o uidA ( ica una enzima por la cual se conocen varios génicos; un gen locus R que codifica un prod a la producción de pigmentos de. antocianina (co ejidos vegetales (Dellaporta et al . , en C ture and Function, pp . 263-282 (1988)); un masa (Sutcliffe, PNAS USA, 75:3737 (1978)) que enzima para la cual se conocen varios (Ow et al., Science, 234:856 (1986)), que pe ción de bioluminiscencia; o un gen de aequorina ., Biochem. Biophys. Res. Comm. , 126:1259 (198 emplearse en detección de bioluminiscencia sen o, o un gen de proteína fluorescente verde (Nied Cell Reports, 14: 403 (1995)).

Se contempla que los genes del complejo de ge son particularmente útiles como marcadores evalú ejo de genes R en maíz codifica una proteína regular la producción de pigmentos de antociani ía de los tejidos de semillas y plantas. Un ejo de genes R es adecuado para transformación o a que la expresión de este gen en células tran ña a las células. De este modo, un gen R intro élulas causará la expresión de un pigmento rojo pora de forma estable, puede marcarse visualment dor evaluable adicional contemplado para utiliz nte invención es la luciferasa de luciérnaga, c el gen lux. La presencia del gen lux en formadas puede ser detectada utilizando, por ula de rayos X, conteo de centelleo, espectrof escente, cámaras de video de luz baja, cámaras toñes o luminometría de múltiples pocilios. Ta que este sistema puede desarrollarse para e cional de bioluminiscencia, tal como sobre p vo de tejido, o incluso para evaluación de as .

Rasgos agronómicos adicionales Las plantas divulgadas en la presente tambié ir uno o más rasgos agronómicos que son principa icio para una compañía de semillas, un produ sador de granos, por ejemplo, resistencia a he sgo de interés (por ejemplo, gen marcador selec de capa de semilla, etc.) . Diversos rasgos de omo también métodos para introducir estos rasgo a, se describen, por ejemplo en la Patente de lo s Nos. 5.569.823; 5.304.730; 5.495.071; 6 .431; 5.767.366; 5.928.937; 4.761.373; 5 .374; 5.162.602; 4.940.835; 4.769.061; 5 .903. 5.276.268; 5.561.236; 4.810.648; y 6.084.1 itud europea No. 0 242 246; en la Solicitud de P Estados Unidos No. 20010016956; y en ifesci . sussex. ac . uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ . formacion vegetal Una vez que una secuencia de ácidos nucle ica la enzima de cierre y/o llave se ha clona ma de expresión, se transforma en una célula ve ra "planta" se refiere a cualquier cia genéticamente estable. Se hace referenci as hospedero que contienen fragmentos de ácido formados como células "transgénicas" y se hace r S organismos que comprenden células transgéni nismos transgénicos" .

Los ejemplos de métodos de transformación de p as vegetales incluyen transformación medi acterium (De Blaere et al., 1987) y tecno rdeo de partículas (Klein et al. 1987; Patent os Unidos No. 4.945.050.). Las plantas entera erarse a partir de células transgénicas mediant conocidos por los expertos en la técnica ( ío, Fromm et al., 1990).

Los casetes de expresión de la presente invenci ducirse en la célula vegetal de una serie d ocidas en la técnica. La expresión "introducció Por consiguiente, estos polinucleótidos ducirse en la célula hospedera de interés en o de transformación, en eventos de trans ados o, por ejemplo, en plantas, como part COIO de reproducción. Los métodos de la inve den de un método particular para introducir u ucleótidos en una planta, solamente q ucleótidos obtengan acceso al interior de al m a de la planta. Los métodos de introduc ucleótidos en plantas se conocen bien en la t yen, a modo no taxativo, métodos de trans itoria, métodos de transformación estable y dos por virus.

"Transformación transitoria" en el contexto ucleótido significa que un polinucleótido se int anta y no se integra dentro del genoma de la pla ser heredado por la progenie del mis cularmente, por la progenie de múltiples gene ivas.

Numerosos vectores de transformación disponib formación vegetal son conocidos por los expert ca de transformación vegetal, y los genes perti invención pueden utilizarse conjuntamente con c os vectores . La selección de vector depender ca de transformación preferida y las especies transformación. Para determinadas especies n preferirse diferentes marcadores de ióticos o herbicidas como se describe en cualqu en la presente.

Los métodos de regeneración de plantas transfor en bien en la técnica. Por ejemplo, se han res plástnido Ti para la administración de ADN aj zando Agrobacterium tumefaciens . Estos gen n al menos una secuencia borde ADN-T e incluyen como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids Res. (1984)). rucción de vectores útiles en la transform acterium, ver por ejemplo, la Publicación de te de los Estados Unidos No. 2006/0260011, pora en la presente a modo de referencia.

La transformación sin el uso de Agrobac erium tu el requerimiento de que secuencias de ADN-T en ansformación elegido, y por consiguiente, tambi zarse vectores que carecen de estas secuenc cas de transformación que no dependen de Agro yen la transformación por medio de bomba culas, captación de protoplastos (por ejemplo roporación) y microinyección . La elección d de ampliamente de la selección preferida de la da por PEG o electroporación, administración me rdeo de partículas o microinyección . Ejemplos cas se describen en Paszkowski et al., EMBO J. (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet . 199: ), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 ( et al., Nature 327: 70-73 (1987). En cada as transformadas son regeneradas en plantas zando técnicas estándar conocidas en la técnica.

La transformación mediada por Agrobacterium ca preferida para la transformación de dicot o a su alta eficiencia de transformación y s dad con muchas especies diferentes. La transfor acterium generalmente implica transferir el io que porta el ADN ajeno de interés a acterium apropiada que puede depender del compl verdes portados por la cepa Agrobacterium hos en & Willmitzer, Nucí. Acids Res. 16: 9877 (1988) La transformación de la especie vegetal objetivo acterium generalmente implica el co-cult acterium que se explanta de la planta y sigue p e conocen bien en la técnica. El te ido transf era sobre un medio seleccionable que porta el esistencia a antibióticos o herbicidas presente s de ADN-t plásmido binario.

Otro abordaje para transformar células vegetale ue implica propulsar partículas inertes o bioló as en tejidos y células vegetales. Esta té ga en la Patente de los Estados Unidos Nos . 4 .006. y 5.100.792. Generalmente, este proc ca propulsar partículas inertes o biológicament as células en condiciones efectivas para pen ficie externa de la célula y permite la inco el tejido celular vegetal.

La transformación de la mayoría de las otiledóneas también se ha convertido en rut cas preferidas incluyen la transferencia directa otoplastos utilizando técnicas de PEG o electro ombardeo de partículas en tejido callo formaciones pueden realizarse con una única es múltiples especies (es decir, cotransformación) écnicas son adecuadas para utilizar con esta i otransformación puede tener la ventaja de e rucción completa del vector y de generar génicas con locus no ligados para el gen de inte dor seleccionable, permitiendo la eliminac dor seleccionable en generaciones posteriores, deseable .

Las Solicitudes de Patente EP 0 292 435, EP 0 3 echnology 11: 194-200 (1993)) describen técnicas formación de líneas consanguíneas élite de maíz rdeo de partículas. Esta técnica utiliza embr inmaduros de 1,5-2,5 mm de largo eliminado de un íz 14-15 días después de la polinización y un dis OOOHe Biolistics para bombardeo.

Las plantas obtenidas por medio de la transforma secuencia de ácidos nucleicos de la presente i n ser cualquiera de una variedad de especies v idas aquellas de monocotiledóneas y dicotiledón go, las plantas utilizadas en el método de la eleccionan preferiblemente de la lista de ivo agronómicamente importantes indicadas más ar sión de un gen de la presente invención en co otras características importantes para la prod ad pueden incorporarse en líneas vegetales a tra itative Genetics and Selection Plant Breeding, W er and Co. , Berlín (1986) .

Las propiedades genéticas diseñadas en las set as transgénicas descritas anteriormente se t nte reproducción sexual o crecimiento vegetativo pueden mantenerse y propagarse en plantas aímente, el mantenimiento y la propagación hace os agrícolas conocidos desarrollados para cum específicos tal como labranza, siembra o cosech Las enzimas de cierre y/o llave divulgadas en la én pueden incorporarse en o mantenerse en ales a través de reproducción o a través de te iseño genético comunes. Los abordajes y téc ducción se conocen bien en la técnica. Ver, por J. R. , Fundamentáis of Plant Genetics and Breed S Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D. guinidad dihaploide, mezcla de variedad, hibr específica, técnicas aneuploides, etc. Las téc dización también incluyen la esterilización de proporcionar plantas estériles masculinas o nte medios mecánicos, genéticos (incluidos trans cos o bioquímicos .

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de il modo no taxativo.

ON EXPERIMENTAL DN recombinante estándar y las técnicas de ular utilizadas en la presente se conocen bi ca y son descritas por J. Sambrook, E. F. Frit tis, Molecular Cloning: A Laboratory manual, la Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ilhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, Experime Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Col secuencia de codificación dentro de un marco de omotor T7lac inducible. Las secuencias de polinu codifican enzimas específicas se generaron med cción inversa de la secuencia de polipéptido a utilizando la preferencia de codón por E. c idos de expresión se introdujeron en una sión de E. coli, BL21 Star (DE3) (Invitrog dos de E. coli recombinantes que contenían el sión pET24b modificado se seleccionaron sobre dar que contenía 50 ug/mL de kanamicina.

Los aislados de E. coli recombinantes se culti ción a 37°C durante 8 horas hasta toda la noche dio LB que contenían 50 ug/mL de kanamicina. Los vo de E. coli se transfirieron a 1 L de m nducción (9,57 g de triptón, 4,8 g de ext ura, 2 mi de MgS04 1 M, ; 1 mL de 1000X metales durante toda la noche. Las células de E. varon fuera de los medios de autoinducción ifugación a lO.OOOXg durante 15 minutos y las ectadas se congelaron a -80°C. somerasa de sacarosa (E.C. 5.4.99.11) La secuencia de aminoácidos para isomerasa de sada por Erwinia carotovora ha sido incluida en l número de acceso YP049947 (SEQ ID NO: 14) . La minoácidos de esta isomerasa de sacarosa se samente en una secuencia de codificac ucleótidos utilizando la preferencia de codón La secuencia de polinucleótidos se generó sis de genes (GeneArt) y se clonó en el v sión pET24b (Novagen) utilizando sitios de re olocan la secuencia codificante en un marco pos romotor T71ac inducible. El plásmido de expr gen) que contienen lisozima (1KU/1 mL BugB nasa (25 unidades/1 mL de BugBuster) seg ación durante 10 min sobre una plataforma de a liminaron los desechos insolubles por centrifu OXg durante 20 min a 4°C. El sobrenadante que ina soluble total y la enzima recombinante se t tubo Eppendorf de 1,5 mL nuevo y se almacenaron y -20°C para mayor caracterización.

La actividad enzimática de isomerasa de sac ? combinando la enzima con el sustrato, sa ndo la producción de isomaltulosa y trehalulos ína soluble total de E. coli recombinante se e idad de isomerasa de sacarosa incubando 10 micro E. coli de sobrenadante, como se describe anter 0 microlitros de 292 mM de sacarosa y 50 mM de iguadora de fosfato de sodio (pH 6,0) a 30 °C du stia en 4 mililitros de anilina, 4 g de difenila itros de acetona y 30 mililitros de ácido fosf La isomaltulosa y trehalulosa se distinguieron res, tales como sacarosa, por su movilidad relati istintos colores producidos cuando reaccionan c anilina. Amarillo verdoso indica la prese ltulosa, rojo indica la presencia de treha n/negro indica la presencia de sacaros acáridos, glucosa y fructosa, producidos lisis de sacarosa fueron azules o roj ctivamente .

