KR20100043820A - 단자엽 식물 형질 전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물 및 상기 식물의 종자에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프로모터들은 식물체 특히 벼 및 단자엽 식물에서 종자내 배유에 특이적으로 발현하는 유전자의 연구 및 형질전환 식물체 생산에 종자 배유 특이 발현 프로모터로 매우 유용하게 쓰일 것이다.

벼, 형질전환, 종자 배유 특이 발현 프로모터, sGFP, 단자엽 식물

Description

단자엽 식물 형질 전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터{Endosperm-specific expression promoters for transforming monocot plants}

본 발명은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물 및 상기 식물의 종자에 관한 것이다.

프로모터는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기 서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific protomer) 또는 유도성 프로모터(inducible 프로모터)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

농경을 발전시킬 수 있는 새로운 특성을 가지는 경작 식물의 생산에 있어서, 식물체로 도입되는 외부유전자(즉, 트랜스진(transgene))의 발현은 전사적, 후-전사적(post-transcriptional), 번역적 및 후-번역적(post-translational) 요소들에 의해 큰 영향을 받는다. 전기 요소들 중 특히, 전사적 요소에 속하는 프로모터는 트랜스진의 전사에 직접적인 영향을 끼쳐 결과적으로 발현의 수준을 변화시킬 뿐만 아니라, 트랜스진이 발현되는 단계, 조직 또는 세포 특이성을 변화시킬 수 있는 가장 중요한 요소이다. 현재까지, 트랜스진의 발현을 위하여 다양한 식물체로부터 수많은 프로모터들이 분리되었지만, 그들 중 소수만이 식물의 형질전환에 실제로 이용되고 있다.

지금까지 개발된 주요 단자엽용 프로모터는 벼의 rbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 벼의 Act1(actin1) 프로모터 및 옥수수의 Ubi1 (ubiqitine1) 프로모터 등 항시 발현 프로모터들로 유전자 발현 연구용으로는 폭넓게 사용되었지만, 거의 전 기관에 트랜스진 발현을 유도하여 불필요한 과발현으로 인한 성장 저해 및 수확량 감소 뿐만 아니라 목적단백질 생산 저하 등의 문제점을 보이는 사례가 많았다.

이러한 문제점을 극복하기 위한 노력으로 식물체의 주요 탄수화물과 단백질 저장 기관이며, 사람을 포함한 동물에게 주요 영양 공급원으로 사용되는 종자의 배유에 목적단백질을 과량발현 시키는 연구가 활발히 진행 중이며, 이에 타기관에서의 불필요한 과잉생산을 없애고 목적단백질의 생산량 증가를 위한 강력한 배유 특이 발현 프로모터 개발의 필요성이 끊임없이 대두되었다.

현재까지 종자 특이 프로모터로는 글루텔린, 글로블린 프로모터 등이 있다. 글루텔린 프로모터의 경우에는 종자내 강한 활성을 가지나, 배유 바깥쪽 층인 엘룰론층에서 강한 활성을 가지며, 글로블린 프로모터의 경우에는 배유-특이적 활성을 가지지만 활성이 약하기 때문에 목적유전자의 배유내 과량 발현용으로 적당하지 않다는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 단자엽 식물 종자내의 배유조직에서 강한 활성을 보이는 배유 특이 발현 프로모터 개발에 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 단자엽 식물에서의 종자 배유 특이 발현에 적합하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 식물의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프로모터들은 식물체 특히 벼 및 단자엽 식물에서 종자내 배유-특이 단백질 발현 분석에 유용하게 사용될 뿐 아니라, 목적단백질에 의한 생산의 저해를 최소화하면서 목적단백질의 과량 생산용 배유 특이 프로 모터로 매우 유용하게 쓰일 것이며, 종자 배유로의 목적단백질 축적을 통해 장기 보관이 용이하며, 목적유전자 추출 비용 절감 효과들도 기대할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 배유 특이 발현 프로모터를 제공하며, 더욱 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는, 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 내 배유 특이 발현용 프로모터를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 식물체 유전자의 배유 특이 발현(endosperm-specific expression)에 적합하며, 목적 유전자의 배유 과량 발현을 통한 목적단백질의 과량 생산에 적합하다. 상기 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열을 가진다. 구체적으로, 서열번호 1의 ESP1 및 서열번호 2의 ESP2은 각각 가상적인 배유 특이 단백질 1 및 2 프로모터(putative endosperm-specific protein promoter)이다.

