CN102803283A

CN102803283A - 源自玉米的表达盒

Info

Publication number: CN102803283A
Application number: CN2010800270477A
Authority: CN
Inventors: M·L·努西奥
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-11-28
Also published as: US20160024514A1; CA3004001A1; EP2440565A4; EP2706065B1; CN104032029A; BRPI1010858B1; CA2763792C; CN104032029B; CN104031920B; CA2763792A1; ES2754306T3; EP2700647A1; BR122018074298B1; BRPI1010858A2; EP2440565A1; EP2700647B1; AU2010258955A1; AU2010258955B2; CN104031920A; US20120198584A1

Abstract

本发明包括用于在植物中表达重组基因产物的表达盒，其包含源自靶基因的调控序列，例如来自HSP70、Ubi158和Ubi361基因的调控序列。使用发育表达谱数据来鉴定了几种候选基因，以用于强的组成型表达盒开发。开发了三种表达盒。它们基于ZmHSP70、ZmUbi158和ZmUBI361基因。

Description

源自玉米的表达盒

对相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请第61/186,038号(于2009年6月11日提交)的权益。上述申请通过提及而以其整体合并入本文中。

发明领域

本发明包括用于在植物中表达重组基因产物的表达盒，该表达盒包含源自靶基因的调控序列，例如来自HSP70、Ubi158和Ubi361基因的调控序列。

背景

在农业生物技术中，植物可以根据需要进行修饰。达到这一目的的一种方法是通过采用现代基因工程技术。例如，通过将目的基因引入到植物中，所述植物可以被特异地修饰为表达所希望的表型性状。为此，最通常地用包含启动子区、编码区和终止区的异源基因来转化植物。当对异源基因进行基因工程改造以便在植物中表达时，启动子的选择常常是至关重要的因素。

启动子由对于该启动子的功能来说必需的几个区域构成。这些区域中的一些是模块化的组件，换句话说，它们可以分开地进行使用以赋予启动子活动，或者它们可与其他元件装配在一起从而构建出新的启动子(Komarnytsky和Borisjuk，Genetic Engineering 25：113-141(2003))。这些启动子区域的第一个区域位于紧接编码序列的上游并形成“核心启动子区域”，其包含偶联元件，通常紧接转录起始位点的上游的20-70个碱基对。核心启动子区域常常包含TATA盒和起始子元件以及起始位点。核心启动子区域的准确长度不是固定的，但通常是可有效识别的。在大多数启动子中通常存在这样这样的区域，只是有一些变化。位于各种经充分表征的元件之间的碱基序列似乎是较不重要的。核心启动子区域常常被称为最小启动子区域，因为它本身是有功能的从而能够促进基础水平的转录。

核心启动子区域的存在将某一序列定义为启动子：如果该区域不存在，则该启动子是无功能的。核心区域的作用是将通用转录机吸引至启动子以进行转录起始。但是，核心启动子区域不足以提供完整的启动子活动。一系列的调控序列构成了启动子的其余部分。所述调控序列决定了表达水平、表达的空间和时间模式，以及对于一些启动子，还决定了在诱导条件下的表达(通过外部因素例如光、温度、化学药品和激素进行调控)。调控序列可以是6-100碱基对的DNA序列的短区域，其定义了反式作用因子例如转录因子的结合位点。调控序列也可以是增强子，能够从远离核心启动子区域之处(有时经过从核心区域开始的几千个碱基)发挥作用的DNA序列的更长区域。调控序列活性可受到反式作用因子(包括通用转录机、转录因子和染色质装配因子)的影响。

某些启动子能够在植物的所有组织中指导相对类似水平的RNA合成。这些启动子称为“组成型启动子”或“不依赖于组织的”启动子。根据它们指导RNA合成的效力，组成型启动子可以分为强、中等和弱的类别。由于在许多情况下需要在植物的不同组织中同时表达嵌合基因以便获得所述基因的所需功能，因而组成型启动子在这方面是特别有用的。虽然已经从植物和植物病毒中发现了许多组成型启动子并进行了表征，但是对于分离出更新型的组成型启动子(合成或天然的)仍具有日益增长的兴趣，这些更新型的组成型启动子能够控制以不同表达水平的嵌合基因的表达，以及用于基因叠加(gene stacking)的在同一转基因植物中多个基因的表达。

最常用的启动子包括：胭脂氨酸合酶(NOS)启动子(Ebert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5745-5749(1987))；章鱼碱合酶(OCS)启动子；花椰菜花叶病毒属启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))、CaMV 35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和玄参花叶病毒35S启动子(Sanger等人，Plant Mol.Biol.14，43343(1990))；来自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亚基的光诱导型启动子(Pellegrineschi等人，Biochem.Soc.Trans.23(2)：247-250(1995))；Adh启动子(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6624-66280(1987))；蔗糖合酶启动子(Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：414-44148(1990))；R基因复合体启动子(Chandler等人，Plant Cell 1：1175-1183(1989))；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；等等。

概述

鉴于这些需求，本发明的目标是提供能够在植物细胞中驱动表达的核酸，优选地分离的核酸，其中所述核酸序列包含由选自SEQ IDNO：13-33的序列所表示的基因的5’-非翻译区、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分。本发明还涉及选自SEQ ID NO：1-3的核酸序列。另一方面，包含所述核酸的所述植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。另外一方面，包含所述核酸的所述植物细胞可以是玉米细胞或烟草细胞。

另一方面，本发明的目标涉及表达异源基因的方法，所述方法包括构建表达盒，该表达盒包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子，其中所述表达盒在植物、植物细胞或植物组织或其部分中是有功能的；和，产生包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述异源基因得到表达。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于单子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于玉米。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于双子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于烟草或大豆。

另一方面，本发明也涉及植物、植物细胞或植物组织或其部分，其包含表达盒，该表达盒包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于单子叶植物。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于玉米。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于双子叶植物。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于烟草或大豆。

另外一方面，本发明也涉及表达盒，其包含选自prZmHSP70(SEQID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。

