CN102417906A - 组织特异性启动子pd54o-544在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及包含一个截短的水稻绿色组织特异启动子P_D54O-544在改良水稻抗病性中的应用。利用P_D54O-544启动子调控一个RNA干扰(RNAinterference，RNAi)构件(construct)的表达，抑制在水稻生殖器官中表达并是生殖发育所必需的基因(显性Xa13或隐性xa13)的功能，可显著增强水稻的抗病性，但不影响水稻的结实率。因为转入的DNA片段不在胚和胚乳中表达，由此培育出来的抗病水稻可以解除人们对转基因食品安全性问题的顾虑。

Description

组织特异性启动子PD54O-544在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一段水稻DNA片段在调控抗病基因表达中的功能应用。所述的DNA片段包含一个水稻基因启动子的截短区段，它能够在水稻的绿色组织中调控基因表达，且在胚和胚乳中不表达。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有超过20亿的人口以水稻为主食，但是各种病害的影响常常造成其产量和品质的下降，从而在很大程度上影响着粮食的安全形势。危害水稻的各种病害中，由革兰氏阴性菌黄单孢杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。在现代农业中，使用化学药剂是减少病害的重要方法，为减少病害损失起到了巨大作用。但是，化学药剂的使用会不可避免地造成环境污染以及威胁人类健康。在人们对食物的安全性和环保性日益重视的今天，减少甚至杜绝化学药剂的使用是农业生产的新要求。

实践和研究表明，利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。但是传统的育种手段具有周期长、耗费大、后代性状复杂筛选困难等缺点，基因工程技术的迅猛发展为解决上述问题提供了有力的技术手段。

但是目前的技术手段和遗传转化体系仍然存在一些不足。很重要的一点便是遗传转化载体中的启动子大多是组成型表达启动子。一些很重要的抗性基因往往具有多种功能，利用组成型启动子控制这些抗性基因，不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费；而且还会影响这些基因的其它功能，造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡(Ehsani等，2003；Karlowski等，2003；Miyao等，2003；Durrant和Dong，2004)。

为了解决以上问题，一些改进措施已经开始运用，如标记基因的消除技术(陈颖等，2001)和植物来源的特异性启动子的应用。启动子是一段对转录的时间，空间和表达量起调控作用的DNA序列。特异性的启动子分为两类，一是受诱导表达的特异启动子，另一类是组织特异性表达的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境做出反应，启动基因表达。组织特异性的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。植物来源的启动子不会造成基因的逃逸，而特异性的启动子又避免了基因过量表达对植物体的伤害，同时调控目标基因只在特定组织中表达，也避免影响目标基因在其它组织中的功能。此外，也可以避免外源基因在人们食用的部位表达，解除人们对转基因食品安全性问题的顾虑。因此，利用特异性启动子来调控抗性基因的表达，是利用抗性基因的最佳途径。

发明内容

本发明的目的是验证水稻中的一个具有绿色组织表达特异性的启动子(P_D54O)的一个截短的DNA片段(P_D54O-544)在改良水稻抗病性中的应用前景。利用这个截短的启动子调控一个RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)构件(construct)的表达，该构件的表达使水稻中的目标基因沉默，从而产生具有高抗病性且结实率正常的转基因水稻。由于该启动子调控的基因在水稻的胚和胚乳中不表达，可以解除人们对转基因食品安全性问题的顾虑。申请人将这个截短的启动子被命名为P_D54O-544。

本发明涉及一段水稻的DNA片段(P_D54O-544)在调控基因组织特异性表达方面的应用。该片段是水稻中一个基因的启动子(P_D54O)的截短片段，该片段能够调控目标基因只在绿色组织中表达而在胚和胚乳中不表达。所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的P_D54O-544启动子作探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子或同源的启动子。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组中扩增得到本发明的P_D54O-544启动子以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含P_D54O-544的序列，将这一序列与基因连接并与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。

本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的启动子或基于该启动子的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子，可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了验证P_D54O-544启动子在改良水稻抗病性的应用过程。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明所涉及的启动子P_D54O-544的核苷酸序列。

图1.启动子P_D54O-544的基本结构。(A)D54O基因启动子区的基本结构。+1是预测的翻译起始位点；-113是预测的CAAT框，控制转录起始的频率。经过功能验证的来源于粳稻品种农垦58的D54O基因启动子-P_D54O(Cai等，2007)包括从-2134bp到+41bp的共2175个核苷酸的DNA片段。(B)本发明中来源于籼稻品种明恢63的D54O基因的截短启动子P_D54O-544的基本结构。除-13位点的碱基不同外(箭头所示处)，P_D54O-544启动子序列与P_D54O启动子序列相同。

