KR101015146B1

KR101015146B1 - 단자엽 식물 형질 전환을 위한 항시 발현용 프로모터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101015146B1
Application number: KR1020080126430A
Authority: KR
Inventors: 김주곤; 이나리; 박수현; 최양도
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-02-16
Also published as: KR20100067852A

Abstract

본 발명은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 항시 발현용 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물 및 상기 식물의 종자에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프로모터들은 식물체 특히 벼 및 단자엽 식물에서 전반적으로 발현하는 유전자의 연구 및 형질전환 식물체 생산에 항시 발현 프로모터로 매우 유용하게 쓰일 것이다.

벼, 형질전환, 항시 발현용 프로모터, GFP, 단자엽 식물

Description

단자엽 식물 형질 전환을 위한 항시 발현용 프로모터 및 이의 용도{Constitutive expression promoters for transforming monocot plants and uses thereof}

프로모터는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기 서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역 할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 유도성 프로모터에는 생물체의 발달 과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

농경을 발전시킬 수 있는 새로운 특성을 가지는 경작 식물의 생산에 있어서, 식물체로 도입되는 외부유전자 (즉, 트랜스진(transgene))의 발현은 전사적, 후-전사적 (post-transcriptional), 번역적 및 후-번역적(post-translational) 요소들에 의해 큰 영향을 받는다. 전기 요소들 중 특히, 전사적 요소에 속하는 프로모터는 트랜스진의 전사에 직접적인 영향을 끼쳐 결과적으로 발현의 수준을 변화시킬 뿐만 아니라, 트랜스진이 발현되는 단계, 조직 또는 세포 특이성을 변화시킬 수 있는 가장 중요한 요소이다. 현재까지, 트랜스진의 발현을 위하여 다양한 식물체로부터 수많은 프로모터들이 분리되었지만, 그들 중 소수만이 식물의 형질전환에 실제로 이용되고 있다.

CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터와 그의 유도체(derivative)는 현재 가장 널리 이용되고 있는 프로모터로서, 식물체의 전 조직에서 광범위한 유전자 발현을 유도하며, 특히 관 조직(vascular tissue) 및 뿌리와 잎의 대부분의 세포에서 큰 활성을 나타낸다. 그러나, CaMV 35S 프로모터는 벼 등의 단자엽 식물에서는 쌍자엽 식물에서보다 낮은 활성을 나타내고, 화분(pollen) 등의 특정 세포에서는 심지어 아무런 활성도 나타내지 않았다.

CaMV 35S 외에 쌍자엽 식물에서 유래한 다른 여러 프로모터들도 단자엽 식물의 형질전환에 이용되고는 있으나, 단자엽 식물에서 유래한 프로모터보다는 낮은 활성을 나타내었다. 이에, 벼의 RbcS(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 벼의 Act1(actin1) 프로모터 및 옥수수의 Ubi1 프로모터가 단자엽 식물의 형질전환에 유용한 프로모터로서 조사되어 왔으며, Act1 및 Ubi1 프로모터는 CaMV 35S 프로모터보다 단자엽 식물에서 비교적 높은 활성을 나타내기 때문에, 단자엽 식물의 형질전환에 일반적으로 이용되고 있다.

그러나, Ubi1 프로모터는 비록 많은 세포 타입에서 활성을 나타내기는 하지만, 식물체 전 조직을 포괄하지는 못하고, 특히, 어린뿌리에서 강력한 활성을 나타내지만, 뿌리가 성숙함에 따라 활성이 현저히 감소되며, Act1 프로모터는 주로 생장 조직과 생식 조직에서 활성을 나타내므로, 단자엽 식물에서 편재하는 유전자(ubiqitous gene)를 발현시키기에는 효과적이지 않다.

따라서, 단자엽 식물의 형질전환에 있어서, 강력하고 안정하며 편재적인 활성을 나타내는 프로모터를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

미국특허 제6958434호에는 OsCc1 프로모터 및 이를 이용하여 단자엽 식물을 형질전환하는 방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 단자엽 식물의 형질전환에 효과적인 프로모터를 개발하고자 예의 노력한 결과, 벼 유래의 특정 프로모터가 단자엽 식물의 유전자의 항시 발현에 적합하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 항시 발현용 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 형질전환된 식물을 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 식물의 종자를 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단자엽 식물의 형질전환을 위한 항시 발현용 프로모터를 제공하며, 더욱 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하는, 단자엽 식물의 형질전환을 위한 항시 발현용 프로모터를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 특정 프로모터에 관한 것으로서, 구체적으로, 상기 프로모터는 단자엽 식물의 형질전환용으로 적합하며, 또한 식물체 유전자의 항시 발현 (constitutive expression)에 적합하다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 식물체 전 기관 또는 조직에서 균등하게 유전자를 발현하는 것일 수 있다. 상기 프로모터는 서열번호 1 에서 3까지의 염기 서열 및 상기 각각의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함한다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1의 아스코르브산 페록시디아제 프로모터 (APX ascorbate peroxidase), 서열번호 2의 가상적인 AP2 도메인 함유 유전자 프로모터 (SCP1 AP2 domain containing putative gene), 서열번호 3의 세포질에 존재하는 포스포글루코네이트 탈수소화효소1 프로모터 (PGD1 cytosolic phosphogluconate dehydrogenase) 이다.

상기 프로모터는 식물체 전 기관과 조직별로 균등하게 유전자를 발현하였다. 이들 중 APX, SCP1, PGD1 프로모터는 기존 OsCc1와 옥수수의 ZmUbi1 항시 발현 프로모터와 견줄만큼 강하게 발현하였다.