另外一方面，本发明涉及通过表达异源基因的方法产生的植物、植物细胞或植物组织或其部分，所述方法包括构建表达盒，该表达盒包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子，其中所述表达盒在植物、植物细胞或植物组织或其部分中是有功能的；和，产生包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述异源基因得到表达。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于单子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于玉米。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于双子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分选自从烟草和大豆。另一方面，本发明也涉及所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的后代，其包含选自prZmHSP70(SEQ IDNO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。本发明也涉及源自所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的所述后代的种子。本发明还涉及源自种子的谷物，所述种子源自所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的所述后代。

另外一方面，本发明还涉及能够在植物细胞中驱动表达的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自下列的核酸序列：(a)与SEQ ID NO：1-3之一至少80％同一的核酸序列；(b)为SEQ ID NO：1-3之一的功能性片段的核酸序列；和(c)在严格条件下与SEQ ID NO：1-3之一杂交的核酸序列。

序列表中的序列的简要说明

SEQ ID NO：1是prZmHSP70的核苷酸序列

SEQ ID NO：2是prZmUbi158的核苷酸序列

SEQ ID NO：3是prZmUbi361的核苷酸序列

SEQ ID NO：4是ZmHSP70二元构建体15907的核苷酸序列

SEQ ID NO：5是ZmUbi158二元构建体17239的核苷酸序列

SEQ ID NO：6是ZmUbi361二元构建体17282的核苷酸序列

SEQ ID NO：7是TMV-ω的翻译增强子的核苷酸序列

SEQ ID NO：8是玉米-优化的Kozak序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：9是玉米-优化的Kozak序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：10是ZmHSP70-GUS表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO：11是ZmUbi158-GUS表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO：12是ZmUbi361-GUS表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO：13是ZmUbi1 CTRL_U29159.1-3_AT探针的核苷酸序列

SEQ ID NO：14是ZmHSP70ZM052966_S_AT探针的核苷酸序列

SEQ ID NO：15是ZmUbi158CTRL_ZMU29158-3_AT探针的核苷酸序列

SEQ ID NO：16是ZmUbi361ZM066361_S_AT探针的核苷酸序列

SEQ ID NO：17是cDNA GenBank登录号X73474的核苷酸序列

SEQ ID NO：18是cDNA TIGR登录号TC279798的核苷酸序列

SEQ ID NO：19是gDNA GenBank登录号AX099713的核苷酸序列

SEQ ID NO：20是gDNA GenBank登录号CL315596.1的核苷酸序列

SEQ ID NO：21是玉米基因组序列重叠群MAGI_102343的核苷酸序列

SEQ ID NO：22是天然ZmHSP70基因(AY222837)的核苷酸序列

SEQ ID NO：23是cDNA GenBank登录号Q41751的核苷酸序列

SEQ ID NO：24是gDNA GenBank登录号AC196154的核苷酸序列

SEQ ID NO：25是gDNA GenBank登录号S94466的核苷酸序列

SEQ ID NO：26是玉米基因组序列重叠群MAGI_6372的核苷酸序列

SEQ ID NO：27是天然ZmUbi158基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：28是共有cDNA TIGR登录号TC369342-cDNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：29是gDNA GenBank登录号AC196194的核苷酸序列

SEQ ID NO：30是gDNA GenBank登录号U29162.1的核苷酸序列

SEQ ID NO：31是玉米基因组序列重叠群MAGI_11628的核苷酸序列

SEQ ID NO：32是玉米基因组序列重叠群MAGI_56231的核苷酸序列

SEQ ID NO：33是天然ZmUbi361基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：34是ZmHSP70装配构建体15902的核苷酸序列

SEQ ID NO：35是ZmUbi158装配构建体17222的核苷酸序列

SEQ ID NO：36是ZmUbi361装配构建体17267的核苷酸序列

SEQ ID NO：37是pCR2.1的核苷酸序列

SEQ ID NO：38是pNOV6901的核苷酸序列

SEQ ID NO：39是1104bp的ZmHSP70的5’-非转录序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：40是304bp的ZmHSP70的5’-非翻译前导序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：41是1602bp ZmHSP70内含子的核苷酸序列

SEQ ID NO：42是ZmHSP70的459bp 3’-非翻译序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：43是3’-非转录ZmHSP70序列的535bp的核苷酸序列

SEQ ID NO：44是源自ZmHSP70的终止子的核苷酸序列

SEQ ID NO：45是1506bp的ZmUbi158的5’-非转录序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：46是163bp的ZmUbi158的5’-非翻译前导序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：47是烟草蚀刻病毒-ω翻译增强子的核苷酸序列

SEQ ID NO：48是2386bp ZmUbi158第一内含子的核苷酸序列

SEQ ID NO：49是ZmUbi158的341bp 3’-非翻译序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：50是660bp的3’-非转录ZmUbi158序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：51是1501bp的ZmUbi361的5’-非转录序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：52是ZmUbi361的260bp 5’-非翻译前导序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：53是1329bp ZmUbi361内含子的核苷酸序列

SEQ ID NO：54是源自ZmUbi361的终止子的核苷酸序列

SEQ ID NO：55是源自ZmUbi158的终止子的核苷酸序列

SEQ ID NO：56是ZmUbi361的65bp 3’-非翻译序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：57是936bp的3’-非转录ZmUbi361序列的核苷酸序列

SEQ ID NO：58是pCR4-TOPO的核苷酸序列

SEQ ID NO：59是载体17680的核苷酸序列

SEQ ID NO：60是载体18271的核苷酸序列

SEQ ID NO：61是载体18272的核苷酸序列

定义

术语“开放阅读框架(ORF)”是指在编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指，在编码序列中的分别界定蛋白合成(mRNA翻译)的起始和链终止的三个相邻核苷酸的单元(‘密码子’)。