图2.抑制Xa13和xa13基因表达的遗传转化质粒D75R和D182R的主要结构特征图。RB和LB代表T-DNA右和左边界；GUS代表β-葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)；35S代表花椰菜花叶病毒启动子，是一种组成型表达的启动子；P_D54O-544代表本发明中应用的启动子；AdhI代表玉米乙醇脱氢酶基因内含子I；OCS代表章鱼碱合成酶基因终止子；Waxy-a intron I代表水稻Waxy基因内含子I。(A)遗传转化质粒D75R(Chu等，2006)。(B)本发明构建的遗传转化质粒D182R。

图3.部分T₀代遗传转化植株在接种白叶枯病菌PXO99三周后的表型。Xa13或xa13基因表达量的降低与植株对白叶枯病菌株PXO99的抗性增强相关。水稻肌动蛋白(actin)基因为参照基因，用来鉴定所检测样品的浓度的一致性。(A)在中花11背景中抑制显性感病基因Xa13的表达。(B)在IRBB13背景中抑制隐性抗白叶枯病主效基因xa13的表达。IR24为感病水稻对照。IR24与IRBB13是近等基因系，前者携带显性Xa13基因，后者携带隐性xa13基因。

图4.转化D75R质粒的遗传转化植株T₁代的抗病性分析和GUS基因的检测。接种白叶枯病菌PXO99后，所有T₁植株的表型与对照相似，这些植株中也没有检测到遗传转化的标记基因GUS，说明它们都是阴性植株。

图5.转化D182R质粒的遗传转化植株T₁代的抗病性分析。T₁代植株中出现抗病和感病表型的分离，抗病表型与GUS基因共分离。双星号(**)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。

具体实施方式

本发明的前期研究工作显示水稻中的显性基因Xa13是感病基因，它的等位隐性基因xa13是抗白叶枯病主效基因，但是二者都是花粉发育所必需的基因(Chu等，2006；Yuan等，2009，2010)。利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)、采用组成型表达启动子抑制感病水稻中的显性基因Xa13的表达，产生了抗病转基因植株(Chu等，2006)。利用RNAi技术、采用组成型表达启动子抑制抗病水稻中的隐性抗白叶枯病主效基因xa13，转基因植株的抗性水平进一步提高(Chu等，2006)。但是抑制显性Xa13基因或隐性xa13基因后，转基因植株变为完全不育(不结种子)或高度不育(结实率非常低)(Chu等，2006)。这些研究结果提示：如果利用一个组织特异性启动子，有选择地只在水稻的非胚和胚乳组织中抑制Xa13或xa13基因的表达，可能可以创建抗白叶枯病而不影响水稻结实率的新的种质资源。

本发明的前期研究工作发现了一个水稻绿色组织特异表达启动子-P_D54O(Cai等，2007；专利号：ZL200710051443.3，发明名称：组织特异性表达启动子P_D54O及其在水稻改良中的应用；发明人：王石平、蔡萌、魏君)。该启动子调控基因特异性地在叶、叶鞘等绿色组织中表达，在胚、胚乳中不表达。将P_D54O启动子的5’-末端截短1591个核苷酸后，变为P_D54O-544启动子(Cai等，2007)。P_D54O-544启动子也在绿色组织中表达，在胚、胚乳中不表达；但是在绿色组织中，P_D54O-544启动子调控的基因的表达量与比P_D54O启动子调控的基因的表达量高大约2-60倍(Cai等，2007)。这些研究结果提示：利用P_D54O-544启动子抑制Xa13或xa13基因的表达，可能可以创建抗白叶枯病而不影响水稻结实率的新的种质资源。

本发明将P_D54O-544启动子应用于调控Xa13和xa13基因的表达，对该启动子的应用进行了功能验证。以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期研究工作结果的基础上将P_D54O-544启动子应用于调控Xa13和xa13基因的表达，创建抗病水稻种质资源的方法和结果。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：从水稻籼稻品种明恢63中分离克隆P_D54O-544启动子

依据启动子P_D54O序列信息(Cai等，2007)，设计PCR引物P_D54O-544F(5′-GGCGAATTCTAGATAATGGATTAAAACCTGG-3′)(下划线为EcoRI酶切位点)和P_D54O-544R(5′-TTACTGCAGACCAGCGGCGAGGTGAT-3′)(下划线为PstI酶切位点)，从水稻籼稻品种明恢63(见《遗传资源来源披露登记表》)的DNA中扩增得到由576个核苷酸组成的P_D54O-544启动子(包括P_D54O启动子中从-544bp到+32bp的区段，序列见序列表SEQ IDNO：1.所示)。同时利用上述两个引物和美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，采用双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)对PCR扩增产物进行测序以验证序列的正确性。测序结果显示，除本发明中来自明恢63的P_D54O-544启动子在-13位置处为碱基A，而来自粳稻品种农垦58(一个曾在中国进行过大面积推广应用的水稻品种)的P_D54O启动子(Cai等，2007)的-13处为碱基G外，P_D54O-544启动子的其他序列与P_D54O启动子相对应位置的序列完全相同(图1)。

