BR112014019593B1 - Método para produzir uma planta com resistência à seca melhorada - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA MELHORAR A RESISTÊNCIA À SECA DE UMA PLANTA E PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TENDO UMA RESISTÊNCIA MELHORADA À SECA, E, USOS DE UMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, DE AMINOÁCIDOS E DE UMA PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, OU PRODUTO DE PLANTA. A presente invenção refere-se a um novo método para aumentar a resistência à seca de uma planta. O método abrange o dano de expressão de um gene ou genes na referida planta. Em comparação com uma planta não manipulada para prejudicar a expressão do(s) referido(s) gene(s), as plantas exibem uma resistência melhorada à seca. São também providas plantas e produtos de planta, que podem ser obtidos através do método de acordo com a invenção.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um método para aumentar a resistência à seca de uma planta. O método abrange o dano da expressão de um gene ou genes ou de uma proteína na referida planta. Em comparação com uma planta não manipulada para debilitar a expressão do(s) referido(s) gene(s) ou proteína (s), as plantas exibem uma resistência melhorada à seca. São também providas plantas e produtos de planta que podem ser obtidos através do método de acordo com a invenção.

Fundamentos da Invenção:

[0002] Os estresses abióticos, tais que a seca, a salinidade, as temperaturas extremas, a toxicidade química e os estresses oxidativos são ameaças à agricultura e constituem a causa primária de perda de colheitas em todo o mundo (Wang et al. (2003), Planta 218 (1) 1-14).

[0003] Na técnica, vários relatórios estão disponíveis, que abordam os fundamentos bioquímicos, moleculares e genéticos do estresse abiótico (Wang et al. (2003), Planta 218 (1) 1-14 de Kilian et al (2007) Planta J 50 (2) 347-363). A modificação da planta para lidar com o estresse abiótico é baseada, de um modo frequente, na manipulação de genes, que protegem e mantêm a função e a estrutura dos componentes celulares. No entanto, devido a respostas geneticamente complexas a condições de estresse abiótico, tais plantas parecem mais difíceis de serem controladas e engenheiradas. Wang, (Wang et al. (2003) Planta 218 (1) 1- 14), inter alia, menciona que uma das estratégias de engenharia genética é baseada no uso de um ou de vários genes, que ou estão envolvidos na sinalização e em vias regulatórias, ou que codificam as enzimas presentes em vias, que conduzem à síntese de protetores funcionais e estruturais, tais que osmolitas e antioxidantes, ou que codificam as proteínas que conferem a tolerância ao estresse.

[0004] Embora melhoramentos para que sejam providas plantas tolerantes ao estresse abiótico tenham sido relatados, a natureza dos mecanismos geneticamente complexos, subjacentes a estes, provê uma necessidade constante quanto a um melhoramento adicional neste campo. Por exemplo, foi ainda relatado que as plantas tolerantes à seca transformadas geneticamente podem ainda exibir um crescimento mais lento e uma biomassa reduzida (Serrano et al. (1999) J. Exp. Bot. 50: 1023 - 1036) devido a um desequilíbrio no desenvolvimento e na fisiologia, tendo, deste modo, um custo de adaptação significativo, em comparação com as plantas que não são transformadas (kasuga et al. (1999), Nature Biot. Vol. 17; Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol. 23, N° 11).

[0005] Várias abordagens biotecnológicas são ainda propostas, de um modo a que sejam obtidas plantas, que cresçam sob condições de estresse. Plantas com uma resistência aumentada ao estresse salino são, por exemplo, expostas na WO 03/ 20015. O documento expõe ainda plantas transgênicas, que são resistentes ao estresse salino por meio da utilização de ácidos dioxigenase nucleicos 9-cis-epoxicarotenóides e de polipeptídeos.

[0006] Plantas com uma resistência à seca aumentada são expostas, por exemplo, nas US 2009/0144850, US 2007/0266453, e na WO 2002/083911. A US 2009/ 0144850 descreve uma planta, que exibe um fenótipo de tolerância à seca, devido a uma expressão do ácido nucleico DR02. A US 2007/0266453 descreve uma planta, que exibe um fenótipo de tolerância à seca, devido a uma expressão alterada de um ácido nucleico DR03 e a WO 2002/083911 descreve uma planta tendo uma tolerância ao estresse da seca aumentada, devido a uma atividade reduzida de um transportador ABC, que é expressado em células de proteção. Um outro exemplo consiste no trabalho de Kasuga e de coautores (1999), que descrevem que a superexpressão de DREB1A, que codifica o cDNA em plantas transgênicas, ativou a expressão de muitos genes tolerantes ao estresse sob condições de crescimento normais e resultou em uma tolerância melhorada à seca, à carga de sal, e ao congelamento. No entanto, a expressão de DREB1A também resultou em um retardo do crescimento severo sob condições de crescimento normais (kasuga (1999) Nat. Biotechnol. 17 (3) 287- 291). Permanece ainda uma necessidade quanto a uma nova metodologia, alternativa e/ ou adicional, para que seja aumentada a resistência ao estresse abiótico, e de um modo particular ao estresse abiótico, tal que a seca.

[0007] Constitui um objeto da invenção atual, que sejam providos novos métodos para aumentar a resistência à seca em uma planta. Com uma tal planta é possível, por exemplo, que seja produzida mais biomassa e ou mais colheita e produtos de planta derivados da mesma, se desenvolvida sob condições de baixa disponibilidade de água/seca, em comparação com as plantas, que não foram submetidas ao método de acordo com a invenção.

Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção provê um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca, comparada a uma planta de controle, que compreende o estágio de debilitar a expressão de uma proteína UPL em uma planta, a referida proteína UPL compreendendo uma sequência de aminoácido, que compreende pelo menos um domínio Pfam HECT de acordo com a PF 00632 e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM, de acordo com o modelo SSF 48371, e opcionalmente a regeneração da referida planta.

[0009] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção provê ainda um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca, comparada a uma planta de controle, que compreende o estágio de debilitar a expressão da proteína funcional UPL4 em uma planta, célula de planta ou protoplastro de planta, em que a referida proteína funcional UPL4 compreende uma sequência de aminoácido, que compreende pelo menos 35% de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:2, e opcionalmente a regeneração da referida planta.

[00010] A referida proteína funcional UPL4 pode ainda compreender uma sequência de aminoácido, que compreende pelo menos um domínio Pfam HECT Pfam de acordo com a PF 00632 e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM, de acordo com o modelo SSF 48371.

[00011] A proteína funcional UPL4 pode ser uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência melhorada à seca, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não está expressada.

[00012] A invenção é adicionalmente dirigida a um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca, comparada a uma planta de controle, que compreende o estágio de debilitar a expressão da proteína funcional UPL4 em uma planta, célula de planta, ou protoplastro de planta, em que a referida proteína funcional UPL4 compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos um domínio Pfam HECT de acordo com a PF 00632 e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM de acordo com o modelo SSF 48371, e opcionalmente a regeneração da referida planta.

[00013] A invenção também se refere a um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca comparada a uma planta de controle, que compreende o estágio de debilitar a expressão da proteína UPL4 funcional, em que a referida proteína funcional UPL4 é codificada por uma sequência de ácido nucleico, que compreende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 60% de identidade com a referida sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, e opcionalmente a regeneração da referida planta.

[00014] A proteína funcional UPL4 pode ser uma proteína, que quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada com a resistência à seca da referida linhagem inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não está expressada.

[00015] O estágio de debilitar a expressão da proteína funcional UPL4 pode ainda compreender ainda a mutação da sequência de ácido nucleico, que codifica a referida proteína UPL4 funcional. A mutação da referida sequência de ácido nucleico pode envolver uma inserção, uma deleção e/ ou substituição de pelo menos um nucleotídeo. O estágio de debilitar a expressão pode compreender o silenciamento do gene. O estágio de debilitar a expressão pode compreender ainda debilitar a expressão de duas ou mais proteínas UPL4 funcionais na referida planta.

[00016] O método pode ainda compreender o estágio de produzir uma planta ou produto de planta a partir da planta tendo uma resistência melhorada à seca.

[00017] A invenção também se refere ao uso de uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 35 % de identidade com a sequência de aminoácido SEQ ID NO:2 ou com uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1 nos testes quanto à resistência à seca em plantas.

[00018] A invenção é dirigida ao uso de uma sequência de aminoácido de UPL4 tendo uma SEQ ID NO:2 ou uma sequência de ácido nucleico de UPL4 da SEQ ID NO:1 nos testes quanto à resistência à seca em plantas Arabidopsis thaliana.

[00019] A invenção refere-se ainda ao uso de pelo menos parte de uma sequência de ácido nucleico de UPL4 da SEQ ID NO:1 ou de pelo menos parte de uma sequência de aminoácido de UPL4 da SEQ ID NO:2 como um marcador para a criação de plantas Arabidopsis thaliana resistentes à seca.

[00020] A invenção provê ainda o uso de uma proteína UPL4 funcional, tal como aqui definido, para a modulação, de um modo preferido para o aumento, da resistência à seca de uma planta.

[00021] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê o uso de uma planta, célula de planta, ou produto de planta, em que a expressão da proteína funcional UPL4 é debilitada, em que a proteína funcional UPL4 é uma proteína, que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resultando em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não é expressada para o crescimento sob condições de estresse de seca, em que as referidas condições de estresse de seca causam com que uma planta de controle, uma célula de planta ou um produto de planta, em que a expressão da referida proteína funcional UPL4 não está debilitada, mostre sinais de estresse de seca, tais que sinais de murchamento, mais precocemente do que a planta, célula da planta, ou produto da planta, em que a expressão da proteína funcional UPL4 é debilitada.

[00022] A invenção também ensina que uma planta Solanun lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale, ou Brassica napus, célula de planta, ou produto de planta, em que a expressão de uma proteína funcional UPL4 é debilitada, em que a proteína funcional UPL4 é uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana, tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não está expressada. A referida planta, célula de planta, ou produto de planta pode ainda compreender um gene UPL4 endógeno rompido.

Breve Descrição dos Desenhos

[00023] A Figura 1 mostra os resultados de um experimento típico, descrito nos Exemplos 1 e 2.

[00024] A Figura 2 mostra o fenótipo resistente à seca de knockout de UPL4 (mutante de inserçãoAt5g02880 Arabidopsis), quando comparado ao fenótipo sensitivo à seca de uma planta de controle (tipo selvagem).