기존의 종자 특이 프로모터인 글루텔린 프로모터는 종자 특이 프로모터이지만, 종피와 배유 사이 층인 엘른론 층에만 목적단백질을 축적시켜, 도정 후 목적 단백질의 회수율이 낮고, 배유에 발현되는 글로블린 프로모터는 활성도가 낮아 목적단백질 생산량이 적은 문제점을 가지고 있었다. 본 발명가가 개발한 ESP1 및 ESP2 프로모터는 식물체 종자 내에서 균등하고 강하게 유전자를 발현하므로, 배유층에 높고 균등한 목적단백질의 축적이 관찰되었다.

또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이 체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 2의 염기 서열과 유사한 기능적 및 면역학적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열의 실질적인 동일성은 폴리뉴클레오티드가 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또 다른 의미는 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로에게 특이적으로 혼성화하는 경우 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 것이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서는 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 정합된 프로브에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 프로브의 길이 및 염기 조성 양자의 함수인, 혼성체의 Tm은 문헌(Sambrook, T. et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (second edition), Volume 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring) 내 의 정보를 이용하여 계산될 수 있다. 전형적으로, 서던 블롯 절차에 대한 엄격한 조건은 0.2XSSC로 65℃에서의 세척을 포함한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에, 세척 조건은 전형적으로 6XSSC에서 약 42℃이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프로모터에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 도 2에 기재된 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 벡터는 본 발명의 프로모터에 변형된 녹색형광단백질 유전자(sGFP), 프로테아제 저해제 II 터미네이터 유전자(T_PINII), OsCc1 프로모터 (Pcytc), 제초제 저항성 유전자 Bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자) 및 노팔린 신타아제 터미네이터(T_NOS)가 작동가능하게 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 본 발명의 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있 다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체에서 배유 특이 발현(endosperm-specific expression)적으로 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 생산 방법에 의해 생산된 목적 단백질을 제공 한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 바람직하게는 상기 식물은 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물로부터 얻은 종자를 제공한다. 바람직 하게는 상기 종자는 단자엽 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

1. 프로모터 서열 예측 및 추출

1997년 발족하여 2004년 12월 벼의 전체 게놈(genome)의 시퀀싱을 마친 IRGSP(international rice genome seqeuncing project) 서열과 이를 근거로 유전자의 명명(annotation)을 실시한 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 데이타를 이용하여, 프로모터 지역을 예측, 벼 형질전환용 벡터 제작에 사용하였다. 명명이 끝난 BAC을 선정하여, 코딩 서열 (CDS)의 ATG 위치에서부터 약 2 킬로베이스페어(kbp) 상류(upstream)까지의 서열을 프로모터 지역으로 가정하고, 이 서열만 따로 추출하여, 이 2 킬로베이스페어(kbp)내에서 전체 크기가 1.5-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머 제작용 주형(template)으로 사용하였다.

2. RT-PCR (역전사효소-PCR) 을 통한 종자 특이 발현 유전자 분석

종자 특이 발현 유전자 분석을 위해 종자와 캘러스, 암배양한 어린 묘, 20일, 1달, 8주된 묘의 잎과 뿌리 그리고 꽃 조직에서 시료를 채취하고, 종자와 캘러 스를 제외한 모든 시료는 건조 스트레스 처리를 하였다. 시료 준비를 위해 에탄올과 20% chlorax 용액으로 종자를 소독하고 암 상태로 5일간 발육 후, 온실에 전개하였다. 전체 RNA를 추출하기 위하여, RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen, Cat. No. 74904)을 사용하였다. 추출한 전체 RNA 400ng으로 제1 가닥 cDNA 합성을 하였고 (Invitrogen, Cat. No. 18080-051), cDNA 합성 반응물 2ul를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 아래와 같으며, 양성 대조군으로 종자 특이 프라이머로 보고된 글루텔린(Glutelin)과 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위해 유비큐틴 프라이머(Ubi)를 사용하였고, 그 서열은 아래와 같다.

