BR112020023773A2 - molécula de ácido nucleico, polipeptídeo, gene quimérico, células vegetais e métodos para produzir uma célula vegetal, para converter uma planta, para selecionar uma planta, para restaurar a fertilidade, para identificar e/ou selecionar uma planta, para produzir uma planta, para produzir sementes, para aumentar a expressão de um polipeptídeo, usos de ácidos nucleicos e de uma planta - Google Patents

Abstract

“molécula de ácido nucleico, polipeptídeo, gene quimérico, células vegetais e métodos para produzir uma célula vegetal, para converter uma planta, para selecionar uma planta, para restaurar a fertilidade, para identificar e/ou selecionar uma planta, para produzir uma planta, para produzir sementes, para aumentar a expressão de um polipeptídeo, usos de ácidos nucleicos e de uma planta”. são descritos métodos para selecionar ou produzir uma planta de cereal que compreende um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo g de trigo e ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos para uso nos mesmos.

Description

“MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, POLIPEPTÍDEO, GENE QUIMÉRICO, CÉLULAS VEGETAIS E MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGETAL, PARA CONVERTER UMA PLANTA, PARA SELECIONAR UMA PLANTA, PARA RESTAURAR A FERTILIDADE, PARA IDENTIFICAR E/OU SELECIONAR UMA PLANTA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA, PARA PRODUZIR SEMENTES, PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, USOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS E DE UMA PLANTA” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se de um modo geral ao campo do melhoramento de plantas e da biologia molecular e diz respeito a um método para selecionar ou produzir uma planta de cereal que compreende um gene restaurador para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, e ácidos nucleicos para uso na mesma.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) é um traço principal de interesse em cereais, tal como trigo, no contexto de produção de semente híbrida comercial (Kihara, 1951, Cytologia 16, 177–193); Wilson e Ross, ,Wheat Inf Serv. (Kyoto) 14:29–30, 1962; Lucken, 1987 (Hybrid wheat. In Wheat and wheat improvement. Editado por E.G. Heyne. American Society of Agronomy, Madison, Wis.); Sage, 1976, Adv. Agron. 28, 265–298). Os citoplasmas de Triticum timopheevii (tipo G) e Aegilops kotschyi (tipo K) são amplamente estudados como indutores de esterilidade masculina no trigo comum (Triticum aestivum), devido a poucos efeitos prejudiciais (Kaul, Male sterility in higher plants. Springer Verlag, Berlin 1988; Lucken, 1987, supra; Mukai e Tsunewaki, Theor. Appl. Genet. 54,1979).

[003] No sistema de produção de sementes híbridas usando o citoplasma tipo G, a restauração da fertilidade é um problema crítico. A maioria dos trigos hexaploides não contém naturalmente genes de restauração de fertilidade (Ahmed et al. 2001, Genes and Genetic Systems 76, 33-38). No complicado sistema de restauração de T. timopheevii, oito loci Rf são relatados para restaurar a fertilidade do citoplasma da esterilidade masculina citoplasmática de T. timopheevii, e suas localizações cromossômicas foram determinadas como: Rf1 (Cr 1A), Rf2 (Cr 7D), Rf3 (Cr 1B), Rf4 (Cr 6B), Rf5 (Cr 6D), Rf6 (Cr 5D), Rf7 (Cr 7B) e Rf8 (Tahir & Tsunewaki, 1969, Jpn J Genet 44: 1 - 9; Yen et al., Can. J. Genet. Cytol. 11, 531-546, 1969; Bahl & Maan, Crop Sci. 13, 317-320, 1973; Du et al. Crop Sci , 31: 319-22, Crop 1991; Sinha et al., Genetica 2013, http://dx.doi.org/10.1007/s10709-013-9742-5). Ma et al.

(Genome 34:727-732, 1991) transferiram um locus gênico Rf de Aegilops umbellulata para o trigo, e foram criadas duas linhagens de translocação independentes com o locus Rf localizado no cromossomo 6AS ou 6BS (a partir de Zhou et al., 2005, Euphytica 141 (1-2): 33-40, doi: 10.1007 / s10681-005- 5067-5).

[004] Zhang et al., (Acta Genetica Sinica 06/2003; 30 (5): 459-

64.) descreveram um locus Rf localizado em 1AS na linha restauradora 7269- 10, com a distância genética entre o marcador SSR Xgwm136 e este gene Rf de 6,7 cM.