术语“非生物胁迫”是指能对植物产生有害影响的非生命环境因素，例如霜冻、干旱、过热、疾风等。

术语“核酸”是指高分子量的多核苷酸，其可以是单链的或双链的，由包含糖、磷酸和碱基(其为嘌呤或嘧啶)的单体(核苷酸)组成。“核酸片段”是指给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与把DNA中所含信息转移到蛋白质中。“基因组”是在生物的每个细胞中所含的遗传物质的整体。术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的，可选地包含能够掺入到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另外指明，否则本发明的具体核酸序列也隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指明的序列。特别地，简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来达到(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语“核酸”与基因、cDNA和由基因编码的mRNA可互换使用。

“可操作连接”是指核酸序列联合成单个核酸片段，从而一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达时，该启动子与该编码序列或功能性RNA是可操作连接的(即该编码序列或功能性RNA处于该启动子的转录控制之下)。可以将以有义或反义方向的编码序列可操作连接至调控序列。

“启动子”是指这样的核苷酸序列，其通过提供关于RNA聚合酶和其他对于正确转录所需要的因子的识别来控制编码序列的表达。“启动子调控序列”可以包含近端和更远端的上游元件和/或下游元件。启动子调控序列影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译。启动子调控序列包括增强子、非翻译前导序列、内含子、外显子和多腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和合成序列，以及可以为合成序列和天然序列的组合的序列。“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或者被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。编码序列可以存在于双链DNA分子的任一条链上，并且即使位于启动子上游或下游均能够发挥功能。术语“启动子”的含义包括“启动子调控序列”。

“初级转化体”和“T0代”是指与最初被转化的组织属于相同遗传代的转基因植物(即，自转化以来未经过减数分裂和受精)。“次级转化体”和“T1、T2、T3等代”是指通过一个或多个减数分裂和受精周期后从初级转化体来源的转基因植物。它们可以通过初级或次级转化体的自体受精，或者通过初级或次级转化体与其他转化或未转化的植物的杂交而获得。

“基因”是指表达mRNA、功能性RNA或特定蛋白质的核酸片段，包括调控序列。术语“天然基因”是指在自然界中发现的基因。术语“嵌合基因”是指包含下述序列的任何基因：1)不是在自然界中一起发现的DNA序列，包括调控序列和编码序列；2)编码不是天然邻接的蛋白质的部分的序列；或3)不是天然邻接的启动子的部分。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含源自相同来源但以与在自然界中所发现的方式不同的方式进行排列的调控序列和编码序列。“转基因”是指通过转化而引入到基因组中并且稳定维持的基因。例如，转基因可包括对于待转化的特定植物的基因来说异源的或同源的基因。此外，转基因可包括插入到非天然生物中的天然基因，或者嵌合基因。术语“内源基因”是指在生物的基因组中处于其天然位置处的天然基因。“外源”基因是指在宿主生物中通常不存在的、但通过基因转移而引入到该生物中的基因。

如在本文中所使用的，“表达盒”，表示能够在合适的宿主细胞中指导特定核苷酸序列的表达的DNA序列，包含可操作连接至目的核苷酸序列(其可操作连接至终止信号)的启动子。它也通常包含对于核苷酸序列的正确翻译来说所需要的序列。编码区通常编码目的蛋白，但也可编码目的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA(以有义或反义方向)。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的至少一个组分相对于它的至少一个其他组分来说是异源的。

“内含子”是指DNA的间插性部分，它几乎只在真核生物基因中出现，但它在基因产物中并不翻译成氨基酸序列。内含子通过称为“剪接”的过程而被从未成熟mRNA上移除，从而形成mRNA，所述称为“剪接”的过程保持外显子不变。对于本发明，术语“内含子”的定义包括对于源自靶基因的内含子的核苷酸序列的修饰。

“外显子”是指携带蛋白质或其部分的编码序列的DNA部分。外显子由间插性非编码序列(内含子)间隔开。对于本发明，术语“外显子”的定义包括对于源自靶基因的外显子的核苷酸序列的修饰。

基因的表达或过表达涉及基因的转录和mRNA翻译成前体蛋白质或成熟蛋白质。“反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。“过表达”是指在转基因生物中超过了在正常或非转化生物中的产生水平的基因产物的产生。“共抑制”是指能够抑制相同或基本上类似的外源或内源基因的表达或转录物积累的有义RNA转录物的产生。共抑制的机制可以在DNA水平(例如DNA甲基化)上、在转录水平上或在转录后水平上。

术语“组成型启动子”是指在所有或大多数发育阶段中在植物的所有或大多数组织中有活性的启动子。如其他分类为组成型的启动子一样，在不同组织或不同阶段中，绝对表达水平可以存在一些变化。

在本文中，术语“组成型启动子”或“不依赖于组织的启动子”可互换使用。

“分离的核酸片段”是指核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物，其是单链的或双链的，可选的包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。以DNA形式存在的分离的核酸片段可包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段。

在本文中，术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”/“分离的核酸片段”可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，其是单链的或双链的，可选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的多核苷酸可包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物的一个或多个区段。核苷酸(通常以其5′-单磷酸形式存在)由如下的单字母名称来指代：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，和“N”指任意核苷酸。

“异源核酸片段”是指不与本发明的植物启动子序列一起天然地出现的序列。虽然这种核苷酸序列对于启动子序列来说是异源的，但它对于植物宿主来说可以是同源的、或天然的、或异源的、或外源的。但是，应当认识到，即时启动子可以与它们的天然编码序列一起使用，以便增加或降低表达，从而导致经转化的种子中表型的变化。

在本文中，术语“在功能上等价的子片段”和“功能等价子片段”可互换使用。这些术语是指分离的核酸片段的一部分或子序列，其中保留了改变基因表达或产生某一表型的能力，无论该片段或子片段是否编码活性酶。例如，该片段或子片段可用于嵌合基因的设计，以便在经转化的植物中产生所需的表型。可以通过在合适的相对于植物启动子序列的方向上连接核酸片段或其子片段(无论其是否编码活性酶)，来设计嵌合基因以用于共抑制或反义。

如在本文中所使用的，术语“基本上类似”和“基本上相应于”是指这样的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基处的变化不影响该核酸片段介导基因表达或产生某一表型的能力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰，例如删除或插入一个或多个核苷酸，所述核苷酸基本上不会改变所得核酸片段的功能性质，相对于初始的未修饰的片段而言。因此，应当理解，正如本领域技术人员将会意识到的，本发明除了特定的示例性序列外还涵盖其他序列。