La identificación de los azúcares presentes en c a placa de TLC desarrollada fue posible compa idad relativa de los azúcares presentes en las m olor de tinción con tinte de anilina con la iva y el color de tinción de estándares de az con migración más lenta tuvo una coloración roj entamente, que los estándares de isomaltulosa o vilidad relativa de esta banda de azúcar se co con los informes publicado sobre la migr lulosa en ensayos de TLC (Cho et al. Biot rs (2007) 29:453-458; un microorganismo prod ltulosa aislado de alimento coreano tradicional. , esta banda de azúcar resultó ser trehalulosa. dar de trehalulosa disponible en el momento del Sin embargo, el análisis de HPLC (Dionex) post ctos y estándares de reacción de isomerasa de idos más tarde indican que esta banda era defini lulosa. También es importante destacar que el pr ión no contenía sacarosa con una movilidad relat isomaltulosa y trehalulosa y movilidad más lent sa y fructosa y monosacáridos . Se esperaba rasa de sacarosa etiquetada con His (SEQ ID NO: 14 Los granulados celulares BL21 [DE3] recombina san isomerasa de sacarosa etiquetada con His (SE e generaron básicamente como se describe en el os granulados celulares BL21 recombinantes se un volumen de 40 mL en solución amortigu cción (50 mM de fosfato de sodio, 500 mM de NaC midazol, pH 8 que contenía inhibidores de rimidos inhibidores de proteasa libre de EDTA che) ) . Las células se lisaron por 2 pasajes a t Prensa FRENCH (Thermo IEC) . El lisado cel ifugó durante 30 minutos a lO.OOOXg a nadante se filtró utilizando dispositivos de f de 0,45 micrones (Millipore) para generar u ado. Una columna HisTrap FF de 5 mi (GE Healt ibró con solución amortiguadora de extracción. tando un gradiente lineal de NaCl de 50 mM de a 50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, pH 8 por e L. La isomerasa de sacarosa activa se detectó en nuo y las fracciones eluyeron a aproximadamente Estas fracciones se agruparon y se concentrar oncentración de proteína final de 0,8 mg/mL. Las partieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

La actividad de la enzima isomerasa de sacarosa s muestras combinando isomerasa de sacarosa e is de 6 ug/mL, 70 mM de solución amortiguadora d trato 0,1 M, pH 6 y 584 mM de sacarosa a 30°C . La muestra se analizó mediante Dionex básicam scribe en el Ejemplo 1G. La tabla 1 presenta la omerasa de sacarosa detectada en las células de binantes que expresan isomerasa de sacarosa (SE La actividad es demostrada por la acumulació nzima dextransacarasa (E.C. 2.4.1.5) Las dextransacarasas (E.C. 2.4.1.5) son siltransferasas capaces de transferir glucosa ula de sacarosa para formar homopolímeros de idos como dextranos. Este tipo de reacción enzi emplo de transglicosilación . El dextrano está ipalmente de enlaces .1,6 alfa D glucosa ble. El dextrano también puede contener una var es 1,4 alfa D glucosa que formar puntos de ram a molécula de dextrano. Estos puntos de ram n un impacto directo en las propiedades fisic como solubilidad) de las moléculas de dext ará la secuencia de polinucleótidos que codi a de dextransacarasa que utiliza la preferencia coli. Esta secuencia de polinucleótidos se sin rá en un vector de expresión y se expresará en sión. Los ensayos de actividad enzimát ansacarasa serán validados comparando la acti ansacarasa recuperada de E coli recombinante a dextransacarasa disponible comercialmente .

La actividad de dextransacarasa se medirá utili de caña de azúcar como fuente de sacar ansacarasas seleccionadas que expresaron E arán de manera similar a como se describe anter la sacarosa será reemplazada por jugo de caña sustrato. Estos experimentos se diseñarán para e idad de las enzimas expresadas para producir de r de sacarosa en presencia de otras proteínas y c nocidos que se hallan en el jugo de caña de azúca Una dextransacarasa mutante ha sido caracteri uth et al. Biochemistry 47: 6678-6684 (2008) q tividad de la enzima de 1 forma tal que puede cat ibe en el Ejemplo 1A. Los granulados celulares c levaron hasta un volumen de 30-40 mL en iguadora de extracción (50 mM de fosfato de sodi Cl, 10 mM de Imidazol, pH 7,2 que contenía inhibi asa (comprimidos inhibidores de proteasa libre etos de Roche) ) . Las células se lisaron me es a través de una Prensa FRENCH (Thermo IEC) . ar se centrifugó durante 30 minutos a lO.OOOXg a nadantes se filtraron utilizando dispositivos d acío de 0,45 micrones (Millipore) . Se equil na de 5 mi HisTrap FF (GE Healthcare) con iguadora de extracción y los lisados acla ron a 5 mL/min. Las enzimas etiquetadas con His ron en 50 mM de fosfato de sodio, 500 mM de N nían 300 mM de imidazol, pH 7,2. Todas las mue ieron a intercambio de solución amortiguadora en to de sodio, 500 mM de NaCl, que contenía 5 zol, pH 7,2.

La dextransacarasa etiquetada con His con acti sa de leucrosa se diluyó hasta 0,1 mg/mL en , 40 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,2 - las r 0 ul se configuraron para la sintasa de leucr go negativo con las siguientes condiciones: #1 #2 Muestra (0,1 mg/ml) 10 10 Solución amortiguadora (200 mM de Solución amortiguradora de Sorensen + 500 mM de CaC12 , pH 7) 60, 8 60, 8 2 M de Sacarosa 14, 6 14, 6 2M de Fructosa 0 14, 6 res cerradas a través de la reacc licosilación . La tabla 2, que compara la muestr ra 2, demuestra que la dextransacarasa con acti sa de leucrosa tiene especificidad alterada cción de leucrosa contra la isomaltosa dependien on de fructosa como un sustrato secundario, 2. Análisis Dionex de productos de carbohi r de dextransacarasa etiquetada con His bianamente con actividad de sintasa de leuc idad enzimática indicada por el cambio en el p úcar determinada comparando las muestras recole empo 0 y el tiempo 24 horas.

Glucosa Fructosa Sacarosa Isomaltosa Isomaltulos uración (% (% total (% total (% total (% total d muestra total de de de azúcar) azúcar) de azúcar) azúcar) azúcar) ivo contiene fracciones bacterianas recolectadas ibe en el Ejemplo 1A de células que contienen u vacío. acarasa de levano, fructosiltransferasa (E.C. 2 2.4.1.99, E.C. 2.4.1.100) Sacarosa : sacarosa fructosiltransferasa (SS .99) , fructosiltransferasa de 1, 2 -ß-fructano ( .100) y sacarasa de levano (EC 2.4.1.10) son o de la clase más grande de fructosiltransfera ías de fructosiltransferasa catalizan la form años compuestos de fructosa ligada por enlaces ß ) glucósido. Las fructosiltransferasas ificarse y aislarse de fuentes vegetales, bacte cas. Estas enzimas pueden expresarse en plan lar fructanos como carbohidratos de almacenami lacion de este polisacárido (fructano) en caña isomerasa de sacarosa y análisis Dionex descri ío IB. Las modificaciones al protocolo con el tar la sensibilidad de los fructanos pueden in rollo en una solución de propanol : butanol : agua ( o de una mezcla seca de ácido fosfórico de urea 1955, Anal Chem 27:33-36). Los polímeros l osa tienen baja movilidad en el ensayo TLC y pe ubicación donde se colocan sobre la placa d e. La hidrólisis de fructanos a fructosa ión de HC1 permitirá la identificación espec osa utilizando el tinte de anilina iormente. Alternativamente, puede utilizarse uñ ructanasa para hidrolizar fructanos en fructo ca será útil para determinar que grandes polím ente fructanos dado que solamente los fruc lizarían por una enzima de fructanasa. izar la conversión de glucosa en fructosa. La ucosa (invertasa) podría expresarse en endosperm presarse en microbios. La enzima purificad zarse para producir fructanos, glucanos y altern Los productos vegetales más dulces pueden sando en plantas una combinación de enzimas que ten la acumulación de fructanos en la planta erten los fructanos directa o indirectamente en presión de invertasa (isomerasa de glucosa) en cumulan fructanos provocará un índice más alto en la planta.

La actividad de sintasa de sacarosa endógen permo creará sacarosa adicional que puede utiliz strato para adicional síntesis de fructano. lternansacarasa Alternano es un polisacárido que consiste en re tizarse, clonarse en un vector de expresión y e coli básicamente como se describe en el Ejemplo La actividad de alternansacarasa puede detect o inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) como acon et al. J. Plant Physiol 160: 765-777 (20 anos pueden hidrolizarse para formar ntables mediante la actividad de una alfa-l,6-gl a-1, 3-glucosidasa o una combinación de las dos e milosacarasa (E.C. 2.4.1.4) La amilosa o almidón es un polisacárido que co úos de glucosilo ligados por enlaces alfa- (1-4) esto de almacenamiento de carbohidratos primari en la mayoría de las plantas. Producir al as que utilizan sacarosa como su compuesto pri enamiento de carbohidratos, tales como la caña d permitir la acumulación de almidón que se co Dirigir una enzima capaz de sintetizar almidón carosa a la vacuola de células de endospermo permitir la acumulación de más almidón en el e íz dado que las enzimas naturales no producen a acuolas de células de endospermo de maíz. Puede irigir la enzima a vacuolas de endospermo cree de almidón debido a la acumulación de almidó rtimiento subcelular que normalmente no acumula nativamente , dirigirse al apoplasto es otra r la conversión de sacarosa en azúcares cerrad almidón o isomaltulosa . En plantas tales como osa se acumula en la hoja y es transportada a te el rellenado de granos que proporciona un su no. La tabla 3 presenta el contenido de azúcar d íz con y sin eliminación de la espiga. Se des o no se elimina la espiga, se acumula azúcar en Puede sintetizarse una secuencia de polinu iizada con codones para la enzima de amilosacara acharea, clonarse en un vector de expresión y e coli básicamente como se describe en el Ejemplo sacarasa etiquetada con His Las células BL21 recombinantes que expré sacarasa se generarán básicamente como se descri ío 1A. Los gránulos celulares congelados BL21 [ san amilosacarasa se recuperará de un cultivo te toda la noche en medios de inducción y se res gBuster HT (Novagen) de 3 mL que contiene inhib asa libre de EDTA completos (Roche) . Las mué arán a temperatura ambiente durante 10 min ado ocasional de las células de lisado. El lisad entrifugará a lO.OOOXg durante 10 minutos a arán 10 uL de sobrenadante en una reacción de 50 nálisis mediante HPAEC Dionex de carbohidratos La separación de carbohidratos y la detección s zando un sistema Dionex IC3000 con un automu x AS, un compartimiento de detección DC Dionex ( ométrica por pulsos (PAD) utilizando un elec ficie de oro certificado de carbohidratos hable) y un sistema de bomba Dionex SP. ación de alta resolución, se utilizó para t sis una columna de guarda Carbopac PA1 de 4x5Om s columnas analíticas Carbopac PA1 de 4x250 ciales del electrodo se fijaron en el cuádrete rbohidratos con electrodo de referencia AgCl, s ificaciones de Dionex Corporation. El sistema zó una fase móvil isocrático que consiste en 1 y 2mM de NaOAc con un tiempo de ejecución de 38 dentificación pico se basó en tiempos de ructanos pueden hidrolizarse en azúcares fermen s de la actividad catalítica de las fructana ío, la fructanasa fructanohidrolasa de 2,1-ß-? 3.2.1.7] puede hidrolizar polímeros de fru acáridos de fructosa que pueden fermentarse par l.

Puede sintetizarse una secuencia de polinu izada con codones para una enzima de fructanasa, vector de expresión y expresarse en E. coli bá se describe en el Ejemplo 1A.

La actividad de fructanasa puede estimarse incu a de fructanasa con una solución de fruc lisis de fructano por medio de la fructanasa li osa de monosacáridos que puede detectarse por T se describe anteriormente para isomerasa de plo IB) . saron en E. coli básicamente como se describ ío IB.