[005] Os documentos WO2017158126A1 e WO2017158128A1 forneceram marcadores mais precisos para identificar e rastrear o locus Rf1 no cromossomo 1AS, quando presente, por exemplo, na linhagem de trigo PI 583676 (USDA National Small Grains Collection).

[006] Geyer et al., (2017, Molecular Genetics and Genomics, https://doi.org/10.1007/s00438-017-1396-z, linha 11/2017) mapearam o mesmo locus Rf como Rf1 em linhagens restauradoras R3, R113, e L19 e estimaram seu efeito nas populações.

[007] No entanto, permanece a necessidade de identificar genes Rf adicionais e/ou alternativos que podem ser usados para desenvolver métodos melhorados para restauração da fertilidade citoplasmática de trigo T.

thimopheevii, incluindo pela combinação com outros genes Rf identificados. A presente invenção fornece uma contribuição ao divulgar um gene Rf a partir do locus Rf1 no cromossomo 1A.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] Em um exemplo de realização, a invenção provê uma molécula(s) de ácido nucleico (isolada ou modificada) que codifica(m) um alelo restaurador funcional do gene da fertilidade (Rf) para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, em que o alelo do gene restaurador funcional é um alelo funcional de um gene da proteína de repetição de pentatricopeptídeo (PPR) compreendido na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1. O gene restaurador funcional pode compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 a partir do nucleotídeo na posição 55 até o nucleotídeo na posição 2433; uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4; ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. O alelo do gene restaurador funcional pode codificar uma proteína PPR capaz de se ligar ao mRNA de ORF256, de preferência a uma sequência de nucleotídeos compreendendo os nt 105 - 121 da SEQ ID NO: 2, embora a proteína PPR também possa ser capaz de interagir com outros sítios em orf256, ou com outros transcritos ou peptídeos mitocondriais e/ou organelares, e pode ser obtido a partir do número de acesso USDA: PI 583676. A sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 também pode ser transcrita em um nível pelo menos 2 vezes maior, ou pelo menos 5 vezes maior ou pelo menos 10 vezes maior nas linhagens de trigo com um restaurador Rf1 funcional, do que em linhagens não Rf1, embora na maioria dos casos a diferença observada consiste na detecção significativa da transcrição em linhagens de trigo com um restaurador Rf1 funcional e nenhuma transcrição detectável em linhagens não Rf1.

[009] Em outro exemplo de realização da invenção, um polipeptídeo (isolado ou modificado) é fornecido codificado pelas moléculas de ácido nucleico descritas na presente invenção, ou compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, de preferência ao longo de todo o comprimento do polipeptídeo.

[010] Ainda em outro exemplo de realização da invenção, um gene quimérico é fornecido compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados (a) um promotor expressável em planta; (b) um ácido nucleico que compreende a molécula de ácido nucleico descrita na presente invenção ou que codifica o polipeptídeo descrito na presente invenção; e opcionalmente (c) uma região de terminação de transcrição e de poliadenilação funcional em células vegetais, em que pelo menos um dos elementos operacionalmente ligados é heterólogo em relação ao outro elemento, ou contém uma sequência modificada. Assim, o promotor expressável em planta (a) pode ser heterólogo em relação ao ácido nucleico que codifica o polipeptídeo descrito na presente invenção (b) ou pode ser heterólogo em relação ao terminador da transcrição e região de poliadenilação (c), quando o último está presente, ou o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo descrito na presente invenção (b) pode ser heterólogo em relação ao terminador da transcrição e à região de poliadenilação (c), quando a última está presente. O promotor expressável em planta pode ser capaz de direcionar a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado pelo menos durante o desenvolvimento (precoce) do pólen e meiose, tal como em anteras ou, mais especificamente, no tapetum ou micrósporos em desenvolvimento.

[011] A invenção fornece ainda células vegetais de cereais ou plantas de cereais ou sementes das mesmas, tais como células de plantas de trigo ou plantas ou sementes das mesmas, compreendendo as moléculas de ácido nucleico ou os polipeptídeos ou os genes quiméricos descritos na presente invenção, de preferência em que o polipeptídeo, ácido nucleico ou o gene quimérico em cada caso é heterólogo em relação à célula vegetal ou planta ou semente.