“3′-非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并且包括多腺苷酸化识别序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷酸化信号的特征通常是影响聚腺苷酸束向mRNA前体的3′-末端的添加。Ingelbrecht等人，Plant Cell 1：671-680(1989)例示了同的3′-非编码序列的使用。

“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，从而导致遗传上稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。

“瞬时表达”是指在宿主生物的所选择的某些细胞类型中常常为报道基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，荧光蛋白基因GFP、ZS-YELLOW1N1、AM-CYAN1、DS-RED)的暂时表达，其中通过转化方法暂时引入转基因基因。

本文中所使用的标准重组DNA和分子克隆方法在本领域中是众所周知的，并且更全面地描述在下列文献中：Sambrook，J.等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress：Cold Spring Harbor，N.Y，1989(此后简称为“Sambrook等人，1989”)；或Ausubel，E M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.，编辑，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons：New York，1990(此后简称为“Ausubel等人，1990”)。

“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA区段的技术，其由一系列重复的循环构成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，Conn.)。通常，使双链DNA热变性，让与靶区段的3′-边界互补的两个引物在低温下退火，然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤构成一个循环。

如在本文中所使用的，短语“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下多核苷酸与其靶子序列杂交(通常在复杂的核酸混合物中)，但本质上不与其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下可以是不同的。更长的序列通常在更高的温度下特异性地进行杂交。关于核酸杂交的广泛指导可在Tijssen(1993)中找到。一般地，在确定的离子强度和pH下，对于特定序列，将严格条件选择为比热解链点(Tm)低约5-10℃。Tm是在平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(由于靶序列是过量存在的，因而在Tm时，50％的探针在平衡时被占据)时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。示例性的严格杂交在65℃，优选地60℃，和最优选地55℃的温度下，在含0.1％SDS的双倍强度(2X)的柠檬酸盐缓冲盐水(SSC)中进行，随后在相同温度下，但用具有降低的SSC浓度的缓冲液来漂洗支持物。此类浓度降低的缓冲液通常为含0.1％SDS的1/10强度的SSC(0.1X SSC)，优选地为含0.1％SDS的0.2X SSC，和最优选地为含0.1％SDS的半强度的SSC(0.5XSSC)。

详细说明

本文所公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调节任何异源核酸序列在宿主植物中的表达，以便改变植物的表型。

表型的各种变化是令人感兴趣的，包括但不限于更改植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸组成、改变植物的病原体防御系统、改变植物对于环境的应答，等等。这些结果可以通过提供在植物中异源产物的表达或内源产物的增加的表达来达到。备选地，所述结果可以通过提供在植物中一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达的减少来达到。这些变化导致经转化的植物的表型的变化。

目的基因反映了在作物开发中所涉及的那些基因的商业市场和利益。目的作物和市场不断变化，并且由于发展中国家打开世界市场，新的作物和技术也将出现。此外，由于我们对于农艺学特征和性状(例如产量和杂种优势)的理解不断增加，用于转化的基因的选择将会相应地变化。转基因(也称为异源基因)的类别包括但不限于编码重要的农艺学性状、抗虫性、抗病性、除草剂抗性、不育性、谷物或种子特征和商业产物的基因。目的基因一般包括在油、淀粉、碳水化合物或营养物代谢中所涉及的那些基因，以及影响种子大小、植物发育、植物生长调节和产量改善的那些基因。植物发育和生长的调节也指植物的各种部分(例如花、种子、根、叶和苗)的发育和生长调节。

其他商业上所希望的性状为赋予冷、热、盐和干旱抗性的基因和蛋白质。

抗病性和/或抗虫性基因可编码对于具有极大的产量降低效应的有害生物的抗性，所述有害生物例如为炭疽病、大豆花叶病毒、大豆胞囊线虫、根结线虫、褐斑病、霜霉病、紫斑病、种子腐烂和幼苗疾病(其通常由腐霉属物种(Pythium sp.)、疫霉属物种(Phytophthora sp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia sp.)、间座壳属物种(Diaporthe sp.)这些真菌引起)。细菌性枯萎病是由细菌丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonassyringae pv.Glycinea)引起的。赋予抗虫性的基因包括，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人，(1986)Gene48：109)；凝集素(Van Damme等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；等等。

除草剂抗性性状可包括编码对于其作用为抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，所述除草剂特别是磺酰脲类型的除草剂(例如，包含导致此类抗性的突变(特别是S4和/或HRA突变)的乙酰乳酸合酶ALS基因)。ALS基因突变体编码对于除草剂绿磺隆的抗性。草甘膦乙酰转移酶(GAT)是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的N-乙酰转移酶，其通过基因改组进行优化以用于广谱除草剂草甘膦的乙酰化，从而形成在转基因植物中草甘膦耐受性的新机制的基础(Castle等人，(2004)Science 304，1151-1154)。对于本领域技术人员来说，显而易见可使用其他除草剂抗性性状。

可以修饰本发明的启动子序列，优选地分离的启动子序列，以提供异源核苷酸序列的一系列组成型表达水平。因此，可利用小于完整的启动子区域，并且保留驱动编码序列表达的能力。但是，应当认识到，mRNA的表达水平可随着删除启动子序列的部分而降低。在一些情况下，减少的表达可能是所希望的。启动子序列的修饰可改变表达的不依赖于组织的、组成型的性质。因此，与SEQ ID NO：1-380％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的SEQ ID NO：1-3的片段可能仍然如本说明书所例示的那样发挥功能。

为鉴定适合于表达盒开发的玉米候选基因及其调控序列，为了在所有样品中表现出最高平均信号的探针，分析了来自发育表达谱系列的玉米表达谱数据。对于每个探针计算平均信号，然后基于平均信号将每个探针进行排序。在该分析中，代表ZmUbi1(一种经充分表征的组成型表达盒)的CTRL U29159.1-3AT探针(SEQ ID NO：13)排名第7位。该分析是选择用于组成型表达盒构建的3个另外启动子候选物的基础：ZmHSP70，排名第2位(SEQ ID NO：23)；ZmUbi158，排名第3位(SEQID NO：30)；和ZmUbi361，排名第10位(SEQ ID NO：38)。表1中的数据(前10位，组成型)概括了结果。