Se ensayó la actividad de 1 , 6 -glucosidasa mid cción de glucosa de a partir de hidrólisis de 1 , 6 -glucósido de isomaltulosa . Se agreg litros de extracto de E. coli bruto a 37 microl ión amortiguadora de reacción de isomaltulosa (1 ltulosa y 30 mM de HEPES (pH 7,5)) a 30 gr s, 50 grados, 60 grados, 70 grados u 80 °C depen zima; durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minu os. Se agregaron 20 microlitros del producto de a microplaca de 96 pocilios, luego se agreg litros de reactivo de oxidasa de glucosa tific) y la mezcla se incubó a 37°C durante 10 de esta incubación, se leyó la absorbancia zando SpectraMax plus 384. La absorbancia de las sidasa descritas por las SEQ ID NOs: 1 - 6 se ev lió que tenían actividades a temperaturas en el °C a 80°C. La figura 1 describe la actividad de sidasa medida en lisado celular total de una cep xpresa la enzima Bacillus thermoamyloliquefacien . Recuperación de la enzima etiquetada con His coli recombinante Las células de E. coli BL21 recombinantes que alfa-1 , 6-glucosidasa (SEQ ID NOs : 1, 3, 5 aron básicamente como se describe en el Ejempl lados celulares congelados que expresan enzim 1 , 6 -glucosidasa etiquetadas con His se elevar lumen de 40 mL en solución amortiguadora de e mM de fosfato de sodio, 500 mM de NaCl, 1 zol, pH 7,2-8 que contenía inhibidores de rimidos inhibidores de proteasa libre de EDTA ión amortiguadora de extracción. Los lisados aci ron a 5 mL/min. Las enzimas etiquetadas con His ron en 50 mM de fosfato de sodio, 500 mM de N ían 150-500 mM de imidazol, pH 7,2-8.

El testigo negativo fueron granulados celulares formados con un vector pET24b básicamente ibe en el Ejemplo 1A. Los granulados celulares ivos se extrajeron básicamente como se iormente por las enzimas alfa-1 , 6 -glucosidasa et is. Sin embargo, la solución amortiguadora de e solución amortiguadora de elución estaban en pH 7 Todas las muestras recolectadas a partir de la ap FF se sometieron a intercambio de iguadora en 50 mM de HEPES, 50 mM de NaC zando una columna de desalinización Bio-Rad Econ columna de desalinización HiPrep 26/10 (GE Hea recombinante" ) . Las muestras congeladas derivad na HisTrapFF se combinaron con sulfato de amonio fosfato de amonio, pH 7 a una concentración to de amonio de 1 M. Esta muestra se aplicó a un p Phenyl HP de 5 mL (GE Healthcare) . Las proteín uyeron de la columna lavando la columna con un lfato de amonio lineal sobre 100 mi de 50 m de dio, 1,5 M de sulfato de amonio, pH 7 a 50 mM de iguadora de fosfato de sodio que no contenía su o. Las fracciones que contenían la enzima se ag ncentraron utilizando un dispositivo concentrado YM-30 (Amicon) . 1 , 6 -glucosidasa de B. thurgiensis (SEQ ID NO: 3) : Se recuperó alfa- 1 , 6 -glucosidasa B. t etada con His (SEQ ID NO: 3) a partir de célul BL21 básicamente como se describe anteriormente Se recuperó alfa-1 , 6 -glucosidasa d oglucosidasius etiquetada con His (SEQ ID NO: 1) élulas de E. coli BL21 básicamente como se iormente (Ejemplo 2B "Recuperación de enzimas et is a partir de E. coli recombinante" ) . Las fracc enen enzima etiquetada con His se agruparon y 0 mM de Tris-HCl, pH 7. Esta muestra se apli na HiTrap Q HP de 5 mL (GE Healthcare) . Las s se eluyeron lavando la columna con un gradient l sobre 100 mL de 50 mM de HEPES , 10 mM de Nací de HEPES, NaCl 1 M, pH 7. Las fracciones que nzima se agruparon y se concentraron en un di ntrador Centri-prep YM-30 (Amicon) . La mezcla se olumna de exclusión HiPrep de tamaño 26/60 S-100 con 20 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, p iones que contienen la enzima se agruparon y se lfa-1 , 6 -glucosidasa de B. thermoamyloliquefacien ) : Se recuperó alfa-1 , 6-glucosidasa d oamyloliquefaciens etiquetada con His (SEQ ID r de células de E. coli BL21 básicamente como se iormente (Ejemplo 2B "Recuperación de enzimas et is a partir de E. coli recombinante" ) . Las fracc enen enzima etiquetada con His se agruparon y O mM de Tris-HCl, pH 7. Esta muestra se apli na HiTrap Q HP de 5 mL (GE Healthcare) . Las s se eluyeron lavando la columna con un gradient l sobre 100 mL de 20 mM de Tris-HCl, 50 mM de N mM de HEPES, NaCl 1 M, pH 7. Las fracciones que nzima se agruparon y se concentraron en un di ntrador Centri-prep YM-30 de 1 mL (Amicon) . La ó a una columna de exclusión HiPrep de tamaño 26 nían la enzima. idad de las enzimas llave alfa-l,6-gl etadas con His Se midió la actividad enzimática de las enzimas sidasa (SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 6) recuperadas a as de E. colí BL2. Las muestras recolectadas a squemas de purificación descritos anteriormente e diluyeron hasta 0,2 mg/mL en 50 mM de HEPES, pH 7. Las reacciones se iniciaron mezclando las n volumen igual de 100 mM de HEPES, 4 mM de' EDT 0,04%, 200 mM de isomaltulosa, pH 7. Para tes ión amortiguadora, se combinaron 100 mM de HEPES, Tween-20 al 0,04%, pH 7 con un volumen igual d somaltulosa . Las reacciones se incubaron a te a para la enzima (37, 45, o 60°C) durante 40 m rmociclador Biorad Tetrad 2 durante el tiempo a ar 3370) y se incubó durante 10 minutos a bancia a una longitud de onda de 500 nm zando un lector de placas SpectraMax 384 P es de absorbancia de las reacciones de mu rtieron en concentraciones de glucosa utili ión de una curva estándar de glucosa generada g alor de absorbancia con respecto a la conc dar de glucosa conocida. La actividad de las as alfa-1, 6 -glucosidasa se describe en la Tabla 4: Datos de la actividad de enzimas alfa-1, 6-gl ra (SEQ ID NO) Glucosa (mM) Temperatura reacción en hanolicus (6) 19,72 60 ermoglucosidasius (1) 29,16 60 go negativo 0,07 60 go . negativo únicamente de 0, 03 60 icación de enzimas llave alfa-1 , 5-glucosidasa y sidasa etiquetadas con His.

Los granulados celulares BL21[DE3] recombina san enzimas llave alfa-1 , 5-glucosidasa y sidasa etiquetadas con His se generaron básicam escribe en el Ejemplo 1A. Los granulados lados se elevaron hasta un volumen de 30-4 ión amortiguadora de extracción (50 mM de fo , 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol , pH 7,2 que idores de proteasa (comprimidos inhibidores de de EDTA completos de Roche) ) . Las células se nte 2 pasajes a través de una Prensa FRENCH (The sado celular se centrifugó durante 30 minutos a . Los sobrenadantes se filtraron utilizando dis iltro al vacío de 0,45 micrones (Millipore) . Se olumna de 5 mi HisTrap FF (GE Healthcare) equili ntraciones de proteína se estimaron por medi o de Bradford. Las muestras se almacenaron a -80° Como testigo negativo, los gránulos celulares expresan el vector pET24b vacío se procesaron ibe anteriormente, salvo que la elusión de HisTr de fosfato de sodio, 500 mM de NaCl, que conten idazol, pH 7,2. sis de actividad de enzimas llave alfa-1 , 5-gluc 1, 1-glucosidasa etiquetadas con His Extractos de enzimas etiquetadas con His se amente como se describe anteriormente y se 0,08 mg/mL en 40 mM de HEPES, 40 mM de NaCl, gl pH 7. Los ensayos de actividad enzimática se ando muestras con un volumen igual de 100 mM de e EDTA, Tween-20 al 0,04%, 200 mM de leucro as llave alfa- 1 , 5-glucosidasa (SEQ ID NOs : 30-33 ltulosa) en glucosa. Las concentraciones de gl reacciones se estimaron utilizando un ensay amente como se describe anteriormente. La nta los datos que demuestran que las enzimas sidasa y alfa-1 , 1-glucosidasa etiquetadas con as y convierten los sustratos de azúcar cerrada ntable . 5: Conversión de azúcares cerradas en glu as llave etiquetadas con His e de muestra GK24 BiGK24 HB27 HB8 ID NO) dé1 (30) (31) (32) (33) de glucosa (mM) 0,94 1, 01 0,42 1, 56 e de muestra SAM1606 Testigo ID NO:) (34) negativo ntración de 8, 67 0,46 sa (mM) Los ensayos de actividad enzimática de d orearán la tasa de isomaltosa liberada de una mo ano durante una reacción de hidrólisis. La crom de exclusión de tamaño también se emplea minar el nivel de hidrólisis de dextrano ndo la liberación de azúcares individuales.

Los ensayos se validarán utilizando una d cialmente disponible de Penicillium sp .11 (Worthington Biochemical Corporation, NJ 08 lisis de dextrano puede medirse incubando 0,1 m gramos/mL de dextrano con 1,9 mL de solución de cialmente disponible (sustrato) . La termoestabi anasas será evaluada en experimentos realizados 70 °C que son temperaturas relevantes al procesa de caña de azúcar de molino de azúcar. Los ados se optimizarán también para detección de de ceso se desplegaron, se recortaron los nudos y l ilizó (pulverizada con etanol al 70% o inmers ueador al 20% durante 20 minutos) . Se extraj s de hojas externas adicionales par exponer los ojas internas y el rollo de hojas se cortó o manejable (12-15 mm de largo) . Los nudos e i es restantes se eliminaron para exponer la re de hojas por encima del meristema apical.

Las secciones transversales del rollo de ron para formar discos de 0,5 - 1,0 mm de zando nada más que un largo de 3,0 cm del mate de hojas. Los discos de rollo de hojas se col dio MS que contenía 2-3 mg/L de 2, 4-D y se cult curidad durante 3-4 semanas. Los discos de rollo dos o separados en el momento del inicio o 2 és del inicio y las piezas resultantes se exten istración de genes utilizando el disposi istración de partículas Biolistics PDS 20 formación de caña de azúcar Los cultivos embriogénicos objetivo se prepararo istración de genes seleccionando piezas de ivo de alta calidad y precultivándolos durante medios nuevos antes de la . administración de los 2-5 horas antes de la administración de ge os objetivo se dispusieron en un patrón objeti s potenciales altamente osmóticos que contení es MS y Vitaminas B5 complementadas con 30 osa y sorbitol 0,2 M y manitol 0,2 más 2 mg/1 Para preparar ADN para bombardeo, las partícula un tamaño de 0,6 micrómetros, BioRad) se resus icerol estéril al 50% mediante agitación con vór ota de la suspensión de partículas de glicerol idual y se dejaron secar. El raacroportador se ca la de genes por encima de la pantalla de deten rdeo de embriones se realizó con una pistola 000 de helio. Se utilizó un disco de ruptura de distancia desde el disco de ruptura h portador se fijó en 8 mm con una pantalla de de m. La distancia entre la pantalla de detenci ones fue de aproximadamente 7 cm. La presión d elio se fijó en aproximadamente 1400 psi. Los ivo (cultivos embriogénicos) se bombardearon ros antes de transferirse a la oscuridad a 28° imadamente 12 horas.

Después de la recuperación, los cultivos bombar firieron a un medio de mantenimiento y se cult en la oscuridad. Después de 7 días, los rdeados se transfirieron a un medio de selecci Después de 4-5 semanas sobre medios de sele a, las colonias de callos embriogénicos sobreviv n selectivamente de los cultivos originale fieren a medios de regeneración (sales MS y vita I de sacarosa, complementados con 3-6 g/L de ma de BAP) a 28 °C en la oscuridad en cajas Flambeau Una semana más tarde, los cultivos se transfier ación iluminada para el desarrollo de brotes te 16 horas a 28°C. Después de 3-4 semanas en l egeneración, las yemas o brotes verdes vis ltivan sobre medios de elongación (sales basa inas B5, 30 g/L de sacarosa libre de hormonas) .

Los brotes regenerados se arraigaron en m zamiento (medios de MS basal) . Los cult zamiento se almacenan a 28°C bajo luz durante as antes de transferirse al invernadero y la Caña de azúcar transgénica que expresa acti ansacarasa Se optimizan las secuencias de las dextran cionadas en base a la preferencia de codon por l r. La secuencia optimizada del codon de caña de . en vectores de transformación para la transfor ña de azúcar. Un experto en la técnica puede se promotor y terminador apropiado para el ansacarasa, así como también seleccionar un cionable para la transformación de caña de azú ncías objetivo se incorporan en el constr sión para que las dextransacarasas dirijan la e rtimiento vacuolar de células de parénquima ena la sacarosa.

Las plantas de caña de azúcar transgénicas se se describe en el Ejemplo 3A. Las plantas tran tos en el Ejemplo 1C se utilizan para deter onalidad de la enzima expresada en plantas transg Generación de plantas transgénicas que anasa .

