BR122018074298B1 - sequência de ácido nucleico, método de expressão de um gene heterólogo e cassete de expressão - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a cassetes de expressão que contêm sequências reguladoras derivadas de um gene de destino, por exemplo, sequências reguladoras dos genes HSP70, Ubi158 e Ubi361 para expressão de produtos de gene recombinante em plantas. Dados de definição de perfil de expressão de desenvolvimento foram usados para identificar diversos genes candidatos para o desenvolvimento de cassete de expressão constitutiva forte. Três cassetes de expressão foram desenvolvidos. Eles são baseados nos genes ZmHSP70, ZmUbi158 e ZmUBI361.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA n.° 61/186.038, protocolado no dia 11 de junho de 2009. O pedido acima é incorporado neste por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção inclui cassetes de expressão que contêm sequências reguladoras derivadas de um gene de destino, por exemplo, se-quências reguladoras dos genes HSP70, Ubi158 e Ubi361 para expressão de produtos de gene recombinante em plantas.

ANTECEDENTES

[003] Em biotecnologia agrícola, as plantas podem ser modificadas de acordo com as necessidades de um indivíduo. Uma maneira de realizar isto é usando modernas técnicas de engenharia genética. Por exemplo, introduzindo um gene de interesse em uma planta, a planta pode ser especificamente modificada para expressar uma característica fenotípica desejável. Para tanto, as plantas são transformadas mais comumente com um gene heterólogo abrangendo uma região promotora, uma região codificadora e uma região de terminação. Ao criar por engenharia genética um gene heterólogo para expressão em plantas, a seleção de uma promotora normalmente é um fator essencial.

[004] As promotoras são compostas por diversas regiões que são necessárias para a função da promotora. Algumas destas regiões são compostos modulares ou, em outras palavras, podem ser usadas isoladas para conceder atividade promotora ou podem ser reunidas com outros elementos para construir novas promotoras (Komarnytsky e Borisjuk, Genetic Engineering 25: 113-141(2003)).

[005] A primeira destas regiões promotoras fica imediatamente antes da sequência de codificação e forma a "região promotora central", contendo elementos de acoplamento, normalmente 20-70 pares de base imediatamente antes do local do início da transcrição. A região promotora central normalmente contém uma caixa TATA e um elemento iniciador, bem como o local de iniciação. A extensão correta da região promotora central não é fixada, mas normalmente é bem reconhecível. Tal região existe, com alguma variação, na maioria das promotoras. As sequências de base que ficam entre os diversos elementos bem caracterizados parecem ter menos importância. A região promotora central normalmente é referida como uma região promotora mínima, pois é funcional per se para promover um nível basal de transcrição.

[006] A presença da região promotora central define uma sequência como sendo uma promotora: se não houver região, a promotora não é funcional. A região central atua para atrair o mecanismo de transcrição geral à promotora para iniciação da transcrição. Entretanto, a região promotora central não é suficiente para oferecer atividade promotora completa. Uma série de sequências reguladoras compõe o restante da promotora. As sequências reguladoras determinam o nível de expressão, o padrão espacial e temporal da expressão e, para um subconjunto de promotoras, expressão sob condições indutivas (regulação por fatores externos, como luz, temperatura, química e hormônios). As sequências reguladoras podem ser regiões curtas de 6-100 pares de base de sequência de DNA que definem os locais de ligação para fatores de transcrição (trans-acting), como fatores de trans-crição. Sequências reguladoras também podem ser ativadores, regiões mais compridas de sequência de DNA que podem agir longe da região promotora central, às vezes a uma distância de diversas quilobases da região central. A atividade da sequência reguladora pode ser influenciada por fatores de transcrição, incluindo mecanismo de transcrição geral, fatores de transcrição e fatores de agrupamento de cromatina.

[007] Algumas promotoras conseguem orientar a síntese de RNA em níveis relativamente semelhantes entre todos os tecidos de uma planta. Elas são chamadas "promotoras constitutivas" ou promotoras "independentes de tecido". As promotoras constitutivas podem ser divididas entre categorias forte, moderada e fraca, de acordo com sua eficácia ao orientar a síntese de RNA. Como é necessário em muitos casos expressar simultaneamente um gene quimérico (ou genes) em diferentes tecidos de uma planta para obter as funções desejadas do gene (ou genes), as promotoras constitutivas são especialmente úteis nesta situação. Apesar de muitas promotoras constitutivas terem sido descobertas de plantas e vírus de plantas e caracterizadas, ainda há um interesse contínuo no isolamento de mais novas promotoras constitutivas, sintéticas ou naturais, que são capazes de controlar a expressão de um gene quimérico (ou genes) a diferentes níveis de expressão e a expressão de diversos genes na mesma planta transgênica para piram idação de genes.

[008] Entre as promotoras usadas mais comumente estão a promotora de síntese de neopalina (NOS) (Ebert e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5745-5749 (1987)); a promotora de síntese de octopina (OCS); promotoras de caulimovírus, como a promotora do vírus do mosaico da cou-ve-flor (CaMV) 19S (Lawton e outros, Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1987)), a promotora CaMV 35S (Odell e outros, Nature 313:810-812 (1985)), e a pro-motora de virus do mosaico da escrofulária 35S (Sanger e outros, Plant Mol. Biol. 14, 43343 (1990)); a promotora induzida por luz da pequena subunida- de de rubisco (Pellegrineschi e outros, Biochem. Soc. Trans. 23(2):247-250 (1995)); a promotora de Adh (Walker e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:6624-66280 (1987)); a promotora de síntese de sacarose (Yang e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:414-44148 (1990)); a promotora de complexo do gene R (Chandler e outros, Plant Cell 1:1175-1183 (1989)); a promotora do gene de proteína de ligação à clorofila a/b; esimilares.

SUMÁRIO

[009] Considerando estas necessidades, um objeto desta invenção é fornecer um ácido nucleico, preferencialmente um ácido nucleico isolado, capaz de orientar a expressão em uma célula da planta, em que a sequência de ácido nucleico abrange uma região 5’-não traduzida, um primeiro éxon, um primeiro íntron, e uma parte de um segundo éxon de um gene representado por uma sequência selecionada do grupo abrangendo SEQ ID N°: 13-33. A invenção também se relaciona à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo abrangendo SEQ ID N°: 1-3. Em outro aspecto, a célula da planta abrangendo o ácido nucleico pode ser uma célula monocoti- ledônea ou uma célula dicotiledônea. Em ainda outro aspecto, a célula da planta abrangendo o ácido nucleico pode ser uma célula de milho ou uma célula de tabaco.

[0010] Em outro aspecto, o objeto da presente invenção é relacionar a um método de expressão de um gene heterólogo abrangendo a construção de um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3), em que o cassete de expressão seja funcional em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte; e criando uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que o gene heterólogo seja expresso. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja tabaco ou soja.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção também se relaciona a uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmllbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3). A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja tabaco ou soja.

[0012] Em ainda outro aspecto, a presente invenção também se relaciona a um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3).

[0013] Em ainda mais outro aspecto, a presente invenção também se relaciona a uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou res- pectiva parte feita pelo método de expressão de um gene heterólogo abrangendo a construção de um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZrnll- bi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3), em que o cassete de expressão seja funcional em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte; e criando uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que o gene heterólogo seja expresso. A invenção também se relaciona à expres-são do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja selecionada do grupo abrangendo tabaco e soja. Em outro aspecto, a presente invenção também se relaciona à progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte, abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZ- mHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3). A presente invenção também se relaciona à semente derivada da progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte. A presente invenção também se relaciona aos grãos derivados da progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte.