表1.组织中的表达的相对信号强度

探针集

表1，续。

探针集

可以构建包含本发明的重组表达盒的质粒载体。质粒载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。本领域技术人员非常清楚在质粒载体中必须存在以便成功地转化、选择和繁殖包含该嵌合基因的宿主细胞的遗传元件。

对于单子叶植物(美国专利号6,037,522)、小麦(Cheng等人，PlantCell Rep.15：971-980(1997))和特别是玉米(美国专利号6,051,409)，已公开了用于转化单子叶植物(主要是通过使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))和获得转基因植物的方法。尤其是对于棉花(美国专利号5,004,863、美国专利号5,159,135)、大豆(美国专利号5,569,834、美国专利号5,416,011)、芸苔属(Brassica)(美国专利号5,463,174)和花生(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653-657(1996)；McKently等人，Plant Cell Rep.14：699-703(1995))，已公开了用于转化双子叶植物(主要是通过使用根瘤土壤杆菌)和获得转基因植物的方法。关于其他常用的植物转化方法的综述，请参见Newell，C.A.，Mol.Biotechnol.16：53-65(2000)。

存在有各种用于从植物组织中再生出植物的方法。具体的再生方法将会依赖于起始植物组织和具体的待再生的植物物种。从单个植物原生质体转化体或从各种经转化的外植体来进行植物的再生、发育和培养在本领域中是众所周知的(Weissbach和Weissbach，编辑，Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，Inc.：San Diego，Calif.，1988)。该再生和生长过程通常包括下列步骤：选择经转化的细胞；培养那些个体化的细胞通过常规的胚胎发育阶段或通过生根的小植株阶段。类似地再生转基因胚和种子。此后，将所得的转基因生根苗种植在合适的植物生长介质例如土壤中。优选地，使再生出的植物自花传粉，以便提供纯合的转基因植物。在另外的情况下，将从再生出的植物获得的花粉与农艺学上重要的品系的以种子培育的植物进行杂交。反过来，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生出的植物授粉。使用本领域技术人员众所周知的方法来培养包含所需多肽的本发明的转基因植物。

除了上面所讨论的程序外，从业者还熟悉标准的资料材料，它们描述了关于构建、操作和分离大分子(例如，DNA分子、质粒等)，产生重组DNA片段和重组表达构建体，以及筛选和分离克隆的具体条件和程序(参见例如：Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press，1995；Birren等人，Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor：New York，1998；Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，2，Cold Spring Harbor：New York，1998；Clark，编辑，Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Springer：New York，1997)。

本领域技术人员还将会认识到，不同的独立转化事件将导致嵌合基因的不同的表达水平和模式(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))。因此，必须筛选多个事件，以便获得展示出所需的表达水平和模式的品系。此类筛选可通过mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的Western分析或者表型分析来完成。也令人感兴趣的是从展示出所需的基因表达谱的经转化的植物获得种子。

可以使用本领域技术人员众所周知的方法(包括但不限于本文中所描述的方法)来完成转化和选择。

实施例

实施例1：ZmHSP70

将ZmHSP70GeneChip探针即ZM052966_S_AT(SEQ ID NO：14)用于鉴定基因组数据库中相应的cDNA和gDNA。鉴定出的cDNA包括GenBank登录号X73474(SEQ ID NO：17)和TIGR登录号TC279798(SEQ ID NO：18)。gDNA包括GenBank登录号AX099713(SEQ IDNO：19)和CL315596.1(SEQ ID NO：20)，以及玉米基因组序列重叠群MAGI_102343(SEQ ID NO：21)。将这些序列用于形成ZmHSP70基因(SEQ ID NO：22)的碱基水平的注释。ZmHSP70基因包含两个外显子，它们被一个内含子间隔开。将这些序列数据用于设计表达盒，按照用于制备OsMADS表达盒的方法，如在美国专利申请公开号US 2007/0006344(其通过提及而以其整体合并入本文中)中所公开的。在目的基因(GOI)的上游，所完成的表达盒包含ZmHSP70启动子，该ZmHSP70启动子包含1104bp的5’-非转录序列(SEQ ID NO：39)、304bp的5’-非翻译前导序列(SEQ ID NO：40)(其在玉米-优化的Kozak序列(gtaaaccatgg，SEQ ID NO：9)中终止)和1602bp ZmHSP70内含子(SEQ ID NO：51)。通过突变翻译起始密码子和改变其他密码子以在经工程改造的翻译起始密码子(在NcoI处)位点上游插入翻译终止，来使ZmHSP70蛋白编码序列沉默。在GOI的下游，该表达盒包含源自ZmHSP70基因的终止子序列(SEQ ID NO：44)。它包含459bp 3’-非翻译序列(SEQ ID NO：42)(其紧在翻译终止密码子之后开始)，加上535bp的3’-非转录ZmHSP70序列(SEQ ID NO：43)。SEQ ID NO：34和4分别定义了ZmHSP70装配载体和二元载体。在这两种情况下，ZmHSP70表达盒(SEQ ID NO：10)均包含β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因。

通过下述方法来制备ZmHSP70装配载体(SEQ ID NO：34)：从玉米基因组DNA中PCR扩增出HSP70末端(SEQ ID NO：44)，并将其克隆到pNOV6901中(作为SacI/XmaI片段)。使用

万法(Stratagene)来校正一个碱基差异。从玉米基因组DNA中PCR扩增出HSP70启动子(prZmHSP70)，随后将其

(Invitrogen)克隆到pCR2.1(SEQ ID NO：37)中。进一步的-介导的位点定向诱变删除了在5′-UTR区域中的起始密码子(ATG)，使两个SacI位点失活，并且校正了在内含子中的一个碱基差异。将经修饰的prZmHSP70作为XhoI/NcoI片段克隆到重组GUS：tZmHSP70(pNOV6901，SEQ ID NO：38)中。