또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 3의 염기 서열과 유사한 기능적 특 성을 갖는 염기 서열이다. 상기 유사한 기능적 등가물에는 작용성 단편을 포함하여, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 내지 3의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열의 실질적인 동일성은 폴리뉴클레오티드가 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또 다른 의미는 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로에게 특이적으로 혼성화하는 경우 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 것이다. 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서는 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 정합된 프로브에 혼성화되는 온도(정해진 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 전형적으로, 서던 블롯 절차에 대한 엄격한 조건은 0.2XSSC로 65℃에서의 세척을 포함한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에, 세척 조건은 전형적으로 6XSSC에서 약 42℃이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프로모터에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 재조합 식물 발현 벡터의 일례로서, 도 2의 A에 기재된 벡터를 예를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 벡터는 본 발명의 프로모터에 변형된 녹색형광단백질 유전자(GFP), 프로테아제 저해제 II 터미네이터 유전자(T_PINII), OsCc1 프로모터 (Pcytc), 제초제 저항성 유전자 Bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자) 및 노팔린 신타아제 터미네이터(T_NOS)가 작동가능하게 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 본 발명의 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용 어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리 신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체에서 항시 발현(constitutive expression)적으로 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 생산 방법에 의해 생산된 목적 단백질을 제공한다. 생산된 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 제조 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공한다. 바람직하게는 상기 식물은 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물로부터 얻은 종자를 제공한다. 바람직하게는 상기 종자는 단자엽 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

1. 프로모터 서열 예측 및 추출

1997년 발족하여 2004년 12월 벼의 전체 게놈(genome)의 시퀀싱을 마친 IRGSP(international rice genome seqeuncing project) 서열과 이를 근거로 유전자의 명명(annotation)을 실시한 TIGR(The Institute for Genomic Research)의 명명 데이타를 이용하여, 프로모터 지역을 예측하고, 벼 형질전환용 벡터 제작에 사용하였다. 명명이 끝난 BAC을 선정하여, 코딩 서열 (CDS)의 ATG 위치에서부터 약 2 킬로베이스페어(kbp) 상류(upstream)까지의 서열을 프로모터 지역으로 가정하고, 이 서열만 따로 추출하여, 이 2 킬로베이스페어 (kbp) 내에서 전체 크기가 1.7-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머 제작용 주형(template)으로 사용하였다.

2. RT-PCR (역전사효소-PCR) 을 통한 항시 발현 유전자 분석

항시 발현 유전자 분석을 위해 종자와, 5일, 20일, 30일, 60일된 묘의 잎과 뿌리 및 꽃 조직에서 시료를 채취하였다. 시료 준비를 위해 70% 에탄올과 20% chlorax 용액으로 종자를 소독하고 암 상태로 5일간 발육 후, 온실에 전개하였다. 전체 RNA를 추출하기 위하여, RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen, Cat. No. 74904)를 사용하였다. 추출한 전체 RNA 400ng으로 제1 가닥 cDNA 합성을 하였고 (Invitrogen, Cat. No. 18080-051), cDNA 합성 반응물 1㎕을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 아래와 같으며, 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위해 유비큐틴 프라이머(Ubi)를 사용하였고, 그 서열은 아래와 같다.

정방향 프라이머 APX: 5'- GACCTCTAGACCGCCGTATT-3'(서열번호 4)

역방향 프라이머 APX: 5'- GCCAACCACTCGCAATCCAA-3'(서열번호 5)

정방향 프라이머 SCP1: 5'- TCGCTGCCTACGCCAACATC-3'(서열번호 6)

역방향 프라이머 SCP1: 5'- TCGCCGAACTAGCAGGTGAG-3'(서열번호 7)

정방향 프라이머 PGD1: 5'- CCGTGAGCTAGCGAGGATCT-3'(서열번호 8)

역방향 프라이머 PGD1: 5'- CCGGTAGGAGTCGAAGTACG -3'(서열번호 9)

정방향 프라이머 OsCc1: 5'- ACTCTACGGCCAACAAGAAC-3'(서열번호 10)

역방향 프라이머 OsCc1: 5'- CTCCTGTGGCTTCTTCAACC-3'(서열번호 11)

정방향 프라이머 Act1: 5'- ATGGTGTCAGCCACACTGTC-3'(서열번호 12)

역방향 프라이머 Act1: 5'- TAACCACGCTCCGTCAGGAT-3'(서열번호 13)

정방향 프라이머 Ubi: 5'- ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3'(서열번호 14)

역방향 프라이머 Ubi: 5'- TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3'(서열번호 15)

PCR 조건은 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA 1㎕, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 4 pmol, 전체 20 ㎕ 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분, 32 사이클로 진행하였다.

3. 프로모터의 증폭(amplification) 및 분리(isolation)

예측된 2 kbp의 프로모터 서열을 주형으로, 프라이머 designer 4 program(ver.4.20, Scientific & Educational software)을 이용, 전체 크기가 1.8-2kb 정도의 프로모터를 분리하기 위한 PCR 프라이머를 디자인하였다. 디자인 조건은 PCR 조건이 프라이머의 GC% 범위가 40-60%, Tm 범위 55-65℃, 염 및 유리 Mg의 농도를 각각 0, 0.15 mM로 하였다. 프라이머(PCR 프라이머)는 그 길이가 주형 특이적 영역이 20 베이스페어(bp), 5'어댑터 서열(adaptor sequence)가 12bp가 되도록 하였다. 이 어댑터 서열은 기존의 제한효소(restriction enzyme)와 DNA ligase(DNA 접합효소)를 이용한 클로닝 방법이 아닌 자리 특이적 재조합을 위해 삽입한 서열이다. PCR 반응의 주형으로 사용할 DNA는 자포니카형 (japponica type) Nipponbare 품종(cultivar)의 벼를 파종하여, 온실에서 3주간 키운 후, 잎 부분만 절제하여, 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 우선 절제한 잎을 액체 질소로 급냉동시키고, 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄한 후, DNAzol(molecular research center, Cat. No. DN128) 용액을 이용하여 분리하였다. PCR 반응은 두 단계로 나누어서 진행하였다. 1차 반응은 벼의 게놈에서 특정 프로모터를 분리하기 위한 반응으로, 12bp 어댑터 서열로 연결된 전체 크기 32bp 주형 특이적 서열 프라이머를 사용한다. 프라이머 서열은 하기와 같이 구성되며,