[0014] Em ainda outro aspecto, a presente invenção também se relaciona a uma sequência de ácido nucleico capaz de orientar a expressão em uma célula da planta, em que a sequência de ácido nucleico abrange uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo abrangendo (a) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica a uma das IDs de SEQ N.°: 1-3; (b) uma sequência de ácido nucleico que é um fragmento funcional de uma das IDs de SEQ N.°: 1-3; e (c) uma sequência de ácido nucleico que se hibridiza sob condições rigorosas a uma das IDs de SEQ N.°: 1-3.BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID N°: 1 é a sequência de SEQ ID N°: 2 é a sequência de SEQ ID N°: 3 é a sequência de nucleotídeos de prZmHSP70 nucleotídeos de prZmUbi158 nucleotídeos de prZmUbi361 SEQ ID N°: 4 é a sequência de nucleotídeos de ZmHSP70, construção binária 15907 SEQ ID N°: 5 é a sequência de nucleotídeos de ZmUbi158, construção binária 17239 SEQ ID N°: 6 é a sequência de nucleotídeos de ZmUbi361, construção binária 17282 SEQ ID N°: 7 é a sequência de nucleotídeos da sequência ativa- dora de tradução líder do vírus do mosaico do tabaco SEQ ID N°: 8 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência Kozak de milho aperfeiçoada SEQ ID N°: 9 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência Kozak de milho aperfeiçoada SEQ ID N°: 10 é a sequência de nucleotídeos do cassete de ex-pressão ZmHSP70-GUS SEQ ID N°: 11 é a sequência de nucleotídeos do cassete de ex-pressão ZmUbi158-GUS SEQ ID N°: 12 é a sequência de nucleotídeos do cassete de ex-pressão ZmUbi361-GUS SEQ ID N°: 13 é a sequência de nucleotídeos da sonda Zmllbil CTRL U29159.1-3 AT SEQ ID N°: 14 é a sequência de nucleotídeos da sonda ZmHSP70 ZM052966_S_AT SEQ ID N°: 15 é a sequência de nucleotídeos da sonda ZmU- bi158 CTRL_ZMU29158-3_AT SEQ ID N°: 16 é a sequência de nucleotídeos da sonda ZmU- bi361 ZM066361 S AT SEQ ID N°: 17 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso X73474 cDNA no GenBank SEQ ID N°: 18 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso TC279798 cDNA no TIGR SEQ ID N°: 19 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso AX099713 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 20 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso CL315596.1 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 21 é a sequência de nucleotídeos da sequência con-tígua MAGl_102343 de genoma do milho SEQ ID N°: 22 é a sequência de nucleotídeos do gene ZmHSP70 nativo (AY222837) SEQ ID N°: 23 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso Q41751 cDNA no GenBank SEQ ID N°: 24 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso AC196154 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 25 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso S94466 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 26 é a sequência de nucleotídeos da sequência con-tígua MAGI_6372 de genoma do milho SEQ ID N°: 27 é a sequência de nucleotídeos do gene Zmll- bi158 nativo SEQ ID N°: 28 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso TC369342-cDNA de cDNA no TIGR de consenso SEQ ID N°: 29 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso AC196194 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 30 é a sequência de nucleotídeos do número de acesso U29162.1 gDNA no GenBank SEQ ID N°: 31 é a sequência de nucleotídeos da sequência con-tígua MAGI_11628 de genoma do milho SEQ ID N°: 32 é a sequência de nucleotídeos da sequência con-tígua MAGI_56231 de genoma do milho SEQ ID N°: 33 é a sequência de nucleotídeos do gene Zmll- bi361 nativo SEQ ID N°: 34 é a sequência de nucleotídeos de ZmHSP70, construção de agrupamento 15902 SEQ ID N°: 35 é a sequência de nucleotídeos de Zmllbi158, construção de agrupamento 17222 SEQ ID N°: 36 é a sequência de nucleotídeos de ZmUbi361, construção de agrupamento 17267 SEQ ID N°: 37 é a sequência de nucleotídeos de pCR2.1 SEQ ID N°: 38 é a sequência de nucleotídeos de pNQV6901 SEQ ID N°: 39 é a sequência de nucleotídeos de 1104 bp da se-quência 5’ não transcrita de ZmHSP70 SEQ ID N°: 40 é a sequência de nucleotídeos da sequência líder 5’ não traduzida de 304 bp de ZmHSP70 SEQ ID N°: 41 é a sequência de nucleotídeos do intron ZmHSP70 1602 bp SEQ ID N°: 42 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência 3’ não traduzida 459 bp de ZmHSP70 SEQ ID N°: 43 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência 3’ não transcrita 535 bp de ZmHSP70 SEQ ID N°: 44 é a sequência de nucleotídeos do terminador de-rivado de ZmHSP70 SEQ ID N°: 45 é a sequência de nucleotídeos de 1506 bp da se-quência 5’ não transcrita de ZmUbi158 SEQ ID N°: 46 é a sequência de nucleotídeos da sequência líder 5’ não traduzida de 163 bp de ZmUbi158 SEQ ID N°: 47 é a sequência de nucleotídeos do ativador de tra-dução líder do vírus ETCH do tabaco SEQ ID N°: 48 é a sequência de nucleotídeos do primeiro íntron ZmUbi158 2386 bp SEQ ID N°: 49 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência 3’ não traduzida 341 bp de ZmUbi158 SEQ ID N°: 50 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência 3’ não transcrita 660 bp de ZmUbi158 SEQ ID N°: 51 é a sequência de nucleotídeos de 1501 bp da se-quência 5’ não transcrita de ZmUbi361 SEQ ID N°: 52 é a sequência de nucleotídeos de uma sequência líder 5’ não traduzida 260 bp de ZmUbi361 SEQ ID N°: 53 é a sequência de nucleotídeos do íntron ZmU- bi361 1329 bp SEQ ID N°: 54 é a sequência de nucleotídeos do terminador de-rivado de ZmUbi361 SEQ ID N°: 55 é a sequência de nucleotídeos do terminador de-rivado de ZmUbi158 SEQ ID N°: 56 é a sequência de nucleotídeos da sequência 3’ não traduzida 65 bp de Zmllbi361 SEQ ID N°: 57 é a sequência de nucleotídeos de 936 bp da se-quência 3’ não transcrita de ZmUbi361 SEQ ID N°: 58 é a sequência de nucleotídeos de pCR4-TOPO SEQ ID N°: 59 é a sequência de nucleotídeos do vetor 17680 SEQ ID N°: 60 é a sequência de nucleotídeos do vetor 18271 SEQ ID N°: 61 é a sequência de nucleotídeos do vetor 18272

DEFINIÇÕES

[0015] Os termos "quadro aberto de leitura"e "ORF"se referem à sequência de aminoácidos codificada entre códons de iniciação e terminação de tradução de uma sequência de codificação. Os termos "códon de iniciação" e "códon de terminação" se referem a uma unidade de três nucleotídeos adjacentes (‘códon’) em uma sequência de codificação que especifica a iniciação e terminação de cadeia, respectivamente, de síntese de proteína (tradução do mRNA).

[0016] O termo "estresse abiótico" se refere a fatores ambientais não vivos, como geada, seca, calor excessivo, ventos fortes, etc., que podem ter efeitos prejudiciais nas plantas.

[0017] O termo "ácido nucleico" se refere a um polinucleotídeo de alto peso molecular, que pode ser de fita simples ou de fita dupla, composto por monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, fosfato e uma base que é uma purina ou pirimidina. Um "fragmento ácido nucleico" é uma fração de uma molécula de ácido nucleico específica. Em plantas mais altas, o ácido desoxirribonucleico (DNA) é o material genético, enquanto o ácido ribonucleico (RNA) está envolvido na transferência das informações contidas no DNA em proteínas. Um "genoma" é todo o corpo do material genético contido em cada célula de um organismo. O termo "sequência de nucleotí-deos" se refere a um polímero de DNA ou RNA, que pode ser de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas capazes de incorporação em polímeros de DNA ou RNA. Salvo indicação contrária, uma sequência de ácido nucleico específica desta invenção também implicitamente abrange variantes modificadas conservadoramente dela mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais codons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos deóxi-inosina e/ou de base mista (Batzer, e outros, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, e outros, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini, e outros, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado alternadamente com gene, cDNA e mRNA codificado por urn gene.

[0018] O termo "unido operativamente" se refere à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de forma que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, uma promotora é unida operativamente com uma sequência de codificação ou RNA funcional quando é capaz de afetar a expressão da respectiva sequên-cia de codificação ou RNA funcional (isto é, que a sequência de codificação ou RNA funcional esteja sob o controle transcricional da promotora). Se-quências de codificação em orientação de sentido ou antissentido podem ser unidas operativamente a sequências reguladoras.

[0019] "Promotora" se refere a uma sequência de nucleotídeos que controla a expressão de uma sequência de codificação fornecendo o reconhecimento de polimerase de RNA e outros fatores exigidos para trans-crição adequada. O termo "sequências reguladoras da promotora" pode abranger elementos anteriores proximais e mais distais e/ou elementos pos-teriores. Sequências reguladoras da promotora influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência de codifi-cação associada. Sequências reguladoras da promotora incluem ativadores, sequências líderes não traduzidas, introns, éxons e sequências de sinal para poliadenilação. Incluem sequências naturais e sintéticas bem como sequên-cias que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais. Um "ativador" é uma sequência de nucleotídeos que podem estimular a atividade da promotora e pode ser um elemento congênito da promotora ou um elemento heterólogo inserido para aumentar a especificidade de tecido ou nível de uma promotora. A sequência de codificação pode existir em uma molécula de DNA de fita simples ou dupla e pode funcionar mesmo quando colocadas antes (anterior) ou depois (posterior) da promotora. O significado do termo "promotora" inclui "sequências reguladoras da promotora".

[0020] "Transformante primária" e "geração TO" se refere a plantas transgênicas que são de mesma geração genética do tecido que foi inicialmente transformado (isto é, não tendo passado por meiose e fertilização desde a transformação). "Transformantes secundárias" e "gerações T1, T2, T3, etc." se referem a plantas transgênicas derivadas de transform antes primárias por meio de um ou mais ciclos meióticos e de fertilização. Podem ser derivadas por autofertilização de transform antes primárias ou secundárias ou cruzamentos de transform antes primárias ou secundárias com outras plantas transformadas ou não transformadas.