[00025] A Figura 3 mostra a sobrevivência à seca do mutante de inserção At5g02880 (UPL4). O mutante de inserção At5g02880 Arabidopsis thaliana sobreviveu à seca de um modo significativamente melhor (p < 0,05) do que as plantas do tipo selvagem (Col-0) ou os mutantes de inserção At5g02880 complementados com a sequência de codificação (CDS) de At5g02880 ( SEQ ID NO:1; controle positivo) e os homólogos de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3), Brassica rapa ( SEQ ID Nos: 5 ou 7), Solanum lycopersicum (SEQ ID NO:9) ou Oryza sativa (SEQ ID NO: 11). Esta figura demonstra que a mutação da inserção no gene UPL4 produz um fenótipo resistente à seca. Além disso, ela também indica que os homólogos deste gene de espécies monocotiledôneas e dicotiledôneas operam de um modo a restaurar o fenótipo suscetível à seca normal. Deste modo, estes homólogos executam a mesma função na tolerância à seca em suas espécies de colheita respectivas. A observação de que ambos os genes UPL4 monocotiledôneos e dicotiledôneos podem restaurar a suscetibilidade à seca quando inseridos no mutante de inserção UPL4 de Arabidopsis sugere que uma atividade reduzida da proteína codificada pelo gene UPL4 torna os fenótipos tolerantes à seca em todo o domínio da planta. Deste modo, a previsão de que o UPL4 (baseada em pesquisas de homologia e de domínio característico [HECT] e na sequência de repetição de Armadillo) irá permitir a identificação dos homólogos de UPL4 da planta na espécie da planta. Subsequentemente, é possível usar métodos bem conhecidos para reduzir a atividade da proteína destes homólogos de planta (por exemplo, mutagênese, TDNA ou inserção de transposon, RNAi, etc.) de um modo a que sejam obtidas plantas resistentes à seca. As barras cinzas possuem valores significativamente mais baixos (p < 0,05) do que as barras pretas.

[00026] A Figura 4 mostra o fenótipo de seca de um mutante de UPL4 de tomate (Solanum lycopersicum). Uma população M2 de segregação contendo homozigotos, heterozigotos e alelos do tipo selvagem foi usada para um experimento de seca. A fotografia - tomada 21 dias após a iniciação do tratamento da seca- mostra uma planta de tomate do tipo selvagem (à direita) e uma planta que porta a mutação V158E no Sig98247 (à esquerda). Os fenótipos tolerantes à seca e a sobrevivência do tratamento de seca foram significativamente melhores (p < 0,1) para a planta que porta a mutação V158E no Sig98247, comparada aos alelos do tipo selvagem, indicando que esta alteração na proteína conduz a um fenótipo tolerante à seca no tomate.

Definições

[00027] Na descrição que se segue e nos exemplos, um número de termos foram usados. De um modo a que seja proporcionada uma compreensão clara e consistente do relatório e das especificações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as seguintes definições são providas. A não ser que aqui definido de um outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados possuem o mesmo significado que comumente entendido por aquele de habilidade ordinária na técnica, à qual esta invenção pertence. As exposições de todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências são aqui incorporadas, em sua totalidade, a título referencial.

[00028] Os métodos para a execução das técnicas convencionais, usadas nos métodos da invenção, serão evidentes para o perito versado na técnica. A prática de técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, química computacional, cultura celular, DNA recombinante, bioinformática, genômica, sequenciamento e campos relacionados são bem conhecidos daqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, nas referências de literatura que se seguem: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Currente protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 e atualizações periódicas; e a série Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.

[00029] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo “compreender” e as suas conjugações é usado em seu sentido não limitativo, de um modo a significar que os itens que se seguem à palavra estão incluídos, mas que os itens não mencionados especificamente não estão excluídos. Ele abrange os verbos “consistindo essencialmente de”, assim como “consistindo de”.

[00030] Tais como aqui usadas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem os referentes plurais, a não ser que o contexto o indique claramente de um outro modo. Por exemplo, um método para o isolamento de “uma” molécula de DNA, tal como acima usado, inclui o isolamento de uma pluralidade de moléculas (por exemplo 10's, 100's, 100's, 10's de milhares, 100's de milhares, milhões, ou mais moléculas).

[00031] Alinhamento e alinhar: com o termo “alinhamento” e “alinhar” é compreendida a comparação de duas ou mais sequências de nucleotídeo, baseadas na presença de estiramentos curtos ou longos de nucleotídeos idênticos ou similares. Vários métodos para o alinhamento de sequências de nucleotídeo são conhecidos na técnica, tal como será adicionalmente explicado abaixo.

[00032] “Expressão de um gene” refere-se ao processo, em que uma região de DNA, que está ligada operacionalmente a regiões regulatórias apropriadas, em particular a um promotor, é transcrita ao interior de um RNA, que é biologicamente ativo, isto é, que é capaz de ser translacionado ao interior uma proteína ou em um peptídeo biologicamente ativo (ou fragmento de peptídeo ativo). “Expressão ectópica” refere-se à expressão em um tecido, no qual normalmente o gene não é expressado. “Expressão de uma proteína” é aqui usado, de um modo intercambiável, com o termo expressão de um gene. Este refere-se ao processo, no qual uma região de DNA, que está operacionalmente ligada a regiões regulatórias apropriadas, em particular a um promotor, é transcrita ao interior de um mRNA, que é subsequentemente translacionado ao interior de uma proteína ou peptídeo (ou fragmento de peptídeo ativo).

[00033] “Funcional”, em relação a proteínas UPL4 ou a variantes, tais que os ortólogos ou mutantes, e aos fragmentos), refere-se à capacidade do gene e/ou da proteína codificada para modificar a resistência à seca (quantitativa e/ ou qualitativa), por exemplo, através da modificação do nível de expressão do gene (por exemplo, por meio de superexpressão ou de silenciamento) em uma planta. Por exemplo, a funcionalidade de uma proteína UPL4, obtida a partir da espécie de planta X, pode ser testada através de vários métodos. De um modo preferido, se a proteína for funcional, o silenciamento do gene, que codifica a proteína na espécie de planta X, usando, por exemplo, os vetores de silenciamenento de gene, irá então conduzir a uma resistência melhorada à seca, como pode ser testado, tal como aqui explicado de um modo detalhado. Além disso, a complementação de um knockout de UPL4 com uma proteína funcional UPL4 será capaz de restaurar ou de conferir a característica, e neste caso irá restaurar a sensibilidade à seca. Aquele versado na técnica não terá dificuldades em testar a funcionalidade.

[00034] O termo “gene” compreende uma sequência de DNA, que compreende uma região (região transcrita), que é transcrita ao interior de uma molécula de RNA (por exemplo, mRNA) em uma célula, operacionalmente ligado a regiões regulatórias adequadas (por exemplo, um promotor). Um gene pode, deste modo, compreender várias sequências operacionalmente ligadas, tais que um promotor, uma sequência líder 5' compreendendo, por exemplo, sequência envolvidas na iniciação da translação, uma região de codificação (proteína) (cDNA ou DNA genômico) e uma sequência não translacionsda 3', que compreende sítios de sequência de terminação de transcrição.

[00035] O termo “cDNA” significa DNA complementar. O DNA complementar é produzido através da transcrição reversa do RNA em uma sequência de DNA complementar. As sequências de cDNA correspondem, deste modo, a sequências de RNA, que são expressadas a partir de genes. Como as sequências de mRNA, quando expressadas a partir do genoma, podem ser submetidas à separação, isto é, os introns são separados a partir do mRNA e os exons são unidos, antes que sejam translacionados no citoplasma em proteínas, sendo entendido que a expressão de um cDNA significa a expressão do mRNA que codifica para o cDNA. A sequência de cDNA pode, deste modo, não ser idêntica à sequência de DNA genômica, à qual ela corresponde como cDNA, podendo codificar apenas o quadro de leitura aberto completo, que consiste dos exons unidos, para uma proteína, enquanto que o DNA genômico é codificado e os exons são entremeados por sequência de intron. A modificação genética de um gene, que codifica o cDNA pode, deste modo, não apenas estar relacionada à modificação das sequências que correspondem ao cDNA, mas pode também envolver a mutação de sequências intrômicas do DNA genômico e/ ou de outras sequências regulatórias de gene daquele gene, desde que ela resulte no dano da expressão do gene.

[00036] “Identidade” é uma medida da identidade das sequências de nucleotídeo ou de sequências de aminoácido. De um modo geral, as sequências são alinhadas, de um modo a que a conjugação de ordem mais alta seja obtida. “Identidade” per se possui um significado reconhecido na técnica e pode ser calculada usando as técnicas publicadas. Vide, por exemplo: (COMPUTACIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M. E Griffin, H. G., eds. Humana Press, New Jersy, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, com Heinje, G, Academic Press, 1987; e SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. E. Devereux, J., eds. M Stockton Press, New York, 1991). Embora existam uma quantidade de métodos para medir a identidade entre duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo, o termo “identidade” é bem conhecido de pessoas versadas na técnica (Carillo, H., e Lipton, D. SIAM, J. Applied Math (1988) 48: 1073). Os métodos comumente empregados para determinar a identidade ou a similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados, àqueles expostos em GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed. Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo, H., e Lipton, D. SIAM J. Applied Math (1988) 48: 1073. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados, ao conjunto de programas GCS (Devereux J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12 (1): 387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. Et al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 403).

[00037] Como uma ilustração, por um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos, por exemplo, 95% de “identidade” a uma sequência de nucleotídeo de referência, que codifica um polipeptídeo de uma certa sequência, é intencionado que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo pode ainda incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de polipeptídeo de referência. Deste modo, o percentual de identidade de uma sequência de nucleotídeo para uma sequência de ácido nucleico de referência é calculado em relação ao comprimento total da sequência de ácido nucleico de referência. Em ainda outras palavras, de um modo a que seja obtido um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados e/ ou substituídos por um outro nucleotídeo, e/ ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5' e 3' da sequência de nucleotídeo de referência, ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, entremeadas ou individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[00038] De um modo similar, por um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido tendo, pelo menos, por exemplo, 95% de “identidade” a uma sequência de aminoácido de referência da SEQ ID NO:2, é intencionado que a sequência de aminoácido do polipeptídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto pelo fato de que a sequência de polipeptídeo pode incluir até cinco alterações de aminoácido por cada 100 aminoácidos do aminoácido de referência da SEQ ID NO:2. Deste modo, o percentual de identidade de uma sequência de aminoácido para uma sequência de aminoácido de referência é calculado em relação a todo o comprimento da sequência de aminoácido de referência. Em ainda outras palavras, de um modo a que seja obtido um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido de referência, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por um outro aminoácido, ou um número de aminoácidos de até 5 % dos resíduos de aminoácido totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminais da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, entremeadas ou individualmente entre os resíduos na sequência de referência em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[00039] Um ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ainda incluir qualquer polímero ou oligômero das bases de purina e pirimidina, de um modo preferido citosina, timina, e uracila, e adenina e guanina, respectivamente (vide Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, em 793-800 (Woth Pub., 1982), que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade, para todos os propósitos. A presente invenção contempla qualquer componente de ácido nucleico de deoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo ou peptídeo, e quaisquer variantes químicas dos mesmos, tais que as formas metilada, hidroximetilada ou glicosiladas destas bases, e os similares. Os polímeros ou oligômeros podem ser heterogêneos ou homogêneos em composição, e podem ser isolados a partir de fontes de ocorrência natural ou podem ser produzidos de um modo artificial ou sintético. De um modo adicional, os ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA, ou uma mistura dos mesmos, e podem existir permanentemente ou transicionalmente em uma forma de filamento único ou de filamento duplo, incluindo homoduplex, heteroduplex, e estados híbridos.

[00040] Tal como aqui usado, o termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma ligação dos elementos de polinucleotídeo em uma relação funcional. Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando ele é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor, ou preferivelmente uma sequência regulatória de transcrição, é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se ela afetar a transcrição da sequência de codificação. Operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas.