정방향 주형 특이적 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCT-주형 특이적 서열-3'

역방향 주형 특이적 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGT-주형 특이적 서열-3'

구체적인 유전자 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다.

a. APX 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTgtaaggtgacatggcatatc-3'(서열번호 16)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTccaatccgaatcaatcaatc-3'(서열번호 17)

b. SCP1 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTttgactttttctgcgaagaa-3'(서열번호 18)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTtaactcttgccggaaaagaa-3'(서열번호 19)

c. PGD1 프로모터 프라이머

정방향 프라이머: 5'-AAAAAGCAGGCTtagatatgccgaacatgacc-3'(서열번호 20)

역방향 프라이머: 5'-AGAAAGCTGGGTgcagatagatgcaccaaatg-3'(서열번호 21)

1차 PCR은 게놈 DNA 50ng, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 10 pmol, 전체 50 ㎕ 반응으로, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분, 30 사이클로 진행하였다.

2차 반응은 프로모터를 형질전환용 벡터에 삽입하기 위해 필요한 특정 어댑터 서열 (att site)를 삽입, 증폭하기 위해 실시하였다. 프로모터에 부가적으로 삽입되어야 할 서열의 길이는 약 29 bp로, PCR의 효율을 높이기 위하여 이 서열의 일부 (12 bp)만을 주형 특이적 서열에 overhang으로 달아 첫 번째 PCR을 수행한 후, 이 PCR 반응액의 1/50(1㎕)을 취해 다시 전체 재조합 서열을 갖는 프라이머(어댑터 서열 프라이머)로 두 번째 PCR 반응을 한다. 따라서, 이 반응물은 벼의 프로모터와 재조합을 위한 att 서열을 모두 갖게 된다. 어댑터 프라이머의 서열은 아래와 같 다.

attB1 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'(서열번호 22)

attB2 어댑터 프라이머: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'(서열번호 23)

2차 PCR은 1차 PCR 반응물 1㎕, 2X Taq premix (Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 어댑터 프라이머 각각 2 pmol, 전체 50 ㎕ 반응으로, 95℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 2분, 5 사이클 후, 다시 95℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 2분, 20 사이클로 진행하였다.

위의 PCR 방법은 Gateway 시스템(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하기 위해 Invitrogen에서 제시한 방법으로 수행하였다.

4. 증폭된 프로모터의 클로닝(cloning)

Gateway 시스템(Invitrogen, Cat. No.12535-029)을 이용하여 벼 형질전환용 벡터에 삽입하였다. 먼저, 증폭시킨 프로모터는 1% 아가로스 겔 상에서 전기 영동 후, 겔 상에서 밴드 분리 및 Mega-spin 아가로스 겔 추출 키트(Intron, Cat. No.17183)으로 정제(purification)하였다. 정제한 프로모터 5 ㎕, BP clonase 효소 혼합물 4 ㎕, 5X BP 반응 완충용액 4 ㎕, pDONR 벡터 300 ng/2㎕, TE 완충용액(10 mM Tris/pH 8.0, 1 mM EDTA), 전체 20 ㎕ BP 반응을 25℃, 16시간 동안 수행하였다. 이후, 이 반응물에 LR clonase 효소 혼합물 6㎕, 0.75 M NaCl 1㎕, 형질전환용 벡터 450 ng/3㎕ 첨가하여 전체 30 ㎕, 25℃, 8시간 동안 LR 반응시켰고, proteinase K 3 ㎕를 첨가, 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 중 2 ㎕를 취해 DH5α 적격 세포(competent cell)에 형질전환하였다. 형질전환시킨 DH5α 세포는 50 ㎍/ml 스펙티노마이신 항생제를 포함한 LB 한천 배지에 깔고, 37℃ 항온기에서 12시간 키운 후, 선발된 세포에서 DNA를 추출하여 프로모터가 삽입되어 있는지를 PCR 반응을 통하여 확인한 후, 시퀀싱 및 BLASTN을 수행하여 분리한 프로모터의 완전한 삽입을 확인하였다.

벼 형질전환용 벡터(pMJ401)는 다음과 같다. 오른쪽 경계 서열(right-border sequence)과 왼쪽 경계서열(left-border sequence)사이에 재조합 후 프로모터와 교체가 될 카세트가 3' 방향에 마커 유전자(visiable marker gene)인 GFP와 PINII(프로테아제 저해제 II) 터미네이터로 연결되어 있다. 이 카세트는 BP 및 LR 반응을 수행할 수 있도록 att 서열를 가지고 있다.

선발 유전자(선별 마커 유전자)는 제초제 저항성 유전자 bar 유전자(bar, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자)가 본 발명가가 개발한 항시 발현 프로모터 OsCc1에 의해서 조절되도록 제조되었고, 이 유전자는 NOS(nopalin synthase) 터미네이터로 연결되어 있다. 또한, 오른쪽 경계 서열(right-border sequence) 말단에 MAR 서열을 장착함으로써 염색체 내 도입부위에 따른 발현양의 변화를 최소화하여 프로모터 고유의 활성만을 측정할 수 있도록 하였다.