[0021] "Gene" se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA, RNA funcional ou proteína específica, incluindo sequências reguladoras. O termo "gene nativo" se refere a um gene conforme encontrado na natureza. O termo "gene quimérico"se refere a qualquer gene que contenha 1) sequências de DNA, incluindo sequências reguladoras e de co-dificação, que não são encontradas na natureza, ou 2) sequências codifi-cando partes de proteínas que não se unem naturalmente, ou 3) partes de promotoras que não se unem naturalmente. Consequentemente, um gene quimérico pode abranger sequências reguladoras e sequências de codifica-ção derivadas de diferentes fontes, ou abranger sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Um "transgene" se refere a um gene que foi introduzido no genoma por transformação e é mantido de maneira estável. Transgenes podem incluir, por exemplo, genes que são heterólogos ou homólogos aos genes de uma planta específica a ser transformada. Além disso, transgenes podem abranger genes nativos inse-ridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. O termo "gene en-dógeno"se refere a um gene nativo em seu local natural no genoma de um organismo. Um gene "estrangeiro" se refere a um gene que não é normal- mente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no orga-nismo por transferência de gene.

[0022] "Cassete de expressão" conforme usado neste instru-mento, significa uma sequência de DNA capaz de orientar a expressão de uma sequência de nucleotídeos específica em uma célula hospedeira apro-priada, abrangendo uma promotora unida operativamente à sequência de nucleotídeos de interesse, que é unida operativamente a sinais de termina-ção. Também normalmente abrange sequências exigidas para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos. A região de codificação normal- mente codifica para uma proteína de interesse, mas também pode codificar para um RNA funcional de interesse, por exemplo, RNA antissentido ou um RNA não traduzido, na direção de sentido ou antissentido. O cassete de ex-pressão abrangendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, ou seja, pelo menos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um de seus outros componentes.

[0023] "íntron" se refere a uma seção interveniente de DNA que ocorre praticamente exclusivamente em um gene eucariótico, mas não é traduzida para sequências de aminoácidos no produto do gene. Os introns são removidos do mRNA pré-maduro por meio de um processo chamado "união", que deixa os éxons inalterados para formar um mRNA. Para os fins da presente invenção, a definição do termo "íntron" inclui modificações à sequência de nucleotídeos de um intron derivado de um gene de destino.

[0024] "Éxon" se refere a uma seção de DNA que transporta a sequência de codificação para uma proteína ou parte dela. Os éxons são separados por sequências intervenientes sem codificação (introns). Para os fins da presente invenção, a definição do termo "éxon" inclui modificações à sequência de nucleotídeos de um éxon derivado de um gene de destino.

[0025] Expressão ou expressão excessiva de um gene envolve a transcrição do gene a tradução do mRNA em uma proteína madura ou precursora. "Inibição de antissentido" se refere à produção de transcrições de RNA antissentido capazes de suprimir a expressão da proteína de destino. "Expressão excessiva" se refere à produção de um produto de gene em organismos transgênicos que ultrapassa os níveis de produção em organismo normais ou não transformados. "Cossupressão" se refere à produção de transcrições de RNA de sentido capazes de suprimir a expressão ou acúmulo de transcrição de genes endógenos ou estrangeiros idênticos ou conside-ravelmente semelhantes. O mecanismo de cossupressão pode ser em nível de DNA (como metilação de DNA), em nível transcricional, ou em nível pós- transcricional.

[0026] O termo "promotora constitutiva" se refere a uma promotora ativa em todos ou na maioria dos tecidos de uma planta em todas ou na maioria das fases de desenvolvimento. Como com as outras promotoras classificadas como constitutivas, pode haver alguma variação nos níveis ab-solutos de expressão entre diferentes tecidos ou fases.

[0027] Os termos "promotora constitutiva" ou promotoras "inde-pendentes de tecido" são usados alternadamente neste instrumento.

[0028] Um "fragmento de ácido nucleico isolado" se refere a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoximbonucleotídeos (DNA) que pode ser de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleo- tídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de DNA pode abranger um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0029] Os termos "polinucleotídeo", "sequência de polinucleotí-deo", "sequência de ácido nucleico", e "fragmento de ácido nuclei- co"/"fragmento de ácido nucleico isolado" são usados alternadamente neste instrumento. Estes termos abrangem sequências de nucleotídeos e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de DNA ou RNA que pode ser de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sin-téticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de um polí-mero de DNA pode abranger um ou mais segmentos de cDNA, DNA genô-mico, DNA sintético ou misturas dos mesmos. Nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma de 5'-monofosfato) são mencionados por uma designação de uma letra, conforme descrito a seguir: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato, "G" para guanilato ou deoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I"for inosina, e "N" para qualquer nucleotídeo.

[0030] Um "fragmento de ácido nucleico heterólogo" se refere a uma sequência que não ocorre naturalmente na sequência promotora da planta da invenção. Apesar de esta sequência de nucleotídeos ser heterólo- ga à sequência promotora, pode ser homóloga, nativa, heteróloga ou estran-geira ao hospedeiro da planta. Entretanto, é reconhecido que as promotoras presentes podem ser usadas com suas sequências de codificação nativas para aumentar ou reduzir a expressão resultante em uma alteração no fenó-tipo na semente transformada.

[0031] Os termos "subfragmento que é funcionalmente equiva-lente" e "subfragmento funcionalmente equivalente" são usados alternada-mente neste instrumento. Estes termos se referem a uma parte ou subse- quência de um fragmento de ácido nucleico isolado em que a capacidade de alterar a expressão do gene ou produzir um fenótipo específico é mantida, quer o fragmento ou subfragmento codifique ou não uma enzima ativa. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser usado na concepção de genes quiméricos para produzir o fenótipo desejado em uma planta trans-formada. Genes quiméricos podem ser concebidos para utilização em cos- supressão ou antissentido, ligando um fragmento de ácido nucleico ou sub-fragmento dele, codificando ou não uma enzima ativa, na direção apropriada com relação à sequência promotora de uma planta.

[0032] Os termos "consideravelmente semelhante" e "conside-ravelmente correspondente" conforme usados neste instrumento se referem a fragmentos de ácido nucleico em que alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico de mediar a expressão do gene ou produzir um fenótipo específico. Estes termos também se referem a modificações dos fragmentos de ácido nucleico desta invenção como exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram consideravelmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante relativo ao fragmento inicial inalterado. Fica, portanto, entendido, como os profissionais qualificados na técnica considerarão, que a invenção abrange mais do que as sequências exemplares específicas.

[0033] As "sequências 3' sem codificação" se referem a se-quências de DNA situadas a posterior de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequên-cias codificando sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão de gene. O sinal de poliadenilação é normalmente ca-racterizado por afetar a adição de características de ácido poliadenílico na extremidade 3' do precursor mRNA. A utilização de diferentes sequências de 3' sem codificação é exemplificada por Ingelbrecht e outros, Plant Cell 1:671- 680 (1989).

[0034] O termo "transformação" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucleico no genoma de um organismo hospedeiro, resul-tando em uma herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgênicos".

[0035] O termo "expressão transiente"se refere a expressão temporária de genes muitas vezes repórteres como β-glucuronidase (GUS), genes de proteína fluorescente GFP, ZS-YELLOW1 N1, AM-CYAN1, DS- RED em alguns tipos de célula selecionados do organismo hospedeiro onde o gene transgênico é introduzido temporariamente por um método de trans-formação.

[0036] Técnicas padrão de clonagem molecular e DNA recom- binante usadas neste processo são bem conhecidas na técnica e são descri-tas com detalhes em Sambrook, J. e outros, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nded.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (doravante "Sambrook e outros, 1989") ou Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. e Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons: Nova York, 1990 (doravante "Ausubel e outros, 1990").

[0037] "PCR"ou "Reação em Cadeia da Polimerase"é uma técnica para a síntese de grandes quantidade de segmentos de DNA específicos, abrangendo uma série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, Conn.). Normalmente, o DNA de fita dupla é aquecido desnaturado, os dois iniciadores complementares aos limites de 3' do segmento de destino são temperados a baixa temperatura e depois estendidos a uma temperatura intermediária. Um conjunto destas três etapas consecutivas compõe um ciclo.

