CN105274113B - miR1432在水稻干旱胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR1432在水稻干旱胁迫中的应用。本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用；所述miR1432的核苷酸序列为序列表中序列1。本发明的实验证明，本发明通过干扰野生型水稻中的miR1432的表达，得到转基因水稻，其与未干扰的野生型水稻相比，抗干旱胁迫。因此，miR1432可用于水稻高抗旱育种，丰富现有的水稻育种材料的遗传多样性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及miR1432在水稻干旱胁迫中的应用。
背景技术
Ca2+在植物细胞信号转导中居于中心位置，是胞内重要的信号分子，它在植物生长发育以及逆境胁迫反应中发挥重要作用。植物在遭受不同的胁迫时，大都需要通过改变胞内钙离子浓度来调动不同的生理过程以应对逆境。而胞内钙离子浓度[Ca2+]cyt的变化主要依靠膜上钙离子转运系统来实现，该转运系统对于[Ca2+]cyt的平衡起到关键作用。最近，有研究指出，在动物和番茄中某些miRNA可以靶向调控膜上钙离子转运基因，影响动、植物的生长发育。但到目前为止，除了番茄外，其它植物中都未见相关的研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒的用途。
本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用；
所述miR1432的核苷酸序列为序列表中序列1。
本发明的另一个目的是提供miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒的用途。
本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育高抗旱性植物中的应用。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
抑制miR1432表达的物质在调控植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。
抑制miR1432表达的物质在提高植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述抑制miR1432表达的物质为如下1)或2)：
1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
本发明第三个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中miR1432表达，得到转基因植物；
所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物。
上述方法中，所述抑制目的植物中miR1432表达为将抑制miR1432表达的物质导入目的植物。
上述方法中，所述抑制miR1432表达的物质为如下1)或2)：
1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒；
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
本发明第四个目的是提供一种抑制miR1432表达的物质。
本发明提供的抑制miR1432表达的物质，为如下1)或2)：
1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
本发明的实验证明，本发明通过干扰野生型水稻中的miR1432的表达，得到转基因水稻，其与未干扰的野生型水稻相比，抗干旱胁迫。因此，miR1432可用于水稻高抗旱育种，丰富现有的水稻育种材料的遗传多样性。
附图说明
图1为miR1432靶基因鉴定。
图2为OE-miR1432干旱胁迫表型分析。
图3为OE-miR1432干旱胁迫表型分析。
图4为OE-eTM1432干旱胁迫表型分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、miR1432的功能验证
1、miR1432靶向调控基因的确定
将通过PsRobot(http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/)中microRNA靶基因预测工具，预测miR1432的靶基因，然后利用Ambion公司的RLM-RACE试剂盒(AM1700)进行5’RACE，进一步验证miR1432的靶基因。
MiRNA通常需要通过其调控靶基因来参与生物学过程，为了研究miR1432的功能，首先通过软件psRobot预测其靶基因，然后通过RLM-5’RACE实验验证，一类钙泵基因(3个ACA基因能被miR1432靶向调控，它们是LOC_Os02g08010、LOC_Os04g51610和LOC_Os08g40530。RLM-5’RACE得到的特异性片段测序显示miR1432介导的靶基因mRNA的切割位置如图1所示。
2、miR1432基因的获取
根据水稻基因组序列设计miR1432的特异引物P1和P2，引物序列如下：
miR1432-P1：ATCTAGAATGAGGGAGGATGTGCGTTC
miR1432-P2：TCTGCAGGAAACCGAAGAATCATCGAGG
提取日本晴水稻(O.Sativa L.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野生型水稻；Loss of Function of OsDCL1Affects MicroRNA Accumulation and CausesDevelopmental Defects in Rice,Plant Physiology,2005,V139(1)296-305；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)的RNA，反转录得到cDNA为模板，用miR1432-P1和miR1432-P2进行PCR扩增，得到207bp的扩增产物，经过测序，该扩增产物具有序列表中序列2，为miR1432基因，编码miR1432，其核苷酸序列为序列1。