[012] Em outro exemplo de realização, também é fornecido um método para produzir uma célula vegetal de cereal ou planta ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta ou semente da mesma, que compreende um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo as etapas de prover a referida célula vegetal ou planta com as moléculas de ácido nucleico ou os genes quiméricos descritos na presente invenção, sendo compreendido que a referida etapa de prover compreende a transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese. As moléculas de ácido nucleico ou os genes quiméricos podem ser transcritos pelo menos 2 vezes mais.

[013] A invenção provê ainda um método para a produção de uma célula vegetal de cereal ou planta ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta ou semente desta, com capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou um método para aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo as etapas de fornecimento ou expressão ou aumento da expressão de um ou mais polipeptídeos descritos na presente invenção na célula vegetal ou planta ou semente. O polipeptídeo Rf- PPR pode ser fornecido pela modificação do genoma da planta para compreender a molécula de ácido nucleico ou o gene quimérico descrito na presente invenção, em que a etapa de modificação inclui transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese. É fornecido ainda no presente documento um ácido nucleico modificado que codifica uma proteína Rf-PPR, tal como uma proteína Rf1-PPR-09 (modificada ou isolada), em que o referido ácido nucleico é modificado por edição do genoma ou mutagênese (por exemplo, mutagênese EMS).

[014] Também é fornecido um método para converter uma planta de cereal não restauradora, como uma planta de trigo, em uma planta restauradora para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo a etapa de modificar o genoma da planta para compreender a molécula de ácido nucleico ou o gene quimérico aqui descrito, em que a etapa de modificação compreende a modificação por transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese.

[015] Em outro exemplo de realização, é fornecido um método para converter uma planta de cereal não restauradora, como uma planta de trigo, em uma planta restauradora para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração da esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, que compreende as etapas de modificação do genoma da planta para aumentar a expressão de um polipeptídeo como descrito na presente invenção na planta.

[016] A invenção fornece ainda células vegetais de cereais ou plantas de cereais ou sementes das mesmas, tais como células da planta do trigo ou plantas ou sementes das mesmas, obtidas de acordo com os métodos aqui descritos, de preferência em que a planta tem uma capacidade de restauração aumentada para a esterilidade masculina citoplasmática ("CMS") tipo G de trigo, de preferência em que o polipeptídeo Rf-PPR descrito é expresso pelo menos durante o desenvolvimento (precoce) do pólen e meiose, tal como na antera ou, mais especificamente, no tapetum ou micrósporos em desenvolvimento. A célula vegetal, planta ou semente pode ser uma célula vegetal, planta ou semente híbrida. Em um exemplo de realização, tal planta tem um ácido nucleico e/ou proteína Rf1_PPR_09 modificada que resulta na restauração de CMS tipo G melhorada em um cereal, como o trigo, em comparação com a restauração obtida com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ou 4 ou sequência de proteína de SEQ ID NO: 5 na referida planta.

[017] Ainda em outro exemplo de realização da invenção, é fornecido um método para selecionar uma planta de cereal compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo ou para a produção de uma planta de cereal compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, compreendendo as etapas de (a) identificar a presença, expressão ou transcrição, tal como por análise de transcrição, de uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição de nucleotídeo 55 a posição de nucleotídeo 2433; e, opcionalmente, selecionar a planta compreendendo, expressando ou transcrevendo a sequência de nucleotídeos.

[018] A invenção também fornece um método para restaurar a fertilidade em uma progênie de uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G ou para a produção de uma progênie vegetal fértil a partir de uma planta progenitora de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, compreendendo as etapas de (a) fornecer uma população de plantas descendentes obtidas a partir do cruzamento de uma planta progenitora de cereal fêmea com uma planta progenitora de cereal masculina, em que a planta parental fêmea é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G e em que a planta parental masculina compreende um alelo do gene restaurador funcional para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo ou transcrevendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (parcialmente) ou SEQ ID NO: 4; (b) identificar na população uma progênie vegetal fértil compreendendo ou expressando ou transcrevendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (parcialmente) ou SEQ ID NO: 4; e opcionalmente (c) selecionar a progênie vegetal fértil; e opcionalmente (d) propagação da planta de progênie fértil.