实施例2：P_D54O-544启动子的应用

1.遗传转化载体的构建

本发明中应用到RNAi技术。这个技术途径的主要原理是：将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过检测目标基因mRNA的表达量并与转基因植株表型进行比对，从而验证目标基因的功能。

本发明中所用的遗传转化质粒D182R是在质粒D75R基础上改建的(图2)。D75R质粒是在基于RNAi的载体pDS1301上构建的(Chu等，2006)。pDS1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004)基础上改建的，利用烟草花叶病毒35S组成型、超量表达启动子驱动一个可以表达dsRNA的构件(construct)(Chu等，2006)。D75R的构建过程见Chu等(2006)中所述。D75R质粒的dsRNA构件的两个位点分别插入了一段Xa13基因的片段(650个核苷酸)的反向互补链(图2A)。

本发明的研究人员将D75R质粒中的35S启动子用P_D54O-544启动子替换，产生的新质粒被命名为D182R(图2B)。D182R的构建过程为：用限制性内切酶EcoRI和PstI消化实施例1中的PCR扩增产物，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后回收DNA片段，即P_D54O-544启动子，用T₄-DNA连接酶将其连入同样用上述两种内切酶消化后的pCAMBIA1301载体(Sun等，2004；见《遗传资源来源披露登记表》)上。利用PCR引物PMCG161F(5′-TTACTGCAGAGGATCAAGTGCAAAGGTC-3′)(下划线为PstI酶切位点)和PMCG161R(5′-AAGGCGATTAAGTTGGGTA-3′)从质粒D75R上扩增得到RNA干扰元件(不包含35S启动子)，用HindIII和PstI消化PCR扩增产物后，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后回收目标DNA片段，用T₄-DNA连接酶将其连入已含有P_D54O-544启动子的pCAMBIA1301载体的对应位置处，完成质粒D182R的构建。将D182R质粒和D75R质粒(作为实验对照)分别电转化(Sambrook和Russell，2001)进入农杆菌菌株EHA105(Sun等，2004)。

2.遗传转化和T₀代遗传转化植株分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005；Ge等，2006)分别将EHA105菌株携带的质粒D182R和D75R转入粳稻品种中花11(见《遗传资源来源披露登记表》)和籼稻家系IRBB13中(见《遗传资源来源披露登记表》)。中花11携带显性感病基因Xa13，IRBB13携带隐性抗病主效基因xa13(Chu等，2006)。因为显性Xa13和隐性xa13基因序列高度同源(Chu等，2006)，故可以用同一个RNAi遗传转化载体抑制这对等位基因的表达。

转化质粒D182R在水稻品种中花11和水稻家系IRBB13背景中分别产生57和26株遗传转化植株，它们分别被命名为D182RZH和D182R13。转化质粒D75R在中花11和IRBB13背景中分别产生29和14株遗传转化植株，它们分别被命名为D75RZH和D75R13。在这些遗传转化植株生长至孕穗期时，采用剪叶法(Sun等，2004)对其接种白叶枯病菌PXO99(见《遗传资源来源披露登记表》)。接种21天后调查病斑面积(病斑长度/病叶长度×％)。同时，利用遗传转化标记基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)的PCR引物Gus2F(5′-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3′)和Gus2R(5′-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCG-3′)扩增检测阳性遗传转化植株；利用PCR引物X13RT-1F(5′-CACGCCTTCACCATCCTGT3-3′)和X13RT-1R(5′-TAAAGTTCGGTAGTAATCCACAC-3′)，采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法(Zhou等，2002)检测随机选取的部分转基因植株中Xa13或xa13基因的表达量。

结果表明，与对照中花11或IRBB13和阴性遗传转化植株相比，所有阳性T₀代遗传转化植株的抗性显著(P＜0.05)增强(表1)。抗性增强的遗传转化植株中Xa13或xa13基因的表达量显著降低(图3)。在同一遗传背景(中花11或IRBB13)下，转化D182R和转化D75R的阳性遗传转化植株的抗性水平无明显差别(图3)。这些结果说明遗传转化植株的抗性增强可能是因为显性Xa13或隐性xa13基因表达量降低的原因；利用绿色组织特异性的P_D54O-544启动子或组成型35S启动子都可以有效抑制Xa13或xa13基因的表达。