[00041] “Planta” refere-se ou à planta total ou a partes de uma planta, tais que as células, o tecido ou os órgãos (por exemplo, pólen, sementes, gametas, raízes, folhas, flores, botões de flor, antéreos, frutos, etc.) obteníveis a partir da planta, assim como aos derivados de qualquer um destes e à progênia derivada de uma tal planta em si mesma ou de cruzamento. “Célula(s) da planta” incluem protoplastos, gametas, culturas em suspensão, microesporos, grãos de pólen, etc., seja em isolamento ou dentro de um tecido, órgão ou organismo.

[00042] Tal como aqui usado, o termo “promotor” refere-se a um fragmento de ácido nucleico, que funciona para o controle da transcrição de um ou mais genes, localizados a montante com relação à direção de transcrição do sítio de iniciação de transcrição do gene, e estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, mas não limitadas, aos sítios de ligação do fator de transcrição, sítios de ligação de proteína ativadora e repressora e quaisquer outras sequências ou nucleotídeos conhecidos daqueles versados na técnica como agindo, de um modo direto ou indireto, para regular a quantidade de transcrição a partir do promotor. De um modo opcional, o termo “promotor” inclui aqui também a região UTR 5' (Região não translacionada 5') ( por exemplo, o promotor pode neste caso incluir uma ou mais partes a montante (5') do códon de iniciação de translação de um gene, pois esta região pode ter uma função na regulação da transcrição e/ou translação. Um promotor “constitutivo” é um promotor, que é ativo na maior parte dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor “indutível” é um promotor, que é regulado fisiologicamente (por exemplo, através da aplicação externa de certos compostos ) ou por meio de desenvolvimento. Um promotor “específico para tecido” apenas é ativo em tipos específicos de tecidos ou células. Um “promotor ativo em plantas ou em células de plantas” refere-se à capacidade geral do promotor para acionar a transcrição dentro de uma parte de uma planta ou de uma célula de planta. Não estão incluídas implicações sobre a atividade espaço- temporal do promotor.

[00043] Os termos “proteína” ou “polipeptídeo” são usados, de um modo intercambiável, e referem-se a moléculas, que consistem de uma cadeia de aminoácidos, sem referência a um modo de ação específico, tamanho, estrutura tridimensional ou origem. Um “fragmento” ou “porção” de uma proteína pode, deste modo, ser ainda referido como a uma “proteína”. Uma “proteína isolada” é usada para fazer referência a uma proteína, que não mais está em seu ambiente natural, por exemplo in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante.

[00044] “Planta transgênica” ou “planta transformada” refere-se, neste caso, a uma planta ou célula de planta, que foi transformada, por exemplo, por meio da introdução de uma mutação não silenciosa em um gene endógeno ou em uma parte do mesmo. Uma tal planta foi geneticamente modificada, de um modo a que sejam introduzidas, por exemplo, uma ou mais mutações, inserções e/ ou deleções no gene e/ ou inserções de um construto que silencia um gene no genoma. Uma célula de planta transgênica pode ainda referir-se a uma célula de planta em isolamento ou em cultura de tecido, ou a uma célula de planta contida em uma planta ou em órgão ou tecido diferenciado, e ambas as possibilidades estão aqui incluídas. Neste caso, uma referência a uma célula de planta na descrição ou nas reivindicações não significa fazer referência apenas a células isoladas ou a protoplastos na cultura, mas refere-se a qualquer célula de planta, em qualquer local que ela possa estar localizada ou qualquer tipo de tecido de planta ou órgão em que ela possa estar presente.

[00045] A troca de nucleotídeo alvejada (TNE) é um processo, pelo qual um oligonucleotídeo sintético, parcialmente complementar a um sítio em um gene cromossômico ou epissômico, dirige a reversão de um único nucleotídeo em um sítio específico. O TNE foi descrito por meio do uso de uma ampla variedade de oligonucleotídeos e objetivos. Alguns dos oligonucleotídeos relatados são quimeras de RNA/ DNA, contendo modificações terminais para conferir resistência a nuclease.

[00046] Tal como aqui usado, o termo “estresse de seca” ou “seca” refere-se a uma condição ambiental sub-ótima associada com a disponibilidade limitada de água para uma planta. A disponibilidade limitada de água pode ocorrer quando, por exemplo, a chuva está ausente ou está mais baixa e/ ou quando as plantas são regadas de um modo menos frequente do que o requerido. A disponibilidade de água limitada para uma planta pode também ocorrer quando, por exemplo, a água está presente no solo, mas não pode ser extraída, de um modo eficiente, pela planta. Por exemplo, quando os solos ligam a água fortemente ou quanto a água possui um alto teor de sal, pode ser mais difícil para uma planta extrair a água a partir do solo. Deste modo, muitos fatores podem ainda contribuir de um modo a resultar em uma disponibilidade de água limitada, isto é, de seca, para uma planta. O efeito de submeter plantas à “seca” ou ao “estresse da seca” pode ser de plantas que não apresentem um crescimento e/ ou desenvolvimento ótimo. As plantas submetidas à seca podem apresentar vários sinais de murchamento. Por exemplo, as plantas podem ser submetidas a um período de pelo menos 15 dias sob condições controladas específicas, em que nenhuma água é provida, por exemplo sem queda de chuva e/ ou rega das plantas.

[00047] O termo “resistência melhorada à seca” refere-se a plantas que, quando providas com uma resistência melhorada à seca, quando submetidas à seca ou ao estresse da seca não efetuam ou apresentam efeitos aliviados, tal como observado em plantas não providas com resistência melhorada à seca. Uma planta normal possui algum nível de resistência à seca. Ele pode ser facilmente determinado quando uma planta, provida com uma resistência melhorada à seca, sob condições controladas selecionadas, tais que o controle de sinais da planta de seca, pode ser observada após um certo período, isto é, quando as plantas são submetidas à seca ou ao estresse da seca. As plantas com uma resistência à seca melhorada irão presentar menos e/ ou sinais reduzidos de terem sido submetidas à seca, tais que o murchamento, quando comparadas com as plantas de controle. Aqueles versados na técnica saberão como selecionar as condições adequadas, tais que, por exemplo, as condições controladas nos exemplos. Quando uma planta possui uma “resistência melhorada à seca”, ela é capar de manter o crescimento normal e ou o desenvolvimento normal quando for submetida à seca ou ao estresse da seca, que iria, de um outro modo, ter resultado em um crescimento reduzido e/ ou em um desenvolvimento reduzido de plantas normais. Deste modo, uma “resistência melhorada à seca” é um termo relativo, determinado pela comparação de plantas, em que a planta mais capaz de sustentar um crescimento (normal) sob condições de estrese à seca é uma planta “resistente à seca melhorada”. Aqueles versados na técnica deverão estar conscientes de como selecionar as condições apropriadas para determinar a resistência à seca de uma planta e de como medir os sinais de secas, tal como descrito, por exemplo, nos manuais providos pelo IRRI, Breeding rice for drought prone environments, Fischer et al., 2003, e pelo CIMMYT, Breeding for drought and nitrogen stresss tolerance in maize: from theory to practice, Banzinger et al., 2000. Exemplos de métodos, que determinam uma resistência melhorada à seca em plantas são providos em Snow and Tingey, 1985, Plant. Physiol., 77, 602-7, and Harb et al. Analysis of drought stress in Arabidopsis, AOP 2010, Plant Physiology Review, e tal como descrito na seção de exemplos abaixo.

Descrição Detalhada da Invenção

[00048] A invenção atual refere-se à melhora da resistência à seca de uma planta por meio do dano à expressão de uma proteína funcional UPL4 na referida planta. A melhora é relativa a uma planta de controle, na qual uma tal modificação não foi introduzida ou não está presente, e em cuja expressão de uma proteína funcional UPL4 não está debilitada. Em ainda outras palavras, uma planta modificada de acordo com a invenção é, em comparação com a planta de controle, isto é, uma planta não modificada, mais capaz de crescer e de sobreviver sob condições de disponibilidade de água reduzida, privação de água (temporária) ou ainda condições de seca. Deve ser ainda entendido que, de acordo com a invenção, a modificação, por exemplo o dano à expressão da proteína UPL4 funcional, pode ainda envolver uma modificação genética, por exemplo, a expressão do gene UPL4, ou a troca de nucleotídeo alvejada.

[00049] A modificação genética inclui a introdução de mutações, inserções, deleções na sequência de ácido nucleico de interesse e/ou a inserção de construtos silenciadores de gene no interior de um genoma de uma planta ou de uma célula de planta, que objetiva a sequência de ácido nucleico de interesse. A modificação genética de uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, de um gene, que codifica o mRNA, pode não estar apenas relacionada à modificação de sequência exon de interesse, que correspondem à sequência de mRNA, mas pode também envolver a mutação de sequência intrônicas de DNA genômico e/ ou de outras sequências regulatórias de gene daquela sequência de ácido nucleico, por exemplo, gene.

[00050] No contexto da presente invenção, a proteína funcional UPL4 pode ser uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana, tendo um gene UPL4 endógeno rompido, tal que a linhagem de knockout At5g02880, por exemplo SALK_091246C (http://www.arabidopsis. org/servlets/SeedSearcher? Action =detail&stock_number=SALK_091246C) aqui citada, resulta em uma planta com uma resistência melhorada à seca, comparada com a resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, por exemplo, uma linhagem de knockout Ar5g02889, por exemplo, SALK_091246C, na qual a referida proteína funcional UPL4 não está expressada.

[00051] O termo “gene UPL4 endógeno rompido” é aqui usado para referir-se a um gene UPL4 naturalmente presente no genoma de uma planta que está rompida, por exemplo, interrompida, por exemplo por meio de uma inserção de T-DNA no interior do referido gene UPL4. A ruptura do referido gene UPL4 endógeno pode ainda resultar na ausência de expressão do referido gene UPL4 endógeno, e, deste modo, na ausência da proteína UPL4 endógena (seja funcional ou não funcional).

[00052] O termo “planta de controle”, como aqui usado, refere-se a uma planta da mesma espécie, de um modo preferido da mesma variedade, e preferivelmente de mesma base genética.

[00053] A invenção atual também se refere à modulação da resistência à seca de uma planta através da modificação da expressão da proteína funcional UPL4 na referida planta. A modulação é relativa a uma planta de controle (preferivelmente da mesma espécie e/ ou variedade, e preferivelmente de mesma base genética), na qual uma tal modificação não foi introduzida ou não está presente.

[00054] Em ainda um aspecto, a presente invenção provê um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca, comparada a uma planta de controle, que compreende o estágio de debilitar a expressão de uma proteína UPL em uma planta, a referida proteína UPL compreendendo uma sequência de aminoácido, que compreende pelo menos um domínio Pfam HECT de acordo com o PF00632 e pelo menos uma repetição da superfamília ARM de acordo com o modelo SSF 48371.

[00055] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca comparada a uma planta de controle, o método compreendendo o estágio de debilitar a expressão da proteína funcional UPL4 na referida planta.