[019] Como outro exemplo de realização da invenção, é fornecido um método para identificar e/ou selecionar uma planta de cereal (por exemplo, trigo) compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo as etapas de (a) identificação ou detecção na planta da presença, expressão ou transcrição de um ácido nucleico ou do polipeptídeo PPR ou de genes quiméricos como aqueles fornecidos na presente invenção e, opcionalmente, selecionar a planta compreendendo, expressando ou transcrevendo o ácido nucleico ou polipeptídeo ou gene quimérico.

[020] Também é um objetivo da invenção fornecer um método para a produção de uma planta de cereal, como uma planta de trigo, compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, compreendendo as etapas de (a) cruzar uma primeira planta de cereal aqui descrita ou fornecida com uma segunda planta de cereal; e (b1) identificar uma progênie vegetal compreendendo, expressando ou transcrevendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4; ou (b2) identificar e selecionar uma progênie vegetal compreendendo, expressando ou transcrevendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4.

[021] É outro objetivo da invenção fornecer um método para a produção de semente híbrida, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma planta parental de cereal masculina, tal como uma planta de trigo como fornecida na presente invenção, em que a planta compreende ou expressa o alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, em que o alelo de gene restaurador funcional está preferencialmente presente na forma homozigótica; (b) fornecer uma planta progenitora de cereal fêmea que é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, e (c) cruzar a planta parental de cereal fêmea com uma planta parental de cereal masculina; ou (a) fornecer uma planta parental de cereal masculina, tal como uma planta de trigo como fornecida na presente invenção, cuja planta compreende ou expressa o alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, em que o alelo de gene restaurador funcional está preferencialmente presente na forma homozigótica; (b) fornecer uma planta parental de cereal fêmea que é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G; (c) cruzar a planta parental de cereal fêmea com a planta parental de cereal masculino; e (d) colher as sementes.

[022] A invenção também provê o uso do ácido nucleico aqui descrito para identificar um ou mais alelos de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo.

[023] Além disso, são fornecidos usos de ácidos nucleicos, polipeptídeos ou genes quiméricos como aqueles aqui descritos para a identificação de uma planta compreendendo e/ou expressando um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G.

[024] As plantas que compreendem e/ou expressam o gene restaurador funcional para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, conforme descrito no presente, podem ser utilizadas para restaurar a fertilidade em uma progênie de uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, tal como uma planta de trigo e/ou para produzir sementes híbridas ou uma população de plantas de cereais híbridas, como sementes ou plantas de trigo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[025] Figura 1: (A) - Estrutura do gene predita para o gene Rf1- PPR-09 identificado. @ indica CDS, # indica 5’ UTR, e * indica 3’ UTR (B) do gene Rf1-PPR-09 identificado indicando o peptídeo de trânsito (itálico) e os motivos PPR (alternadamente sublinhados e não sublinhados) incluindo o 5º e 35º aminoácido implicados no reconhecimento de RNA (negrito). (C) Representação gráfica da estrutura do polipeptídeo Rf1-PPR-09 com motivos PPR.

[026] Figura 2: Níveis médios de expressão relativa do gene Rf1- PPR-09 através de 6 pares NIL contrastantes, cada um com/sem o locus Rf1, bem como em uma linhagem de controle que não contém o locus Rf1 e linhagem doadora de Rf1. A progênie contendo Rf1 foi identificada após a genotipagem KASP com marcadores de mapeamento fino e fenotipada para confirmar a restauração da fertilidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[027] A presente invenção descreve a identificação de um gene restaurador funcional (Rf) para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo (isto é, citoplasma de T. timopheevii) localizado no cromossomo 1B (braço curto 1AS), assim como métodos para detectar o gene Rf. Esses métodos podem ser usados na seleção assistida por marcadores (MAS) de plantas de cereal, como o trigo, que compreendem os referidos genes funcionais restauradores localizados nos cromossomos 1A. A identificação dos genes e marcadores é, portanto, extremamente útil em métodos para produção de sementes híbridas, visto que eles podem ser usados, por exemplo, em um método para restaurar a fertilidade na progênie de uma planta que possui esterilidade masculina citoplasmática tipo G, produzindo, assim, progênies férteis a partir de uma planta parental com esterilidade masculina citoplasmática tipo G. Da mesma forma, a presente descrição também permite identificar plantas sem o alelo desejado, de modo que as plantas não restauradoras possam ser identificadas e, por exemplo, eliminadas dos cruzamentos subsequentes. A identificação de um gene restaurador subjacente ao locus Rf1 no cromossomo 1AS permite ainda a manipulação direcionada para, por exemplo, aumentar sua expressão, ou aumentar a atividade, ou combinação direcionada do gene subjacente ao locus Rf1 com outros loci ou genes restauradores.