Se optimizan los codones de las dextranasas sele expresión en caña de azúcar utilizando la prefe por la caña de azúcar. La secuencia de genes co r optimizada se clona en un vector de trans ado para la transformación de la caña de az to en la técnica puede seleccionar el pr nador apropiado para la dextranasa, así como cionar un marcador seleccionable para la trans aña de azúcar. La enzima de dextranasa se d rtimiento subcelular del RE de células de p zando las secuencias objetivo apropiadas. La e anasa se dirige fuera del compartimie de azúcar3D: Expresión transitoria en hojas de acha azucarera Los casetes de expresión descritos en el Ejemp ron en un vector binario o un vector binario que én un origen de replicacion a partir de BCTV, uillado de las hojas de remolacha, (SEQ ID NO: res binarios con el origen de replicacion a parti ansfirieron en una cepa Agrobacterium tumefacien zando el método de congelado-descongelado (An y vector. En: Gelvin SB, Schilproot RA (eds ular biology - manual . Kluwar Academic Pu echt, pp A3 1-19 (1988)). Los vectores binario n de replicacion a partir de BCTV se transfirie LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens utilizando ngelado-descongelado (An et al., Binary vector. E chilproot RA (eds) , Plant molecular biology manua ración de cultivos de Agrobacterium y la infilt de tabaco o remolacha azucarera se llevó a cab ibe en Azhakanandam et a .- , Plant Mol. Biol. 63: ) . Brevemente, las agrobacterias mo icamente se cultivaron toda la noche en 50 mL de e contenía 100 µ? de acetosiringona y 10 µ? de y posteriormente se granularon mediante centrif g durante 10 min. Los granulados se resuspendie de infección [sales de Murashige y Skoog con v osa al 2%, 500 µ? de MES (pH 5,6), 10 µ? de ? de acetosiringona] hasta OD60o = 1,0 y posterio vieron a 28°C durante 3 horas. La infiltración iduales se realizó sobre remolacha azucar imadamente 3 semanas) y plantas de tabaco T imadamente 4 semanas) utilizando una jeringa onando la punta de la jeringa (sin aguja) c sión vegetal (capaz de procesar el intrón y por sa una enzima completamente procesada) contra robacterium (capaz de procesar el intrón y por paz de expresar una enzima funcional) .

Expresión transitoria en hojas de tabaco y rera Los casetes de expresión descritos en el Ejemp ron en un vector binario o un vector binario que én un origen de replicación a partir de BCTV, uillado de las hojas de remolacha (SEQ ID NO: res binarios sin el origen de replicación firieron en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tu zando el método de congelado-descongelado (An y vector. En: Gelvin SB, Schilproot RA (eds ular biology manual . Kluwar Academic Pu echt, pp A3 1-19 (1988)). Los vectores bina transgénicas (realizadas en la variedad cult o Xanthi) que contenían un gen Pl/HC-Pro mutad uprime el silenciamiento postranscripcional de ory et al., Nat Biotechnol 20:622 (2002)) se u la expresión transitoria de las enzimas selecci de tabaco. La preparación de cultivos de Agroba filtración de plantas de tabaco o remolacha azu a cabo como se describe en Azhakanandam et al Biol. 63: 393-404 (2007) . Brevemente, las agro icadas genéticamente se cultivaron toda la noche medio LB que contenía 100 µ? de acetosiringona ES (pH 5,6) y posteriormente se granularon ifugación a 4000Xgr durante 10 min. Los granu pendieron en el medio de infección [sales de Mu con vitaminas, sacarosa al 2%, 500 µ? de MES ( de MgS04, y 100 µ? de acetosiringona] hasta OD60 istema de expresión transitoria de maíz Los casetes de expresión descritos en el Ejemp ron en un vector binario. Los constructos se tran cepa LBA4404 de Agrobacterium turnefaciens que ido auxiliar (pSBI) utilizando el método de c ngelado (An et al., Binary vector. En: Ge proot RA (eds) , Plant molecular biology manual mic Publishers, Dordrecht, páginas A3 1-19 (1988)) El sistema de expresión transitoria de maíz se e zando almácigos de maíz jóvenes (de 5-12 d ración de cultivos de Agrobacterium y la infilt de maíz se llevó a cabo como se describe en Azh ., Plant Mol. Biol . 63: 393-404 (2007) . Breveme acterias modificadas genéticamente se cultivaron en 50 mL de un medio LB que contenía 1 siringona y 10 µ? de MES (pH 5,6) y posterior plantas infiltradas se mantuvieron a 22-25°C eríodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscur o vegetal se cultivó después de 5-7 dí tración para análisis posterior.

Para asegurar que la actividad enzimática medida presión vegetal de las enzimas, los constr sión también incorporaron un intrón en la secu ucleótidos que codifica la enzima. La prese n asegura que la expresión de la enzima se d sión vegetal (capaz de procesar el intrón y por sa una enzima completamente procesada) contra robacterium (capaz de procesar el intrón y por paz de expresar una enzima funcional) . allos y plantas de maíz transgénicos La transformación del callo de maíz se realizó u todo de transformación biolística. Los embriones pendieron en glicerol estéril al 50% mediante órtice. Una alícuota de la suspensión de partí rol y oro se combinó mediante un mezclado suave ol de ADN del gen que codifica el marcador sele y el gen de interés presentados en la Tabla ío 12. La mezcla se combinó con 2 , 5 de midina 1M fría para precipitar el ADN so culas de oro. Las partículas de oro con ADN pr avaron en etanol . Las partículas de oro la pendieron en etanol y las alícuotas de la suspe e colocaron uniformemente en el centro de los ana macroportadora individual y se dejaron s portador se cargó en la pistola de genes por enc lia de detención. El bombardeo de embriones se na pistola de genes PDS—1000 de helio. Se ut de ruptura en el intervalo de 650 - 1800 a oscuridad. Después de 3 días, el tejido de rdeado se transfirió a un medio de inducción d y se incubó durante 1 semana para inducir la for S . Los callos se transfirieron luego a un eion que contenía mañosa durante tres semanas a 2 idad.

La selección de callos transgénicos se firiendo tejido calloso vivo a un medio de selec vó a 28°C en la oscuridad durante 3 semanas. L vivientes se transfirieron a un medio de selecció ultivaron durante 2 semanas adicionales a 28 ° idad. Los callos sobrevivientes se transfirieron l de regeneración y se cultivaron a 28°C en la ite 2 semanas .

Los tejidos callosos se incubarán bajo 16 horas para estimular el desarrollo de brotes. Una ve laca de titulación/trituradora de microtubos Kl un polvo. Se agregó la solución amortiguadora , 2mM de EDTA, Tween-20 al 0,02%, lOOm de azúca altulosa, leucrosa o trehalulosa, dependiendo \a) , pH 7) a las muestras en polvo para proporc nsión espesa. Las muestras se incubaron en un Col a 80% de velocidad durante 30 min. Las mue firieron mediante una pipeta de calibre ancho P20 PCR a 100 uL por tubo y se incubaron a la te iada para la enzima (50, 60, 70, 80°C dependien a) en un termociclador Biorad Tetrad 2. La mu firió a un filtro de centrifugación de membrana x 5KD MW y se centrifugó a 12.000Xg durante 20 de filtro Millipore Multiscreen-HV y se filtró cío. Después de la filtración, las muestras se ua Milii-Q en la medida necesaria y se colocaron ngelado sobre hielo durante 5-8 min ( ngelarse) . Las canastas de filtración ngeladas y los tubos de Eppendorf se" centrifuga OOOXg durante 15 min a 4°C y se recolectó el fil El filtrado se hirvió a 100°C durante 5 min se ifugación a 16. OOOXg durante 20 min. El filtrad ltró adicionalmente transfiriendo el filtrado h ltro de centrifugación de membrana Millipore Bi se centrifugó a 12. OOOXg durante 20 min o una o Millipore Multiscreen-HV y se filtró a 20 ado se recolectó y se diluyó en agua Milli-Q en aria y se colocó en viales de muestra de 0,3 o 1, divisoras para análisis. ío 4: Enzima isomerasa de sacarosa expresada en xpresión transitoria de isomerasa de sacarosa en acha azucarera y tabaco haron y extrajeron básicamente como se descri ío 3H y se analizaron mediante Dionex para carb amente como se describe en el Ejemplo 1G.

La cromatografía de HPAE Dionex utilizó están r pura como referencia del tiempo de retenci cción de la curva estándar para determi ntraciones de azúcar. Las concentraciones de on en el azúcar total que consiste en glucosa, osa, trehalulosa e isomaltulosa cuando está pres azúcares representan >98% del área pico tota togramas, proviniendo el resto de picos nocidos del medio de extracción biológico de la La actividad de isomerasa de sacarosa e itoriamente infiltradas se detectó directament ción de los dos productos principales de la c ática de sacarosa en azúcares cerradas, treha 6: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de hojas xpresan una isomerasa de sacarosa (SEQ ID NO: 16) 7: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de hojas xpresan transitoriamente isomerasa de sacarosa. tra Glucosa + Sacarosa (% Trehalulosa Iso Fructosa (% total total de (% total de (% 8: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de acha azucarera que expresan transitoriamente iso osa (SEQ ID NO: 16) . . 9: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de acha azucarera que expresan transitoriamente isor osa (SEQ ID NO: 16) . tra Glucosa + Sacarosa Trehalulosa Isom Fructosa (% (% total (% total de (% t total de de azúcar) azúcar) azúc azúcar) 8 28,2 28, 5 33, 1 10,2 8 43, 2 54,2 2,3 0,3 8 56,5 34, 7 5,8 3,0 8 42,4 56, 1 0,9 0,6 igo 50,4 49, 6 0,0 0,0 tivo igo 42, 9 57, 1 0, 0 0,0 tivo igo 39,8 60,2 0,0 0,0 tivo igo 74,4 25, 6 0,0 0,0 ti o tividad de isomerasa de sacarosa dentro de la , básicamente como se describe anteriormente pa baco y remolacha azucarera que expresan transit rasa de sacarosa. La Tabla 10 presenta d stran que la isomerasa de sacarosa se expresa ac jas de maíz que expresan transitoriamente isom osa y produce la acumulación de las azúcares ltulosa y trehalulosa dentro de la hoja de maíz. 10: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de hojas de san transitoriamente isomerasa de sacarosa (SEQ ID N ra Glucosa + Sacarosa (% Trehalulosa Isoma Fructosa (% total de (% total de (% t total de azúcar) azúcar) azúca azúcar) 78, 9 17,2 2,4 1,5 ) 63, 7 33,3 2,1 0,9 7) Callo de maíz transgénico que expresa isome rosa El callo de maíz transgénico que expresa i acarosa se generó bombardeando embriones una secuencia de pol inuc leót idos lineal. El ransformación de embriones y generación d básicamente como se describe en el Ejemplo rgo, se bombardearon dos secuenci nucleótidos al mismo tiempo. Una de las se ol inuc leót idos contenía el marcador selecc que permite la selección de células sgénico mediante el crecimiento sobre man nda secuencia de pol inucleót idos , pEB38, secuencia de pol inucleót idos de maíz op codifica una isomerasa de sacarosa (SEQ La isomerasa de sacarosa se dirigió a la 11: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de tejido íz transgénico que expresan isomerasa de sacaros tra Glucosa + . Sacarosa Trehalulosa Isom Fructosa (% % total de % total de % t total de azúcar azúcar azúc azúcar) B38 14, 8 0, 95 38,2 46, 0 B38 25, 0 0,69 35,3 39,0 B38 32, 0 5,13 34, 8 28,1 igo 70,0 30,0 0,0 0,0 tivo r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo es callo de maíz transgénico generado por de azúcar transgénica mediante el crecimien a. La segunda secuencia de polinucleótidos, nía una secuencia de polinucleótidos de monocot izada que codifica una isomerasa de sacarosa (S La isomerasa de sacarosa se dirigió a la vac 12 presenta datos que demuestran que el callo d r transgénica que expresa isomerasa de sacarosa zúcares cerradas trehalulosa e isomaltulosa . 12: Análisis de carbohidratos (HPAEC) de tejido aña de azúcar transgénica que expresan isom osa . tra Glucosa + Sacarosa Trehalulosa Isoma Fructosa (% % total de % total de % to total de azúcar azúcar azúca azúcar) B38 44, 13 37, 70 8, 87 9,30 dor seleccionable PMI . emolacha azucarera transgénica que expresa isom osa (SEQ ID NO: 16) Las plantas de remolacha de azúcar transgé enen el gen de expresión 17588 (descrito en el e generaron básicamente como se describe en la tente WO02/14523 que es un método de transform ples brotes. El callo de remolacha azucarera tr leccionó utilizando selección de mañosa (el gen cionable fue PMI) que se realizó básicamente ibe en la solicitud de patente WO94/20627.