[00056] “Debilitar a expressão de uma proteína UPL4 funcional”, tal como aqui usado, pode ainda compreender que a expressão do gene UPL4 é debilitada, e/ ou que a expressão do gene UPL4 é normal, mas a translação do mRNA resultante é inibida ou evitada (por exemplo, por interferência do RNA), e/ ou que a sequência de aminoácido da proteína UPL4 foi alterada, de tal modo que a atividade específica de ubiquitina proteína ligase seja reduzida, comparada à atividade específica de ubiquitina proteína ligase da proteína, tal como ilustrado na SEQ ID NO: 2, de um modo preferido sob condições fisiológicas, e em particular em condições fisiológicas idênticas. De um modo alternativo, uma proteína UPL4 pode se tornar não funcional ou menos funcional pela varredura da mesma por meio do uso de inibidores de UPL4, tais que um anticorpo que se liga especificamente à referida proteína UPL4, ou ainda outros inibidores de UPL4 por exemplo, proteínas que interrompem, evitam, ou reduzem a atividade de uma proteína UPL4, ou ainda inibidores químicos, tais que íons, ou metais, ou a varredura de cofatores. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente à referida proteína UPL4 pode ser expressado, de um modo simultâneo, com a referida proteína UPL4, deste modo reduzindo a sua atividade específica. A atividade específica de ubiquitina proteína ligase de uma proteína UPL4 pode ser considerada “reduzida” se a atividade específica de ubiquitina proteína ligase de uma tal proteína for estatisticamente significativamente menor do que a atividade específica de ubiquitina proteína ligase da proteína, tal como ilustrado na SEQ ID NO:2. A atividade específica de ubiquitina proteína ligase da proteína UPL4 pode, por exemplo, ser reduzida em pelo menos 5 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou mais. A expressão reduzida do gene UPL4 endógeno de uma planta pode ser alcançada através da alteração da sequência promotora, por exemplo, por meio do uso de mutagênese alvo. Aquele versado na técnica será capaz de determinar a atividade específica de ubiquitina proteína ligase, com base em métodos de rotina.

[00057] Os presentes inventores acreditam que debilitando a expressão (por exemplo, através da redução, repressão ou deleção da expressão e/ ou da atividade) da proteína UPL4 funcional, conduz-se à ausência ou a um nível reduzido da proteína UPL4 funcional, seja como uma consequência da baixa expressão, por exemplo, por meio de interferência de RNA, ou ainda como uma consequência da atividade/ funcionalidade diminuída da proteína UPL4, ou um ou mais dos acima, e que a referida ausência ou nível reduzido da proteína funcional UPL4 conduz a uma necessidade diminuída quanto à água ou à resistência melhorada à seca da referida planta.

[00058] As proteínas de Ubiquitina Proteína Ligase (UPLs) são conhecidas como estando envolvidas na regradação seletiva de proteínas regulatórias, tanto na levedura como em animais *Hibregtse et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 2563 - 2567, Pickart ( 20001) Annu. Rev. Biochem. 70, 503, 533). As proteínas destinadas à degradação são modificadas com uma cadeia de múltiplas Ubiquitinas e são então reconhecidas pelo proteossoma 26S. Uma classe importante destas proteínas de Ubiquitina Proteína Ligase é formada pelos HECT E3s, que compreendem um domínio de 350 aminoácidos, denominado o domínio HECT na extremidade C-terminal (baseada em sua homologia para o térmico C da Proteína E6-Associada humana (E6-AP) (Huibregtse et al. (1995) Proc. Natul. Acad. Sci. USA, 92, 2563- 2567). O domínio HECT inclui uma região altamente conservada, que circunda a cisteína posicionalmente não variante, requerida para catalisar a transferência de Ubiquitina.

[00059] De acordo com Downes et al. (2003, Plant J 35, 729- 742), as plantas também contêm E3s, com sete presentes na Arabidopsis: UPL1, UPL2, UPL3, UPL4, UPL5, UPL6 e UPL7. Downes et al. descrevem ainda que UPL1, UPL2, UPL3, UPL4, UPL5, UPL6 e UPL7 podem ser agrupados pela estrutura em quatro subfamílias baseadas nas posições intron/ exon dos genes correspondentes, sequência da proteína e comprimento, e na presença dos motivos de proteína adicionais à montante do domínio HECT: UPL 1/2, UPL 3/4, UPL 5, e UPL 6/7. A presença de uma variedade de domínios a montante no domínio HECT sugere que os membros individuais da família UPL1- UPL7 possuem conjuntos distintos de alvos e de funções (vide Downes et al. 20003, The Plant Journal, 35, 729- 742, e de um modo particular na Figura 1 do mesmo, quanto à maiores informações com referência às características distintas das diferentes proteínas UPL).

[00060] Em Arabidopsis thaliana, a Ubiquitina proteína Ligase 4 pode ser distinguida da Ubiquitina Proteína Ligase 3, por exemplo, na ausência de uma região de resíduo de 650 aminoácidos do término C da Ubiquitina Ligase 4 (Downes et al. (2003) Plant J 35, 729-742).

[00061] A Ubiquitina Proteína Ligase 4, tal como encontrada em Arabidopsis thaliana, foi relatado como tendo, aproximadamente, 54% de identidade de sequência de aminoácido para a Ubiquitina proteína Ligase 3 (Downes et al. (2003) Plant J 35, 729- 742). o Nome local da Ubiquitina Proteína Ligase 4 é At5g02880, e o nome ORF é F9G14 (ambos de acordo com www.uniprot/Q9LyZ7).

[00062] A proteína UPL4 de Arabidopsis thaliana compreende 1502 aminoácidos (tal como ilustrado na SEQ ID NO:2). A sequência de cDNA, que codifica a proteína UPL4 de Arabidopsis thaliana compreende 4506 nucleotídeos (ilustrados na SEQ ID NO:1). O gene UPL4 de Arabidopsis thaliana compreende 4506 nucleotídeos (ilustrados na SEQ ID NO:1). O gene UPL4 de Arabidopsis thaliana é também referido como a KL15 (para Kaktus Like no cromossoma 5) com base em sua similaridade com o gene KAKTUS em Arabidopsis (vide Refy et al. Mol Gen Genomics (2003) 270: 403-414).

[00063] Uma “proteína UPL4”, tal como aqui usada, compreende a proteína ilustrada na SEQ ID NO:2, assim como os fragmentos e variantes da mesma. As variantes de uma proteína UPL4 incluem, por exemplo, as proteínas tendo pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, tal que 100% de identidade da sequência de aminoácido, de um modo preferido ao longo do comprimento total, para a SEQ ID NO:2. A identidade da sequência de aminoácido é determinada em um alinhamento em pares usando o algoritmo de Nedleman e Wunsch e os parâmelhos de falha de GAP, tal como acima definido.

[00064] Uma planta Arabidopsis thaliana tendo uma inserção de T- DNA no gene que codifica UPL3 é conhecida a partir de Downes et al. ((2003) Plant J. 35, 729-742). Este mutante UPL3 apresenta um desenvolvimento de tricoma aberrante. Downes et al. Também descrevem uma planta Arabidopsis thaliana tendo uma isnerção de T-DNA no gene que codifica UPL4. Downes et al. Descrevem que, em contraste com o mutante UPL3, o mutante UPL4 não demonstrou fenótipos anormais quando desenvolvido sob condições de crescimento ótimas e desenvolveu tricomas normais.

[00065] Em ainda um outro aspecto, é provido um método para a produção de uma planta tendo uma resistência melhorada à seca, o método compreendendo o estágio de debilitar a expressão da referida planta de um gene, que codifica uma proteína UPL4.

[00066] “Expressão debilitada”, de acordo com a presente invenção, denota a ausência ou a presença reduzida de uma proteína de UPL4 funcional e de variantes da mesma, que compreendem uma sequência de aminoácido com mais do que 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, e 95% de identidade de sequência com a mesma. Ela também denota a ausência ou a presença reduzida das proteínas aqui descritas, que comprendem pelo menos um domínio Pfam HECT, PF 00632, e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM, modelo SSF 48371. Aqueles versados na técnica conhecem bem os muitos mecanismos disponíveis para si na técnica, de um modo a debilitar a expressão de um gene, por exemplo, em um nível de transcrição ou em um nível de translação.

[00067] Em ainda um outro aspecto, é aqui provido um método para aumentar a resistência à seca de uma planta, o método compreendendo o estágio de debilitar a expressão da referida planta de um gene, em que a sequência de aminoácido (ou proteína) codificada pelo referido gene compreende pelo menos um domínio Pfam HECT (PF 00632) e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM (modelo SSF 48371), tal como determinado na forma abaixo descrita. Deve ser ainda entendido que a frase “pelo menos um modelo de repetição da Superfamília SSF 48371” compreende quatro sequências de repetição de Armadillo a partir do gene UPL4 da sequência de aminoácido da Figura 3. Deste modo, a frase “pelo menos um modelo de repetição da Superfamília ARM SSF 48371” tem a intenção de compreender as quatro sequências de repetição de Armadillo.

[00068] Tal como aqui usado, “Pfam” ou “PFAM” refere-se a uma grande coleção de múltiplos alinhamentos de sequência e de modelos de Markov escondidos, que abrangem muitas famílias de proteína comuns, e que está disponível de http:// pfam. Sanger.ac.uk/. A base de dados Pfam contêm uma grande coleção de famílias de proteína, cada qual representada por múltiplos alinhamentos. Estes alinhamentos têm sido usados para construir os modelos de Markov escondidos (HMMs) para cada família de domínio de proteína. Os alinhamentos representam estruturas conservadas evolucionárias e a presença de um domínio em uma proteína de interesse pode ser indicativo no que se refere à sua função biológica. Perfis de modelos de Markov escondidos (perfis HMMs) construídos a partir dos alinhamentos de Pfam são úteis para o reconhecimento automático de que uma nova proteína pertence a uma família de proteína existente, mesmo se a homologia do alinhamento parecer ser baixa. Outras proteínas na mesma família de proteína são identificadas pela investigação da sequência de aminoácido de uma sequência de proteína contra o Modelo de Markov Escondido usando o software HMMER. O software HMMER (versão 3.0 de http://hmmmer. Janelia. Org/) é capaz de usar este HMM para pesquisar quanto à presença deste domínio em novas sequências. Os acertos das proteínas candidatas foram derivados tendo-se em consideração apenas HMMER e as suas sequências, que estavam acima do limiar de inclusão de falha.

[00069] A versão Pfam 24.0 (Outubro de 2009) contém os alinhamentos e os modelos para as famílias de proteína 11912 (vide base de dados de famílias de proteína Pfam: R. D. Finn, et Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38: D211-222). Pfam é baseada em uma base de dados de sequência denominada Pfamseq, que está baseada na liberação UniProt 15.6 (liberação Swiss-Prot 57.6 e liberação SP- TrEMBL 40.6).

[00070] Os alinhamentos na base de dados Pfam representa estruturas conservadas evolucionárias, que podem ser relevantes para a função de uma proteína. Os modelos de Markov escondidos (HMMs) construídos a partir dos alinhamentos de Pfam, são úteis para estabelecer se uma proteína pertence a uma família de proteína existente. Este é ainda o caso se a homologia/ identidade através de alinhamento for baixa. Uma vez, por exemplo, que uma proteína, que está envolvida em uma certa característica (por exemplo, sensibilidade à seca) é reconhecida, e, por exemplo, o dano à sua expressão confere uma característica melhorada (por exemplo, a resistência à seca), outras proteínas na mesma família de proteína podem ser ainda identificadas por aqueles versados na técnica através da comparação de uma sequência de aminoácido de uma proteína (e codificadas por um DNA candidato) contra o Modelo de Markov Escondido) usando um software HMMER (Http: hmmer. Janelia. Org/ versão. Versão HMMER 3.0 foi liberada em 28 de março de 2010).