[0038] Conforme utilizado neste instrumento, a frase "condições rigorosas de hibridização" se refere a condições sob as quais um poli- nucleotídeo hibridiza com sua subsequência de destino, normalmente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente com ne-nhuma outra sequência. Condições rigorosas são dependentes de sequência e podem ser diferentes sob circunstâncias diferentes. Sequências mais longas normalmente hibridizam especificamente a temperaturas mais altas. Um guia abrangente sobre a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, 1993. Geralmente, condições rigorosas são selecionada como aproximadamente 5-10°C a menos do que o ponto de fusão térmico (Tm) da sequência específica a uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica, pH, concentração de ácido nucleico definidos) na qual 50% das sondas adicionais ao destino hibridizam até a sequência de destino com equilíbrio (como as sequências de destino existem em excesso, ao Tm, 50% das sondas são ocupadas com equilíbrio). Uma hibridização rigorosa exemplar é realizada a uma temperatura de 65°C, preferivelmente 60°C e mais preferivelmente 55°C, em solução salina tamponada com citrato de força dupla (2X) (SSC) contendo 0,1 % SDS seguida por enxágue do apoio à mesma temperatura, mas com um tamponamento com uma concentração reduzida de SSC. Tais tamponamentos de concentração reduzida são nor-malmente um décimo da força SSC (0,1 X SSC) contendo 0,1 % SDS, prefe-rivelmente 0,2X SSC contendo 0,1 % SSC e mais preferivelmente meia força SSC (0,5X SSC) contendo 0,1 % SDS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0039] As sequência de nucleotídeos da promotora e métodos descritos neste instrumento são úteis para regular a expressão de qualquer sequência de ácido nucleico heterólogo em uma planta hospedeira de forma a alterar o fenótipo de uma planta.

[0040] Diversas alterações no fenótipo são de interesse, inclu-indo, entre outros, modificar a composição de ácidos graxos em uma planta, alterar a composição de aminoácidos de uma planta, alterar o sistema de defesa de patógenos de uma planta, alterar a resposta da planta ao ambiente, e similares. Estes resultados podem ser alcançados oferecendo expressão de produtos heterólogos ou maior expressão de produtos endógenos nas plantas. Alternativamente, os resultados podem ser alcançados oferecendo uma redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, par-ticularmente enzimas ou cofatores na planta. Estas alterações resultam em uma alteração no fenótipo da planta transformada.

[0041] Os genes de interesse refletem os mercados comerciais e interesses dos envolvidos no desenvolvimento dos cultivos. Os cultivos e mercados de interessem mudam e, conforme as nações em desenvolvimento abrem mercados mundiais, também surgirão novos cultivos e tecnologias. Além disso, de acordo com o nosso entendimento das características agro-nômicas, como aumento de heterose e rendimento, a escolha dos genes para transformação mudará de maneira correspondente. Categorias de transgenes, também conhecidos como genes heterólogos, por exemplo, in-cluem, entre outras, genes codificando importantes características agronô-micas, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, esterilidade, características de grãos ou semente, e produtos comerciais. Genes de interesse incluem, geralmente, os envolvidos em metabolismo de nutriente, carboidrato, amido ou óleo bem como os que afetam tamanho da semente, desenvolvimento da planta, regulação do crescimento da planta e melhoria de rendimento. Regulação de crescimento e desenvolvimento da planta também se refere à regulação de desenvolvimento e crescimento de diversas partes de uma planta, como flor, semente, raiz, folha e germe.

[0042] Outras características comercialmente desejáveis são genes e proteínas que oferecem resistência ao frio, calor, sais e seca.

[0043] Genes com resistência a doenças e/ou insetos podem codificar resistência a pragas que apresentem grande obstáculos ao rendi-mento, como, por exemplo, antracnose, vírus do mosaico da soja, nematoide de cisto de soja, nematoide de raiz, melanose marrom, míldio do tabaco, mancha púrpura da semente, desintegração da semente e doenças de mudas normalmente causadas pelos fungos Pythium sp., Phytophthora sp., Rhizoctonia sp., Diaporthe sp. Ressecamento bacteriano causado pela bac-téria Pseudomonas syringae pv. Glycinea. Genes que conferem resistência a insetos incluem, por exemplo, genes da proteína tóxica Bacillus thuringien- sis (Patente dos EUA N.° 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al (1986) Gene 48:109); lecitinas (Van Damme e outros (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); e similares.

[0044] Características de resistência a herbicida podem incluir codificação de genes para resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de síntese de acetolactato (ALS), especificamente os herbicidas do tipo sulfonilureia (por exemplo, o gene de ALS de síntese de acetolactato con-tendo mutações que causam este tipo de resistência, especificamente as mutações S4 e/ou HRA). Os mutantes do ALS-gene codificaram resistência ao clorsulfurão herbicida. Transferase de acetil glifosato (GAT) é uma N- acetiltransferase do Bacillus licheniformis que foi aperfeiçoada por mistura de gene para acetilação do herbicida de amplo espectro, glifosato, formando a base de um novo mecanismo de tolerância ao glifosato em plantas trans- gênicas (Castle e outros (2004) Science 304, 1151-1154). Seria óbvio usar outras características de resistência a herbicida para um profissional qualifi-cado na técnica.

[0045] As sequências da promotora, preferivelmente sequências de promotora isoladas, da presente invenção podem ser modificadas para fornecer uma série de níveis de expressão constitutiva da sequência de nucleotídeos heterólogos. Desse modo, menos do que todas as regiões promotoras podem ser utilizadas e a capacidade de orientar a expressão da sequência de codificação é retida. Entretanto, é reconhecido que os níveis de expressão de mRNA podem ser reduzidos com exclusões de partes de sequências da promotora. Em alguns casos, a expressão reduzida pode ser desejável. A modificação das sequências da promotora pode mudar a natu-reza constitutiva independentemente de tecido da expressão. Portanto, fra-gmentos de SEQ ID N°: 1-3 que são 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a SEQ ID N°: 1-3 ainda podem funcionar conforme exemplificado por esta descrição.

[0046] Para identificar genes de milho candidatos e respectivas sequências reguladoras apropriadas para desenvolvimento de cassete de expressão, dados de definição de perfil de expressão de milho de uma série de definições de perfil de expressão de desenvolvimento foram analisados por sondas que demonstraram o sinal médio mais alto entre todas as amostras. O sinal médio foi calculado com relação a cada sonda e depois cada sonda foi classificada com base no sinal médio. A sonda CTRLJJ29159.1 - 3_AT (SEQ ID N°: 13) representando Zmllbil, um cassete de expressão constitutivo bem caracterizado, ficou em 7o nesta análise. Esta análise foi a base para selecionar 3 promotoras candidatas adicionais para construção de cassete de expressão constitutivo: ZmHSP70, ficou em 2o (SEQ ID N°: 23), Zmllbil58, ficou em 3o (SEQ ID N°: 30), e ZmUbi361, ficou em 10° (SEQ ID N°: 38). Os dados na tabela 1 (10 principais constitutivos) resumem os resultados. Tabela 1. Força de sinal relativa da expressão em tecidos

[0047] Vetores de plasm ídeos abrangendo os cassetes de ex-pressão recombinante da presente invenção podem ser construídos. A escolha do vetor de plasm ideo depende do método que será usado para transformar as células hospedeiras. O técnico versado sabe quais são os elementos genéticos que devem existir no vetor de plasm ideo para transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras contendo o gene quimérico.

[0048] Métodos para transformação de monocotiledôneas, principalmente usando Agrobacteríum tumefaciens, e obtendo plantas trans-gênicas foram publicados para monocotiledôneas (Patente dos EUA N.° 6.037.522), trigo (Cheng e outros, Plant Cell Rep. 15:971-980 (1997), e es-pecificamente milho (Patente dos EUA N.° 6.051.409). Métodos para trans-formação de dicotiledôneas, principalmente usando Agrobacteríum tumefaci-ens,e obtendo plantas transgênicas foram publicados, entre outros, para algodão (Patente dos EUA N.° 5.004.863, Patente dos EUA N.° 5.159.135); soja (Patente dos EUA N.° 5.569.834, Patente dos EUA N.° 5.416.011); Brássica (Patente dos EUA N.° 5.463.174); e amendoim (Cheng e outros, Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), McKently e outros, Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)). Para ver uma análise de outros métodos normalmente usados para transformação de plantas, consulte Newell, C. A., Mol. Bio- technol. 16:53-65 (2000).

[0049] Existem vários métodos para a regeneração de plantas a partir de tecidos de plantas. O método específico de regeneração dependerá do tecido inicial da planta e da espécie específica da planta a ser regenerada. A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas de transfor- mantes protoplastas de planta simples ou de diversos explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, Eds.; In Methods for Plant Molecular Biology; Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1988). Este processo de regeneração e crescimento normalmente inclui as etapas de seleção de células transformadas, fazendo a cultura destas células individualizadas por meio das fases habituais de desenvolvimento embriônico ou por meio de fase de plantinha enraizada. Embriões e sementes transgênicos são regenerados de modo semelhante. Os germes enraizados transgênicos resultantes são depois plantados em um meio de crescimento de planta apropriado, como solo. Preferivelmente, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. De outra forma, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas a partir de sementes de linhas agronomicamente importantes. In-versamente, o pólen das plantas destas linhas importantes é usado para po-linizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada usando métodos bem co-nhecidos pelos versados da técnica.