Las plantas de remolacha azucarera transgé zaron mediante PCR para determinar si el cionable (PMI) y el gen de isomerasa de sacarosa 6) estaban presentes en la planta. Además, las p acha azucarera transgénica se analizaron en un lisador de tejidos (25-30 s, 30 H rizar el tejido en el agua. Los cierres que cu íos se perforaron y las muestras se hirvieron de agua durante 10 min. Después del hervido, se adicionales de ddH20 seguido de centrifugación rpm) . Los sobrenadantes se transfirieron a un f ifugación Millipore y se centrifugaron a 1200 Los sobrenadantes filtrados se almacenaron a -2 i el análisis se realizó directamente .

Las muestras se diluyeron 100 veces con agua del análisis utilizando el sistema HPAE Di ma HPAE Dionex, ICS-3000 se utilizó para sep hidratos . El instrumento se equipó con un automu emperatura regulada, columna de guarda CarboPac mm, columna analítica de 3x15 mm CarboPac PA20 d tector amperométrico por pulsos (PAD) . La fa demuestran que las plantas de remolacha génicas expresan una enzima isomerasa de sacar rior acumulación de las azúcares cerradas, isoma lulosa. Las azúcares cerradas son detectadas en molacha azucarera transgénicas que expresan isom indica que la enzima es expresada y es capaz idad enzimático que convierte la sacarosa en iso halulosa . 13 : Plantas de remolacha azucarera transgén san isomerasa de sacarosa.

PCR PCR Dionex - Dionex o PMI GOI isomaltulosa trehalu : 1 A al + + + ++ :2 A al + + ++ :2 A al + + -, + PCR PCR Dionex - Dionex o PMI GOI isomaltulosa trehalu :1 A al + + + ++ :2 A al + + + ++ :3 A al + + + +++ :4 A al + + ++ :5 . A al + + + ++ :5 A - + ++ :7 A + + + : 1 A + + - + :l B + + + ++ : 1 C + + + ++ emplo 12, se utilizó para generar hojas de ta san transitoriamente dextransacarasa básicamente ibe en el Ejemplo 3D. La expresión transi ansacarasa en hojas de tabaco se realizó utili r 902195 que contiene una secuencia de polinu izada de dicotiledónea que codifica una dextra actividad de sintasa de leucrosa (SEQ ID NO: con expresión transitoria se cosecharon y e ántente como se describe en el Ejemplo 3H y se a nte Dionex para carbohidratos básicamente ibe en el Ejemplo 1G.

La cromatografía de HPAE Dionex utilizó están r pura como referencia del tiempo de retenci cción de la curva estándar para determi ntraciones de azúcar. Las concentraciones de a on en el azúcar total que consiste en glucosa, itoriamente una dextransacarasa con actividad de eucrosa (vector 902195) y demuestra que las 0 pueden expresar una dextransacarasa activa que nversión de sacarosa en leucrosa de azúcar cerra .la en la hoja.' xpresión transitoria de dextransacarasa (SEQ ID jas de maíz.

Las hojas de maíz que expresan transit ansacarasa con actividad de sintasa de leu aron básicamente como se describe en el Ej zando el vector pEB47 (descrito en el Ejemplo ende una secuencia de polinucleótidos de monoco izada que codifica una dextransacarasa (SEQ ID ojas de maíz se cosecharon y extrajeron básicam escribe en el Ejemplo 3H. Se analizó el cont hidrato del extracto como se describe en el Eje in embargo, las dos secuencias de polinucleó rdearon al mismo tiempo. Una de las secue ucleótidos contenía el marcador seleccionable , te la selección de células de caña de azúcar tr nte el crecimiento sobre mañosa. La segunda secu ucleótidos , pEB28, contenía una secuen ucleótidos de monocotiledoneas optimizada que extransacarasa (SEQ ID NO: 37). La dextransac ió a la vacuola. La Tabla 15 presenta d stran que el callo de caña de azúcar transgé sa isomerasa de sacarosa acumuló la leucrosa d da . 14: Tejido vegetal que expresa dextransacarasa osa y/o isomaltosa. tabaco maíz caña de azúcar ransacarasa Leucrosa Leucrosa Leucrosa e iso sa en maíz o callo de caña de azúcar, puede rando el contenido total de almidón de la amil expresa callos con los callos testigo que formado con el gen. El contenido total de ali uier tejido vegetal de interés puede medirse u rotocolo similar a aquel del kit de Ensayo de Megazyme. En este ensayo, el almidón contenid ra vegetal es desintegrada en monómeros de g s de la digestión por una alfa-amilasa glucosidasa . La solución resultante de gluco rarse mediante una reacción de oxidasa-perox sa (GOPOD) básicamente como se describe en el Ej esta reacción, las enzimas de oxidasa de tegran la glucosa en peróxido de hidrógeno q ren la peroxidada, liberando oxígeno que reacció noantipirina en solución para evolucionar en cado debe transformarse con una vector vacío q r como una muestra testigo. Tanto los formados como los testigos deben cultivarse ini dios de sacarosa para proporcionar amilosacaras ato natural y aumentan el contenido de almidón os callos. Después de crecimiento suficiente, s (tanto AMS como testigos) deben transferirse rbitol donde el metabolismo natural del tejido d antecedentes de almidón transitorio y, teór á el polímero de carbohidrato produci sacarasa. En cultivo de tejido, el sorbitol es abolizado por plantas a un grado mucho más inf osa. Con sorbitol como una fuente de carbono, s las células vegetales agotan las reservas de al enamiento y transitorias dejando que se ac on derivad de amilosacarasa. ío de un protocolo levemente modificada qu arse para analizar material calloso lio imadamente, 30-70mg del tejido molido debería la e etanol al 80-90% durante 30-60 minutos y cent te 5 minutos a 3000rpm para lavar cualquie le u otros compuestos solubles. Pueden agregars anol adicionales según sea necesario, en la medí las muestras se traten de forma idéntica. El lado debería lavarse luego en 5mL de agua ifugarse nuevamente durante 5 minutos a 3000 nar etanol restante. En esta etapa, el granulad penderse completamente en 3mL de una dilución amilasa (Megazyme) en 50 mM de solución de MOP arse durante 6 minutos en un baño de agua de 1 ras deberían transferirse entonces a un baño de donde 4mL de solución amortiguadora de NaOAc pH arse con 3 mL de reactivo GOPOD, e incubarse d os a 50°C. Una vez que se enfría a temperatura nsidad óptica de las muestras puede leerse a 5 a la lectura de OD de las muestras y su compar tándar conocido, la cantidad de glucosa, y por calcularse el almidón, en la muestra de peso se Después de finalizar el análisis del contenido on, se espera que los callos que expresan e sacarasa muestren un nivel aumentado del almid encima de los callos testigo negativos debi cción adicional de polímeros de carbohidratos a enzima. Adicionalmente , la expresión dirigi a > amilosacarasa a la vacuola o apoplasto de ales transgénicas serviría para aislar el almidó r de las enzimas metabolizadoras de almidón end ten la acumulación de un carbohidrato cerrado cialmente desarrollando un método para enum rciones de amilosa y amilopectina en material ve ración de las muestras testigo con muestras que en de amilosacarasa podrían identificar ca sición estructural que podrían estar presentes eros producidos mediante eventos que sacarasa, lo que sugiere que se está cerrando un rbohidrato. Un método posible de lograrlo es a sayo de unión de yodo. En este ensayo, los ??? hidrato producidos por plantas son solubiliz o y luego teñidos con yodo. Los complejos de yod tantes absorberán en diferentes longitudes diendo de las proporciones de amilosa y ami ntes en el extracto. A través de la compara dares conocidos y mezclas de amilosa y amil calcularse tanto la cantidad total de almidón o debe repetirse al menos dos veces más para ase nación suficiente de azúcares solubles ciales compuestos de unión de yodo de las mues ial de las muestras se le deben agregar 5mL de e e incubarse nuevamente durante 15 minutos a 100° ntrifugar la muestra, deben agregarse 5 mL de a zcla. El granulado debe resuspenderse entonces n 5mL de acetona para garantizar la eliminación ualquier residuo de etanol, centrifugarse d os a 3000rpm, y el granulado debe dejarse enfri se durante toda la noche. Para solubilizar el al lado seco, deben agregarse 5 mL de KOH 0,5M e te 2-3 horas a 100 °C. Los desechos pueden g nte centri ugación durante lOmin a 3000rpm. Pa polímeros de carbohidrato solubilizado, prim alizarse 1 mL del extracto de KOH con 5mL de H ía para cada muestra, dado que esto ind rciones de amilosa y amilopectina en las muestr zar los espectros de las muestras, se config ma de ecuaciones utilizando la ley de Beer en b es de absorbancia en seis longitudes de onda di ediciones de la absorbancia se registrarán a 5 tud de onda de la mayor diferencia entre los sa y amilopectina donde la absorbancia de amilop a la absorbancia de amilosa; 548nm/ la longitu ico de amilopectina puro; 630nm, la longitud de de amilosa pura; 700nm, la longitud de onda de encia entre los picos de amilosa y amilopectina bancia de amilosa es mayor a la absorba pectina; 800nm, la longitud de onda de 1 bancia debido a amilosa donde la absorba pectina se acerca a cero; y la longitud de ? de almidón total al mostrar un aumento de dio en las muestras que expresan el gen de amilo s, se espera que los eventos que expresan amil zcan un polímero de carbohidrato que está más ín ionado con amilosa que amilopectina . Por l ía observarse una mayor proporción de ami ración con muestras testigo. Este cambio sición de almidón producido en eventos que sacarasa respaldará la producción exitosa de un do en tej ido vegetal .

Digestión de polímeros de carbohidrato produc as con enzimas expresadas por plantas La capacidad de una enzima llave producida por u gerir un sustrato cerrado producido por una pla lificarse utilizando el principio subyacent - san alfa-amilasa en la semilla a través de méto lecidos de laboratorio, lo que proporciona un expresada por la planta purificada (alfa-amila res cerradas producidas en tabaco u otro sistem l gen de amilosacarasa pueden extraerse en agua aterial vegetal liofilizado después de lavar co O-90% para eliminar toda azúcar o compuesto hr y Milner J. Biol . Chem. 111 (3): 679-687. (1 amilosa no proporcionará glucosa en su diges dad de glucosa producida debe ser suficiente par tada por el ensayo de reacción de GOPOD cuando s una muestra testigo del azúcar cerrada sin dig a que se detecte una diferencia en los niveles d ste tipo de ensayo de digestión, que verifica as llave expresadas por la planta son realmente ir los cierres producidos por la planta.

Detección de actividad de amilosacarasa en formadas de manera estable o plantas que itoriamente amilosacarasa.

La amilosacarasa puede expresarse yá sea transit través de la transformación estable de maí achas, tabaco u otras plantas con un promotor q expresión en el tejido objetivo apropiado permo, embrión, etc.) y con secuencias objet en la amilosacarasa a la ubicación subcelular ola, cloroplasto, citoplasma, apoplasto, etc.) zarse una variedad de técnicas para detectar la en de amilosacarasa en plantas.

Por ejemplo, las muestras de tejidos veget san el polipéptido de amilosacarasa pueden inc scuridad durante 24 a 48 horas para que l tegre el almidón transitorio producido en el clo ados con 85 mi de agua destilada) , pueden luego la muestra y dejarse incubar a temperatura ambi ras testigo que han estado en la oscuridad du no deberían contener almidón y no deberían en la solución de Lugol . Las muestras que exp e amilosacarasa deberían teñir de negro debido a e produce en el vacuola u otros organelos dirigí sión de la enzima de amilosacarasa..