通过下述方法来制备ZmHSP70二元载体(SEQ ID NO：4)：用限制酶RsrII来使受者载体线性化。用限制酶RsrII和SanDI来消化ZmHSP70装配载体，从而切除由SEQ ID NO：10定义的表达盒。然后，将该表达盒在RsrII位点处克隆到受者载体中。

通过土壤杆菌转化(这是本领域技术人员众所周知的技术)将ZmHSP70二元载体(SEQ ID NO：4)转化到玉米中。在所产生的46个事件中，17个事件结籽。通过组织化学定位(所有事件)和酶活性(选定事件)来分析在完全展开的叶中的GUS酶。

取来自17个T0玉米植物的叶孔片作为样品以用于由ZmHSP70表达盒驱动的GUS活性的组织化学分析，15个植物显示出阳性GUS表达，并且所有阳性表达均显示出浅的着色强度。为了证实prZmHSP70-驱动的GUS表达，我们从几个植物样品中进行了通过4-甲基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)测定法(Armenta等人)的GUS活性分析。在该情况下，组织化学分析是纯定性的测量。通过由转基因产生的蛋白质的提取和分析，GUS酶活性测定提供了定量的信息。prZmHSP70-驱动的GUS在叶表面结构(如“乳头状突起”或“腺毛”或“毛状体”(表皮表面的突起))中强烈地表达。

事件MZAS2007020377A005A和MZAS2007020377A010A是单拷贝的、GUS阳性的，并且产生充足的种子。选择它们用于T1分析。分离现象与T0数据相一致。表2概括了F1幼苗的分析。进行三种分析以检查在来自每个植物的年幼叶组织中的GUS报道基因活性：组织化学定位、ELISA和酶活性。基于这些结果，选择植物以用于GUS表达的发育评估。

表2.prZmHSP70植物表征概括

¹ng/mg可溶性蛋白

²pmol/分钟/mg蛋白

用MZAS2007020377A005A幼苗来进行的进一步实验检查了响应于热激的GUS活性。将2周龄的植物经历在42℃下的热激2小时，然后通过ELISA和酶测定法来分析GUS活性。结果列在表3中。在对照植物和经历热激的植物之间，GUS活性没有可辨别的差异。

表3.响应于热激的GUS活性。

¹ng/mg总蛋白

²pmol/分钟/mg蛋白

表4提供的数据概括了在ZmHSP70 T1/B1植物生殖组织中的组织化学定位数据。

表4.关于15907事件的T1/B1组织化学定位结果。

标注

0 阴性

1 非常淡的蓝色

2 淡蓝色

3 蓝色

4 深蓝色

5 非常深的蓝色

ND 无数据

＊胚乳和胚为阴性

这里提供的数据显示，prZmHSP70(SEQ ID NO：1)在大多数玉米植物组织中是有功能的。

实施例2：ZmUbi158

将ZmUbi158 GeneChip探针即CTRL_ZMU29158-3_AT(SEQ IDNO：15)用于鉴定基因组数据库中相应的cDNA和gDNA。鉴定出的cDNA包括GenBank登录号Q41751(SEQ ID NO：23)。gDNA包括GenBank登录号AC196154(SEQ ID NO：24)和S94466(SEQ ID NO：25)，以及玉米基因组序列重叠群MAGI_6372(SEQ ID NO：26)。将这些序列用于形成ZmUbi158基因(SEQ ID NO：27)的碱基水平的注释。ZmUbi158基因包含三个外显子，它们被两个内含子间隔开。将这些序列数据用于设计表达盒，按照用于制备OsMADS表达盒的方法，如在美国专利申请公开号US 2007/0006344(其通过提及而以其整体合并入本文中)中所公开的。在目的基因(GOI)的上游，所完成的表达盒包含ZmUbi158启动子，该ZmUbi158启动子包含1506bp的5’-非转录序列(SEQ IDNO：45)、163bp的5’-非翻译前导序列(SEQ ID NO：46)(其包含烟草蚀刻病毒ω翻译增强子(SEQ ID NO：47)，并且在玉米-优化的Kozak序列(ataaaccatgg)(SEQ ID NO：8)中终止)和2386bp ZmUbi158第一内含子(SEQ ID NO：48)。通过突变翻译起始密码子和改变其他密码子以在经工程改造的翻译起始密码子(在NcoI处)位点上游插入翻译终止，来使ZmUbi158蛋白编码序列沉默。在GOI的下游，该表达盒包含源自ZmUbi158基因的终止子序列(SEQ ID NO：55)。它包含341bp 3’-非翻译序列(SEQ ID NO：49)(其紧在翻译终止密码子之后开始)，加上660bp的3’-非转录ZmUbi158序列(SEQ ID NO：50)。SEQ ID NO：35和5分别定义了ZmUbi158装配载体和二元载体。在这两种情况下，ZmUbi158表达盒(SEQ ID NO：11)均包含β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因。

如上所描述的来设计prZmUbi158启动子(SEQ ID NO：2)。产物通过限制性分析和完整序列分析来进行验证。将GUS编码序列组分作为NcoI/SacI片段克隆到该表达盒中。对克隆连接点进行测序。

从17222中作为RsrII/SanDI片段切出ZmUbi158-GUS表达盒(SEQID NO：11)，并将其连接至受者载体中的RsrII位点。对克隆连接点进行测序。

通过土壤杆菌转化(这是本领域中众所周知的技术)将ZmUbi158二元载体(SEQ ID NO：5)转化到玉米中。在所产生的35个事件中，14个事件结籽。表5概括了关于这些事件的种子产生数据。通过组织化学定位和ELISA来分析在年幼的叶和完全展开的叶中的GUS酶。T0数据概括在表5中。