[0050] Além dos procedimentos discutidos acima, os profissionais conhecem os materiais de recurso padrão que descrevem as condições e procedimentos específicos para a construção, manuseio e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.), geração de fragmentos de DNA recombinante e construções de expressão re- combinantes e a triagem e isolamento de clones (consulte, por exemplo, Sambrook, J. e outros, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nded.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Mali- ga e outros, In Methods in Plant Molecular Biology; Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren e outros, In Genome Analysis: Detecting Genes, 1; Cold Spring Harbor: Nova York, 1998; Birren e outros, In Genome Analysis: Analyzing DNA, 2; Cold Spring Harbor: Nova York, 1998; Clark, Ed., In Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual; Springer: Nova York, 1997).

[0051] O profissional versado também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão dos genes quiméricos (Jones e outros, EM- BO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida e outros, Mol. Gen. Genetics 218:78- 86 (1989)). Assim, diversos eventos devem ser triados para obter linhas exibindo o nível e padrão de expressão desejado. Tal triagem pode ser realizada por análise Northern de expressão de mRNA, análise Western de expressão de proteína ou análise fenotípica. Também de interesse são as sementes obtidas de plantas transformadas exibindo o perfil de expressão do gene desejado.

[0052] Transformação e seleção podem ser realizadas usando métodos bem conhecidos aos profissionais da técnica incluindo, entre outros, os métodos descritos neste instrumento.

EXEMPLOS Exemplo 1: ZmHSP70

[0053] A sonda ZmHSP70 GeneChip, ZM052966_S_AT (SEQ ID N°: 14), foi usada para identificar cDNAs e gDNAs correspondentes em bancos de dados genômicos. Os cDNAs identificados incluem acesso X73474 do GenBank (SEQ ID N°: 17) é acesso TC279798 do TIGR (SEQ ID N°: 18).

[0054] Os gDNAs incluem acessos AX099713 (SEQ ID N°: 19) e CL315596.1 do GenBank (SEQ ID N°: 20), e sequência contígua MA- Gl_102343 de genoma do milho (SEQ ID N°: 21). Estas sequências foram usadas para desenvolver uma anotação em nível de base do gene ZmHSP70 (SEQ ID N°: 22). O gene ZmHSP70 abrange dois éxons separados por um íntron. Os dados da sequência foram usados para projetar um cassete de expressão seguindo o método usado para fazer os cassetes de expressão OsMADS, conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA, Publicação Número 2007/0006344, incorporado nesse instrumento por referência em sua totalidade. Antes do gene de interesse (GOI) o cassete de expressão concluído abrange a promotora ZmHSP70 contendo 1104 bp da sequência 5’ não transcrita (SEQ ID N°: 39), uma sequência líder 5’ não tra- duzida 304 bp (SEQ ID N°: 40) que termina em uma sequência Kozak de milho aperfeiçoada (gtaaaccatgg, SEQ ID N°: 9) e o intron 1602 bp ZmHSP70 (SEQ ID N°: 51).

[0055] A sequência de codificação da proteína ZmHSP70 foi si-lenciada realizando mutação dos códons de início de tradução e alterando outros códons para inserir paradas de tradução antes do local do códon de início de tradução projetado (no Ncol). A posterior da GOI, o cassete de ex-pressão abrange uma sequência de terminador (SEQ ID N°: 44) derivado do gene ZmHSP70. Abrange uma sequência 459 bp 3’ não traduzida (SEQ ID N°: 42) que inicia logo depois do códon de parada de tradução, mais 535 bp de sequência ZmHSP70 3' não transcrita (SEQ ID N°: 43). SEQ ID N°: 34 e 4 definem os vetores binários e de agrupamento de ZmHSP70, respectiva-mente. Em ambos os casos, o cassete de expressão ZmHSP70 (SEQ ID N°: 10) abrange o gene repórter β-glucuronidase (GUS).

[0056] O vetor de agrupamento ZmHSP70 (SEQ ID N°: 34) foi criado pelo seguinte método: O término HSP70 (SEQ ID N°: 44) teve PCR ampliado do DNA genômico de milho e clonado em pNQV6901 como um fragmento Sacl/Xmal. O método QUIKCHANGE® (Stratagene) foi usado para corrigir a disparidade de uma base. A promotora HSP70 (prZmHSP70) teve PCR ampliado de DNA genômico de milho, que foi subsequentemente clonado por TOPO® (Invitrogen) em pCR2.1 (SEQ ID N°: 37). Mutagênese orientada por local mediada por QUICKCHANGE® adicional excluiu os locais de códon de início (ATG) na região 5'-UTR, inativou dois locais Saci, e corrigiu a discrepância de uma base no íntron. O prZmHSP70 modificado foi clonado em GUStZmHSP70 recombinante (pNQV6901, SEQ ID N°: 38) como um fragmento Xhol/Ncol.

[0057] O vetor binário ZmHSP70 (SEQ ID N°: 4) foi criado pelo seguinte método. O vetor receptor foi linearizado com a enzima de restrição Rsrll. O vetor de agrupamento ZmHSP70 foi digerido com enzimas de restrição Rsrll e SanDI, extirpando o cassete de expressão conforme definido pela SEQ ID N°: 10. O cassete de expressão foi então clonado no vetor receptor no local Rsrll.

[0058] O vetor binário ZmHSP70 (SEQ ID N°: 4) foi transformado em milho por transformação por Agrobacterium,uma técnica bem conhecida aos profissionais qualificados. Dos 46 eventos que foram produzidos, 17 deram semente. A enzima GUS em folhas totalmente expandidas foi testada por localização histoquímica (todos os eventos) e atividade da enzima (even-tos selecionados).

[0059] Perfurações em folha de dezessete plantas de milho T0 foram amostradas em termos de análise histoquímica de atividade GUS ori-entada pelo cassete de expressão ZmHSP70, quinze plantas mostraram ex-pressão GUS positiva e todas as expressões positivas demonstraram inten-sidade de descoloração leve. Para conformar a expressão GUS orientada por prZmHSP70, realizamos análise de atividade GUS pelo método de ensaio 4-metilumbeliferona β-D-galactopiranosideo (MUG) (Armenta, e outros) de diversas amostras de plantas. Análise histoquímica é uma medida pura- mente qualitativa neste caso. O ensaio de atividade da enzima GUS fornece informações quantitativas por meio de extração e análise da proteína produ-zida pelo transgene. O GUS orientado por prZmHSP70 possui forte expressão e uma estrutura de superfície de folha como "papila foliácea"ou "pelos glandulares" ou "tricomas" (protrusões da superfície epidérmica).

[0060] Os eventos MZAS2007020377A005A e MZAS2007020377A010A são de cópia simples, positivo para GUS e produ-zem muita semente. Foram selecionados para análise T1. A segregação foi consistente com os dados T0. A Tabela 2 resume a análise de mudas F1. Três ensaios foram realizados para examinar atividade de gene repórter GUS no tecido de folha jovem de cada planta: localização histoquímica, ELISA e atividade de enzima. Com base nestes resultados, as plantas foram selecionadas para avaliação de desenvolvimento da expressão GUS. Tabela 2. Resumo de caracterização da planta prZmHSP70

[0061] Um experimento adicional com mudas MZAS2007020377A005A examinou a atividade GUS em resposta a ensaio de choque térmico. Plantas de duas semanas passaram por choque térmico a 42°C por 2 horas, depois a atividade GUS foi testada por ELISA e ensaio de enzima. Os resultados estão na Tabela 3. Não houve diferença discerní- vel na atividade GUS entre as plantas de controle e as que passaram por choque térmico. Tabela 3. Atividade GUS em resposta a choque térmico.

[0062] A Tabela 4 fornece dados que resumem os dados de localização histoquímica sobre tecido reprodutivo de planta ZmHSP70 T1/B1 Tabela 4. Resultados de localização histoquímica T1/B1 para eventos 15907.

[0063] Os dados indicados aqui demonstram que prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1) é funcional na maioria dos tecidos de planta de milho. Exemplo 2: Zmllbil58

[0064] A sonda ZmUbi158 GeneChip, CTRL_ZMU29158-3_AT (SEQ ID N°: 15), foi usada para identificar cDNAs e gDNAs correspondentes em bancos de dados genômicos. Os cDNAs identificados incluem acesso Q41751 do GenBank (SEQ ID N°: 23). Os gDNAs incluem acessos AC196154 (SEQ ID N°: 24) e S94466 do GenBank (SEQ ID N°: 25), e sequência contígua MAGI_6372 de genoma do milho (SEQ ID N°: 26). Estas sequências foram usadas para desenvolver uma anotação em nível de base do gene Zmllbil58 (SEQ ID N°: 27). O gene ZmU- bi158 abrange três éxons separados por dois introns. Os dados da sequência foram usados para projetar um cassete de expressão seguindo o método usado para fazer os cassetes de expressão OsMADS, conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA, Publicação N.° 2007/0006344, incorporado neste instrumento por referência em sua totalidade. Antes do gene de interesse (GOI) o cassete de expressão concluído abrange a promotora ZmU- bi158 contendo 1506 bp da sequência 5’ não transcrita (SEQ ID N°: 45), uma sequência líder 5’ não traduzida 163 bp (SEQ ID N°: 46) que contém o ativa- dor de tradução líder do vírus ETCH do tabaco (SEQ ID N°: 47) e termina em uma sequência Kozak de milho aperfeiçoada (ataaaccatgg) (SEQ ID N°: 8) e o primeiro íntron 2386 bp ZmUbi158 (SEQ ID N°: 48).