5. 아그로박테리움(Agrobacterium-mediated)을 이용한 벼의 형질전환(transformation)

낙동 벼 종자(Oryza sativa L. cv Nakdong)를 겉 호영만 제거한 후, 70%(v/v) 에탄올을 첨가하고, 1분 동안 가볍게 흔들어 씻어냈다. 씻어낸 종자들은 다시 20% chlorax 에 넣어 1시간 동안 흔들어 소독하고, 멸균수로 여러 번 세척하였다. 세척한 벼 종자는 형질전환을 위해, 장(Jang)에 의해 기술된 바와 같이(Jang, I-C. et al., Mol breeding, 5:453-461, 1999) 캘러스 유기 배지(2N6)에서 한 달간 배양하여 배아 캘러스를 유기한 후, Agrobacterium triple mating 방법으로 얻은 아그로박테리움과 공동배양(co-cultivation)하여 상기 프로모터가 삽입된 형질전환 벡터를 벼 게놈에 삽입시킨 후, 형질전환된 캘러스 선택배지(2N6-CP)에서 한 달간 배양하였다. 이후, 선택적으로 자란 세포들을 골라 재분화 배지(MS-CP)에서 한 달에서 두 달간 배양 후 재분화된 식물체를 온실에서 순화시켰다. 순화된 T0 벼는 비선택성 제초제인 바스타(basta) 처리를 하여 제초제 저항성을 보이는 식물체만 골라 후대검정을 하였다.

6. GFP 발현 관찰 및 벼 기관별 프로모터 활성 분석

프로모터의 활성 분석을 위하여 사용한 마커 유전자 GFP의 형광발현 확인은 종자, 발아 후 1개월 된 묘의 잎과 뿌리 및 꽃 기관에서 관찰하였다. 유전자의 발현 관찰은 유전자 삽입 및 분리가 확실히 관찰될 수 있는 T2 세대에서부터 실시하였다. 종자에서의 GFP 발현은 호영을 벗기고, LAS3000 시스템(Fuji photo film. co.)과 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 종자의 배와 배유에서 GFP 발현을 관찰하였다. 발아 후 1개월 된 묘의 경우, 종자에서 GFP 발현을 관찰한 종자들을 다시 에탄올과 20% chlorax 용액에 소독, 선발마커 bar 유전자의 활성 확인을 위하여, PPT 성분이 함유되어 있는 MS-P 배지(PPT 4 mg/l)에서 암 상태에서 3일간 발아 시킨 후 빛이 있는 조건에서 2일간 배양시켰다. 발아된 어린 묘(etiolated seedling)를 흙에서 25일간 키운 후, 잎과 뿌리에서의 유전자 발현을 관찰하였다. LAS3000의 조건은 precision, standard, exposure time 1초(excitation filter 460 nm, barrier filter 510 nm)로 하였다. 꽃은 출수하기 직전에 채취하여 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용, 꽃의 호영을 제거하기 전과 후를 관찰, 기관별 GFP 형광을 관찰하였다.

7. RT-PCR(역전사효소 PCR)와 Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 을 통한 프로모터 활성 분석

프로모터의 활성 분석을 위한 전체 RNA 추출은 해당 형질전환체의 종자와 5일, 20일, 30일, 60일된 묘의 잎과 뿌리 및 꽃 조직에서 실시하였다. 각 조직에서 전체 RNA를 추출하기 위하여, RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen, Cat. No. 74904)를 사용하였다. 추출한 전체 RNA 400ng으로 제1 가닥 cDNA 합성을 하였고(Invitrogen, Cat. No. 18080-051), 이 cDNA 합성 반응물 1㎕를 취해 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 두 종류의 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 프로모터 뒷부분에 삽입된 GFP의 발현양을 상대적으로 비교하기 위한 프라이머(프라이머 GFP)이고, 두 번째 프라이머는 사용한 cDNA 양(loading control) 비교를 위한 프라이머(프라이머 Ubi)로, 프라이머 서열은 아래와 같다.

정방향 프라이머 GFP: 5'-CAGCACGACTTCTTCAAGTCC-3'(서열번호 24)

역방향 프라이머 GFP: 5'-CTTCAGCTCGATGCGGTTCAC-3'(서열번호 25)

정방향 프라이머 Ubi: 5'-ATGGAGCTGCTGCTGTTCTA-3'(서열번호 14)

역방향 프라이머 Ubi: 5'-TTCTTCCATGCTGCTCTACC-3'(서열번호 15)

RT-PCR 조건은 PTC200 PCR machine(MJ research), cDNA 1㎕, 2X Taq premix(Solgent.Co. Cat. No. EP051020-T2B6-1), 주형 특이적 프라이머 각각 2 pmol, 전체 20 ㎕ 반응으로, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 31 사이클로 진행하였다 (단, 종자일 경우 33 사이클로 진행함).

Real time qRT-PCR 조건은 Mx3000P(Stratagene), cDNA 1 ㎕, 2X 사이버그린 qRT-PCR premix (Invitrogen. Cat. No. 11765-100), 주형 특이적 프라이머 각각 2 pmol, 전체 20 ㎕ 반응으로, 95℃ 15초, 60℃ 30초 40 사이클로 진행하였고, 반응 종료 후, 제조사에서 제공한 프로그램 Mx3000P(Stratagene)을 이용하여 프로모터 활성을 정량 분석하였다.