Las hojas contienen una variedad de tipos de s, tales como las células pavimentosas, que so ente especializadas que forman la mayor part ficie de la hoja. Estas son fácilmente identific ormas de piezas de puzzle (en dicotiledóneas) y allan en la superficie de la hoja. No plastos ni amiloplastos , de modo que si se encu células pavimentosas 1 tienen lo que par so de cromatografía de exclusión de tamaño miento, HPSEC. Utilizando HPSEC; un polí hidrato de amilosacarasa cerrado podría identif terizarse en base a su peso molecular o distrib de cadena.

La extracción de almidón del material vegetal sis por HPSEC podría llevarse a cabo básicament ibe en Santacruz et al J. Agrie. Food Chem. 2004, 1989. El almidón podría extraerse de material ve hoja o callo mediante la liofilización y mo ial vegetal. El tejido vegetal liofilizado a mezclarse con etanol al 90% (v/v) y colocar de agua hirviendo durante 15 minutos. Despué ifugación a lOOOg durante 10 minutos, el granula se tres veces más con etanol caliente al lado puede lavarse nuevamente con etanol al on de etanol al 90% y hervirse durante 30 és de la centrifugación, el sobrenadante puede de extraerse el granulado nuevamente con etanol obrenadantes pueden combinarse y mezclarse con en una relación de 1 parte de DMSO a 9 partes d lución puede incubarse a temperatura ambiente d os y centrifugarse para obtener un granulado de anulado de almidón puede entonces solubilizarse 0% con hervido durante 15 minutos. El almid mificarse para análisis de GPC básicamente ibe en Yao et al Carbo. Research. 2005, 340:70 mificación del almidón puede llevarse a cabo en to de Sodio, solución amortiguadora de pH 4,0 q tado hasta 42-50C. Puede prepararse una reac na 880ul de solución amortiguadora de NaAC tibi ranulado de almidón solubilizado de DMSO. Para omatografía de permeacion en gel o HPSEC podría esta muestra de almidón concentrado para caract ctura de . almidón del carbohidrato de amil do. Las muestras de almidón pueden diluirse en DMSO en preparación para análisis mediante e SEC.

Utilizando un sistema de HPSEC tal como siste e 717. Podrían inyectarse 50ul de polímero de al icar en una columna de guarda Ultrahydrogel d 011565) y una columna Ultrahydrogel 250 A de 7 , 11525) con bomba de HPLC isocrática Waters 15 ctómetro diferente, tal como Waters modelo ción. Puede utilizarse una velocidad de flujo n en una columna, temperatura de columna de ratura del detector de 40°C. Los estándares ular para la - calibración de columnas podr zando estándares puede determinarse la relación generar una curva estándar. De este modo minarse y caracterizarse el largo de caden iero de amilosacarasa . ío 7 : Plantas transgénicas que expresan enzimas 1 abaco y remolacha azucarera transgénicos transit san alfa- 1 , 6 -glucosidasa Se generaron hojas de tabaco y remolacha azuca san transitoriamente una enzima alfa-1, 6-gl ámente como se describe en el Ejemplo 3D. Se genera expresan transitoriamente alfa-1 , 6-glucosidasa u r binario 902525 o el vector binario 902526 de BC res binarios contienen casetes de expresión que lfa-1, 6-glucosidasa (SEQ ID NO: 11) que se ha d s del RE y se espera que se acumule en el apop ñaron las hojas de tabaco y. remolacha azucarera inf 15. Análisis de carbohidratos de hojas de ta san transitoriamente una enzima alfa- 1 , 6 -glucósi : 11) . La actividad enzimática se indica med o en la abundancia de cada azúcar como un porce zúcares totales durante un período de 24 horas.

I 16. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de hojas de remolacha azucarera que itoriamente una enzima alfa-1 , -glucosidasa (SE La actividad enzimática se indica mediante el bundancia de cada azúcar como un porcentaj res totales durante un período de 24 horas. r total = cantidad total de azúcares identific secuencia de polinucleótidos lineal. El mé formación de embriones y generación de ca amente como se describe en el Ejemplo 3F; sin em rdearon dos secuencias de polinucleótidos o. Una de las secuencias de polinucleótidos co dor seleccionable , PMI, que permite la sele as de maíz transgénicas mediante el crecim a. La segunda secuencia de polinucleótidos, 5, contenía una secuencia de polinucleótidos o íz que codificaba una alfa- 1 , 6 -glucosidasa (SEQ Q ID NO: 56) . La alfa- 1 , 6 -glucosidasa se di ulo endoplasmático (902435) o al cloroplasto (90 El análisis de la actividad enzimática de sidasa en los callos de maíz transgénicos se lle yendo la enzima de los callos transgénicos e inc cto con isomaltulosa . Si1 la actividad enzimática turalizadas en las muestras. Se combinaron es de extracto clarificado y solución amortigu ión (200 mM de Isomaltulosa, 100 mM de HEPES, -20, 4 mM de EDTA, 40 mM de NaOH, inhibidor de oche, completo, libre de EDTA]) y se incubaron a rmociclador BioRad Tetrad 2. Las muestras se rec s tiempos 0 y 24 horas. Las muestras recolec aron a 95 °C durante 5 minutos antes de la conge C. Las muestras se analizaron mediante Dionex. esume los datos que demuestran que el callo génico expresa una enzima alfa- 1 , 6 -glucosidasa ac 17. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de tejido de callo de maíz transforr sa enzimas alfa-1 , 6 -glucosidasa . La actividad e dica mediante el cambio en la abundancia de ca un porcentaje de los azúcares totales durante u r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeterm incluyen en el análisis de las muestras. El ivo es callo de maíz transformado con un ve ene solo el marcador seleccionable PMI . allo de caña de azúcar transgénica que expresa sidasa Se generó un callo de caña de azúcar transgé saba una enzima alfa-1 , 6-glucosidasa básicamente ibe en el Ejemplo 3A; sin embargo, se bombarde ncías de polinucleótidos al mismo tiempo. ; Una ncías de polinucleótidos contenía el cionable, PMI, que permite la selección de cé de azúcar transgénica mediante el crecimiento e gunda secuencia de polinucleótidos, 902425, cont regó solución amortiguadora (100 mM de HEPES, 0,04% de Tween-20, pH 7) a las muestras en po rcionar una suspensión espesa. Las muestras se rotador Glas-Col a 80% de velocidad durante 30 ras se transfirieron mediante pipeta de calib a una PCR de 96 pocilios a razón de 100 uL por ncubaron a 60°C durante 20 minutos. Los extr ifugaron a 177OXg durante 30 mins para granular turalizadas en muestras. Se combinaron volúmene xtracto clarificado y 271 mM de trehalulosa/1 ltulosa y se incubaron a 60 °C en un termociclad d 2. Las muestras se recolectaron en los tiempo . Las muestras recolectadas se incubaron a 95 ° utos antes de la congelación a -20 °C. Las mu zaron mediante cromatografía HPAE básicamente ibe en el Ejemplo 1G. La Tabla 18 demuestra que Glucosa Fructosa Isomaltulosa Treh ra (% total de (% total de (% total de (% azúcar) azúcar) azúcar) azúc 5 -9,6 tido) 8,98 9,59 -6,86 igo -2, 1 lVO 2,53 3, 70 -2,82 r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo es un callo de caña de azúcar de tipo silves xpresión transitoria de enzima alfa- 1 , 1-glucosi : 27) en hojas de remolacha azucarera y tabaco Se generaron hojas de tabaco y remolacha azuca san transitoriamente una enzima alfa-1 , 1-glucosi tradas, se extrajeron y la actividad enzimática ámente 'corno se describe en el Ejemplo 3G. L , alfa-1 , 1-glucosidasa, cataliza la conver ltulosa o trehalulosa en los azúcares fer osa y glucosa y se ensayó a 70°C. El aná hidratos del filtrado final se llevó a cabo U ma Dionex básicamente como se describe en el Ej ablas 19 - 20 resumen datos que demuestran la itoria de una alfa-1 , 1-glucosidasa en las hojas olacha azucarera. 19. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de hojas de tabaco que expresan transit enzima alfa-1 , 1-glucosidasa . La actividad enzim a mediante el cambio en la abundancia de cada az rcentaje de los azúcares totales durante un perí .

Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo son hojas de tabaco que expresan transitori r binario vacío . 20. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de hojas de remolacha azucarera que itoriamente enzimas alfa-1 , 1-glucosidasa . La ática se indica mediante el cambio en la abun azúcar como un porcentaje de los azúcares totale ríodo de 24 horas.

Glucosa Fructosa Trehalul stra (% total de (% total de (% tot azúcar) azúcar) azúcar) 612 12,48 13, 70 -13, 59 roplasto 522 18, 73 19,51 -22,46 plasto allo de maíz transgénico que expresa alfa-1 , l-gl Se generó un callo de maíz transgénico que exp a alfa-1 , 1-glucosidasa bombardeando embriones de vectores binarios. El método de transforma ones y generación del callo fue básicamente ibe en el Ejemplo 3F; sin embargo, se bombarde ncias de polinucleótidos al mismo tiempo. Una ncías de polinucleótidos contenía el cionable, PMI, que permite la selección de cé transgénico mediante el crecimiento en mañosa. L ncia de polinucleótidos, 902429, contenía una linucleótidos optimizada de maíz que codificaba lucosidasa (SEQ ID NO: 49). La alfa-l,l-gl a dirigida a quedar retenida por el lasmático.

Se recolectaron callos de maíz que expresan la ctos con volúmenes < 20 uL se agruparon de modo muestras fueran > 30 uL en volumen. Se c enes iguales de extracto y solución amortiguado trehalulosa, 93 mM de isomaltulosa , 100 mM d de Tween-20, 4 mM de EDTA, 40 mM de NaOH, inhi asa Roche) y se incubaron a 70 °C en un term d Tetrad 2. Las muestras se recolectaron en los horas. Las muestras recolectadas se incubaro te 5 minutos antes de la congelación a -2 ras se analizaron mediante Dionex básicamente ibe en el Ejemplo 1G. La Tabla 21 demuestra que íz expresa una alfa-1 , 1-glucosidasa activa, 21: Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de tejido de callo de maíz transfort sa una enzima alfa-1 ; 1-glucosidasa . La ática se indica mediante el cambio en la abund r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo fue un callo de maíz transgénico generado formación con el vector binario que expresa dor seleccionable (PMI) . xpresión transitoria de alfa-1 , 5-glucosidasa por o neraron hojas de tabaco que expresan transitoria a alfa-1, 5-glucosidasa (SEQ ID NO: 46) básicame escribe en el Ejemplo 3D. El vector para itoria fue el vector binario 902550 de BCTV ibe en el Ejemplo 12. El vector binario 902550 ene un cassette de expresión que codifica una sidasa (SEQ ID NO: 46) que está dirigida al clo . 22. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de hojas de tabaco que expresan transit nzima alfa-1 , 5 -glucosidasa . La actividad enzim a mediante el cambio en la abundancia de cada az rcentaje de los azúcares totales durante un perí .