[0065] A sequência de codificação da proteína ZmUbi158 foi si-lenciada realizando mutação dos códons de início de tradução e alterando outros códons para inserir paradas de tradução antes do local do códon de início de tradução projetado (no Ncol). A posterior da GOI, o cassete de ex-pressão abrange uma sequência de terminador (SEQ ID N°: 55) derivado do gene ZmUbi158. Abrange uma sequência 341 bp 3’ não traduzida (SEQ ID N°: 49) que inicia logo depois do códon de parada de tradução, mais 660 bp de sequência Zmllbil58 3'não transcrita (SEQ ID N°: 50). SEQ ID N°: 35 e 5 definem os vetores binários e de agrupamento de Zmllbil58, respectivamente. Em ambos os casos, o cassete de expressão Zmllbil58 (SEQ ID N°: 11) abrange o gene repórter β-glucuronidase (GUS).

[0066] A promotora prZmllbi158 (SEQ ID N°: 2) foi projetada conforme descrito acima. O produto foi verificado por análise de restrição e análise de sequência completa. O componente da sequência de codificação GUS foi clonado no cassete de expressão como um fragmento Ncol/Sacl. As ligações de clonagem foram sequenciadas.

[0067] O cassete de expressão ZmUbi158-GUS (SEQ ID N°: 11) foi extirpado de 17222 como um fragmento RsrlI/SanDI e ligado ao local Rsrll no vetor receptor. As ligações de clonagem foram sequenciadas.

[0068] O vetor binário ZmUbi158 (SEQ ID N°: 5) foi transformado em milho por transformação por Agrobacteríum, uma técnica bem conhecida. Dos 35 eventos que foram produzidos, 14 deram semente. A Tabela 5 resume os dados de produção de semente destes eventos. A enzima GUS em folhas jovens e totalmente expandidas foi testada por localização histo- química e ELISA. Os dados T0 estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5. Resultados do ensaio GUS de plantas T0.

2 GUS como ng/mg de proteína solúvel de tecido de folha V6. 3 tecido de folha foi incubado em reagente de coloração histoquímica durante a noite a 37°C, depois foi limpo e marcado como positivo ou negativo.

[0069] A Tabela 6 resume os dados do ensaio GUS T1/B1 sobre tecido de plantas contendo o cassete de expressão ZmUbi158-GUS. Tabela 6. Dados de ensaio GUS T1/B1 sobre tecido de plantas contendo o cassete de expressão ZmUbi158-GUS.

1A indica todos os tecidos incubados à temperatura ambiente por 7 horas; B indica todos os tecidos incubados a 37°C por 16 horas; C indica folha da espiga, folha pendão, palha, cabelo, pendão incubados a 37°C por 16 horas, outros tecidos incubados à temperatura ambiente por 5 horas; D indica folha da espiga, folha pendão, palha, cabelo, pendão incubados a 37°C por 16 horas, outros tecidos incubados à temperatura ambiente por 6 horas; E indica folha da espiga, folha pendão, palha, cabelo, pendão incubados a 37°C por 16 horas, outros tecidos incubados à temperatura ambiente por 4 horas; F indica folha da espiga, folha pendão, palha incubados a 37°C por 16 horas, outros tecidos incubados à temperatura ambiente por 5 horas; G indica folha da espiga, folha pendão, palha incubados a 37°C por 16 horas, outros tecidos incubados à temperatura ambiente por 7 horas

[0070] Os dados apresentados na Tabela 6 demonstram que prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) é funcional em tecido de planta de milho, abran-gendo SEQ ID N°: 2. Exemplo 3: Zmllbi361

[0071] A sonda ZmUbi361 GeneChip, ZM066361_S_AT (SEQ ID N°: 16), foi usada para identificar cDNAs e gDNAs correspondentes em bancos de dados genômicos. Os cDNAs identificados incluem acesso TC369342-cDNA do TIGR (SEQ ID N°: 28). Os gDNAs incluem acessos AC196194 (SEQ ID N°: 29) e U29162.1 do GenBank (SEQ ID N°: 30), e se-quência contígua MAGI_11628 de genoma do milho (SEQ ID N°: 31) e MA- Gl_56231 (SEQ ID N°: 32). Estas sequências foram usadas para desenvolver uma anotação em nível de base do gene Zmllbi361 (SEQ ID N°: 33).

[0072] O gene Zmllbi361 abrange dois éxons separados por um íntron. Os dados da sequência foram usados para projetar um cassete de expressão seguindo o método usado para fazer os cassetes de expressão OsMADS, conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA, Publicação N.° 2007/0006344, incorporado neste instrumento por referência em sua to- talidade. Antes do gene de interesse (GOI) o cassete de expressão concluído abrange a promotora Zmllbi361 contendo 1501 bp da sequência 5’ não transcrita (SEQ ID N°: 51), uma sequência líder 5’ não traduzida 260 bp (SEQ ID N°: 52) que contém o ativador de tradução líder do vírus ETCH do tabaco (SEQ ID N°: 47) e termina em uma sequência Kozak de milho aperfeiçoada (ataaaccatgg) (SEQ ID N°: 8) e o íntron 1329 bp ZmUbi361 (SEQ ID N°: 53). A sequência de codificação da proteína Zmllbi361 foi silenciada realizando mutação dos códons de início de tradução e alterando outros có- dons para inserir paradas de tradução antes do local do códon de início de tradução projetado (no Ncol). A posterior da GOI, o cassete de expressão abrange uma sequência de terminador (SEQ ID N°: 54) derivado do gene Zmllbi361. Abrange uma sequência 65 bp 3’ não traduzida (SEQ ID N°: 56) que inicia logo depois do códon de parada de tradução, mais 936 bp de sequência ZmUbi361 3' não transcrita (SEQ ID N°: 57). SEQ ID N°: 36 e 6 definem os vetores binários e de agrupamento de Zmllbi361, respectivamente. Em ambos os casos, o cassete de expressão Zmllbi361 (SEQ ID N°: 12) abrange o gene repórter β-glucuronidase (GUS).

[0073] O cassete de expressão prZmUbi361 (SEQ ID N°: 12) foi concebido conforme descrito acima e sintetizado, fornecido em pCR4- TOPO (SEQ ID N°: 58). SEQ ID N°: 12 foi extirpado como um fragmento SanDIIRsrlI e ligado ao suporte principal da SEQ ID N°: 35. A sequência GUS foi extirpada de pNQV6901 como um fragmento Ncol/Sacl e ligada ao cassete de expressão ZmUbi361.

[0074] O cassete de expressão prZmUbi361 (SEQ ID N°: 12) foi extirpado de 17267 como um fragmento SanDI/RsrlI e ligado ao local Rsrll no vetor receptor.

[0075] O vetor binário ZmUbi361 (SEQ ID N°: 6) foi transformado em milho por métodos de transformação bem conhecidos na técnica. Dos 36 eventos que foram produzidos, 21 deram semente. A Tabela 7 resume os dados de genotipação e produção de semente destes eventos. A transcrição GUS (mRNA) também foi quantificada em tecido de folha jovem. A enzima GUS em folhas totalmente expandidas foi testada por localização histoquí- mica e ELISA. Os dados TO estão resumidos na Tabela 7. Tabela 7. Produção de semente e dados histoquímicos GUS de ZmUbi361.

1expressão relativa para controle endógeno (fator de alongamento 2a) 2 GUS como ng/mg de proteína solúvel 3 pontuado positivo (+) ou negativo (-); "ND" é 'sem dados’

[0076] Plantas T1 representando três eventos foram analisadas para determinar o desempenho do cassete de expressão de cassetes abrangendo a promotora ZmUbi361. A abordagem experimental incluiu dois estudos, um ensaio de mudas e um estudo de desenvolvimento. Ambos os tecidos de raiz e de folha de mudas T1/B1 foram analisados para verificar acúmulo de proteína GUS.

[0077] Dados de proteína repórter de GUS de mudas T1/F1 abrangendo ZmUbi361 estão na Tabela 8. Tabela 8.

1 unidades relativas 2 proteína solúvel ng GUS/MG

[0078] O estudo de desenvolvimento demonstra o acúmulo espacial de proteína GUS em toda a planta. Para fazer isto, as plantas foram amostradas em três fases, no desenvolvimento reprodutivo inicial ou R1 (Ritchie e outros, 1992), pós-polinização ou R2 e desenvolvimento reprodutivo posterior (R3). Diversas partes da planta foram analisadas usando histoquímica. Os dados sugerem que ZmUbi158 é menos ativo no tecido reprodutivo em relação a tecidos vegetais; entretanto, é ativo no pólen.