실시예 1: 항시발현 유전자들의 벼 조직별 발현 분석

APX, SCP1 및 PGD1 항시발현 프로모터의 조직 특이 활성을 보기 위하여 종자와 5일, 20일, 30일, 60일된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직 및 꽃 조직으로부터 시료를 채취하였고, 각각의 시료에서 전체 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 2 % 아가로스 겔에 전기영동(gel electrophoresis) 하였다. 도 1은 RT-PCR을 이용하여 벼 내에서 3개의 항시발현 유전자들의 조직별 발현양상을 비교한 결과이다. 도 1에서와 같이 본 발명에 사용한 APX, SCP1 및 PGD1 의 벼 내 조직별 발현은 여러 조직에서 고르게 발현하고 있음을 알 수 있다. 또한, 이미 잘 알려진 항시발현 프로모터인 OsCc1과 Act1의 유전자 발현과 비슷한 양상을 보이는 것으로 미루어 볼 때 이들이 항시발현 유전자임을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 벼 형질전환용 벡터 제작 및 프로모터 구조

프로모터 활성 분석을 위한 벼 형질전환용 벡터를 제작하였으며, 도 2의 A에 도시하였다. 도 2의 A는 pMJ401 벡터를 나타낸다. PCR로 분리한 프로모터를 클로닝 하기 위한 모벡터이다. attR1, attR2 자리는 BP 반응 후 프로모터가 가지고 있는 attL1, attL2 서열과 재조합(자리 특이적 재조합)이 일어나는 부위로, LR 반응 후, 프로모터는 카세트와 교체되고 attR1, attR2 서열도 attB1, attB2 서열로 교체된다. 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. MAR, matrix attachment region(1.3kb), X98408; 카세트 B, 전환 카세트 B(1.7kb), invitrogen, Cat. No. 11828-019; GFP, 변형된 녹색 형광 단백질 유전자(0.74kb), U84737; TPINII, 프로테아제 저해제 II 터미네이터(1.0kb), X04118; OsCc1, 시토크롬 c 프로모터(0.92kb), Af399666; BAR, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제 유전자(0.59kb), X17220; TNOS, 노팔린 신타아제 터미네이터(0.28kb).

도 2의 B는 본 발명의 프로모터의 벼 게놈상에서의 구조를 나타낸다.

실시예 3: RT-PCR을 이용한 형질전환체 벼 조직별 프로모터 활성 (GFP 발현 수준) 분석

형질전환체의 종자와 5일, 20일, 30일, 60일된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직, 및 꽃 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 2% 아가로스 겔에 전기영동(gel electrophosresis) 하였다. 각 PCR 산물은 5 ㎕씩 로딩하였다. 도 3은 RT-PCR을 이용하여 종자와 5일, 20일, 30일, 60일된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직 및 꽃 조직에서 각 프로모터에 의한 GFP 발현양을 반정량적으로 분석하였다. GFP는 GFP 프라이머로 증폭시킨 PCR 산물로, 프로모터 뒷부분에 삽입된 GFP 유전자의 발현양을 상대적으로 비교하기 위한 것으로 산물의 크기는 141bp이다. 개체간의 변이에 따른 유전자 발현의 차이를 고려하여 각 프로모터의 형질전환체 분석은 삽입부위가 서로 다른 3개체(events)를 사용하였다. 잘 알려져 있는 옥수수 Ubi1 프로모터(ZmUbi)와의 활성비교를 통하여 APX, SCP1 및 PGD1 프로모터는 상대적으로 활성이 강하며 전조직에 고르게 분포함을 알 수 있었다.

실시예 4: Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR)을 이용한 형질전환 벼 조직별 프로모터 활성 분석

도 4 및 도 5는 형질전환벼 내에서의 각 프로모터의 활성에 따른 GFP 유전자의 조직별 발현양상을 정량적으로 분석한 결과이다. 도 3과 동일한 방법으로 형질전환체의 종자와 5일, 20일, 30일, 60일된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직, 및 꽃 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하 여 증폭시킨 후, 목적유전자로 사용한 GFP의 유전자 특이 프라이머를 사용하여 Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 분석을 실시하였다. 개체간의 변이에 따른 유전자 발현의 차이를 고려하여 각 프로모터의 형질전환체 분석은 삽입부위가 서로다른 3개체(events)를 사용하였다.

도 4는 항시발현 프로모터 형질전환체의 5일, 20일, 30일, 60일된 묘에서 각각 잎과 뿌리 조직에서의 활성을 정량적으로 보여준다. 도 5는 생식기관이며 저장기관인 종자와 또 다른 생식기관인 꽃에서 항시발현 프로모터들의 활성을 정량적으로 보여준다.

실시예 5: 삽입부위가 다른 형질전환체별 프로모터 활성 비교

프로모터는 벼 게놈 내 삽입위치에 따라 그 활성 정도가 크게 변할 수 있기 때문에 삽입부위가 서로 다른 다수의 형질전환체를 대상으로 프로모터의 활성변화를 측정 분석함으로써 프로모터를 실제 도입유전자 발현에 사용할 때 예측 가능한 활성범위를 정해줄 수 있다. 각 프로모터 별로 삽입부위가 서로 다른 형질전환체(프로모터 당 5-14 개체)를 발아 후 20일간 온실에서 키운 후 잎과 뿌리 조직에서 전체 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, PCR을 수행하여 증폭시킨 후, 목적유전자로 사용한 GFP의 유전자 특이 프라이머를 사용하여 Real time qRT-PCR (실시간 정량 역전사효소-PCR) 분석을 실시하였다. 도 6은 형질전환 벼 내에서의 각 프로모터의 활성에 따른 GFP 유전자의 발현양상을 정량 분석한 결과이다. 이렇게 얻은 형질전환 개체별 프로모터 활성변화 분포도는 해당 프로모터를 도 입유전자(transgene) 발현에 이용할 때 발현수준의 최소치와 최대치를 사전에 예측하는 좋은 지표가 된다.