表1.T₀代遗传转化植株对白叶枯病菌株PXO99的反应

(1)利用遗传转化标记基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)的PCR引物Gus2F和Gus2R扩增检测阳性遗传转化植株。+表示所检测植株携带遗传转化标记基因GUS，为阳性植株；-表示所检测植株不携带遗传转化标记基因GUS，为阴性植株。

(2)每株遗传转化植株接种3-5片叶，21天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自多个叶片的平均值±标准差。

调查所有T₀代遗传转化植株的结实率概况，结果显示转化D75R质粒的阳性植株的结实率明显低于转化D182R质粒阳性植株的结实率。在中花11遗传背景下，转化D182R的阳性遗传转化植株的结实率在60％-80％之间，与阴性遗传转化植株和对照中花11相比无明显差异；转化D75R的阴性遗传转化植株的结实率在60％-80％之间，阳性遗传转化植株的结实率在20％以下，其中D75RZH15、D75RZH30两株阳性遗传转化植株结实率为0。在IRBB13遗传背景下，转化D182R的阳性遗传转化植株的结实率约为70％，与阴性遗传转化植株和对照IRBB13相比无明显差异；转化D75R的阴性转化植株的结实率约为70％，阳性遗传转化植株的结实率在20％以下，其中D75R13-1、D75R13-4、D75R13-15三株阳性遗传转化植株结实率为0，D75R13-2、D75R13-3两株阳性遗传转化植株的成熟种子不足20颗。这些结果表明，利用组织特异性的P_D54O-544启动子不仅能够有效地抑制Xa13或xa13基因的表达，而且不会影响植株的结实率。

3.遗传转化植株的共分离分析

为了进一步验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与Xa13或xa13基因的表达量的降低相关，选取T₀代抗性增强且Xa13或xa13基因的表达量显著降低的T₁代家系(D75RZH1、D75RZH4、D75R13-2、D75R13-3、D182RZH29、D182RZH41、D182R13-20、D182R13-28)进行基因型和抗性共分离分析。在孕穗期时接种白叶枯病菌PXO99，接种21天后调查病斑面积。同时取植株的叶片抽取DNA，采用遗传转化载体所携带的报告基因GUS的PCR引物Gus2F(5′-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3′)和Gus2R(5′-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACCG-3′)扩增检测阳性遗传转化植株。

分析发现，D75RZH1、D75RZH4、D75R13-2和D75R13-3(由组成型启动子35S调控RNAi构件抑制Xa13或xa13基因)T₁代家系的全部植株对白叶枯病菌PXO99的表型与对照相似。这些植株都不携带遗传转化的标记基因GUS(图4)，即它们都是阴性植株。该结果验证了Chu等(2006)的结果；Chu等(2006)研究发现组成型抑制显性Xa13或隐性xa13基因影响了植株的生殖发育，从而导致植株结实率严重下降，仅仅少量不携带RNAi构件的受精卵能够发育成种子，使得由此而获得的抗病性状无法遗传。

而D182RZH29、D182RZH41、D182R13-20和D182R13-28(由启动子P_D54O-544调控RNAi构件抑制Xa13或xa13基因)T₁代家系中出现抗病和感病表型的分离。与对照相比，所有抗性增强的遗传转化植株都携带标记基因GUS，而所有抗性没有增强的遗传转化植株都不携带GUS(图5)。这些结果表明用启动子P_D54O-544调控的对Xa13或xa13基因的抑制能够使植株获得良好的抗病性，这种抗病性状能够稳定地遗传同时不会影响植株的结实率。

以上研究结果证实P_D54O-544启动子的应用能够在不影响植株结实率的前提下，提高植株的抗性水平。因为显性Xa13和隐性xa13都是水稻生殖发育所必需的基因，Xa13或xa13基因在花器官中表达是水稻正常生殖发育的必要条件(Chu等，2006)。利用P_D54O-544启动子调控RNAi构件抑制显性Xa13或隐性xa13基因都不影响遗传转化植株的结实率，说明P_D54O-544启动子调控的DNA不在种子中表达。因此，P_D54O-544启动子不仅可以用于水稻的抗性改良，也可以在水稻改良中用于调控其他基因。因为转入的基因不在种子中表达，由此培育出来的水稻可以解除人们对转基因食品安全性问题的顾虑。

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Claims (2)

1.一种用于水稻抗病性改良的、截短的水稻绿色组织特异启动子P_D54O-544，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的启动子在改良水稻抗病性方面的应用，其特征在于它调控的基因不在胚和胚乳中表达。

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