[00071] Após o estabelecimento da presença de um domínio Pfam HECT (PF 00632) como acima descrito, uma proteína candidata tem que satisfazer ao requerimento de compreender pelo menos uma repetição da Superfamília ARM (modelo HMM SSF 48371; http: //supgam. org/SUPERFAMILY/cgibin/ scop.cg?ipid = SSF 48371; http:// supfam. Org/ SUPERFAMILY/ cgu-bin/ scop.cgi?ipid = SSF48371, tal como pode ser estabelecido, por exemplo, por meio do uso da aplciação InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/pfa/iprscan/; Quevillon et al. (2005) 33(2) W116- W120. E. M. Sdobnov and R. Apweiler (2001) Bioinformatics, 17, 847-848). Quevillon e os colegas descrevem que a InterProScan é uma ferramenta, que combina diferentes métodos de reconhecimento de assinatura de proteína das bases de dados de um membro do consórcio InterPro em uma fonte, com bases de dados disponíveis de publicidade distintas na aplicação. A proteína, assim como as sequências de DNA, podem ser analisadas. Uma versão baseada na web está acessível para as organizações acadêmicas e comerciais a partir do EBI (http: ///www.wbi.ac.uk/ interProScan/).

[00072] A anotação da SUPERFAMILY está baseada em uma coleção de modelos de Markov escondidos, que representam os domínios de proteína estrutrual no nível da superfamília SCOP. Uma superfamília agrupa domínios conjuntos, que possuem uma relação evolucionária. A anotação é produzida através do escaneamento de sequências de proteína a partir de cerca de 1.400 genomas completamente sequenciados contra os modelos de Markov escondidos.

[00073] Todo software é aplicado sob ajustes de falha.

[00074] De um modo resumido, um modelo de Markov Escondido para o domínio HECT (modelo PF 00632 http://pfam.sanger.ac.uk/family?acc= PF00632) foi obtido a partir da base de dados de Pfam (versão 24 de http://pfam.sanger.ac.uk) e colocado em um arquivo separado. O softwware HMMER foi usado para determinar que as sequência de proteínas amino são caracterizadas pelo domínio Pfam HECT. Em adição, o conjunto de proteína filtrado foi adicionalmente reduzido por meio do emprego do pacote Superfamily (usando o modelo SSF 48371 http://supfam. Org /SUPERFAMILY/ cgi-bin/ scop. Cg?ipid = SSF48371) da aplicação InterProScan (http:/www.ebi.ac.uk/ Tools/ pfa/iprscan/) (Quevillon et al., quanto a repetições ARM). Além disso, as sequências foram alinhadas usando a ferramenta de alinhamento múltiplo MUSCLE. A árvore filogenética foi inferida por meio do algoritmo de protpars do pacote PHYLIP. Proteínas (planta) satisfazendo a ambos os requerimentos (tendo um domínio Pfam HECT PF 006632 e uma repetição Erm do modelo SuperFamily SSF 48371) são proteínas de acordo com a invenção; e o dano à expressão das mesmas pode ser útil para que seja provida uma resistência melhorada à seca / aumentada à planta, e exemplos de tais proteínas e de cDNA são aqui expostos. Aqueles versados na técnica conhecem bem como efetuar a determinação e os testes, com base na informação provida acima.

[00075] Sem desejarmos estar limitados pela teoria, os atuais inventores especulam que a presença desta combinação ou domínios na proteína de acordo com a invenção aumenta a sensibilidade das plantas à seca, e que o dano à expressão de tais proteínas tendo estes domínios, melhora a resistência da planta à seca.

[00076] O dano no nível transcricional pode ser o resultado da introdução de uma ou mais mutações na transcrição de sequências de regulação, que incluem promotores, aumentadores, iniciação, terminação ou sequências de divisão de intron. Estas sequências estão localizadas, de um modo geral, 5' de, 3' de, ou dentro da sequência de codificação dos genes de acordo com a invenção. De um modo independente, ou ao mesmo tempo, o dano à expressão pode ser ainda provido através de deleção, substituição, rearranjo ou inserção de nucleotídeos na região de codificação dos genes.

[00077] Por exemplo, na seção de codificação, os nucleotídeos podem ser substituídos, inseridos, ou deletados, conduzindo à introdução de um, dois ou mais códons de interrupção prematuros. Além disso, a inserção, deleção, rearranjo ou substituição pode conduzir a modificações na sequência de aminoácido codificada, e deste modo então prover a expressão debilitada da proteína UPL4 funcional. Além disso, as partes grandes dos genes podem ser removidas, por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou até mesmo 100% da (região de codificação) do gene são removidos a partir do DNA presente na planta, deste modo debilitando a expressão da proteína UPL4 funcional.

[00078] De um modo alternativo, um, dois, três ou mais nucleotídeos podem ser introduzidos no gene ou genes, que codificam para uma proteína UPL4, ou conduzindo a, por exemplo, um desvio de quadro, ou conduzindo à introdução de uma sequencia que codifica aminoácidos adicionados, ou à introdução de uma sequência que não codifica aminoácidos adicionais, ou ainda à introdução de grandes inserções, deste modo debilitando a provisão/ expressão da proteína UPL4 funcional.

[00079] Em ainda outras palavras, a deleção, substituição ou inserção de nucelotídeo(s) em uma sequência de nucleotídeo, que codifica uma proteína UPL4, tal como acima descrito, pode conduzir a, por exemplo, um desvio de quadro, uma introdução de um códon de interrupção, ou à introdução de um códon não sentido. De um modo particular, a introdução de um códon de interrupção e a introdução de uma mutação de desvio de quadro são geralmente aceitos como modos eficientes de produção uma planta de knockout, ou seja, uma planta com expressão reduzida, reprimida ou deletada, e/ ou a atividade de uma proteína específica.

[00080] Uma mutação de desvio de quadro (também denominada de erro de quadro ou de um desvio de quadro de leitura) é uma mutação genética, causada por indélios (inserções ou deleções) de um número de nucleotídeos, que não é divisível por três em uma sequência de nucleotídeo. Devido à natureza tripla da expressão de gene por códons, a inserção ou deleção pode alterar o quadro de leitura (o agrupamento dos códons), resultando em uma translação completamente diferente do original. Quando mais precocemente ocorrer na sequência a deleção ou a inserção, mais alterada será a proteína produzida. Uma mutação de desvio de quadro irá causar, de um modo geral, a leitura dos códons após a mutação para a codificação para diferentes aminoácidos, mas podem ocorrer exceções resultantes a partir da redundância no código genético. Além disso, o código de interrupção (“UAA”, “UGA” ou “UAG”) na sequência original não será lido, e um códon de interrupção alternativo pode resultar em um sítio de interrupção mais cedo ou mais tarde. A proteína produzida pode ser anormalmente curta ou anormalmente longa.

[00081] A introdução de um códon de interrupção em uma sequência de nucleotídeo, que codifica uma proteína UPL4 tal como aqui definido, pode resultar em uma interrupção prematura de uma transcrição, o que resulta, de um modo geral, em uma proteína UPL4 truncada, incompleta e não funcional. De um modo preferido, o códon de interrupção é introduzido precocemente na direção de transcrição. Quando mais precocemente na sequência o códon de interrupção for introduzido, mais curta e mais alterada será a proteína produzida. A introdução de um códon não sentido em uma sequência de nucelotídeo, que codifica a proteína UPL4, pode resultar no transcrito mRNA, em que, por exemplo, um códon não mais codifica para o aminoácido, como naturalmente ocorre no UPL4, por exemplo, um códon que normalmente codifica para um aminoácido, que é essencial para uma proteína UPL4, pode ser funcional. Deste modo, uma tal proteína UPL4 pode não ser funcional.

[00082] Em ainda outras palavras, o dano pode compreender a mutação de um ou mais nucleotídeos nos genes aqui expostos, resultando ou na presença de menos ou até mesmo na ausência total do produto de expressão de proteína (isto é, a ausência de proteína que seria obtida quando os genes de acordo com a invenção não fossem modificados como acima descrito), ou na presença de proteína não funcional.

[00083] Deste modo, em ainda uma modalidade do método aqui exposto, o dano é a consequência de uma ou mais mutações no referido gene, resultando na presença de menos produto de expressão de proteína ou na ausência de um produto de expressão de proteína.

[00084] O termo inibição/ presença de menos do que aqui usado refere- se à redução na expressão de proteína de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou de até mesmo 99% em comparação com uma planta de controle, na qual a expressão não é debilitada. O termo “ausência de expressão de proteína” refere-se à ausência virtual de qualquer produto de expressão, por exemplo, menos do que 5%, 4 %, 3%, 2% ou até mesmo menos do que 1 %, em comparação com o controle.

[00085] Tal como será entendido por uma pessoa versada na técnica, uma mutação pode ser também introduzida em uma sequência de nucleotídeo que codifica UPL4, tal como aqui definido pela aplicação de compostos mutagênicos, tais que metano sulfonato de etila (sem) ou de outros compostos capazes de introduzir (de um modo aleatório) mutações em sequências de nucleotídeo. Tais compostos mutagênicos ou o referido outro composto pode(m) ser usado(s) como um meio para a criação de plantas abrigando uma mutação em uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína UPL4.

[00086] De um modo alternativo, a introdução de uma mutação em uma sequência de nucleotídeo, que codifica uma proteína (UPL4) de acordo com a invenção, pode ser efetuada através da introdução de DNA de transferência (T-DNA) na seção de nucleotídeo que codifica uma tal proteína, por exemplo o T-DNA do plasmídeo que induz tumor (Ti) de algumas espécies de bactérias, tais que Agrobacterium tumefaciens. Um elemento de T-DNA pode ser introduzido na referida sequência de nucleotídeo, conduzindo ou a uma proteína não funcional ou à ausência de expressão da proteína, consequentemente diminuindo a necessidade quanto a água de uma planta obtida através do método de acordo com a invenção (vide, por exemplo, Krysan et al., 1999, The Plant Cell, Vol. 11, 283- 2290). Do mesmo modo, pode ser vantajoso o uso de inserção de um elemento transponível (Vide, por exemplo, kunze et al. (1997) Advances in Botanical Research 27 341-370 ou Chandlee (1990), Physiologia Planta 79 (1), 105-115).

[00087] Em ainda uma modalidade, a introdução de uma mutação, em uma sequência de nucleotídeo, que codifica uma proteína de acordo com a invenção, é efetuada pela troca de nucleotídeo alvejada (TNE), por exemplo, tal como descrito na WO 2007073170. Pela aplicação de TNE, os nucleotídeos específicos podem ser alterados em uma sequência de nucleotídeo que codifica UPL4, por meio do que, por exemplo, om códon de interrupção pode ser introduzido, que pode, or exemplo, resultar em uma sequência de nucleotídeo, que codifica uma proteína truncada de acordo com a invenção com atividade diminuída ou inexistente.

[00088] Em ainda uma outra modalidade, é provido um método, tal como acima exposto, em que o dando e expressão da proteína funcional UPL4 é causado pela expressão da proteína não funcional. Tal como explicado acima, uma pessoa versada na técnica não tem problema em determinar a funcionalidades dos genes de acordo com a invenção. Por exemplo, ela pode efetuar estudos de complementação por meio da introdução do gene de controle, sem quaisquer modificações, no interior de uma planta, na qual a expressão de uma proteína de acordo com a invenção foi debilitada e na resistência à seca estudada.