정방향 프라이머 ESP1: 5'-TGATCTGCCACTCAGCATAC-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머 ESP1: 5'-AAGGCTCGACGTGAAGGATT-3'(서열번호 4)

정방향 프라이머 ESP2: 5'-GGCGTGCTCGAGTTCAGGTT-3'(서열번호 5)

역방향 프라이머 ESP2: 5'-CTTCAAGCTACGAGCTTCCT-3'(서열번호 6)

정방향 프라이머 GLU: 5'-TTCGTCGTGGACAGCTACTT-3'(서열번호 7)

역방향 프라이머 GLU: 5'-TGAGCCTCTGAGCCTCTCT-3'(서열번호 8)

정방향 프라이머 Ubi: 5'-GAATCGCCTTCTCAAGATGC-3'(서열번호 9)

역방향 프라이머 Ubi: 5'-AATGGTGTCCGAGGACTCAA-3'(서열번호 10)

PCR 조건은 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA 2ul, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 4pmol, 전체 20ul 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 4℃ 10분, 25 사이클로 진행하 였다.

3. 프로모터의 증폭(amplification) 및 분리(isolation)

예측된 프로모터 서열을 주형으로, 프라이머 designer4 program(ver.4.20, Scientific & Educational software)을 이용, 전체 크기가 1.5-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머를 디자인하였다. 디자인 조건은 PCR 조건이 프라이머의 GC% 범위가 40-60%, Tm 범위 55-65℃, 염 및 유리 Mg의 농도를 각각 0, 0.15 mM로 하였다. 프라이머(PCR 프라이머)는 그 길이가 주형 특이적 영역이 20 베이스페어(bp), 5'어댑터 서열(adaptor sequence)가 12bp가 되도록 하였다. 이 어댑터 서열은 기존의 제한효소(restriction enzyme)와 DNA ligase(DNA 접합효소)를 이용한 클로닝 방법이 아닌 자리 특이적 재조합을 위해 삽입한 서열이다. PCR 반응의 주형으로 사용할 DNA는 자포니카형(japponica type) Nipponbare 품종(cultivar)의 벼를 파종하여, 온실에서 3주간 키운 후, 잎 부분만 절제하여, 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 우선 절제한 잎을 액체 질소로 급냉동시키고, 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄한 후, DNAzol(molecular research center, Cat. No. DN128) 용액을 이용하여 분리하였다. PCR 반응은 두 단계로 나누어서 진행하였다. 1차 반응은 벼의 게놈에서 특정 프로모터를 분리하기 위한 반응으로, 12bp 어댑터 서열로 연결된 전체 크기 32bp 주형 특이적 서열 프라이머를 사용한다. 프라이머 서열은 하기와 같이 구성되며,

정방향 주형 특이적 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCT-주형 특이적 서열-3'

역방향 주형 특이적 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGT-주형 특이적 서열-3'

구체적인 유전자 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다.

a. ESP1 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTCGTTCCCTGCGATTAGATAC-3'(서열번호 11)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTCTTAGTTTCCCACTGCTCTT-3'(서열번호 12)

b. ESP2 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTGGTAAGACATGAGGTCCCTTTTA-3'(서열번호 13)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTGCTACTTGTGTCCGTTCTTCTGT-3'(서열번호 14)

1차 PCR은 게놈 DNA 50ng, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 10pmol, 전체 50ul 반응으로, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분, 30 사이클로 진행하였다.

2차 반응은 프로모터를 형질전환용 벡터에 삽입하기 위해 필요한 특정 어댑터 서열 (att site)를 삽입, 증폭하기 위해 실시하였다. 프로모터에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 약 29 bp로, PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부 (12 bp)만을 주형 특이적 서열에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 수행한 후, 이 PCR 반응액의 1/50(1ul)을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 프라이머(어댑터 서열 프라이머, 서열번호 15, 16)로 두 번째 PCR 반응을 한다. 따라서, 이 반응물은 벼의 프로모터와 재조합을 위한 att 서열를 모두 갖게 된다. 어댑터 서열 프라이머의 서열은 아래와 같다.

attB1 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 15)

attB2 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 16)

2차 PCR은 1차 PCR 반응물 1ul, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 어댑터 프라이머 각각 2pmol, 전체 50ul 반응으로, 95℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 2분, 5 사이클 후, 다시 95℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 2분, 20 사이클로 진행하였다.