Glucosa Fructosa Leucrosa tra (% total de (% total de (% tot azúcar) azúcar) azúcar) 50 18, 07 20, 36 -38, 43 igo tivo 3,30 1,50 -4,80 r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análi.sis de las muestras. El ncías de polinucleót idos al mismo tiempo. Un ncias de pol inucleótidos contenía el cionable, PMI , que permite la selección de cé transgénico mediante el crecimiento en ma da secuencia de pol inucleótidos , 902423, cont ncia de pol inucleótidos optimizada de m icaba una alfa- 1 , 5 -glucosidasa (SEQ ID NO: 1 , 5 -glucosidasa estaba dirigida al cloroplasto Se recolectaron callos de maíz que expresan u lucosidasa (SEQ ID NO: 43), 1 callo por po s de 96 pocilios de 2 mL (Whatman) que cont ete de bolas de cromo, de 3/16" por pocil ras se congelaron a -80°C. El material cong en configuración 9 durante 4 min' en una ación/trituradora de microtubos Kleco. Se a uL de solución amortiguadora de extracción (1 lacas se centrifugaron a 1770Xg durante 10 m en centrifugadora de cesto giratorio Eppendor obrenadantes de filtraron usando una placa f pore Mult iscreen-HV. Los extractos filtrad ras de callo se combinaron. Las muestras co concentraron de -1,6 mL a 100-500 uL ntradores Microcon con filtros de membrana on) . Se agregó un volumen igual de 200 mM de tracto a una placa para PCR de 96 pocili arón a 80°C en el termoc ic lador . Las mues ectaron en los tiempos 0 y 24 horas. Las ectadas se incubaron a 95 °C durante 5 minut a congelación a -20 °C. Las muestras se an nte Dionex básicamente como se describe en el Se confirmó la actividad de alfa- 1 , 5 -glu ndo la conversión del azúcar cerrado, leuc Glucosa Fructosa Leucrosa ra (% total de {% total de (% to azúcar) azúcar) azúcar) 3 6, 86 12,71 -19, 57 go ivo 0,48 0, 73 -1, 21 r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo consistió en callo de maíz transformado con ontiene solo el marcador seleccionable (PMI) . ío 8: Combinación de enzimas de cierre y enzim sadas en plantas Las hojas de tabaco que expresan transitoriament neraron básicamente como se describe en el Eje Básicamente como se describe en el Ejemplo iltraron hojas enteras de tabaco con ambos íos 17588 y 092526. La coinfiltración se llev se describe en el Ejemplo 3D, excepto que se in a hoja de tabaco dos cepas de Agrobacterium, niendo uno de los dos vectores. Las hojas infilt ectaron y se congelaron a -80°C en bloques de 24 contienen cojinetes de bolas de cromo de 3 ial congelado se agitó en configuración 9 duran a placa de titulación/trituradora de microtubos reó un polvo. Las muestras de polvo se transíi de centrifugación de 30 mL y se centrifugaron a te 20 minutos a 4°C. Los sobrenadantes se transf nuevos y se ajustaron a 50 mM de HEPES, 0,02% mM de EDTA y 20 mM de NaOH, resultando en una m tre 7 y 8. Las muestras luego se transfirieron rasa de sacarosa se demostró por la acumul lulosa y isomaltulosa en el testigo negativo (175 ra (17588 y 902526) . Se observa que la muestra 6) acumuló menos trehalulosa e isomaltulosa go negativo (17588) . Si bien no ha de limit na teoría, esta observación sugiere que la enzi lucosidasa está activa en la muestra (17588 y 9 consiguiente lleva a la conversión de treha ltulosa en azúcares fermentables .

Las Tablas 24-25 demuestran que las plantas que itoriamente isomerasa de sacarosa y alfa-l,6-gl san enzimas activas. La actividad de alfa- 1 , 6 -gl mostró mediante la comparación de las muestras las muestras recolectadas a las 48 horas que d onversión de los azúcares cerrados, trehal ltulosa, en los azúcares fermentables , gl ación para actividad de llave. (T. ethanolicus) r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo consistió en hojas de tabaco no infiltradas, 25. Análisis mediante HPAEC de produ hidratos de hojas de tabaco que expresan transit rasa de sucrosa y una enzima alfa- 1 , 6 -glucosi 24 muestra la hidrólisis de los azúcares r total = cantidad total de azúcares identific ra en base a tiempos de retención de estándares Los picos extraños en las muestras son indeter e incluyen en el análisis de las muestras. El ivo consiste en hojas de tabaco que itoriamente isomerasa de sacarosa y un vector . ío 9: Producción de azúcares fermentables y/o et roducción de glucosa usando dextransacarasa y de La dextransacarasa y la dextranasa forman un as que son una combinación de cierre y 1 ansacarasa cataliza la formación de dextranos, orma cerrada de azúcar o carbohidrato. La dext nzima llave que puede usarse para convertir el menté en una forma fermentable de azúcar.

La dextransacarasa se ¡expresa en plantas de ños. La dextranasa se proporciona como una cida por planta transgénica (Ejemplo 3C) o ía producida microbianamente (Ejemplo 2C) . somaltulosa fermentada para producir etanol Se evaluaron cepas de levadura, Saccharomyces ce detectar la capacidad de fermentar isomalt l . Las cepas se cultivaron en un medio que conte tracto de levadura y 20 g de peptona por litro medio se complementó con glucosa o isomaltulo zar la concentración final apropiada.

Se inocularon colonias de levadura simples en de glucosa al 2% y se incubaron durante 24 hora élulas se centrifugaron a 3000Xg durante 5 mi nadante se desechó, las células se pendiéndolas en 5 mL de agua destilada, las as se centrifugaron a 3000Xg durante 5 min ntación. Las muestras para el análisis de etanol tiraron cada una hora durante seis horas y se al °C. Después que se recolectaron todas las mué laron y filtraron en columnas SpinX de nylon nes mediante centrifugación a 7000 rpm durante 5 lución filtrada luego se sometió a HPLC para d ncentración de etanol y la composición de azúc ión que se muestra en la tabla 26. La gráfi a 2 resume el etanol producido por varias ura cultivadas en presencia de glucosa o isomal empo . 26: Rendimiento de etanol a partir de cepas de vadas con isomaltulosa o glucosa de Azúcar Porcentaje de Porcentaj ura rendimiento rendimien ; de etanol teórico No todas las cepas de levadura, incluyendo las ura comerciales usadas en la industria del etano apacidad de fermentar la isomaltulosa . Lo arios para la fermentación de isomaltulosa ducirse en cepas comerciales mediante acop énesis o transformación. Estos genes pueden inc a alfa glucosidasa, además de un receptor que p ncía de isomaltulosa e induce la expresión portador de alfa-glucósido que transporta la iso os alfa glucósidos a la célula. Los genes involu funciones ocurren en el locus de melezitos isiae y pueden introducirse en otras cepas de nte técnicas de acoplamiento conocidas por los técnica (Hwang & Lindegren Nature vol 203 no 49 92 (1964)) . Alternativamente, la secuencia codif enzima alfa- 1 , 6 -glucosidasa de alta eficienc iáa a efectos de aumentar la velocidad de capt ltulosa por cepas de levadura para mejorar la e fermentación de isomaltulosa . Otro abordaje p ificar cepas que expresan constitutivamente l arios para la fermentación de isomaltulosa o mu iseñar cepas de levadura de modo que itutivamente los genes necesarios para la fermen ltulosa. Las técnicas necesarias para estos abor amente conocidas para los expertos en la técnica. Levadura transgénica que expresa enzimas llave Un gen optimizado con codón de levadura para 06 (Sc_SA 1606) glucosidasa (número de acceso 266) se clonó en los sitios Xhol/Xbal de pGEM ) , que contienen una señal de secreción DEX4 N- creó una proteína de fusión DEX4 -Sc_SAM1606 gluc El marcador URA3 se reemplazó por el locus ka tte kanMX se recombinaron usando recombinación S ge, Nature Methods 4: 251-256 (2007)). Brevement entos se trataron con ADN polimerasa T4 a te nte para crear ADN monocatenario, la reacción s és de 15 minutos con dCTP y los fragme nsformaron en células competentes TOP10 de trogen) . Los plásmidos aislados de las células d binantes se secuenciaron y analizaron mediante e icción. El vector resultante se denominó pEB68.

Un segundo vector de levadura que contenía el g lucosidasa de Bacillus thuringiensis se generó secuencia de polinucleótidos optimizada con ura que codificaba la alfa- 1 , 6 -glucosidasa ctura principal de pEB68 mediante recombinación pEB77. r Se obtuvo un testigo 'vector-vacío' que consist eraron manteniéndolas a 30 °C durante 4-5 horas d ransformación y luego se colocaron en placas YPD que contenía 200 ug/mL de G418.

La actividad enzimática de glucosxdasa asociada se midió en las células de levadura tran cionado tres clones de levadura que expré ína de fusión DEX4 -Sc_SAMl606 y tres clones de ransformar que se inocularon en 5 mL de YPD con ura sin transformar se inoculó en YPD sin se és de 24 horas de crecimiento, las células se g medio se separó y usó para análisis enzimático.

La actividad de Sc-SAM1606 se midió a 70°C du combinando 10 uL de medio de levadura, 25 uL de iguadora (100 mM de Hepes, 4 de m EDTA, 0,04 % pH 7,0), y 15 uL de una solución de azúcar que mM de trehalulosa, 100; mM de isomaltulosa , 7 ene 10 g de extracto de levadura, 20 g de pepton ltulosa y 0,5% de glucosa por litro de me vos se cultivaron hasta que la glucosa se a ) . Después de 24 horas, las células se hicieron servó 1 mL de medio para actividad enzimática. evaluar la actividad de glucosidasa en isomalt ró la siguiente reacción: 25 ul de solución amor 00 mM de Hepes, pH: 7,0, 4 m de EDTA, 0,04 % nhibidores de proteasa) , 10 ul de isomaltulosa ( ul de medio obtenido tal como se describió anter 0 uL de reacción se incubaron durante toda la Se agregaron 20 uL de la reacción anterior a 2 ivo glucosa oxidasa (ensayo GOPOD básicamente ibe en el Ejemplo 2B) y se incubaron a 37°C d os. Las reacciones consistieron en tres r cos. La concentración i de glucosa medida se sponde a los valores mostrados en la figura 3. 27: Conc . de glucosa de muestras (mM) : D sar transformados de levadura que expresa gl o la ecuación de curva estándar de glucosa. ío 11: Mejora de moléculas para aumentar la a estabilidad y eficiencia catalítica y especifi cto La mejora en las enzimas de isomerasa de sacar rse a través del diseño racional de la enz ante para reconocimiento de sustrato y especifi cto. (Ravaud et al. The Journal of Biological 282, No. 38, págs. 28126-28136, 21 de setiembre ío 12 : Constructos para expresión transitoria La Tabla 1 resume los constructos de expresió la generación de plantas transgénicas estables én para la expresión de enzimas transitoria os vegetales. Las secuencias de ADN que co ínas se optimizaron con codones para el iado; por ejemplo, los constructos de expresión expresión en planta transgénica transitoria y e o y remolacha azucarera se optimizaron con cod iledóneas mientras que los constructos de ados para expresión de planta transgénica trans le en caña de azúcar y maíz se optimiz otiledóneas. Las tablas de optimización con codo ania) , adicionalmente , algunos de. los vect ron mediante GeneArt (Alemania) ..

El vector binario 17588 contiene un cassette de os siguientes componentes unidos operativamente : el promotor de ubiquitina Arabidopsis (SEQ ID ncia de acceso a RE GY1 (SEQ ID NO: 13), que d éptido codificado por la región codificadora de carosa a través del retículo endoplasmático; la ceso a esporamina vacuolar (SEQ ID NO 15) que c éptido de isomerasa de sacarosa del lasmático a la vacuola; una secuencia de pol izada con dicotiledóneas que codifica una isom osa (SEQ ID NO: 16); y una secuencia de terminac El vector binario pEB47 contiene un cassette de os siguientes componentes unidos operativamente : un potenciador FMV (SEQ ID NO: 22) ; un potenc entes componentes unidos operativamente en est tor de ubiquitina de maíz (SEQ ID NO: 18) ; gamma zeína de maíz (SEQ ID NO: 19) que d éptido codificado por la secuencia de polipép rasa de sacarosa al retículo endoplasmático; sec o esporamina vacuolar (SEQ ID NO: 15) que co éptido codificado por la secuencia de polipép rasa de sacarosa desde el retículo endoplasmát la; secuencia de polinucleótidos optimiz otiledóneas que codifica isomerasa de sacarosa 0') ; y el terminador NOS.

El vector binario 902525 contiene un cass sión con los siguientes componentes unidos opera te orden: promotor de ubiquitina de Arabidopsis ) ; secuencia de acceso a RE GY1 (SEQ ID NO : e el polipéptido codificado por la región codifi te orden: promotor de NOS de Agrobacterium (SE secuencia de acceso a RE GY1 (SEQ ID NO: 13) , q olipéptido codificado por la región codific rasa de sacarosa a través del retículo endopl ncía de polipéptidos optimizada con dicotiledó ica polipéptido de isomerasa de sacarosa (SEQ ID nador NOS. Se espera que la enzima isomerasa de sada por este cassette de expresión se acumul asto de la célula vegetal transgénica que comp tte de expresión.