실시예 6: 프로모터 형질전환 벼의 잎과 뿌리 조직 내 GFP 형광 발현 관찰

본 발명에서 사용된 프로모터의 활성 분석을 위하여 발아 후 1개월 된 프로모터 형질전환체의 잎과 뿌리 조직을 취하여 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)으로 GFP 형광을 관찰하였다.

도 7은 프로모터 형질전환 벼의 잎과 뿌리 조직에서 GFP 형광 발현을 보여준다. 도 7에서 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. NC, 음성 대조군 낙동벼 (비형질전환 벼); ZmUbi, 옥수수의 Ubi1 프로모터; Actin, 벼 Actin1 프로모터; OsCc1, 벼 시토크롬 c 프로모터.

음성 대조군의 잎, 뿌리 조직에서는 GFP 형광 발현이 관찰되지 않은 반면, 프로모터 형질전환 벼의 잎과 뿌리 조직에서는 GFP 형광 발현이 뚜렷하고 고르게 관찰되었다. 이는 양성 대조군인 ZmUbi, Actin1 및 OsCc1 형질전환벼의 경우와 동일하게 본 발명의 항시발현 프로모터들의 활성이 잎과 뿌리 조직에 고르게 분포하고 있음을 시각적으로 보여준다.

실시예 7: 프로모터 형질전환 벼의 생식기관 내 GFP 형광 발현 관찰

본 발명에서 사용된 프로모터의 생식(reproduction)기관 내에서의 활성분석을 위하여 프로모터 형질전환체의 호영을 벗긴 종자를 취하여 입체현미경 SZX9- 3122(Olympus, Tokyo, Japan)으로 GFP 형광을 관찰하였다.

종자에서 GFP 발현을 균등(homozygous)하게 보이는 T2 세대 종자를 온실에 파종하여 꽃이 출수하기 직전에 채취하여 입체현미경 SZX9-3122(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여, 꽃의 호영을 제거하기 전과 후의 GFP 형광을 관찰하였다. 도 8은 형질전환 벼의 종자와 꽃에서의 GFP 형광 발현을 보여준다. 도 8에서 각 유전자에 대한 설명은 하기와 같다. NC, 음성 대조군 낙동벼 (비형질전환 벼); ZmUbi, 옥수수의 Ubi1 프로모터; Act1, 벼 Actin1 프로모터; OsCc1, 벼 시토크롬 c 프로모터.

OsCc1 프로모터 형질전환체는 벼 종자와 어린 묘의 잎과 뿌리에서 모두 GFP 형광이 관찰되었고, 꽃에서는 거의 발현되지 않았다. Act1 프로모터 형질전환체는 잎과 뿌리외에 수술에서도 GFP 형광이 관찰되었다. ZmUbi 프로모터 형질전환체는 큰 호영(lemma), 작은 호영(palea), 암술(pistil), 수술(anther) 등 모든 화기에서 GFP 형광이 고르게 관찰되었다. 본 발명에서 분리한 APX, SCP1 및 PGD1 프로모터는 GFP 형광이 ZmUbi와 유사하게 식물체 전 조직에서 고르게 관찰되었다.

그러나 프로모터 형질전환체 내 조직별 GFP 형광 발현이 Real time-qPCR(실시간 정량 PCR) 결과와 부분적으로 다르게 나타나는 것은 분석방법의 민감도가 매우 다르기 때문이며, 따라서 GFP 형광 관찰은 프로모터 활성의 정성적인 자료로만 활용할 수 있다.

도 1은 벼의 여러 조직에서의 항시발현 유전자들의 발현을 보여주는 것이다.

도 2는 벼 형질전환용 벡터의 모식도(A)와 프로모터의 구조(B)이다.

도 3은 RT(reverse transcription) PCR을 이용하여 형질전환 벼의 종자와 각각 5, 20, 30일된 벼의 잎과 뿌리조직에서의 GFP 발현양을 관찰한 것이다.

도 4는 Real Time-qPCR을 이용하여 각각 5일, 20일, 30일, 60일된 형질전환 벼의 잎과 뿌리조직에서의 GFP 발현을 양적으로 비교한 것이다.

도 5는 Real Time-qPCR을 이용하여 형질전환 벼의 종자와 꽃에서의 GFP 발현을 양적으로 비교한 것이다.

도 6은 여러 event에서의 GFP 발현의 양적인 비교를 통하여 프로모터 강도를 가늠한 것이다.

도 7은 형질전환된 벼의 잎과 뿌리에서의 GFP 형광 발현을 보여주는 것이다.

도 8은 형질전환된 벼 종자와 꽃에서의 GFP 형광 발현을 보여주는 것이다.