위의 PCR 방법은 Gateway 시스템(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하기 위해 Invitrogen에서 제시한 방법으로 수행하였다.

4. 증폭된 프로모터의 클로닝(cloning)

Gateway 시스템(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하여 벼 형질전환용 벡터에 삽입하였다. 먼저, 증폭시킨 프로모터는 1% 아가로스 겔 상에서 전기 영동 후, 겔 상에서 밴드 분리 및 Mega-spin 아가로스 겔 추출 키트(Intron, Cat. No.17183)으로 정제(purification)하였다. 정제한 프로모터 5ul, BP clonase 효소 혼합물 4ul, 5X BP 반응 버퍼 4ul, pDONR 벡터 300ng/2ul, TE 버퍼(10mM Tris/pH8.0, 1mM EDTA), 전체 20ul BP 반응을 25℃, 16시간 동안 수행하였다. 이후, 이 반응물에 LR clonase 효소 혼합물 6ul, 0.75M NaCl 1ul, 형질전환용 벡터 450ng/3ul 첨가하여 전체 30ul, 25℃, 8시간 동안 LR 반응시켰고, proteinase K 3ul를 첨가, 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 중 2ul를 취해 DH5α 적격 세포(competent cell)에 형질전환하였다. 형질전환시킨 DH5α 세포는 50ug/ml 스펙티노마이신 항생제를 포함한 LB 한천 배지에 깔고, 37℃ 항온기에서 12시간 키운 후, 선발된 세포에서 DNA를 추출하여 프로모터가 삽입되어 있는지를 PCR 반응을 통하여 확인한 후, 시퀀싱 및 BLASTN을 수행, 분리한 프로모터의 완전한 삽입을 확인하였 다.

벼 형질전환용 벡터(pMJ401)는 다음과 같다. 오른쪽 경계 서열(right-border sequence)과 왼쪽 경계서열(left-border sequence)사이에 재조합 후 프로모터와 교체가 될 카세트가 3' 방향에 마커 유전자(visiable marker gene)인 sGFP와 PINII(프로테아제 저해제 II) 터미네이터로 연결되어 있다. 이 카세트는 BP 및 LR 반응을 수행할 수 있도록 att 서열를 가지고 있다. 선발 유전자(선별 마커 유전자)는 제초제 저항성 유전자 Bar 유전자(bar, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자)이 본 발명가가 개발한 항시 발현 프로모터 OsCc1에 의해서 조절되도록 제조되었고, 이 유전자는 NOS(nopalin synthase) 터미네이터로 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

5. 아그로박테리움(Agrobacterium-mediated)을 이용한 벼의 형질전환(transformation)

낙동 벼 종자(Oryza sativa L. cv Nakdong)를 겉 호영만 제거한 후, 70%(v/v) 에탄올을 첨가하고, 1분 동안 가볍게 흔들어 씻어냈다. 씻어낸 종자들은 다시 20% chlorax 에 넣어 1시간 동안 흔들어 소독하고, 멸균수로 여러 번 세척하였다. 세척한 벼 종자는 형질전환을 위해, 장(Jang)에 의해 기술된 바와 같이 (Jang, I-C. et al., Mol breeding, 5:453-461, 1999) 캘러스 유기 배지(2N6)에서 한 달간 배양하여 배아 캘러스를 유기한 후, Agrobacterium triple mating 방법으 로 얻은 아그로박테리움과 공동배양(co-cultivation)하여 상기 프로모터가 삽입된 형질전환 벡터를 벼 게놈에 삽입시킨 후, 형질전환된 캘러스 선택배지(2N6-CP)에서 한 달간 배양하였다. 이후, 선택적으로 자란 세포들을 골라 재분화 배지(MS-CP)에서 한 달에서 두 달간 배양 후 재분화된 식물체를 온실에서 순화시켰다. 순화된 T0 벼는 비선택성 제초제인 바스타(basta) 처리를 하여 제초제 저항성을 보이는 식물체만 골라 후대검정을 하였다.