表5.关于T0植物的GUS测定结果。

¹GUS，表示为ng/mg来自V6叶组织的可溶性蛋白。

²GUS，表示为ng/mg来自V12叶组织的可溶性蛋白。

³将叶组织于37℃在组织化学染色试剂中温育过夜，然后清洗，并且划分为阳性或阴性。

表6概括了关于包含ZmUbi158-GUS表达盒的植物的组织的T1/B1GUS测定数据。

表6.关于包含ZmUbi158-GUS表达盒的植物的组织的T1/B1 GUS测定数据。

表6，续。

表6，续。

标注：0＝阴性；1＝非常淡的蓝色；2＝淡蓝色；3＝蓝色；4＝深蓝色；5＝非常深的蓝色。

¹A表明所有组织在室温下温育7小时；B表明所有组织在37℃下温育16小时；C表明穗叶、雄花穗叶、苞叶、穗丝、雄花穗在37℃下温育16小时，其他组织在室温下温育5小时；D表明穗叶、雄花穗叶、苞叶、穗丝、雄花穗在37℃下温育16小时，其他组织在室温下温育6小时；E表明穗叶、雄花穗叶、苞叶、穗丝、雄花穗在37℃下温育16小时，其他组织在室温下温育4小时；F表明穗叶、雄花穗叶、苞叶在37℃下温育16小时，其他组织在室温下温育5小时；G表明稳叶、雄花穗叶、苞叶在37℃下温育16小时，其他组织在室温下温育7小时。

表6中所呈现的数据显示，prZmUbi158(SEQ ID NO：2)在包含SEQ ID NO：2的玉米植物组织中是有功能的。

实施例3：ZmUbi361

将ZmUbi361 GeneChip探针即ZM066361_S_AT(SEQ ID NO：16)用于鉴定基因组数据库中相应的cDNA和gDNA。鉴定出的cDNA包括TIGR登录号TC369342-cDNA(SEQ ID NO：28)。gDNA包括GenBank登录号AC196194(SEQ ID NO：29)和U29162.1(SEQ ID NO：30)，以及玉米基因组序列重叠群MAGI_11628(SEQ ID NO：31)和MAGI_56231(SEQ ID NO：32)。将这些序列用于形成ZmUbi361基因(SEQ IDNO：33)的碱基水平的注释。ZmUbi361基因包含两个外显子，它们被一个内含子间隔开。将这些序列数据用于设计表达盒，按照用于制备OsMADS表达盒的方法，如在美国专利申请公开号US 2007/0006344(其通过提及而以其整体合并入本文中)中所公开的。在目的基因(GOI)的上游，所完成的表达盒包含ZmUbi361启动子，该ZmUbi361启动子包含1501bp的5’-非转录序列(SEQ ID NO：51)、260bp的5’-非翻译前导序列(SEQ ID NO：52)(其包含烟草蚀刻病毒ω翻译增强子(SEQ IDNO：47)，并且在玉米-优化的Kozak序列(ataaaccatgg)(SEQ ID NO：8)中终止)和1329bp ZmUbi361内含子(SEQ ID NO：53)。通过突变翻译起始密码子和改变其他密码子以在经工程改造的翻译起始密码子(在NcoI处)位点上游插入翻译终止，来使ZmUbi361蛋白编码序列沉默。在GOI的下游，该表达盒包含源自ZmUbi361基因的终止子序列(SEQID NO：54)。它包含65bp 3’-非翻译序列(SEQ ID NO：56)(其紧在翻译终止密码子之后开始)，加上936bp的3’-非转录ZmUbi361序列(SEQID NO：57)。SEQ ID NO：36和6分别定义了ZmUbi361装配载体和二元载体。在这两种情况下，ZmUbi361表达盒(SEQ ID NO：12)均包含β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因。

如上来设计prZmUbi361表达盒(SEQ ID NO：12)并合成，将其以在pCR4-TOPO(SEQ ID NO：58)中的形式来提供。将SEQ ID NO：12作为SanDI/RsrII片段切出，并连接至SEQ ID NO：35的主链。从pNOV6901中作为NcoI/SacI片段切出GUS序列，并将其连接至ZmUbi361表达盒。

从17267中作为SanDI/RsrII片段切出prZmUbi361表达盒(SEQ IDNO：12)，并将其连接至受者载体中的RsrII位点。

通过本领域中众所周知的转化方法，将ZmUbi361二元载体(SEQ IDNO：6)转化到玉米中。在所产生的36个事件中，21个事件结籽。表7概括了关于这些事件的种子产生和基因分型数据。还在年幼的叶组织中定量了GUS转录物(mRNA)。通过组织化学定位和ELISA来分析在完全展开的叶中的GUS酶。T0数据概括在表7中。

表7.关于ZmUbi361的种子产生和GUS组织化学数据。

¹相对于内源对照(延伸因子2α)而言的相对表达

²GUS，表示为ng/mg可溶性蛋白

³划分为阳性(+)或阴性(-)；“ND”为“无数据”

分析了代表3个事件的T1植物，以确定包含ZmUbi361启动子的盒的表达盒性能。该实验方法由两项研究构成：幼苗测定法和发育研究。就GUS蛋白积累，分析了T1/B1幼苗的根和叶组织。

关于包含ZmUbi361的T1/F1幼苗的GUS报道蛋白数据列在表8中。

表8.

¹相对单位

²ng GUS/mg可溶性蛋白

该发育研究证明了在整个植物中GUS蛋白的空间积累。为了进行该研究，在三个阶段对植物进行取样：早期生殖发育(或R1)(Ritchie等人，1992)、授粉后(或R2)和晚期生殖发育(R3)。使用组织化学法来分析几个植物部分。这些数据暗示，相对于营养组织来说，ZmUbi158在生殖组织中活性较低，但它在花粉中具有活性。

关于携带ZmUbi361表达盒的T1玉米的发育表达的数据列在表9A-9D中。这些数据表明，相对于叶来说，ZmUbi361在根中活性更高。

ZmUbi361的定量性能为ZmUbi158的2-4倍。在单拷贝幼苗中，在低端处GUS蛋白积累为可溶性蛋白的0.5％，和在高端处它为可提取的蛋白的4％。

表9A.处于V8阶段的植物。

表9B.处于授粉前阶段的植物。

表9C.处于授粉后9天的植物。

表9D.处于授粉后17天的植物。

实施例5：在双子叶植物中的启动子功能性

在烟草植物中测试了SEQ ID NO：2和3以确定这些从单子叶植物基因设计的启动子是否将会作为双子叶植物中的启动子而发挥功能。烟草是模型生物，并且可用作表达盒在其他双子叶植物例如大豆中将会如何运行的预测者。