上述扩增反应体系如下表1：
表1 为扩增反应体系
上述扩增反应程序如下表2：
表2 为扩增反应程序
3、miR1432过表达载体的构建
将上述2获得的PCR产物用XbaⅠ和PstⅠ限制性内切酶酶切，与经过同样酶切的表达载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA，澳大利亚)连接，得到重组载体，命名为OE-miR1432，表达miR1432，该重组载体为将序列2所示的DNA分子替换表达载体pCAMBIA2300的XbaⅠ和PstⅠ酶切位点间的DNA片段。
4、miR1432敲低表达载体的构建
在水稻基因组上通过miR1432的target mimic的分析，发现了一个可以通过target mimicry方式负向调控miR1432的序列，设计扩增这段序列的特异引物:
eTM1432-P1:ATCTAGAGGTAGGTGTGGCGCGGTATT
eTM1432-P2:TCTGCAGCGAGTGGTTCGGCAAGGGGA
提取日本晴水稻(O.Sativa L.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野生型水稻；Loss of Function of OsDCL1Affects MicroRNA Accumulation and CausesDevelopmental Defects in Rice,Plant Physiology,2005,V139(1)296-305；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)的RNA，反转录得到cDNA为模板，用eTM1432-P1和eTM1432-P2进行PCR扩增，得到353bp的扩增产物，经过测序，该扩增产物具有序列表中序列3所示的核苷酸。
将上述PCR产物用XbaⅠ和PstⅠ限制性内切酶酶切，与经过同样酶切的表达载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA，澳大利亚)连接，得到重组载体，命名为OE-eTM1432，为将序列3所示的DNA分子替换表达载体pCAMBIA2300的XbaⅠ和PstⅠ酶切位点间的DNA片段。
5、转基因水稻的获得
1)农杆菌转化获得转基因水稻
将上述3获得的重组载体OE-miR1432和上述4获得的重组载体OE-eTM1432分别导入农杆菌AGL1(ATCC No.BAA-101，购自ATCC)，得到重组菌AGL1/OE-miR1432和重组菌AGL1/OE-eTM1432。
将重组菌AGL1/OE-miR1432和重组菌AGL1/OE-eTM1432通过农杆菌介导的方法转入日本晴水稻(O.Sativa L.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野生型水稻；Lossof Function of OsDCL1Affects MicroRNA Accumulation and Causes DevelopmentalDefects in Rice,Plant Physiology,2005,V139(1)296-305；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)中，得到T0代转OE-miR1432水稻和T0代转OE-eTM1432水稻。
2)PCR鉴定
提取T0代转OE-miR1432水稻和T0代转OE-eTM1432水稻的基因组DNA，然后用35S启动子的特异引物P3和miR1432-P2的特异引物和eTM1432-P2的特异引物，分别进行OE-miR1432和OE-eTM1432转基因植物的PCR鉴定。
P3引物序列如下：P3：TGCTTCGTCAGGCTTAGATGTG
引物P3和miR1432-P2的特异引物扩增T0代转OE-miR1432水稻，得到369bp的为阳性T0代转OE-miR1432水稻。
引物P3和eTM1432-P2的特异引物扩增T0代转OE-eTM1432水稻，得到515bp的为阳性T0代转OE-eTM1432。
将上述PCR鉴定均为阳性的植株命名为阳性T0代转OE-miR1432水稻和阳性T0代转OE-eTM1432水稻。
使用复能基因的miRNA检测试剂盒(All-in-OneTM miRNA qRT-PCR DetectionKit，购自GeneCopoeia)，使用miR1432特异引物miR1432-qs(ATCAGGAGAGATGACACCGAC)与试剂盒里的引物按照试剂盒的方法进行定量PCR检测，发现OE-eTM1432水稻中miR1432表达显著下降(图2)。
6、功能验证
将阳性T0代转OE-miR1432水稻1(OE-miR1432-1)、阳性T0代转OE-miR1432水稻2(OE-miR1432-3)、阳性T0代转OE-eTM1432水稻1(OE-eTM1432-1)和阳性T0代转OE-eTM1432水稻1(OE-eTM1432-2)水培生长约15天，移栽到含有20％(质量百分含量)PEG的水培液中处理12天，而后正常培养，观察其萎蔫及复水后水稻生长情况。以野生型水稻为对照。每个株系30株，实验重复3次，结果取平均值。