6. GFP 발현 관찰을 통한 벼 기관별 프로모터 활성 분석

프로모터의 활성 분석을 위하여 사용한 마커 유전자 sGFP의 발현 확인은 종자, 묘의 잎과 뿌리 기관에서 관찰하였다. 유전자의 발현 관찰은 유전자 삽입 및 분리가 확실히 관찰될 수 있는 T2 단계에서부터 실시하였다. 종자에서의 GFP 발현은 호영을 벗기고, LAS3000 시스템(Fuji photo film. co.)과 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 종자 전체와 횡단면을 대상으로 배와 배유의 GFP 발현을 통해 해당 프로모터의 활성을 관찰하였고. 벼의 뿌리와 잎 조직에서의 해당 프로모터 활성 분석은, GFP 발현이 확인된 해당 프로모터 종자를 호영을 제거한 후, 에탄올과 20% chlorax 용액에 소독, PPT 성분이 함유되어 있는 MS-P 배지(PPT 4mg/l)에 이틀간 발아하여 선별 마커 bar 유전자의 활성을 확인하였다. 암 상태에서 발아된 어린 묘(etiolated seedling)은 온실에서 2주간 배양한 후, 어린 잎과 뿌리에서의 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 해당 프로모터 활성을 분석하였다.

7. real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 을 통한 프로모터 활성 분석

프로모터의 활성 분석을 위한 전체 RNA 추출은 비형질전환체와 해당 형질전환체의 종자와 캘러스, 암배양한 어린 묘, 20일, 1달, 8주된 묘의 잎과 뿌리 그리고 꽃 조직에서 실시하였고, 종자와 캘러스를 제외한 모든 시료는 건조 스트레스 처리를 하였다. ESP1과 ESP2 프로모터의 조직 특이 활성을 보기 위하여 종자와 캘러스, 5일간 암 배양한 어린 묘, 20일, 1달, 8주된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직을, 그리고 꽃 조직으로부터 시료를 채취하였고, 종자와 캘러스를 제외한 모든 시료는 건조 스트레스 처리하였다.

GFP 발현을 관찰한 종자들을 에탄올과 20% chlorax 용액에 소독, 선별 마커 bar 유전자의 활성 확인을 위하여, PPT 성분이 함유되어 있는 MS-P 배지(PPT 4mg/l)에서 항온기(incubator chamber), 암 상태로 5일간 발육 후, 온실에 전개하였다. 전체 RNA를 추출하기 위하여, RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen, Cat. No. 74904)을 사용하였다. 비형질전환체와 형질전환체에서 추출한 전체 RNA 400ng으로 제1 가닥 cDNA 합성을 하였고(Invitrogen, Cat. No. 18080-051), 이 cDNA 합성 반응물 2ul를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 두 종류의 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 프로모터간 삽입된 GFP의 발현양을 상대적으로 비교하기 위한 프라이머(프라이머 GFP)이고, 두 번째 프라이머는 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위한 프라이머 (프라이머 Ubi, 서열번호 8, 10)로, 프라이머 서열은 아래와 같다.

정방향 프라이머 GFP: 5'-GCAGAAGAACGGCATCAAGG-3'(서열번호 17)

역방향 프라이머 GFP: 5'-GGTGCTCAGGTAGTGGTTGT-3'(서열번호 18)

PCR 조건은 Mx3000P(Stratagene), cDNA 2ul, 2X 사이버그린 qRT-PCR premix (Invitrogen. Cat. No. 11765-100), 주형 특이적 프라이머 각각 4pmol, 전체 20ul 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 1분, 4℃ 10분, 40 사이클로 진행하였고, 반응 종료 후, 제조사에서 제공한 프로그램 Mx3000P(Stratagene)을 이용하여 프로모터 활성을 정량 분석하였다.