[028] Outro uso do conhecimento do gene subjacente ao locus Rf1 no melhoramento de plantas é auxiliar na recuperação do genótipo original recorrente pela reprodução por retrocruzamento. A reprodução com retrocruzamento é o processo de cruzar uma progênie de volta com um de seus pais. O retrocruzamento é normalmente feito com o propósito de realizar introgressão de um ou alguns loci de um doador parental em um fundo genético de outro modo desejável a partir da planta parental recorrente. Quanto mais ciclos de retrocruzamento são feitos, maior é a contribuição genética da planta parental recorrente à variedade resultante. Isso é muitas vezes necessário, porque as plantas parentais doadoras podem ser de outra forma indesejáveis, ou seja, devido ao baixo rendimento, à baixa fecundidade ou similares. Em contrapartida, as variedades que resultam de programas de melhoramento intensivos podem ter excelente rendimento, fecundidade ou similares, sendo meramente deficientes em uma característica desejada, tal como restauração da fertilidade. Como um versado na técnica entende, o retrocruzamento pode ser feito para selecionar a favor ou contra uma característica/traço. Por exemplo, na presente invenção, pode-se selecionar um gene restaurador para criação de uma linhagem restauradora ou pode-se selecionar contra um gene restaurador para criação de uma linhagem mantenedora (pool feminino).

[029] O locus Rf no cromossomo 1A foi mapeado até um segmento ao longo do cromossomo 1A, em um intervalo de cerca de 15,6 cM.

O mapeamento fino adicional estreitou a região 1A para um intervalo de cerca de 1,9 cM (de 30,9 a 32,8 cM ao longo do cromossomo 1A) (consulte o pedido PCT publicado WO2017/158126 - integralmente incorporado ao presente documento por referência).

[030] A esterilidade masculina em conexão com a presente invenção refere-se ao fracasso ou fracasso parcial das plantas em produzir pólen funcional ou gametas masculinos. Isso pode ser devido a predisposições genéticas naturais ou introduzidas artificialmente ou pode ser devido à intervenção humana sobre a planta no campo. As plantas masculinas férteis, por outro lado, são plantas capazes de produzir pólen funcional normal e gametas masculinos, preferencialmente em níveis normais A esterilidade/fertilidade masculina pode ser refletida no desenvolvimento de semente mediante autopolinização, por exemplo, ensacando as panículas (cabeças) para induzir a autofertilização. Da mesma forma, a restauração de fertilidade também pode ser descrita em termos de conjunto de semente mediante o cruzamento de uma planta masculina estéril com uma planta que carrega um gene restaurador funcional, em comparação a um conjunto de sementes resultante do cruzamento (ou autocruzamento) de plantas totalmente férteis. A falha parcial na produção de pólen ou gametas masculinos refere-se preferencialmente a plantas que produzem menos de 20%, menos de 15% ou menos de 10% de sementes férteis após autofecundação, ou mesmo menos de 5%.

[031] Um progenitor/planta parental masculino ou pólen parental é uma planta parental que provê os gametas masculinos (pólen) para fertilização, enquanto uma planta parental feminina ou semente parental é a planta que provê os gametas femininos para fertilização, sendo a referida planta feminina que carrega as sementes.