[00089] De um modo alternativo, ela pode efetuar experimentos análogos àqueles experimentos abaixo descritos nos exemplos, e determinar a resistência à seca em

[00090] uma planta, na qual uma ou mais mutações foram introduzidas nos genes de acordo com a invenção, por meio de comparação a uma planta do tipo selvagem/ de controle adequada.

[00091] O dano pode ser também provido no sítio translacional, por exemplo, através da introdução de um códon de interrupção prematuro ou através de modificações pós-translacionais que influenciam, por exemplo, o desdobramento da proteína.

[00092] Independentemente do mecanismo, o dano de acordo com a presente invenção é indicado pela ausência ou presença reduzida da proteína UPL4 funcional, em contraste com a proteína UPL4 não funcional, que pode estar presente em níveis normais.

[00093] Tal como explicado acima, o termo inibição da expressão ou a presença reduzida, tal como aqui usado, refere-se a uma redução na expressão da proteína de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou até mesmo de 99%, em comparação com uma planta de controle, na qual a expressão não é debilitada. O termo “ausência de expressão de proteína” refere-se à ausência virtual de qualquer produto de expressão, por exemplo menos do que 5%, 4%, 3%, 2% ou até menos do que 1 % em comparação com o controle.

[00094] De acordo com ainda uma outra modalidade, o dano é causado por meio de silenciamento do gene, por exemplo, com interferência de RNA ou silenciamento de RNA.

[00095] Com o auxílio de métodos de biologia molecular prontamente disponíveis para a pessoa versada na técnica, o dano dos genes pode ser também efetuado através de silenciamento de gene, por exemplo por meio do uso de técnicas de interferência de RNA, dsRNA ou através de outras técnicas de silenciamento de expressão (vide, por exemplo, kusaba et al. (2004) Current Opinion in Biotechnology 15:139-143, ou Preuss and Pikaard (2003) in RNA Interference (RNAi)- Nuts & Bolts de siRNA technology (pp. 23- 36),©2003 by DNA Press, LLC Edited by: David Engelke, PH. D) ou, como já discutido acima, através de knockout.

[00096] Em ainda uma outra modalidade preferida, e como já discutido acima, é provido um método de acordo com a invenção, em que o dano é causado através de inserção, deleção e/ ou substituição de pelo menos um nucleotídeo. Por exemplo, 1, 2, 3 ... 10, 40, 50, 100, 200, 300, 1000, ou ainda mais nucleotídeos podem ser inseridos, deletados ou substituídos nos genes de acordo com a invenção. São também antecipadas as combinações de inserção, deleção e/ ou substituição, seja nas regiões de codificação ou nas regiões de não codificação do gene.

[00097] Em ainda uma outra modalidade do método aqui exposto, o método compreende o estágio de debilitar a expressão na referida planta de mais do que 1, por exemplo de 2, 3, 4, 5, ou de todos os genes que codificam uma proteína UPL4.

[00098] Nesta modalidade, a expressão de mais do que um gene, tal como acima descrito, e presente em uma planta particular, é debilitada. Por exemplo, a expressão de um, dois, três, quatro, ou de todos os genes que codificam uma proteína UPL4, quando presentes em uma planta, é debilitada. Por meio de que seja debilitada a expressão de mais genes, tal como acima descrito, ao mesmo tempo (quando presentes em uma planta) uma resistência à seca ainda mais melhorada pode ser alcançada.

[00099] Em ainda uma outra modalidade, a planta provida pelo método de acordo com a invenção pode ser usada para a produção de plantas adicionais ou de produtos de planta derivados a partir da mesma. O termo “produtos de planta” refere-se àquele material, que pode ser obtido a partir da planta desenvolvida, e inclui frutos, folhas, órgãos da planta, gorduras da planta, óleos da planta, amido da planta, frações de proteína da planta, sejam triturados, moídos, ou ainda intactos, produzidos com outros materiais, secados, congelados, e assim por diante. De um modo geral, tais produtos de planta podem, por exemplo, ser ainda reconhecidos pela presença de um gene, tal como aqui exposto, modificado de uma forma tal que a expressão de uma proteína funcional seja debilitada, tal como descrito acima.

[000100] De um modo preferido, a expressão e/ ou a atividade de uma proteína UPL4 de acordo com a invenção é debilitada (por exemplo, reduzida, reprimida ou deletada) em uma planta, que pertence à família Brassicaceae, que inclui Brassica napus (semente de colza), família Solanaceae, que inclui o tomate, ou a família Curcubitaceae, que inclui o melão e o pepino, ou a família Poacease, que inclui Oryza, incluindo o arroz, ou Zea mays, que inclui o milho, ou a Fabaceae, que inclui legumes, ervilhas ou feijão. De um modo preferido, o método de acordo com a invenção é aplciado em tomate, arroz, milho, melão ou pepino, deste modo produzindo uma planta com uma necessidade diminuída com relação à água ou com uma resistência melhorada à seca em comparação com uma planta não transformada correspondente. É também provida uma célula de planta, planta ou um produto de planta obtenível através do método de acordo com a invenção, e em que a referida célula de planta, planta ou produto de planta apresenta uma expressão reduzida da proteína funcional UPL4 comparada a uma planta de controle não submetida ao método de acordo com a invenção.

[000101] É também provida uma célula de planta, planta ou produto de planta, caracterizado pelo fato de que na referida célula de planta, planta, ou produto de planta a expressão de pelo menos um, preferivelmente de todos os genes que codificam a proteína UPL4, tais que aqueles, em que a sequência de cDNA, que corresponde ao mRNA transcrito a partir do referido pelo menos um gene, compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO:1, e aqueles, em que a sequência de cDNA que corresponde à sequência de mRNA transcrita a partir do referido pelo menos um gene compreende pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidade com a referida sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:1 e/ ou em que a sequência de aminoácido, codificada pelo referido pelo menos um gene compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO:2, ou em que a sequência de aminoácido, codificada pelo referido pelo menos um gene, compreende pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:2 e/ ou em que a sequência de aminoácido, codificada pelo referido pelo menos um gene, compreende pelo menos um domínio Pfam HECT ( PF 00632) e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM (modelo SSF 48371), tal como definida acima, é danificada. De um modo preferido, a planta não é o mutante Arabidopsis thaliana, tal como descrito nos exemplos abaixo, ou um mutante de inserção de T-DNA Brachypodium, ou um mutante de inserção de T-DNA Zea mays, ou um mutante de inserção de T-DNA Oryza sativa.

[000102] Em ainda um outro aspecto, a invenção é ainda dirigida ao uso de um gene, em que a sequência de cDNA, que corresponde à sequência de mRNA transcrita a partir do referido gene, compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO:1 e e na Figura 2, e em que a sequência de cDNA, que corresponde à sequência de mTNA transcrita a partir do referido gene compreende pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidade com a mesma e/ ou em que a sequência de aminoácido, codificada pelo referido gene, compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO:2, e as sequências de aminoácido com mais do que 35%, 40%, 50%, 60%, 79%, 80%, 90%, 95% de identidade com as mesmas e/ ou em que a sequência de aminoácido, codificada pelo referido gene, compreende pelo menos um domínio Pfam HECT (PF 00632) e pelo menos uma repetição da Superfamília ARM (modelo SSF 48371), tal como acima definido, para que seja provida uma resistência à seca aumentada a uma planta.

[000103] Nesta modalidade, o gene descrito pode ser usado como um alvo para melhorar a resistência à seca em uma planta, de acordo com a exposição neste, ou o gene pode ser ainda suado para identificar novas proteínas envolvidas na sensibilidade e na resistência à seca.

[000104] Em ainda uma outra modalidade, é provido um uso de uma sequência de UPL4 tendo a SEQ IS No.1 ou 2 da espécie Arabidopsis thaliana nos testes de resistência à seca em plantas Arabidopsis thaliana. De um modo adicional, é provido um uso, em que a sequência UPL4 é uma sequência análoga à SEQ ID N ° 1 ou 2 de uma outra espécie de planta em que os testes são efetuados em plantas de uma outra espécie de planta. Além disso, é ainda provido um método para testar plantas ou células de planta com uma resistência melhorada à seca, que compreende os estágios de: - prover uma população heterogência de células de planta ou de plantas com a sequência UPL4 provida; - determinar a sequência de pelo menos parte do gene UPL4 das células de plantas ou plantas; - comparar as sequências UPL4 determinadas a partir das células de planta ou de plantas com a sequência UPL4 provida; - identificar as células de planta em que a sequência UPL4 compreende uma mutação.

[000105] De um modo alternativo, no método, as células de planta ou plantas, que são providas, são de uma outra espécie, e são caracterizadas pelo fato de que a sequência do gene UPL, que é provida, é uma sequência análoga de outras espécies.

[000106] Deste modo, por meio do uso da sequência SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 da sequência UPL4 da espécie Arabidopsis thaliana, ou de uma sequência análoga da mesma a partir de uma outra espécie, as sequências UPL4 mutadas podem ser identificadas na espécie de planta, que pode prover uma resistência melhorada à seca. Uma sequência análoga, em uma outra espécie, da sequência SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°2 da sequência UPL4 da espécie Arabidopsis thaliana é definida como uma sequência tendo pelo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma. A proteína UPL4 análoga pode ter substancialmente a mesma função que a SEQ ID N° 1 ou a SEQ ID N° 2.

[000107] No método, uma população heterogênea de células de planta ou de plantas da espécie é provida. A população heterogênea pode, por exemplo, ser provida submetendo-se as células de planta a um mutágeno, que introduz mutações aleatórias, deste modo provendo uma população heterogênea de uma célula de planta. Deste modo, a população heterogênea pode ser derivada a partir de uma única variedade de planta, que é submetida a uma mutagênese aleatória, de um modo a que seja obtida uma variedade de mutações na descendência, deste modo provendo uma população heterogênea. Muitos mutágenos são conhecidos na técnica, por exemplo, radiação iônica, radiação UV, e substâncias químicas mutagênicas, tais que azidas, brometo de etídeo ou etil metano sulfonato (EMS). Deste modo, aquele versado na técnica pode também prover uma população heterogênea de plantas ou de células de planta. Além disso, aquele versado na técnica pode também prover uma variedade de plantas como uma população heterogênea, isto é, não apenas uma única variedade a partir de uma espécie. Uma variedade de plantas pode apresentar variedade genética, elas não são geneticamente idênticas, mas devido ao fato de que as plantas são da mesma espécie, elas são substancialmente idênticas. Em qualquer caso, uma população heterogênea ou células de planta ou plantas podem ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência.

[000108] Através da determinação de pelo menos parte da sequência da sequência de gene UPL4 com a sequência de plantas ou de células de planta a partir da população heterogênea, e subsequentemente comparação destas sequências com a sequência de gene UPL4 provida (a referência), podem ser então identificadas as células de planta ou as plantas, que compreendem uma mutação na sequência de gene UPL4. Deve ser ainda entendido que uma tal comparação pode ser executada pelo alinhamento das sequências e pelo fato de que uma mutação é uma diferença com relação a pelo menos um ácido nucleico ou posição de aminoácido na sequência (UPL4) análoga (referência) da espécie de planta. Deste modo, são identificadas plantas ou células de plantas, que possuem mutações no gene UPL4 (por exemplo, inserções, deleções, substituições), que podem prover uma resistência melhorada à seca.