실시예 1: 벼 배유 특이 발현 유전자의 벼 내 발현 분석

ESP1과 ESP2 프로모터의 조직 특이 활성을 보기 위하여 종자와 캘러스, 5일간 암 배양한 어린 묘, 20일, 1달, 8주된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직, 및 꽃 조직으로부터 시료를 채취하였고, 종자와 캘러스를 제외한 모든 시료는 건조 스트레스 처리한 후, 각각의 시료에서 전체 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 1.2% 아가로스 겔에 전기영동(gel electrophosresis) 하였다. 도 1은 RT-PCR을 이용하여 벼 내에서의 ESP1, ESP2의 조직별 발현 양상을 비교한 결과이다. 도 1에서와 같이 본 발명에 사용한 ESP1과 ESP2 의 벼 내 조직별 발현은 종자에서 강하게 발현되고 있었으며, 그 외에 조직에서는 발현이 관찰되지 않았다. 또한, 건조 스트레스와 같은 환경 스트레스에서도 발현 유도가 관찰되지 않아 종자의 배유 특이 유전자임을 확인하였다. 한편, 기존에 강력한 종자 특이 유전자로 알려진 글루텔린 유전자와 발현을 비교한 결과, ESP1, ESP2이 글루텔린에 비해 상대적으로 높은 발현이 관찰되었다. 결과적으로 ESP1, ESP2은 캘러스와 잎, 뿌리, 꽃조직에서는 발현을 하지 않은 종자 특이 발현 유전자이며, 기존에 보고된 종자 특이 유전자인 글루텔린보다 발현량이 높은 유전자임을 확인하였다.

실시예 2: 벼 형질전환용 벡터 제작

벼 형질전환용 벡터를 제작하였으며, 도 2에 도시하였다. 도 2의 A는 PCR로 분리한 프로모터를 클로닝하기 위한 모벡터인 pMJ401이다. attR1, attR2 자리는 BP 반응 후 프로모터가 가지고 있는 attL1, attL2 서열과 재조합(자리 특이적 재조합)이 일어나는 부위로, LR 반응 후, 프로모터는 카세트와 교체되고 attR1, attR2 서열도 attB1, attB2 서열로 교체된다. 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. MAR: matrix attachment region(1.3kb), X98408; 카세트 B: 전환 카세트 B(1.7kb), invitrogen, Cat. No. 11828-019; sGFP : 변형된 녹색 형광 단백질 유전자(0.74kb), U84737; T _PINII : 프로테아제 저해제 II 터미네이터(1.0kb), X04118; P _{OsCc1 ;} OsCc1 프로모터(0.92kb), Af399666; Bar : 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자(0.59kb), X17220; T _NOS : 노팔린 신타아제 터미네이터(0.28kb).

도 2의 B 및 C는 삽입되는 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 나타낸다. B. ESP1 배유 특이 단백질 1 프로모터 벡터; C. ESP2 배유 특이 단백질 2 프로모터 벡터.

실시예 3: sGFP 형광 발현 분석을 통한 프로모터 활성 분석

발명한 프로모터의 활성 분석을 위하여 각 프로모터 벡터로 형질전환시킨 벼 종자에서 호영을 벗긴 종자, 종자의 횡단면, 20일 키운 벼의 잎과 뿌리 조직을 대상으로 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 GFP 발현을 관찰하였다.

도 3은 형질전환 벼 각 기관에서의 sGFP 형광 발현을 보여주는 것이다. 도 3에서 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. NT: 음성 대조군 낙동벼(비형질전환 종자), ESP1: 배유 특이 발현 유전자 1 프로모터 (endosperm-specific protein 1 promoter), ESP2: 배유 특이 발현 유전자 2 프로모터 (endosperm-specific protein 2 promoter).

형질전환을 시키지 않은 대조군(음성 대조군)의 종자와 엽조직, 뿌리 조직에서는 약간의 백그라운드 외에 어떠한 GFP 발현도 관찰되지 않았으며, 형질전환벼에서도 종자를 제외한 잎과 뿌리 조직에서 음성대조군과 비슷한 수준의 백그라운드만이 관찰되었지만, ESP1, ESP2 형질전환 종자에서는 강한 GFP 발현이 관찰되었고, 종자를 횡단하여 관찰한 결과, 배유내에 균일하고 높은 GFP 축적이 관찰되어, 본 발명의 ESP1, ESP2 프로모터가 형질전환체 내에서 잎, 뿌리, 꽃, 캘루스 조직에서는 발현 활성을 가지지 않으면서, 종자내 배유-특이 발현을 하는 배유-특이 발현 프로모터로 작용함을 확인하였다.