[032] Esterilidade masculina citoplasmática “CMS” refere-se à esterilidade masculina com base citoplasmática e maternalmente herdada. A CMS é a esterilidade masculina total ou parcial nas plantas como resultado de interações mitocondriais e nucleares específicas e é herdada maternalmente através do citoplasma. A esterilidade masculina é o fracasso ou fracasso parcial de plantas em produzir anteras funcionais, pólen, ou gametas masculinos embora plantas CMS ainda produzam gametas femininos viáveis. A falha parcial na produção de pólen ou gametas masculinos refere-se preferencialmente a plantas que produzem menos de 20%, menos de 15% ou menos de 10% de sementes férteis após autofecundação, ou mesmo menos de 5%. A esterilidade masculina citoplasmática é usada na agricultura para facilitar a produção de semente híbrida. A esterilidade masculina citoplasmática é causada por uma ou mais mutações no genoma mitocondrial (denominada “citoplasma estéril”) e é herdada como um traço dominante transmitido maternalmente. Para a esterilidade masculina citoplasmática ser usada na produção de semente híbrida, a semente parental deve conter um citoplasma estéril e o pólen parental deve conter genes restauradores (nucleares) (genes

Rf) para restaurar a fertilidade de plantas híbridas cultivadas a partir de sementes híbridas. Consequentemente, tais genes Rf, preferivelmente, são ao menos parcialmente dominantes, mais preferivelmente dominantes, a fim de ter capacidade de restauração suficiente nas plantas descendentes.

[033] “Esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao citoplasma de Triticum timopheevii que pode conferir esterilidade masculina introduzida no trigo comum (ou seja, Triticum aestivum), resultando assim em uma planta que carrega genes nucleares do trigo comum, mas citoplasma de Triticum timopheevii que tem esterilidade masculina. O citoplasma de Triticum timopheevii (tipo G) como indutores de esterilidade masculina no trigo comum foi estudado extensivamente (Wilson e Ross, 1962, supra; Kaul, Male sterility in higher plants. Springer Verlag, Berlin.1988; Lucken, Hybrid wheat. Em: Wheat and wheat improvement. Editado por E.G. Heyne. American Society of Agronomy, Madison, Wis, 1987; Mukai e Tsunewaki, Theor. Appl. Genet. 54, 153-60, 1979; Tsunewaki, Jpn. Soc. Prom. Sci. (Tóquio), 49-101, 1980 (Em: Tsunewaki K. (ed.) Genetic diversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops; Tsunewaki et al., Genes Genet. Syst. 71, 293-311, 1996). A origem do fenótipo CMS conferido pelo citoplasma de T.timopheevii é a expressão de um novo gene quimérico/transcrito chamado orf256, que está localizado a montante de sequências cox1 e é cotranscrito com um gene cox1 aparentemente normal.

Antissoros preparados contra sequências de polipeptídeos previstas a partir de orf256 reconheceram uma proteína de 7 kDa presente na linhagem CMS, mas não nas linhagens parentais ou restauradas (Song e Hedgcoth, Genome 37(2), 1994; Hedgcoth et al., Curr. Genet. 41, 357–365, 2002).

[034] Conforme usado no presente pedido “um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo” ou “um locus restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo” ou um “QTL restaurador para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo” indica um alelo que tem a capacidade de restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G, isto é, uma linhagem que carrega genes nucleares de trigo comum, mas citoplasma de Triticum timopheevii. A restauração contra citoplasma tipo G foi descrita, por exemplo, por Robertson e Curtis (Crop Sci. 7, 493–495, 1967), Yen et al. (Can. J. Genet.

Cytol. 11, 531-546, 1969), Bahl e Maan (Crop Sci. 13, 317-320, 1973), Talaat et al. (Egypt. J. Genet. 2, 195–205, 1973) Zhang et al., (2003, supra) Ma e Sorrels (1995, supra), Kojima (1997, supra), Ahmed et al. (2001, supra), , Zhou et al.

(2005, supra). Tais genes ou alelos restauradores são referidos também como genes Rf e alelos Rf. Conforme descrito pelo menos nos exemplos, o gene restaurador aqui descrito também é mais altamente expresso, particularmente em espículas em desenvolvimento, em linhagens de trigo identificadas como compreendendo o locus Rf1 quando comparadas às linhagens de trigo que foram identificadas como não compreendendo o locus Rf1 ou em comparação com linhagens de trigo não restauradoras. O nível de expressão médio relativo do gene restaurador em linhagens de trigo identificadas como compreendendo o locus restaurador Rf1 em comparação com o nível de expressão médio relativo do gene restaurador em linhagens de trigo identificadas como não compreendendo o locus Rf1 restaurador (particularmente nível de expressão médio relativo em espículas em desenvolvimento) varia em um nível de expressão cerca de 2 vezes a pelo menos cerca de 25 vezes maior, tal como entre 7 vezes e 12 vezes maior. Normalmente, a proporção é cerca de 10 vezes maior. Espera-se que os níveis de proteína codificados pelo gene Rf1 também sejam aumentados nas linhagens de trigo identificadas como compreendendo o locus Rf1 restaurador em comparação com as linhagens de trigo identificadas como não compreendendo os locus Rf1 restaurador e podem igualmente ter níveis pelo menos 2 vezes maiores, ou variando entre cerca de 2 vezes a pelo menos cerca de 25 vezes maiores, tal como níveis entre 7 vezes e 12 vezes maiores.