[0079] Os dados da expressão de desenvolvimento de milho T1 transportando o cassete de expressão ZmUbi361 estão nas Tabelas 9A a 9D. Estes dados indicam que Zmllbi361 é mais ativo na raiz em comparação à folha. O desempenho quantitativo de Zmllbi361 é de 2 a 4 vezes superior do que de Zmllbil58. Na extremidade inferior, o acúmulo de proteína GUS representa 0,5 % de proteína solúvel e na extremidade superior, 4% da proteína extraível em mudas de cópia simples. Tabela 9A. Plantas em fase V8.

Exemplo 5. Funcionalidade da promotora em uma dicotiledônea

[0080] SEQ ID N°: 2 e 3 foram testadas em plantas de tabaco para determinar se estas promotoras, que foram projetadas de genes de monocotiledôneas, funcionariam como promotoras em dicotiledôneas. O tabaco é um organismo modelo e é útil como indicador de como será o desempenho dos cassetes de expressão em outras plantas dicotiledôneas, como a soja.

[0081] O cassete de expressão prZmUbi158-GUS (SEQ ID N°: 11) de plasmídeo 17222 (SEQ ID N°: 35) foi digerido com enzima de restrição com SanDI e Rsrll e, subsequentemente, clonada no local Rsrll do vetor binário 17680 (SEQ ID N°: 59) para criar o vetor 18271 (SEQ ID N°: 60). SEQ ID N°: 60 foi transformado em tabaco por transformação mediada por Agrobacterium.O desempenho de prZmUbi158 em plantas de tabaco T0 está registrado na Tabela 10, abaixo. Como os dados indicam, prZmUbi158, apesar de reter alguma função, não foi uma promotora altamente ativa no tabaco. Tabela 10. Funcionalidade prZmUbi158 em plantas de tabaco T0.

1 unidades relativas 2 proteína solúvel ng GUS/mg

[0082] O cassete de expressão prZmUbi361-GUS (SEQ ID Nº: 12) de plasmídeo 17267 (SEQ ID Nº: 36) foi digerido com enzima de restri- ção com SanDI e RsrII e, subsequentemente, clonada no local RsrII do vetor binário 17680 (SEQ ID Nº: 59) para criar o vetor 18272 (SEQ ID Nº: 61). SEQ ID Nº: 61 foi transformado em tabaco por transformação mediada por Agrobacterium.O desempenho de prZmllbi361 em plantas de tabaco TO está registrado na Tabela 11, abaixo. Como os dados indicam, prZmUbi361 foi altamente ativo no tabaco. Estes dados indicam que prZmUbi361 é uma promotora desejável para utilização em plantas dicotiledôneas bem como em plantas monocotiledôneas. Tabela 11. funcionalidade prZmllbi361 em tabaco TO.

1 unidades relativas 2 proteína solúvel ng GUS/mg Exemplo 6. Aprimoramento de promotora

[0083] SEQ ID N°: 1-3 são modificadas sequencialmente para excluir da região 5’, e a cada 200 bp, uma parte da sequência promotora original. As exclusões são feitas usando métodos bem conhecidos por qual-quer profissional habilitado na técnica, incluindo PCR, mutagênese e síntese de gene. As séries de exclusões são, então, ligadas a vetores binários com-pilados com Xhol/Ncol,respectivamente, para substituir as promotoras originais. A construção do fragmento GUS da nova promotora é introduzida em monocotiledôneas e dicotiledôneas usando o método de ensaio transiente descrito no Pedido de Patente Provisório dos EUA N°: 61/186.025, incorporado neste instrumento por referência em sua totalidade, e por transformação mediada por Agrobacteríum tumefaciens para gerar plantas transgênicas.

[0084] A expressão GUS nestas plantas transgênicas é examinada por ensaio de atividade e ensaio histoquímico em tecido de raiz e folha, conforme descrito acima. Ao comparar as atividades GUS em diversas construções de exclusão e construções da promotora original, os fragmentos 5’ conferindo atividade de promotora funcional são identificados como frag-mentos de promotora funcional e classificados com base no tamanho. Com isto, o menor fragmento de promotora funcional da sequência da promotora original é determinado.

[0085] Uma série de substituições de base nos menores fragmentos da promotora original é gerada por síntese de gene química direta. Além disso, códons de início indesejados são assim silenciados. Estes mu- tantes são clonados para gerar outro conjunto de construções GUS de promotora. A expressão GUS destas construções em plantas transgênicas tem a medida determinada usando os métodos descritos acima. Domínios essenciais nos menores fragmentos funcionais, em que substituições de base anulam a atividade da promotora, são assim determinados.

[0086] Os cassetes de expressão também podem ser aprimorados removendo ou adicionando ativadores de transcrição ou de tradução. Como exemplo, sem limitação, o cassete de expressão abrange uma promotora selecionada do grupo abrangendo SEQ ID N°: 1, 2, e 3. Como exemplo adicional, o cassete de expressão também abrange os ativadores de transcrição eFMV (nucleotídeos 306 - 499 da SEQ ID N°: 6) e e35S (nucleotídeos 506 - 798 da SEQ ID N°: 6) imediatamente antes da promotora. Como exemplo adicional, o cassete de expressão também abrange o ativador de tradução líder do vírus do mosaico do tabaco (SEQ ID N°: 7) imediatamente a posterior da promotora. Como exemplo adicional, o cassete de expressão também abrange uma sequência Kozak (SEQ ID N°: 8 ou SEQ ID N°: 9) imediatamente antes do códon de início do gene de interesse.

Conclusão

[0087] Considerando os resultados indicados aqui, um objeto desta invenção é fornecer um ácido nucleico, preferencialmente um ácido nucleico isolado, capaz de orientar a expressão em uma célula da planta, em que a sequência de ácido nucleico abrange uma região 5’-não traduzida, um primeiro éxon, um primeiro íntron, e uma parte de um segundo éxon de um gene representado por uma sequência selecionada do grupo abrangendo a SEQ ID N°: 13-33. A invenção também se relaciona à sequência de ácido nucleico selecionada do grupo abrangendo a SEQ ID N°: 1-3. Em outro aspecto, a célula da planta abrangendo o ácido nucleico pode ser uma célula monocotiledônea ou uma célula dicotiledônea. Em ainda outro aspecto, a célula da planta abrangendo o ácido nucleico pode ser uma célula de milho ou uma célula de tabaco.

[0088] Em outro aspecto, um objeto da presente invenção é re-lacionar a um método de expressão de um gene heterólogo abrangendo a construção de um cassete de expressão abrangendo uma promotora seleci-onada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmllbi361 (SEQ ID N°: 3), em que o cassete de expressão seja funcional em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte; e criando uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que o gene heterólogo seja expresso. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja tabaco ou soja.

[0089] A presente invenção também se relaciona a uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZ- mUbi361 (SEQ ID N°: 3). A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja tabaco ou soja.

[0090] A presente invenção também se relaciona a um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3).

[0091] A presente invenção também se relaciona a uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte feita pelo método de expressão de um gene heterólogo abrangendo a construção de um cassete de expressão abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3), em que o cassete de expressão seja funcional em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte; e criando uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte abrangendo o cassete de expressão, em que o gene heterólogo seja expresso. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma monocotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja milho. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja uma dicotiledônea. A invenção também se relaciona à expressão do gene heterólogo em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte em que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte seja selecionada do grupo abrangendo tabaco e soja. Em outro aspecto, a presente invenção também se relaciona à progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte, abrangendo uma promotora selecionada do grupo abrangendo prZmHSP70 (SEQ ID N°: 1), prZmUbi158 (SEQ ID N°: 2) e prZmUbi361 (SEQ ID N°: 3). A presente invenção também se relaciona à semente derivada da progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte. A presente invenção também se relaciona aos grãos derivados da progénie da planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte.