실시예 4: Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 을 통한 프로모 터 활성 분석

ESP1과 ESP2 프로모터의 형질전환체 내에서 조직 특이 활성 및 양적 발현 분석을 수행하기 위해 비형질전환체와 ESP1, ESP2 프로모터 형질전환체를 대상으로 종자와 캘러스, 5일간 암 배양한 어린 묘, 20일, 1달, 8주된 묘에서 각각 잎과 뿌리 그리고 꽃 조직으로부터 시료를 채취하였고, 종자와 캘러스를 제외한 모든 시료는 건조 스트레스 처리한 후, 각각의 시료에서 전체 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 목적유전자로 사용한 GFP의 유전자 특이 프라이머를 사용하여 실시간 정량역전사효소-PCR 분석을 실시하였다. 도 4는 형질전환벼 내에서의 ESP1, ESP2의 조직별 발현양상을 정량 분석한 결과이다. 도 4에서와 같이 본 발명에 사용한 ESP1과 ESP2 프로모터가 형질전환체 내에서도 종자 특이 활성을 가지고 있었으며, 그 외에 조직에서는 어떠한 활성도 관찰되지 않았다. 또한, 건조 스트레스와 같은 환경 스트레스에서도 활성을 보이지 않았다. 한편, ESP1, ESP2 프로모터의 형질전환체 내에서의 양적 활성 분석 결과, 강한 활성이 보였으며, 특히 뿌리, 잎, 꽃조직에서는 발현을 하지 않으면서 오직 종자내에서만 ESP1이 ESP2보다 5배 이상 높은 프로모터 활성을 보임을 확인하였다. 이와 같이 본 발명에서는, 작물종자의 배유에서 특이적으로 유전자 발현을 유도하고, 그 활성이 기존의 배유-특이 프로모터보다 훨씬 강한 종자-배유 특이 프로모터 2종, ESP1 과 ESP2프로모터를 발명하였다.

도 1은 벼 내 종자 배유 특이 유전자의 조직별 발현 분석 결과이다.

도 2는 종자 배유 특이 프로모터 활성 분석용 벼 형질전환 운반체 모식도이다.

도 3은 형질전환체내 GFP 발현 관찰을 통한 종자 배유 특이 프로모터의 조직별 활성 분석이다.

도 4은 Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 을 통한 형질전환체내 종자 배유 특이 프로모터의 조직별 활성 정량 분석이다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation <120> Endosperm-specific expression promoters for transforming monocot plants <130> PN08216 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1868 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1868) <223> Endosperm-specific protein 1 promoter <400> 1 cttagtttcc cactgctctt ggtgatggat ggacgagttg gaggagaggg gcttatatac 60 acggagtaga cgagaatata tgcaaaaagg gataacaaac ttacctaatc tctttatcat 120 gctgatgtgt ttatagccta aaggaatatc tagtttgtct gttgcaaaca agatgatgca 180 aaaagggcat aggtaaaaac ttgtaagtca ttatatgctt gattgatcat taaacacata 240 gataccattg ttttaaagtt ggaaaagtgt tttttttgtt agagtgaagc aagagttatg 300 ccatgttttc ttgctatcgc acataggaat gctgaaaaag attttgtatt agtgccaccc 360 aagaaaataa agacatgctt ttaaaggtga gagttaggga tttgccttgt gattacgtgg 420 tatgactaga ggacaatagg ttattggtag tgtagctaca aaaagagaaa acaaactaca 480 ctaaattcac aatcaggcta gcataagatt gcactctaga aacgtacatg tacattgctt 540 gtgagatcat gacaaaaaca taacaacaaa attcactttt 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Sequence <220> <223> attB1 adaptor primer <400> 15 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 adaptor primer <400> 16 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP forward primer <400> 17 gcagaagaac ggcatcaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP reverse primer <400> 18 ggtgctcagg tagtggttgt 20

Claims (11)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는, 단자엽 식물의 형질전환을 위한 종자 내 배유 특이 발현용 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 식물체 종자 내에서 균등하고 강하게 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
3. 제1항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수인 것을 특징으로 하는 프로모터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
6. 제5항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체에서 배유 특이 발현 (endosperm-specific expression)적으로 목적 단백질을 생산하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
9. 제8항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
10. 제9항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
11. 제9항에 따른 식물의 종자.

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