El vector binario 901612 contiene un cass sión con los siguientes componentes unidos opera te orden: promotor de ubiquitina de Arabidopsis ) ; secuencia de acceso plástido FNR (SEQ ID NO: ce el polipéptido de alfa-1 , 1-glucosidasa al clo ncia de polipéptidos optimizada con dicotiledó lipéptido de dextransacarasa al retículo endopl ncía de acceso esporamina vacuolar (SEQ ID NO: ce el polipéptido codificado por la secue éptidos de dextransacarasa desde el lasmático a la vacuola; secuencia de pol izada con dicotiledóneas que codifica una dextra ctividad de leucrosa sintasa (SEQ ID NO: 35); t El vector pEB28 contiene un cassette de expresió entes componentes unidos operativamente en est tor de ubiquitina de maíz (SEQ ID NO: 18); gamma zeína de maíz (SEQ ID NO: 19) que d éptido codificado por la secuencia de polipép ansacarasa al retículo endoplasmático; secu o a esporamina vacuolar (SEQ ID NO: 15) que co éptido codificado por la secuencia de polipép ica una alfa-1 , 5-glucosidasa (SEQ ID NO : 46); t El vector 902423 contiene un cassette de expré siguientes componentes . unidos operativamente : promotor de ubiquitina de maíz (SEQ ID ciador TMV (SEQ ID NO: 40) ; secuencia de plasto (SEQ ID NO: 41) que dirige el polipéptido lucosidasa codificado por la secuencia de pol ID NO: 43) al cloroplasto; secuencia de pol izada de maíz que codifica alfa- 1 , 5 -glucosidasa 3); terminador de ubiquitina de maíz (SEQ ID NO: El vector binario 90522 contiene un cassette de os siguientes componentes unidos operativamente : promotor de ubiquitina de Arabidopsis (SEQ ID ncía de acceso al RE GY1 (SEQ ID NO: 13) que éptido de alfa- 1 ,¡l-glucosidasa al ucleótidos optimizada de maíz que codifica una sidasa (SEQ ID NO: 54) ; secuencia de retención d : 51) ; secuencia de terminación de ubiquitina ID NO: 45) .

El vector 902425 contiene un cassette de expré siguientes componentes unidos operativamente : promotor de ubiquitina de maíz (SEQ ID ncía potenciadora TMV (SEQ ID NO: 40) ; secu o a cloroplasto (SEQ ID NO: 26) ; secue ucleótidos optimizada con monocotiledóneas que alfa-1 , 6-glucosidasa (SEQ ID NO: 56) ; secu nación de ubiquitina de maíz (SEQ ID NO : 45) . 28: Constructos de expresión o Promotor Elementos Enzima reguladores r Promotor de secuencia de Isomerasa de o Promotor Elementos Enzima reguladores r secuencia de acceso a RE gamma-zeína maíz (SEQ ID 19) ; secuencia acceso esporamma vacuolar ID NO: 15) Promotor de secuencia de Isomerasa de ubiquitina acceso RE de sacarosa (SEQ de maíz {SEQ gamma-zeína NO: 20) ID NO: 18) maíz (SEQ ID 19) ; secuencia acceso esporamina vacuolar (SEQ NO: 15) Promotor Elementos Enzima reguladores NO: 10) {SEQ ID NO : secuencia acceso esporamina vacuolar (SEQ NO: 15) Promotor de secuencia de Dextransacarasa ubiquitina acceso RE de (SEQ ID NO: 37) de maíz (SEQ gamma-zeína ID NO: 18) maíz (SEQ ID 19) ; secuencia acceso esporamina vacuolar {SEQ NO: 15) Promotor de secuencia de Alfa-1,6-ubiquitina retención de RE glucosidasa (SEQ de maíz (SEQ (51) ; terminador ID NO: 54) o Promotor Elementos Enzima reguladores r ubiquitina de maíz (SEQ ID NO: 45) 2 Promotor de Secuencia de Al£a~1/ 1— ubiqui ina acceso a plástido glucosidasa de FNR (SEQ ID NO: Bacillus (SEQ ID Arabidopsis 26) NO: 27) : (SEQ ID NO: 7) 2 Promotor de secuencia de Alfa-1,1- ubiquitina acceso a RE GY1 glucosidasa (SEQ de (SEQ ID NO: 13) ID NO: 52) Arabidopsis (SEQ ID NO: 7) 9 Promotor de Potenciador TMV Alfa-1, 1- ubiquitina (SEQ ID NO: 40); glucosidasa (SEQ de maíz (SEQ Secuencia de ID NO: 49) ID NO: 39) acceso a ¡RE (SEQ ' Promotor Elementos Enzima reguladores 7) Promotor de Potenciador TMV Alfa-1, 5- ubiquitina (SEQ ID NO: 40) ; glucosidasa de maíz (SEQ secuencia de ID NO: 43) ID NO: 39) acceso a cloroplasto FNR (SEQ ID NO: 41) ; terminador de ubiquitina de maíz (SEQ ID NO: 45) Se hace constar que con relación a esta fecha, o conocido por la solicitante para llevar a la tada invención, es el que resulta claro de la ipción de la invención.

Claims (1)

1. REI INDICACIONES Habiéndose descrito la invención como atenc ma como propiedad lo contenido en las s ndicaciones : 1. Un método para producir un azúcar fe terizado porque comprende: a) proporcionar material vegetal transgé ende uno o más carbohidratos cerrados; y b) poner en contacto el material génico con una o más enzimas llave en donde el aliza en condiciones suficientes para la conve hidrato cerrado en azúcar fermentable. 2. El método de conformidad con la reivindic terizado porque uno o más carbohidratos cer cionan del grupo que consiste en isom na fuente seleccionada del grupo que consiste en al transgénico que expresa una enzima llave, ibinante que expresa una enzima llave, génica que expresa una enzima llave, microbio qu nzima llave y levadura que expresa una enzima ll 5. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la planta transgénica se selecc que consiste en maíz, remolacha azucarera, sor úcar . 6. Un método para producir un azúcar fe terizado porque comprende: a) proporcionar material vegetal transgé ende una o más enzimas de cierre y uno hidratos cerrados; y b) poner en contacto el material génico con la o las enzimas llave en donde el co rupo que consiste en dextransacarasa, sacarosa d nansacarasa, isomerasa de sacarosa y amilosacara 9. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la o las enzimas llave se selecc que consiste en dextranasa, alfa-amilasa, gluc 1 , 5 -glucosidasa ,¦ alfa-1 , 1-glucosidasa y sidasa . 10. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la o las enzimas llave son propo na fuente seleccionada del grupo que consiste en al transgénico que expresa una enzima llave, binante que expresa una enzima llave, génica que expresa una enzima llave, microbio qu nzima llave y levadura que expresa una enzima li 11. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la planta transgénica se selec hidrato o carbohidratos cerrados en azúcar ferme c) fermentar el azúcar fermentable par ol . 13. El método de conformidad con la reivindic terizado porque el carbohidrato cerrado se selec que consiste en isomaltulosa , trehalulosa, on, dextrano, fructano, maltulosa, turanosa e is 14. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la o las enzimas llave se selecc que consiste en dextranasa, alfa-amilasa, gluc 1 , 5 -glucosidasa, alfa-1 , 1-glucosidasa y sidasa . 15. El método de conformidad con la reivindic terizado porque la o las enzimas llave son propo na fuente seleccionada del grupo que consiste en al transgénico que expresa una enzima llave, úcar . 18. Un método para producir un alcohol cara e comprende : a) proporcionar material vegetal transgé ende una o más enzimas de cierre y uno hidratos cerrados; b) poner en contacto el material génico con una o más enzimas llave en donde el aliza en condiciones suficientes para la conver hidrato o carbohidratos cerrados en azúcar ferme c) fermentar el azúcar fermentable par ol. 19. El método de conformidad con la reivindica terizado porque el o los carbohidratos cer cionan del grupo que consiste en isom lulosa, leucrosa, almidón, dextrano, fructano, m sidasa . 22. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas llave son propo na fuente seleccionada del grupo que consiste en al transgénico que expresa una enzima llave, binante que - expresa una enzima llave, génica que expresa una enzima llave, microbio qu nzima llave y levadura que expresa una enzima li 23. El método de conformidad con la reivindica terizado porque el alcohol se selecciona del g ste en etanol y butanol . 24. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la planta transgénica se selecc que consiste en maíz, remolacha azucarera, sor úcar. 25. Un método para producir un azúcar fe terizado porque la o las enzimas llave están del o los carbohidratos cerrados. 27. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas llave están di organelo seleccionado del grupo que cons plasto, vacuola, citoplasma, apoplasto y lasmático . 28. El método de conformidad con la reivindica terizado porque el o los carbohidratos cer cionan del grupo que consiste en isom lulosa, leucrosa, almidón, dextrano, fructano, m osa e isomaltosa. 29. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas llave se selecc que consiste en dextranasa, alfa-amilasa, gluc 1 , 5-glucosidasa, alfa- 1 , 1-glucosidasa y terizado porque la planta transgénica se selecc que consiste en maíz, remolacha azucarera, sorg úcar . 32. Un método para producir un azúcar fe terizado porque comprende: a) proporcionar material vegetal transgé ende una o más enzimas de cierre, uno o más carb dos y una o más enzimas llave; y b) procesar el material vegetal transg ciones suficientes para que las enzima o enzim ertan los carbohidrato o carbohidratos cerrados ntable . 33. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas de cierre se se rupo que consiste en dextransacarasa, sacarosa d nansacaras , isomerasa de sacarosa y amilosacara terizado porque el o los carbohidratos cer cionan del grupo que consiste en isom lulosa, leucrosa, almidón, dextrano, fructano, m osa e isomaltosa. 37. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas llave se selecc que consiste en dextranasa, alfa-amilasa, gluc 1 , 5-glucosidasa, alfa-1 , 1-glucosidasa y sidasa. 38. El método de conformidad con la reivindica terizado porque la o las enzimas llave son propo na fuente seleccionada del grupo que consiste en al transgénico que expresa una enzima llave, binante que expresa una enzima llave, génica que expresa una enzima llave, microbio qu nzima llave y levadura qúe expresa una enzima li e se seleccionan del grupo que consi ansacarasa, sacarosa de levano, alternan rasa de sacarosa y amilosacarasa . 42. La planta transgénica de conformidad ndicación 40, caracterizada porque la o las enzi dirigidas fuera del carbohidrato cerrado. 43. La planta transgénica de conformidad ndicación 40, caracterizada porque la o las enzi dirigidas a un organelo seleccionado del g ste en cloroplasto, vacuola, citoplasma, apo ulo endoplasmático . 44. La planta transgénica de conformidad ndicación 40, caracterizada porque el car do se selecciona del grupo que consiste en isom lulosa, leucrosa, almidón, dextrano, fructano, osa e isomaltosa. ¡ 47. Una planta transgénica caracterizada ende uno o más carbohidratos cerrados y una o más 48. La planta transgénica de conformidad ndicación 47, caracterizada porque la o las enzi dirigidas fuera del o los carbohidratos cerrados r 49. La planta transgénica de conformidad ndicación 47, caracterizada porque la enzima li ida a un organelo seleccionado del grupo que co plasto, vacuola, citoplasma, apoplasto y lasmático . 50. La planta transgénica de conformidad ndicación 47, caracterizada porque el o los carb dos se seleccionan del grupo que cons ltulosa, trehalulosa, leucrosa, almidón, año, maltosa, turanosa e isomaltosa. 53. Un método para producir un azúcar fe terizado porque comprende: a) proporcionar material vegetal transg el material vegetal transgénico se selecciona consiste en remolacha azucarera, sorgo, maíz y r, y en donde el material vegetal transgénico co una o más enzimas de cierre en donde las enzima cierre se seleccionan del grupo que cons ansacarasa, sacarosa de levano, alternan rasa de sacarosa y amilosacarasa, uno o más carbohidratos cerrados en do hidrato o carbohidratos cerrados se seleccionan onsiste en isomaltulosa, trehalulosa, leucrosa, anos, fructanos, maltosa, turanosa e isomaltosa, una o más enzimas llave en donde las enzima o se seleccionan del grúpo que consiste en de 54. Una planta transgénica caracterizada ende : a) una o más enzimas de cierre en donde l imas de cierre se seleccionan del grupo que co ansacarasa, sacarosa de levano, alternan rasa de sacarosa y amilosacarasa, b) uno o más carbohidratos cerrados en hidrato o carbohidratos cerrados se seleccionan onsiste en isomaltulosa, trehalulosa, leucrosa, anos, fructanos, maltosa, turanosa e isomaltosa, c) una o más enzimas llave en donde las as llave se seleccionan del grupo que con anasa, alfa-amilasa, glucoamilasa , alfa- 1 , 5 -glu 1, 1-glucosidasa y alfa- 1 , 6 -glucosidasa; y en d a o enzimas llave están dirigidas fuera de hidratos cerrados; y i