[0092] A presente invenção também se relaciona a uma sequência de ácido nucleico capaz de orientar a expressão em uma célula da planta, em que a sequência de ácido nucleico abrange uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo abrangendo (a) uma sequência de ácido nucleico que seja pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID N°: 1-3; (b) uma sequência de ácido nucleico que é um fragmento funcional de uma das SEQ ID N°: 1-3; e (c) uma sequência de ácido nucleico que se hibridiza sob condições rigorosas a uma das SEQ ID N°: 1-3. BIBLIOGRAFIA Iyer M., Wu L., e outros V (2001) Two step transcriptional ampli-fication as a method for imaging reporter gene expression using weak pro-moters PNAS 98(25): 14595-14600. Larkin, J.C., Oppenheimer, D.G., Pollock, S., e Marks, M.D. (1993) Arabidopsis GLABROUS1 gene requires downstream sequences for function. Plant Cell. 5(12): 1739-1748. Sieburth, L.E., e Meyerowitz, E.M. (1997) Molecular dissection of the AGAMOUS control region shows that cis elements for spatial regulation are located intragenically. Plant Cell. 9(3): 355-365. Batzer, et al (1991) Enhanced evolutionary PCR using oligonu-cleotides with inosine at the 3'-terminus. Nucleic Acid Res. 19:5081. Ohtsuka, et al (1985) An alternative approach to deoxyoligonu-cleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J. Biol. Chem. 260:2605-2608. Rossolini, et al (1994) Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous se-quence information. Mol. Cell Probes 8:91-98. Paszkowski et al (1984).Direct Gene Transfer to Plants. EMBO J 3:2717-2722 Potrykus et al (1985) Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer. Mol. Gen. Genet. 199:169-177 Reich et al (1986) Efficient transformation of alfalfa protoplasts by the intranuclear microinjection of Ti-plasmids. Bio/Technology 4:1001- 1004 Klein et al (1987) High velocity microprojectiles for delivering nu-cleic acids into living cells. Nature 327:70-73. Uknes et al (1993) Regulation of pathogenesis-related protein-1 a gene expression in tobacco. Plant Cell 5:159-169 Hofgen, R, e Willmitzer, L (1988) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucl. Acid Res. 16:9877 Schocher et al (1986) Co-transformation of foreign genes into plants. Bio/Technology 4:1093-1096 Gordon-Kamm et al (1990) Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants. Plant Cell 2:603-618 Fromm et al (1990) Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Bio/Technology 8:833-839. Koziel et al (1993) Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Bio/Technology 11:194-200 Vasil et al (1992) Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technology 10:667-674 Vasil et al (1993) Rapid production of transgenic plants by direct bombardment of cultured immature embryos. Bio/Technology 11:1553-1558 Weeks et al (1993) Rapid Production of Multiple Independent Lines of Fertile Transgenic Wheat (Triticum aestivum). Plant Physiol. 1102:1077-1084 Murashiga et al (1962) A revised medium for rapid growth and bio-essays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497 Negrotto et al (2000) The use of phosphomannose isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Reports 19:798-803 Eastmond, P.J., van Dijken, A.J.H., Spielman, M., Kerr, A., Tissi- er, A.F., Dickinson, H.G., Jones, J.D.G., Smeekens, S.C., Graham, I.A. (2002). Trehalose-6-phosphate synthase 1, which catalyses the first step in trehalose synthesis, is essential for Arabidopsis embryo maturation. Plant J. 29, 225-235. Nuccio, M.L., Russell, B.L., Nolte, K.D., Rathinasabapathi, B., (1998). The endogenous choline supply limits glycine betaine synthesis in transgenic tobacco expressing choline monooxygenase. Plant J. 16, 487- 496. Ranocha, P., McNeil, S.D., Ziemak, M.J., Li, C., Tarczynski, M.C., e Hanson, A.D. (2001). The S-methylmethionine cycle in angiosperms: ubiquity, antiquity and activity. Plant J. 25, 575-584. Ritchie, S.W., Hanway, J.J., Benson, G.O. (1997). How a Corn Plant Develops. Special Report No. 48. Iowa State University of Science and Technology Cooperative Extension Service. Ames, Iowa. Rontein, D., Dieuaide-Noubhani, M., Dufourc, E.J., Raymond, P., Rolin, D. (2002b). The metabolic architecture of plant cells. Stability of central metabolism and flexibility of anabolic pathways during the growth cycle of tomato cells. J. Biol. Chem. 277, 42948-43960. Vogel, G., Aeschbacher, R.A., Müller, J., Boiler, T. e Wiemken, A. (1998). Trehalose-6-phosphate phosphatases from Arabidopsis thaliana: identification by functional complementation of the yeast tps2 mutant. Plant J. 13, 673-683. Wingler, A. (2002). The function of trehalose biosynthesis in plants. Phytochem. 60, 437-440. Armenta, R. T. Tarnowski, I. Gibbons, e E.F. Ullman (1985) Improved Sensitivity in Homogeneous Enzyme Immunoassays using a Fluoro- genic Macromolecular Substrate: an Assay for Serum Ferritin, Analytical Bio-chemistry, 146:211-219. Ebert P., Ha S., An, G., Identification of an essential upstream element in the nopaline synthase promoter by stable and transient assays. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5745-5749 (1987) Lawton M., Tierney M, Nakamura I., Anderson E., Komeda Y., Dube P., Hoffman N., Fraley R., Beachy R., Expression of a soybean β- conclycinin gene under the control of the Cauliflower Mosaic Virus 35S and 19S promoters in transformed petunia tissues. Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1987) Odell J., Nagy F., Chua N., Identification of DNA sequences re-quired for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313:810-812 (1985) Sanger M., Daubert S., Goodman R., Characteristics of a strong promoter from figwort mosaic virus: comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic virus and the regulated mannopine synthase promoter. Plant Mol. Biol. 14, 433-43 (1990) Pellegrineschi A., Kis M., Dix I., Kavanagh T., Dix P., Expression of horseradish peroxidase in transgenic tobacco. Biochem. Soc. Trans. 23(2):247-250 (1995) Walker J., Howard E., Dennis, E., Peacock W., DNA sequences required for anaerobic expression of the maize alcohol dehydrogenase 1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:6624-6628 (1987) Yang N., Russell D., Maize sucrose synthase-1 promoter directs phloem cell-specific expression of Gus gene in transgenic tobacco plants. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:4144-8 (1990) Chandler V., Radicella J., Robbins T., Chen J., Turks D., Two regulatory genes of the maize anthocyanin pathway are homologous: isolation of B utilizing R genomic sequences. Plant Cell 1:1175-1183 (1989) Batzer M., Carlton J., Deininger P., Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the 3'-terminus. Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) Ohtsuka E., Matsuki S., Ikehara M., Takahashi Y., Matsubara K., An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) Rossolini G., Cresti S., Ingianni A., Cattani P., Riccio M., Satta G., Use of deoxyinosine-containing primers vs. degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information. Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) Ingelbrecht I., Herman L., Dekeyser R., Van Montagu M., Depicker A., Different 3' end regions strongly influence the level of gene expression in plant cells. Plant Cell 1:671 -680 (1989) Sambrook, J. e outros, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova York, 1989 Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seid- man, J. G., Smith, J. A. e Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons: Nova York, 1990 Geiser M., Schweitzer S., Grimm C., The hypervariable region in the genes coding for entomopathogenic crystal proteins of Bacillus thurin- giensis: nucleotide sequence of the kurhdl gene of subsp. kurstaki HD1. (1986) Gene 48:109-118 Van Damme E., Smeets K., Van Leuven F., Peumans W., Molecular cloning of mannose-binding lectins from Clivia miniata. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825-830 Castle L., Siehl D., Gorton R., Patten P., Chen Y., Bertain S., Cho H., Duck N., Wong J., Liu D., Lassner M. Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene. (2004) Science 304, 1151-1154 Cheng M., Jarret R., Zhijian L., Xing A., Demski J., Production of fertile transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996) Cheng M., Fry J., Pang S., Zhou H., Hironaka C., Duncan D., Conner T., Wan Y., Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobac-terium tumefaciens. Plant Cell Rep. 15:971-980 (1997) McKently A., Moore G., Doostdar H., Neidz R., Agrobacterium- mediated transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) embryo axes and the development of transgenic plants. Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995) Newell, C. A., Plant Transformation Technology. Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000) Weissbach e Weissbach, Eds.; In Methods for Plant Molecular Biology; Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1988 Maliga e outros, In Methods in Plant Molecular Biology; Cold Spring Harbor Press, 1995 Birren e outros, In Genome Analysis: Detecting Genes, 1; Cold Spring Harbor: Nova York, 1998 Birreπ e outros, In Genome Analysis: Analyzing DNA, 2; Cold Spring Harbor: Nova York, 1998 Clark, Ed., In Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual; Springer: Nova York, 1997 Jones J., Dunsmuir P., Bedbrook J., High level expression of in-troduced chimaeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J. 4:2411-2418(1985) De Almeida E., Gossele V., Muller C., Dockx J., Reynaerts A., Botterman J., Krebbers E., Timko M., Transgenic expression of two marker genes under the control of an Arabidopsis rbcS promoter: Sequences encoding the Rubisco transit peptide increase expression levels. Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989) Komarnytsky, S., Boris, N., Functional analysis of promoter ele-ments in plants. Genetic Engineering 25: 113-141 (2003) 1/1

Claims (5)

1. Sequência de ácido nucleico, caracterizada por compreender a SEQ ID N°: 3.

2. Método de expressão de um gene heterólogo caracterizado pelo fato de que compreende: a) construção de um cassete de expressão compreendendo a SEQ ID N°: 3, em que o cassete de expressão é funcional em uma planta, célula da planta, ou tecido da planta; e b) criação de uma planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte, compreendendo o cassete de expressão, em que o gene heterólogo é expresso.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte é uma monocotiledônea.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a planta, célula da planta, ou tecido da planta ou respectiva parte é milho.

5. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID N°: 3.