[035] O termo “mantenedor” refere-se a uma planta que quando cruzada com a planta CMS não restaura a fertilidade, e mantém esterilidade na progênie. A linhagem mantenedora é usada para propagar a linhagem CMS, e pode ser referida também como uma linhagem não restauradora. Linhagens mantenedoras têm os mesmos genes nucleares que as linhagens CMS (isto é, não contém genes Rf funcionais), mas diferem na composição de fatores citoplásmicos que causam esterilidade masculina nas plantas, isto é, mantenedores têm citoplasma “fértil”. Portanto, quando uma linhagem estéril masculina é cruzada com sua progênie mantenedora o mesmo genótipo estéril masculino será obtido.

[036] O termo “cereal” refere-se a membros das monocotiledôneas da família Poaceae que são cultivados para os componentes comestíveis de seus grãos. Estes grãos são compostos de endosperma, germe e farelo. Milho, trigo e arroz juntos são responsáveis por mais de 80% da produção mundial de grãos. Outros membros da família de cereais compreendem centeio, aveia, cevada, triticale, sorgo, arroz selvagem, espelta, einkorn, emmer, trigo duro e kamut. Uma “planta de cereal fêmea” ou “planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática” é uma planta de cereal que compreende citoplasma que causa esterilidade masculina, como descrito no presente.

[037] Em um exemplo de realização, a planta de cereal de acordo com a invenção é uma planta de cereal que compreende pelo menos um genoma A ou genoma relacionado, tal como trigo (T. aestivum; ABD), espelta (T. spelta; ABD), duro (T. turgidum; AB), cevada (Hordeum vulgare; H) e centeio (Secale cereale; R). Em um exemplo de realização específico, a planta de cereal de acordo com a invenção é trigo (Triticum aestivum; ABD).

[038] Um ensaio particularmente útil para detecção de marcadores de SNP é, por exemplo, PCR Competitiva Alelo-Específica da KBioscience (KASP, vide www.kpbioscience.co.uk). Para desenvolver o ensaio KASP com os 70 pares de base e os 70 pares de base a montante e a jusante, respectivamente, do SNP são selecionados e dois iniciadores diretos alelo- específicos e um iniciador reverso alelo-específico é projetado. Vide, por exemplo, Allen et al. 2011, Plant Biotechnology J. 9, 1086-1099, especialmente as páginas 1097-1098 para método do ensaio KASP.

[039] A posição dos segmentos de cromossômicos identificados, e os marcadores dos mesmos, quando expressos como frequências de recombinação ou unidades de mapas, são providos no presente como uma matéria de informação geral. Os exemplos de realização aqui descritos foram obtidos usando populações de trigo particulares. Consequentemente, as posições de segmentos e marcadores particulares como unidade de mapas são expressas com referência às populações utilizadas. Espera-se que os números dados para segmentos e marcadores particulares como unidades de mapa possam variar de cultivar para cultivar e não são parte da definição essencial dos segmentos e marcadores de DNA, cujos segmentos e marcadores de DNA são diferentemente descritos, por exemplo, pela sequência de nucleotídeos.

[040] Um locus (plural loci), como usado no presente documento, refere-se a uma determinada localização ou posição no genoma, por exemplo, em um cromossomo ou braço de cromossomo, em que, por exemplo, um gene ou marcador genético é encontrado. Um QTL (locus de traço quantitativo), como usado no presente, refere-se a uma posição no genoma que corresponde a uma característica mensurável, ou seja, uma característica, como os loci Rf descritos no presente.

[041] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “alelo(s)”, tal como de um gene, significa qualquer uma ou mais formas alternativas de um gene em um locus particular. Em uma célula diploide de um organismo, os alelos de um determinado gene são localizados em um local ou locus (loci no plural) específico em um cromossomo. Um alelo está presente em cada cromossomo do par de cromossomos homólogos ou possivelmente em cromossomos homeólogos.