[000109] De um modo preferido, são selecionadas plantas, que possuem mutações que iriam resultar em um dano de expressão de uma proteína UPL4 funcional, tal como já delineado acima. As mutações que iriam debilitar a expressão de uma proteína funcional UPL4 podem ser mutações que iriam romper o quadro de leitura aberto (introduzir um desvio de quadro ou um códon de interrupção) ou ainda romper ou alterar, de um outro modo, a função da proteína codificada por meio da alteração de nucleotídeos em códons, que codificam os aminoácidos, que são essenciais para o funcionamento apropriado da proteína, deste modo conduzindo a uma resistência modificada (por exemplo, aumentada) à seca, em comparação com a proteína não alterada. O método pode ainda ser usado, por exemplo, na triagem e na seleção de plantas, que foram submetidas à modificação genética, que objetiva a sequência UPL4, tal como acima exposto. Além disso, a sequência UPL4 pode ser também usada em um ensaio de triagem, no qual uma população (heterogênea) de plantas é submetida à seca.

[000110] Em ainda uma outra modalidade, é provido o uso de pelo menos parte de UPL4 tendo a SEQ ID N°1 ou a SEQ ID N °2 da espécie Arabidopsis thaliana como um marcador para criar plantas Arabidopsis thaliana resistentes à seca. Além disso, a sequência UPL4 pode ser de uma sequência análoga de uma outra espécie, em que o marcador destina-se a criar plantas resistentes à seca de outras espécies de planta.

[000111] A presente invenção também se refere ao uso de uma planta, célula de planta, ou produto de planta, em que a expressão de uma proteína funcional UPL4 é debilitada, em que a proteína funcional UPL4 é uma proteína, que quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido resulta em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada à resistência à seca da referida inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não é expressada para o crescimento de condições de estresse de seca, em que as referidas condições de estresse de seca causam com que uma planta de controle, uma célula de planta, ou um produto de planta, em que a expressão da referida proteína UPL 4 não esteja debilitada, apresente sinais de estresse à seca, tais que sinais de murchamento mais precocemente do que a planta, célula de planta, ou produto de planta, em que a expressão da proteína funcional UPL4 é debilitada.

[000112] Em ainda um aspecto, a presente invenção refere-se a uma planta, célula de planta ou produto de planta, obtenível ou obtido através do método aqui ensinado. De um modo adicional, a invenção provê ainda uma semente derivada a partir de uma tal planta.

[000113] A invenção também refere-se a uma planta, célula de planta, ou produto de planta, em que a expressão da proteína funcional UPL4 é debilitada, em que a proteína funcional UPL4 é uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana, tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana, tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não é expressada. A referida planta, células de planta, ou produto de planta, por exemplo, compreende um gene UPL4 endógeno rompido.

[000114] A planta, célula de planta ou produto de planta pode ser qualquer planta ou célula de planta, ou pode ser ainda derivado a partir de qualquer planta, tais que as plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas, mas de um modo ainda mais preferido a planta pertence à família Solanaceae. Por exemplo, a planta pertence ao gênero Solanum (incluindo lycopersicum), Nicotiana, Capsicum, Petunia e ainda outros gêneros. As espécies hospedeiras que se seguem podem, de um modo adequado, ser ainda usadas: Tabaco ( espece Nicotiana, por exemplo, N.benthamiana, N. Plumbaginifolia, N.tabacum, etc.), espécies vegetais, tais que o tomate (Solanum lycopersicum), tal que, por exemplo, o tomate cereja, var. Cerasiforme ou o tomate atual, var. Pimpinellifolium) ou o tomate arbóreo (S. Betaceum, sin. Cyphomandra betaceae ), batata (Solanum tuberosem), berinjela (Solanum melongena), pepino (Solanum muricatum), cocona (Solanum sessilliflorum) e naranjilla (Solanum quitoense), pimentas (Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Capsicum baccatum), espécie ornamental (por exemplo, Petunia hybrida, Petunia axillaries, P.integnifolia).

[000115] De um modo alternativo, a planta pode ainda pertencer a qualquer outra família, tal que à Cucurbitaceae ou Gramineae. As plantas hospedeiras incluem ainda, por exemplo, o milho (espécie Zea), trigo (espécie Triticum), cevada (por exemplo, Hordeum vulgare), aveia (por exemplo, Avena sativa), sorgo (Sorghum bicolor), centeio (Secale cereale), soja (Glycine spp., por exemplo G.max), algodão (espécie Gossypium, por exemplo G. hirsurtum, G. Barbadense), Brassica spp. (por exemplo, B. Napus, B. Juncea, B. Oleracea, B. Rapa, etc.), girassol (Helianthus annus), açafrão, inhame, mandioca, alfafa (Medicago sativa), arroz (espécie Oryza, por exemplo, o grupo de variedade O.sativa indica ou o grupo de variedade japonica), gramíneas de forragem, milheto pérola (Pennisetum spp., por exemplo P.glaucum), espécies arbóreas (Pinus, álamo, abeto, fúnquia, etc.), chá, café, óleo de plama, coco, espécies vegetais, tais que ervilha, zucchini, feijões ( por exemplo, a espécie Phaseolus), pepino, alcachofra, aspargo, brócolis, alho, alho-poró, alface, cebola, rabanete, nabo, couve de bruxelas, cenoura, couve-flor, chicória, aipo, espinafre, endívia, erva-doce, beterraba, plantas portando frutos carnosos (uvas, pêssegos, ameixas, morangos, mangas, maçã, ameixa, cereja, damasco, banana, amora preta, mirtilo, frutas cítricas, kiwi, figos, limão, lima, nectarinas, framboesa, melancia, laranja, toranja, etc.), espécies ornamentais (por exemplo, Rosa, Petúnia, Crisântemo, Lily, espécie Gerbera), ervas (menta, salsa, manjericão, tomilho, etc.), ávores lenhosas (por exemplo, espécies de Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus), espécies fibrosas, por exemplo, o linho (linum usitatissimum) e o cânhamo (Cannabis sativa), ou organismos modelo, tais que Arabidopsis thaliana).

[000116] Os hospedeiros preferidos são as “plantas de colheita”, isto é, espécies de plantas que são cultivadas e criadas por seres humanos. Uma planta de colheita podem ser cultivada para propósitos alimentares (por exemplo, colheitas de campo), ou ainda para propósitos ornamentais (por exemplo, a produção de flores para o corte, relvas para gramados, etc.). Uma planta de colheita, tal como aqui definido, também inclui as plantas, a partir das quais produtos não alimentícios são colhidos, tais que óleo para combustível, polímeros plásticos, produtos farmacêuticos, cortiça e os similares.

[000117] De um modo preferido, a planta, célula da planta ou produto da planta de acordo com a invenção não é uma planta, célula de planta ou produto de planta de Arabidopsis thaliana ou Brachypodium.

[000118] A planta, célula de planta ou produto de planta de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser uma planta, célula de planta ou produto de planta de Solanum lycopersicum ou Brassica rapa.

[000119] Deste modo, a invenção refere-se, por exemplo, a uma planta, célula de planta ou produto de planta de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale, ou Brassica napus, em que a expressão da proteína funcional UPL4 é debilitada, em que a proteína funcional UPL4 é uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T- DNA de Arabidopsis thaliana, tendo um gene de UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência à seca debilitada, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, no qual a referida proteína funcional UPL4 não está expressada. A referida planta, célula de planta, ou produto de planta pode ainda compreender um gene UPL4 endógeno rompido.

[000120] Todas as referências aqui citadas são incorporadas a este, a título referencial, em sua totalidade.

Exemplos Exemplo 1 - Teste de Seca

[000121] Sementes de Arabidopsis thaliana (At) transformadas com o vetor Agrobacterium tumefaciens pROK2, que conduzem à ausência da proteína funcional UPL4 (NASC ID: N655716, código AGI A T%G02880 e SALK_091246C; a seguir referidos como a sementes mutantes ou como a plantas mutantes) foram obtidas a partir do Nottingham Arabidopsis Stock Centre (BASC; School of Niosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE 12 5RD, United Kingdom). Como controle, At Col-0 (Columbia, N60000); a seguir referido como a semente ou planta de controle) foram usadas.

Meio de Crescimento:

[000122] Uma mistura de solo, que compreende uma parte de areia e de vermiculita e duas partes de compostagem foi usada ( areia: vermiculita: compostagem = 1:1:2). Esta mistura aumenta a percolação de água, pois facilita a absorção de água uniforme por cada vaso e uma melhor drenagem da água. Antes da semeadura, as sementes foram mantidas a 4°C durante 3 dias, sob condições escuras e úmidas para a estratificação.

[000123] Ambas as sementes mutante e de controle foram semeadas em uma bandeja retangular contendo 8 x 5 = 40 vasos de ~4 cm de diâmetro, com uma densidade de 5 plantas por vaso. Uma solução de nutriente ( EC = 1,5) foi suprida a todas as plantas a partir do fundo dos vasos na bandeja, 10 dias após a germinação (DAG), e em 15 DAG as plantas foram então submetidas à seca (durante 15, 16, 17 ou 18 dias) através da transferência dos vasos para bandejas secas. Subsequentemente, as plantas foram reidratadas e observadas quanto à recuperação após 1 semana.

[000124] Três réplicas de vaso de cada genótipo foram induzidas na triagem pré-seca. O tempo total, requerido para um teste completo, foi de aprox. 36- 39 dias.

Exame do ensaio de seca

[000125] Uma vez que as plantas alcançaram o estágio de 2 folhas, elas foram desbastadas, de um modo a que fossem mantidas exatamente 5 plantas por vaso. Em 10 DAG, as plantas receberam nutrição (EC = 1,5) e em 15 DAG cada vaso foi movido para uma bandeja seca. A partir deste dia em diante, as plantas não receberam mais qualquer água. A cada dia as plantas, em especial o controle ( ou tipo selvagem) (Col-0) foram observadas quanto a sinais de murchamento. No 15 ° dia da seca (DOD), Col-0 murchou completamente e não mais se recuperou mediante reidratação. Determinamos estes dia como o ponto de murchamento permanente (PWP). Deste dia em diante, uma réplica do mutante foi reidratada e observada quanto a sinais de recuperação e fotos foram então efetuadas. O mutante demonstrou sobrevivência durante pelo menos mais 2 dias sob condições de seca, comparado ao controle, e foi então submetido a uma triagem rigorosa.

Exemplo 2: Teste de Seca Meio de crescimento:

[000126] O mesmo mutante e plantas de controle que no Exemplo 1 foram desenvolvidos em um equipamento de bandeja similar, tal como acima descrito, no teste de pré-triagem. As plantas foram então submetidas ao estresse pela manutenção de água a partir de 15 DAG, até que o controle alcançasse o seu PWP. Durante este período, a cada dia alternado, os vasos foram então deslocados dentro das bandejas, de um modo a que fossem então reduzidos os seus efeitos de posição e de um modo a que fosse então permitida uma evaporação uniforme. No dia 15 DOD, as plantas de controle alcançaram o PWP e não mais se recuperaram mediante a reidratação. Uma réplica do vaso a partir do mutante foi reidratada a cada dia, a partir de 15 DOD em diante e verificada quanto à recuperação do estresse de seca. Foram efetuadas fotos e a recuperação foi graduada. O mutante demonstrou uma recuperação a partir do estresse de seca durante pelo menos mais 3 dias, após o controle ter alcançado o seu PWP.