阳性T0代转OE-miR1432水稻水培生长约15天后(图3A)，转移到含有20％PEG的水培液中培养12天(图3B)，可以看出OE-miR1432萎蔫程度远远大于对照。而后复水，4天时(图3C)，可以明显看出OE-miR1432存活率显著低于对照。将阳性T0代转OE-miR1432水稻1(OE-miR1432-1)和阳性T0代转OE-miR1432水稻2(OE-miR1432-3)的叶皮进行了离体叶片失水实验。取正常生长日本晴叶片和OE-miR432的叶片，快速放于滤纸上称重M1，然后放于室内自然晾干，并按照不同的时间间隔同时记录日本晴和OE-miR432叶片的失水后重量M2。每个样本取10个叶片，三个重复。通过公式，失水率＝(M1-M2)/M1,计算不同时间的失水率，结果如图3D所示，显示OE-miR1432转基因水稻的叶片失水显著快于对照。阳性T0代转OE-eTM1432水稻1(OE-eTM1432-1)和阳性T0代转OE-eTM1432水稻1(OE-eTM1432-2)结果如图4所示，其中，图4A为20％PEG处理之后复水2d结果，可以看出，OE-eTM1432长势明显好于对照，图4B为离体叶片失水实验，可以看出，OE-eTM1432的失水显著慢于对照。
通过以上实验证明，降低miR1432表达可以增强水稻抗旱能力。
Claims (5)
1.抑制miR1432表达的物质在提高植物抗旱性中的应用；
所述抑制miR1432表达的物质为如下1）或2）：
1）核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2）含有1）的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒；
所述植物为单子叶植物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述单子叶植物为水稻。
3.一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中miR1432表达，得到转基因植物；
所述抑制目的植物中miR1432表达为将抑制miR1432表达的物质导入目的植物；
所述抑制miR1432表达的物质为如下1）或2）：
1）核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2）含有1）的组载体、表达盒、重组菌或重组病毒；
所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物；所述植物为单子叶植物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述单子叶植物为水稻。
5.一种抑制miR1432表达的物质，为如下1）或2）：
1）核苷酸序列为序列3的DNA片段；
2）含有1）的组载体、表达盒、重组菌或重组病毒。
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|---|---|---|---|
| CN201510817378.5A Active CN105274113B (zh) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | miR1432在水稻干旱胁迫中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105274113B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710341A (zh) * | 2013-12-16 | 2014-04-09 | 河南农业大学 | 一种miR1432靶基因串联模拟物、基因表达盒、表达载体、制备方法及应用 |
-
2015
- 2015-11-23 CN CN201510817378.5A patent/CN105274113B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710341A (zh) * | 2013-12-16 | 2014-04-09 | 河南农业大学 | 一种miR1432靶基因串联模拟物、基因表达盒、表达载体、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| GenBank 登录号：GQ418449.2;Wang,Y. 等;《NCBI》;20100614;参见序列部分 * |
| Identification of novel and candidate miRNAs in rice by high throughput sequencing;Ramanjulu Sunkar 等;《BMC Plant Biology》;20080229;第8卷(第25期);第1-17页 * |
| microRNAs as promising tools for improving stress tolerance in rice;Anca Macovei 等;《Plant Signaling&Behavior》;20120802;第7卷(第10期);第1296-1301页 * |
| miRNA expression patterns of Triticum dicoccoides in response to shock drought stress;Melda Kantar 等;《PLANTA》;20101111;第233卷(第3期);第471-484页 * |
| PMTED: a plant microRNA target expression;Xiuli Sun 等;《BMC Bioinformatics》;20130603;第14卷(第1期);第471-484页 * |
| 毛竹miR397和miR1432的克隆及其逆境胁迫响应表达分析;王丽丽 等;《林业科学》;20150630;第51卷(第6期);第63-70页 * |
| 水稻MAPKKs基因功能鉴定和microRNAs靶模拟材料构建;张小庆;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20120515(第05期);第D047-29页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105274113A (zh) | 2016-01-27 |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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