<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation <120> Constitutive expression promoters for transforming monocot plants and uses thereof <130> PN08217 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1673 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1673) <223> Ascorbate peroxidase promoter <400> 1 gtaaggtgac atggcatatc tatgtggtga ttttggtggg accaaggact atatcagccc 60 acatgacaaa tttaaaggac ttgtttggac aatatgaaag attaaggact aaaatgacct 120 aggagcgaaa ctttagggac catattggct attctccctt tttgacacga atgaaaaatc 180 caatttcata acttgtctgg aaaccgcgag acgaatcttt tgagcctaat taatccgtca 240 ttagcacatg cgaattactg tagcacttat ggttaattat ggactaatta agctcaaaag 300 attcgtcttg cgatttcctt tttaactgtg taattagttt ttcttttact ctatatttaa 360 tgctccatgc atatgtctaa agatttgatt taatgttttt cgaaaaaact tttggaggac 420 taaccgggcc taacgtgact tgaagagctg tgacagcgca aatcgtgaaa cgcggatgga 480 cctagcatta tggtgatgta ggaagtgcct tgctggcagt ggcaggtacc gtgcaagtgt 540 aataccatag atccgttggc ttatctgatt acatgatgat gattactccc tccgtttcac 600 aaatataagt cattttagca tttttcacat ttatattgat gttatgtcta gattcattaa 660 catcaatatg aatgtgggaa atgctagaat gacttacatt gtgaaacgga tcattaacat 720 caatatgaat gtggaaaatg ctagaatgac ttacactgtg aaacggaggg agtatacgat 780 tatgtaatga aaaaaggagt acaatactag tcgccgtctc cccgcaaaaa aagtactagt 840 tgtcgtcaag taggggagta ataataataa taataataag ggataatata caggctgtgt 900 ttagatcgtg tgccaaattt ttttaaagta tacggacaaa tatttaaata ttaaacatag 960 actaataaca aaacaaatta cagattccat ctgtaaactg cgagacgaat ctattaaacc 1020 taattaattc gttattagca aatgtttact gtagcaccac attatcaaat catggcgtaa 1080 ttagctcaaa agattcgtct cgcgatttac atgcaaacca tgcaattgat ttttttttca 1140 tctacgttta gttctatgca tgtgtccaaa tattcgatgt gatgaaaaaa ttggtaattc 1200 gaggaaaaaa tttaaatcta aacacggcca cagtataaaa aaaaatagta gcgttgttgt 1260 ttatgaaaga ggatggtaaa gtaagacaag ataacgcaag ggcctaaaaa agtggagacg 1320 aagaagaaga cggaatatat tgcattggaa aagtgagcgc ttggacgaga gaaaaactcg 1380 gattcaagcg tccatatcag tggacaccac caatgggagg tggccacgtg ggcaggtccc 1440 gggtggaatc tggcgcgttc acacgggagg ttccgaaatt acggcaacgc cactggagtg 1500 cgaggcgcag gatgtgagat ccacggcggg ggctccgcta ctagaaactt cttctggtcg 1560 tgggtggtac gcaccctcgc gcctcgcctt tatattacta gtaagaagat ctcatccctc 1620 cttggtgagg tgaggtgagt tgagttgggg attgattgat tgattcggat tgg 1673 <210> 2 <211> 1853 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1853) <223> AP2 domain containing putative gene promoter <400> 2 ttgacttttt ctgcgaagaa tcctgtttac ggcgcataat aagatcgaag aatcacgcct 60 aactgcatgc agatacagtg ccgagaacag aatcagatct gcggattaac ggaagacttg 120 ttttagcttc cgtcttttta tctggccata tgaaacagtc tctcctaaaa atagaatcac 180 tgtatagtaa acaaatcttg ggattgtcag caagtgccaa gtccacgtag aggaaaatct 240 tccaaaatat atcgtgggtc atcagatgag agattctcgc acaaaacatg cttacgtgtc 300 aaacgaggca cgctacgaaa aaagaggaag ctgaccaatc gacggcccct ccgtggccac 360 atgtttttgc ccgcttttcc aaaaaaaatt ccgttccgtt ttacggtgcc cgtttacctt 420 ggccctcaag ttagctggaa acacaaaatc cttccaattc tgtcgtgggg cctctcacga 480 taatttcagc attaagtact ttatttattc taaaaatatc tatcgccatt tccatgtgtc 540 agaaattagt tctgagttaa ggacgtcttg attgggagat tagccttggc cgcgtggaat 600 ctcaaccata gaatcccaat ccccttcttt tccgttgccc tatcactaga tctggtcact 660 atgcagaagt gtaaggggcc cacatgtcnt gnagacgatg atgtacaggc caggcgtgta 720 ggtgaancnt ttatcatttg ctagccgcct catctcgccc attcgcttcc ccgtcataaa 780 gcccccccaa aaccctcccc acctctgcca tttggtgctt atccccatga gtggtgggga 840 cacatcgccc gggccccaca tgtcagctaa aacccccgca tgcttccgga cggtagcacc 900 ggtaccgaga tttttactcc gcgaggtgac cgctctgtca ctgcgcgtgg gcccggacgt 960 agtagtggcc cacccgtcac tgtgttcgta gcaggcgact gtgcagaaat ctggtgcgtg 1020 aagccgcaga atatcagccg gaggcagaga ggccactccc gcgtgacatg agggaccata 1080 tggtggggtg ggcccacgcg tcagtgtgat ggggtggggg ataggcgcgt gagggagagg 1140 aatgggtgga ggagtgggag gggattaaat atcggcggag gagacgagcc caaccccttt 1200 tgctcctctc gccgttttgg tcggggtttt agcgagcgcg tgggaggccg gaggcgacga 1260 cgacgaccgc gccgccgtcg gagaagaagg ccgcggaagc accagtacca gcacccgtat 1320 atgtcttcta gccccttctc cgatctggtg gtagtcgtgc tcctcgtctg cgccgtcgtc 1380 gccgcagccg tcctcctccc cctcgtctgc gcccgccgat ctatgcacca gaggctccac 1440 ggctggaaca agcccacgtc gatgctcagg tgcgtccggg tgcccctccc ccaccgtgaa 1500 atttttcatc tttggcgagg tttacgccga tctggagtgg atttgaccgg gtttcgcggc 1560 cggttcgtcc agatctggag ggttcttggt gggtttttgt ggggtttttg attgatgggt 1620 ttgtttctcg tctgtgattt tgcagggacg ggttcggggt caagtattcc gggttcctcc 1680 acataaggcc gtgtggtttc tgtcgaggag attgacggat tcgatcgatt cgtgttcgtc 1740 tccgtcaaat ttttgcacaa gagaaaaaaa aagtttcccc cttttagagt ttttcccctt 1800 cagttttgtc agtttttgtg aggaatttta gagttctttt ccggcaagag tta 1853 <210> 3 <211> 1889 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> promoter <222> (1)..