用SanDI和RsrII从质粒17222(SEQ ID NO：35)中限制酶消化出prZmUbi158-GUS表达盒(SEQ ID NO：11)，并随后克隆到二元载体17680(SEQ ID NO：59)的RsrII位点中，从而产生载体18271(SEQ IDNO：60)。通过土壤杆菌-介导的转化，将SEQ ID NO：60转化到烟草中。在T0烟草植物中prZmUbi158的性能记录在下面的表10中。正如这些数据所表明的，prZmUbi158不是在烟草中具有高度活性的启动子，尽管其保留了一些功能。

表10.在T0烟草植物中的prZmUbi158功能性。

表10，续。

¹相对单位

²ng GUS/mg可溶性蛋白

用SanDI和RsrII从质粒17267(SEQ ID NO：36)中限制酶消化出prZmUbi361-GUS表达盒(SEQ ID NO：12)，并随后克隆到二元载体17680(SEQ ID NO：59)的RsrII位点中，从而产生载体18272(SEQ IDNO：61)。通过土壤杆菌-介导的转化，将SEQ ID NO：61转化到烟草中。在T0烟草植物中prZmUbi361的性能记录在下面的表11中。正如这些数据所表明的，prZmUbi361在烟草中具有高度活性。这些数据显示，prZmUbi361是用于在双子叶植物以及单子叶植物中使用的所希望的启动子。

表11.在T0烟草中的prZmUbi361功能性。

表11，续。

¹相对单位

²ng GUS/mg可溶性蛋白

实施例6：启动子优化

顺次修饰SEQ ID NO：1-3，以便按每200bp从5’-区域开始删除原始启动子序列的一部分。所述删除通过使用本领域技术人员众所周知的方法(包括PCR、诱变和基因合成)来进行。然后，将系列缺失物分别连接至用XhoI/NcoI消化的二元载体，以替代原始启动子。使用在美国临时专利申请号61/186,025(其通过提及而以其整体合并入本文中)中所描述的瞬时测定法，和通过由根瘤土壤杆菌介导的转化，将新启动子片段：GUS构建体引入到单子叶植物和双子叶植物中，从而产生转基因植物。

如上面所描述的，在根和叶组织中，通过活性测定法和组织化学测定法来分析在这些转基因植物中的GUS表达。通过比较在各种缺失构建体和原始启动子构建体中的GUS活性，将赋予功能性启动子活性的5’-片段鉴定为功能性启动子片段，并且基于大小进行分类。由此确定了原始启动子序列的最小功能性启动子片段。

然后，通过直接化学基因合成，在最小功能性启动子片段中产生一系列碱基置换。另外，由此使不想要的起始密码子沉默。克隆这些突变体，从而产生另一组启动子：GUS构建体。测量在转基因植物中这些构建体的GUS表达，这是通过使用上面所描述的方法来测定的。由此确定了在最小功能性片段内的必要结构域，其中碱基置换消除了启动子活性。

表达盒也可以通过去除或添加转录和翻译增强子来进行优化。作为实例而非限制性的，所述表达盒包含选自SEQ ID NO：1、2和3的启动子。作为进一步的实例，所述表达盒在紧接启动子的上游处进一步包含转录增强子eFMV(SEQ ID NO：6的核苷酸306-499)和e35S(SEQ IDNO：6的核苷酸506-798)。作为进一步的实例，所述表达盒在紧接启动子的下游处进一步包含TMV-ω翻译增强子(SEQ ID NO：7)。作为进一步的实例，所述表达盒在紧接目的基因的起始密码子的上游处进一步包含Kozak序列(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9)。

结论

鉴于这里提供的结果，本发明的目标是提供能够在植物细胞中驱动表达的核酸，优选地分离的核酸，其中所述核酸序列包含由选自SEQ IDNO：13-33的序列所表示的基因的5’-非翻译区、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分。本发明还涉及选自SEQ ID NO：1-3的核酸序列。另一方面，包含所述核酸的所述植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。另外一方面，包含所述核酸的所述植物细胞可以是玉米细胞或烟草细胞。

本发明也涉及植物、植物细胞或植物组织或其部分，其包含表达盒，该表达盒包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ IDNO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于单子叶植物。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于玉米。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于双子叶植物。本发明还涉及包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于烟草或大豆。

本发明也涉及表达盒，其包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。

本发明还涉及通过表达异源基因的方法产生的植物、植物细胞或植物组织或其部分，所述方法包括构建表达盒，该表达盒包含选自prZmHSP70(SEQ ID NO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子，其中所述表达盒在植物、植物细胞或植物组织或其部分中是有功能的；和，产生包含所述表达盒的植物、植物细胞或植物组织或其部分，其中所述异源基因得到表达。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于单子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于玉米。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分属于双子叶植物。本发明还涉及在植物、植物细胞或植物组织或其部分中表达异源基因，其中所述植物、植物细胞或植物组织或其部分选自从烟草和大豆。另一方面，本发明也涉及所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的后代，其包含选自prZmHSP70(SEQ IDNO：1)、prZmUbi158(SEQ ID NO：2)和prZmUbi361(SEQ ID NO：3)的启动子。本发明也涉及源自所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的所述后代的种子。本发明还涉及源自种子的谷物，所述种子源自所述植物、植物细胞或植物组织或其部分的所述后代。

本发明还涉及能够在植物细胞中驱动表达的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自下列的核酸序列：(a)与SEQ ID NO：1-3之一至少80％同一的核酸序列；(b)为SEQ ID NO：1-3之一的功能性片段的核酸序列；和(c)在严格条件下与SEQ ID NO：1-3之一杂交的核酸序列。

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