[000127] A Figura 1 mostra uma fotografia, que compara o mutante e o controle, demonstrando o efeito superior do mutante com relação à resistência ao estresse de seca.

Exemplo 3: Teste de Seca Materiais e Métodos

[000128] Material de Planta. Uma linhagem de inserção de TDNA com um gene A T5G02880 (UPL4) (SALK_091246C) foi obtida a partir do Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC). Foram produzidas linhagens de complementação pela transformação estável de plantas de Arabidopsis thaliana usando a transformação em imersão de floral (Bent et al., 2006, Methods Mol. Biol. Vol. 343: 87 -103). Homólogos do gene UPL4 de Arabidopsis thaliana (A T5G02880) foram identificados a partir de várias espécies de culturas, incluindo Brassica rapa (repolho), Solanum lycopersicum (tomate) e Oryza sativa (arroz) e as espécies modelo Arabidopsis thaliana ( UPL3; AT4G38600). Tabela 1. Homólogos da proteína UPL4 e do gene UPL4 de Arabidopsis thaliana.

[000129] Tabela 2. Percentual de identidade de sequência de ácido nucleico entre a Arabidopsis thaliana

[000130] A sequência de cDNA de UPL4 (SEQ ID NO: 1) e as sequências de cDNA de homólogos de Arabidopsis thaliana (Atg38600 UPL3); SEQ ID NO:3), Brassica rapa (Br17038; SEQ ID NO:5 & Br47159; SEQ ID NO:7), Solanum lycopersicum (Sig98247; SEQ ID NO: 9), e Oryza sativa entre a sequência de proteína UPL4 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2) e as sequências de proteína de homólogos em Arabidopsis thaliana (At4g38600; SEQ ID NO:2) e as sequências de proteínas de homólogos em Arabidopsis thaliana (At4g38600; SEQ ID NO:4), Brassica rapa (Br17038; SEQ ID NO: 6 & Br47159; SEQ ID NO: 8), Solanum lycopersicum (Sig98247; SEQ ID NO: 10), e Oryza sativa (Os5g03100; SEQ ID NO:12 ) (segunda coluna).

[000131] Ensaio de seca: Linhagens de knockout e de complementação de TDNA, do tipo selvagem, foram semeadas em um projeto bloqueado replicado em bandejas de mudas de 50 células, contendo uma mistura de 2:1:1 de meio isento de sujeira Metro-MIx 852, areia fina e vermiculita. As bandejas plantas foram colocadas a 4 °C durante três dias, de um modo a romper a dormência e então transferidas para uma câmara de desenvolvimento (16 h 22/20 °C, 50% rH) para a germinação e o estabelecimento. Linhagens de complementação, foram pulverizadas com uma formulação de glufosinato (20 mg de glufosinato, 20 μl de tensoativo Silwet, 200 ml de água), uma vez que elas tivessem expandido os cotiledôneos, de um modo a assegurar que apenas as linhagens transformadas seriam selecionadas. Seguindo-se a este tratamento, as mudas em cada célula foram desbastadas a uma planta única. Uma vez que as plantas tivessem atingido o estágio de 4-6 folhas verdadeiras, elas foram então aclimatadas a condições de déficit de uma maior pressão de vapor, de um modo a até mesmo promover o estresse de seca (28/26°C, 25% rH) e as plantas incomumente pequenas foram então identificadas para a remoção, antes do tratamento de seca. As bandejas de plantação foram embebidas com água, e foram então deixadas drenar, deixando todas as células na capacidade do vaso. Bandejas inteiras foram regadas, uma vez que as plantas do tipo selvagem tivessem sido constatadas como estando em seu ponto de murchamento permanente (1,5 - 2 semanas de tratamento de seca). As plantas foram então deixadas em recuperação durante alguns dias e a sobrevivência foi então registrada, com as plantas anormalmente pequenas previamente identificadas omitidas a partir de análises adicionais.

[000132] Análise estatística. A significância estatística de diferntes probabilidades de sobrevivência durante este tratamento de seca foi avalaida por meio da aplicação do teste de proporções determinadas ou iguais no programa de software estatístico, R (http://www.r-project.org/). A função prop.test foi usada, de um modo a testar a hipótese nula de que as proporções de plantas sobreviventes entre o mutante e o tipo selvagem (de uma cauda), ou de um modo alternativo entre as linhagens de mutante de inserção contendo ou não contendo transgenes de complementação de duas caudas), foram iguais.

Resultados:

[000133] A Figura 2 mostra o fenótipo resistente a seca de knockout de UPL4 (mutante de inserção At5g002880 de Arabidopsis) quando comparado ao fenótipo sensível à seca de uma planta de controle (tipo selvagem).

[000134] O mutante de inserção At5g02880 de Arabidopsis sobreviveu à seca de um modo significativamente melhor (p< 0,05) do que as plantas do tipo selvagem (Col-0) ou os mutantes de inserção, complementados com a sequência de codificação (CDS) de At5g02880 SEQ ID NO:1; controle positivo) e homólogos de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:3), Brassica rapa (SEQ ID Nos: 5 e 7), Solanum lycopersicum (SEQ ID NO:9) ou Oryza sativa ( SEQ ID NO:11). A Figura 3 demonstra que uma mutação de inserção no gene UPL4 produz um fenótipo resistente à seca. Além disso, ela também indica que os homólogos deste gene das espécies de monotiledôneos e de dicotiledôneos operam de um modo a restaurar o fenótipo suscetível à seca normal. Deste modo, estes homólogos efetuam a mesma função na tolerância à seca em suas espécies de cultura respectivas. A observação de que ambos os genes UPL4 monocotiledôneos e dicotiledôneos podem restaurar a suscetibilidade à seca quando inseridos no mutante UPL4 de Arabidopsis sugere que uma atividade reduzida da proteína codificada pelo gene UPL4 torna os fenótipos tolerantes à seca em todo o reino da planta. Assim sendo, o prognóstico de UPL4 (com base em pesquisas de homologia e no domínio característico [HECT] e nas sequências de repetição de Armadillo) irão permitir a identificação de homólogos UPL4 da planta nas espécies de planta. Subsequentemente, é possível ainda usar os métodos bem conhecidos para reduzir a atividade da proteína destes homólogos de planta (por exemplo, mutagênese, TDNA, ou inserção de transposon, RNAi, etc.), de um modo a que sejam então obtidas plantas resistentes à seca. As barras cinzas possuem valores significativamente mais baixos (p< 0,005) do que as barras pretas.

Exemplo 4: Resistência à seca no tomate

[000135] Material da planta: Uma nova mutação no gene de tomate Solyc 10g055450 (Sig98427; SEQ ID NO: 9) foi gerada através de triagem de EMS. A mutação consistiu de uma alteração de aminoácido de valina (propriedades hidrofóbicas) para ácido glutâmico (aminoácido negativamente carregado) (na posição 158 da proteína). Uma população M2 de segregação contendo alelos homozigotos, heterozigotos e do tipo selvagem foi usada para todos os experimentos de seca. Uma segunda mutação foi identificada no mesmo gene de tomate, causando uma alteração do aminoácido do ácido aspártico (aminoácido negativamente carregado) para ácido glutâmico (aminoácido negativamente carregado) (na posição 114 da proteína). Devido à similaridade nas propriedades bioquímicas, era improvável que esta mutação causasse alterações significativas nas propriedades da proteína e ela foi, deste modo, usada como um controle negativo nos ensaios de seca. A análise de Sift (Ng and Henikoff, 2003 - Nucl. Acids Res. 31:3812 - 3814) demonstrou que é provável que esta mutação seja tolerada. Uma população M2 de segregação contendo alelos homozigotos, heterozigotos e do tipo selvagem foi usada para todos os experimentos de seca.

[000136] Ensaio de seca. Mudas de tomate, que eram homozigotas, heterozigotas ou do tipo selvagem para a mutação V 158E descrita foram desenvolvidas em vasos plásticos de 2,5 pol. (6,35 cm), contendo uma mistura de 2:1:1 de um meio isento de sujeira Metro- Mix 852, areia fina e vermiculita em uma câmara de crescimento (16 h 22/20 °C, 50% rH). Mediante o estabelecimento, as mudas foram então aclimatadas a condições de déficit de pressão de vapor maiores, de um modo a que seja até mesmo promovido o estresse de seca ( 28/ 26 °C, 25% rH). Os vasos foram então embebidos com água e então deixados secar, deixando todas as plantas na capacidade do vaso. As plantas foram então submetidas a um período de estresse de seca de 1 semana, e então regadas e deixadas em recuperação durante 24 horas, quando a sobrevivência foi então avaliada.

[000137] Análise estatística. A significância estatística de diferentes probabilidades de sobrevivência durante este tratamento de seca foi avaliada mediante a aplicação do teste de proporções determinadas ou iguais no programa de software estatístico, R (http: //www.r.project org/). A função prop.test foi usada para testar a hipótese nula de que as proporções de plantas sobreviventes entre homozigotos e mutantes do tipo selvagem (uma cauda) fossem iguais.

Resultados

[000138] Plantas de tomate, homozigotos para a mutação V 158E no Sig98247 sobreviveram ao tratamento de seca de um modo significativamente melhor (p, 0,1), comparadas aos alelos do tipo selvagem, indicando que esta alteração da proteína conduz a um fenótipo tolerante à seca no tomate (Fig. 4). Tal como esperado, a mutação adicional no Sig 98247 (D 114E) não mostrou quaisquer fenótipos relacionados à seca (todas plantas a partir da segregação da população M2 eram igualmente suscetíveis à seca).

Claims (11)

1. Método para produzir uma planta possuindo resistência à seca melhorada, comparada a uma planta controle, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de debilitar a expressão da proteína ubiquitina ligase (UPL) 4 funcional endógena em uma planta, em que a proteína UPL4 funcional endógena compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma dentre SEQ ID No. 6, 8, 10 e 12, em que a proteína UPL4 funcional endógena é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos uma dentre SEQ ID No. 5, 7, 9 e 11 ou sequências degeneradas das mesmas, e em que a expressão debilitada resulta na ausência da proteína UPL4 funcional endógena.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína UPL4 funcional endógena compreende uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 10 ou 12.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína UPL4 funcional endógena é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos uma dentre SEQ ID No. 5, 7, 9 e 11.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína UPL4 funcional endógena compreende uma sequência de aminoácidos tendo a SEQ ID No. 12.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a planta é Oryza, preferencialmente Oryza sativa.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a proteína UPL4 funcional endógena é uma proteína que, quando expressada em uma linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido, resulta em uma planta com uma resistência à seca prejudicada, comparada à resistência à seca da referida linhagem de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana tendo um gene UPL4 endógeno rompido no qual a proteína UPL4 funcional endógena não é expressa.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de debilitar a expressão da proteína UPL4 funcional endógena compreende a mutação de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de SEQ ID No. 5, 7, 9 e 11.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida mutação da sequência de ácido nucleico envolve uma inserção, uma deleção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de debilitar a expressão compreende o silenciamento de um gene de qualquer uma das sequências de ácido nucleico de SEQ ID No. 5, 7, 9 e 11.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de debilitar a expressão de duas ou mais proteínas UPL4 funcionais endógenas na referida planta.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de produzir uma planta ou um produto de planta a partir da planta tendo resistência melhorada à seca.

Images