(1889) <223> Cytosolic phosphogluconate dehydrogenase promoter <400> 3 tagatatgcc gaacatgacc aatatagaaa aggtcatatt tgtgaataga gagaagtaat 60 aatatgaata gcaaatacgg agtacgtata tagcatcata taacacatgg aagtctcttt 120 cagttagtta atctatcaca tgcgggattt gcggttaaaa gctctgttcc ccaaaacgat 180 aaactaatct aaaatcctcg caaaaaaatt taaaaaatct gtaatcttaa attcgaggaa 240 actcatgtga agaatgaggt ggtggtgacg tcaccaacaa acagatgcga aatggagaag 300 atgccctggc ctgcaactgg gccgagccgc cgttggtccg gtccacgttc tgattgccag 360 tttgccacca actccaactc catatggcac gtggggccca ccacgcccgt ggagacccag 420 gcccacaagt caggcagcaa ttttgacccg cctaccgccg ctgcggcggc tatctctgcg 480 aggcggtccg gtcccacccg tcagagagac gtcctgatcg cggcaggtgt gaaaggcaag 540 ggggatattt ggtgggctat ttaagcaggc ggtgcggtag gtggtcgact cgctgcacgc 600 ctttccgcga tttcgtcagt tacccagatc tcatcttacg caggtgagct ccgatctccc 660 ctctcccgcg ctgcgatttt gatttgatcc gtcgcgccgc atcgcgtcgt cgcttggtag 720 gatcatccat ccgtcccccg cgcagcgcga gctgtctagt ttctgctcga ttttttagtt 780 cctgtttatg ggggagggag ggagagaggg agggattggg tggaggcgaa ccaggaatcg 840 tcctggcggt gtgatgtctg gatgaattgg attggcagcg tcttttagtg gctgagagat 900 tgtttccttg ttactgttcc gtggggttta caactttaga atttgtttct tcgacagcat 960 gcagcaactt ggtagaattt agctgcatgt tctaggtggt ttgttgctgc tgatcctgct 1020 cgtttggatc aacgattttt ggggggctga gattaattgg ttggtacagt cttggttagt 1080 tacatccatg ggaacatgca gttggttatt ggtttgcaca tggagtacta ctgctaatgg 1140 ggtagatata gacagtgtgt gcgccaaagc ttgctaccac tagtttcttt aagtatagtg 1200 cctcccaatt accaatatta cctattttca gtgtaaagtg ttaaatagaa agattgcttc 1260 tgattgctat ctcctttact gaattggtag ttaggtgcac atcttccatt gtaacgtatg 1320 tgttaccatg gctcatgtac tagttatgct agatatgttg tgctgctaaa catatatact 1380 agaaagaatg ctaccactcg ttccttctgt tgttaattgt ggaatgtttt gcaatctcta 1440 gtttgtagct cacaactgac catatgattc cccatccaag tgtcgacctc atgtgtgatt 1500 tcataaataa aaaagagcat attttcagga tcctgttatg atcctcattt catacattta 1560 tatacctttt ccataataca tgaatgatgc ctcactcaat gctataaatg ttcacattat 1620 atattacctc ctcctacaag tatgaaatat gaattgccat aggccataca aaagagccca 1680 ctccctatat tggactcgat aaatattttt agtacatagc tcttaacttg catgtcatag 1740 tctgatgtac tgtccttttt gaattggaaa ctctgttact ttataaaaag gattgacatt 1800 tgtattccat tgttaaaaga aaagcaacat ctgcacaaac tagtttgttc tgcgcatgat 1860 gtattgatac atttggtgca tctatctgc 1889 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX forward primer <400> 4 gacctctaga ccgccgtatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX reverse primer <400> 5 gccaaccact cgcaatccaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP1 forward primer <400> 6 tcgctgccta cgccaacatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP1 reverse primer <400> 7 tcgccgaact agcaggtgag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGD1 forward primer <400> 8 ccgtgagcta gcgaggatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGD1 reverse primer <400> 9 ccggtaggag tcgaagtacg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCc1 forward primer <400> 10 actctacggc caacaagaac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCc1 reverse primer <400> 11 ctcctgtggc ttcttcaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act1 forward primer <400> 12 atggtgtcag ccacactgtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Act1 reverse primer <400> 13 taaccacgct ccgtcaggat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi forward primer <400> 14 atggagctgc tgctgttcta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubi reverse primer <400> 15 ttcttccatg ctgctctacc 20 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX promoter forward primer <400> 16 aaaaagcagg ctgtaaggtg acatggcata tc 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX promoter reverse primer <400> 17 agaaagctgg gtccaatccg aatcaatcaa tc 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP1 promoter forward primer <400> 18 aaaaagcagg ctttgacttt ttctgcgaag aa 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP1 promoter reverse primer <400> 19 agaaagctgg gttaactctt gccggaaaag aa 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGD1 promoter forward primer <400> 20 aaaaagcagg cttagatatg ccgaacatga cc 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGD1 promoter reverse primer <400> 21 agaaagctgg gtgcagatag atgcaccaaa tg 32 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 adaptor primer <400> 22 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 adaptor primer <400> 23 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP forward primer <400> 24 cagcacgact tcttcaagtc c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP reverse primer <400> 25 cttcagctcg atgcggttca c 21

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하는, 단자엽 식물의 형질전환을 위한 항시 발현용 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 식물체 전 기관 또는 조직에서 균등하게 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수인 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
제5항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 식물 발현 벡터.
제6항에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 식물체에서 항시 발현(constitutive expression)적으로 목적 단백질을 생산하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민 및 에리스로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
제9항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물.
제10항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제10항에 따른 식물의 종자.