[042] Conforme utilizado na presente invenção, a expressão “cromossomos homólogos” significa cromossomos que contêm informações para os mesmos aspectos biológicos e contêm os mesmos genes nos mesmos loci, mas possivelmente alelos diferentes desses genes. Os cromossomos homólogos são cromossomos que se pareiam durante a meiose. Os “cromossomos não homólogos”, que representam todos os aspectos biológicos de um organismo, formam um conjunto, e a quantidade de conjuntos em uma célula é denominada de ploidia. Os organismos diploides contêm dois conjuntos de cromossomos não homólogos, em que cada cromossomo homólogo é herdado de um pai diferente. Em espécies tetraploides, existem dois conjuntos de genomas diploides, de modo que os cromossomos dos dois genomas são referidos como “cromossomos homeólogos” (e similarmente os loci ou genes dos dois genomas são referidos como loci ou genes homeólogos). Da mesma forma, espécies hexaploides têm três conjuntos de genomas diploides, etc. Uma espécie de planta diploide, tetraploide ou hexaploide pode compreender uma grande quantidade de alelos diferentes em um locus particular. Os níveis de ploidia de espécies de trigo domesticadas variam de diploide (Triticum monococcum, 2n = 14, AA), tetraploide (T.

turgidum, 2n = 28, AABB) até hexaploide (T. aestivum, 2n = 42, AABBDD).

[043] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “heterozigótico(a)” significa uma condição genética existente quando dois alelos diferentes residem em um locus específico, mas são posicionados individualmente em pares correspondentes de cromossomos homólogos na célula. Inversamente, como usado aqui, o termo “homozigótico(a)” significa uma condição genética existente quando dois alelos idênticos residem em um locus específico, mas são posicionados individualmente em pares correspondentes de cromossomos homólogos na célula.

[044] Um alelo de um gene ou locus particular pode ter uma penetrância particular, isto é, pode ser dominante, parcialmente dominante, codominante, parcialmente recessivo ou recessivo. Um alelo dominante é uma variante de um locus ou gene particular que, quando presente na forma heterozigótica em um organismo, resulta no mesmo fenótipo que quando presente na forma homozigótica. Um alelo recessivo, por outro lado, é uma variante de um alelo sobre a qual, na forma heterozigótica, o alelo dominante prevalece, resultando, assim, no fenótipo conferido pelo alelo dominante, enquanto que somente na forma homozigótica leva ao fenótipo recessivo. As expressões parcialmente dominante, codominante ou parcialmente recessivo referem-se à situação em que o heterozigoto exibe um fenótipo que é intermediário entre o fenótipo de um organismo homozigótico para o alelo e um organismo homozigótico para o outro alelo de um locus ou gene particular.

Esse fenótipo intermediário é uma demonstração de dominância ou penetrância parcial ou incompleta. Quando a dominância parcial ocorre, uma variedade de fenótipos é normalmente observada na prole. O mesmo se aplica aos alelos parcialmente recessivos.

[045] Um “contig”, como usado no presente, refere-se a um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos que juntos representam uma região de consenso de DNA. Em projetos de sequenciamento bottom-up, um contig refere-se a dados de sequência sobrepostos (leituras); em projetos de sequenciamento top-down, contig refere-se aos clones sobrepostos que formam um mapa físico do genoma que é usado para guiar o sequenciamento e montagem. Os contigs podem, assim, se referir tanto a sequência de DNA sobreposta como a segmentos físicos sobrepostos (fragmentos) contidos nos clones dependendo do contexto.

[046] Em outro exemplo de realização, o referido alelo de gene restaurador funcional é um alelo funcional de um gene que codifica uma proteína de repetição pentatricopeptídica (PPR) (ou seja, um gene PPR) que se localiza dentro da região genômica descrita no documento WO2017/158126.

[047] As proteínas PPR são classificadas com base em sua arquitetura de domínio. As proteínas PPR de classe P possuem vários motivos de aminoácidos canônicos, normalmente consistindo em 35 resíduos de aminoácidos, embora os motivos possam variar entre 34 e 36 ou mesmo 38 aminoácidos. As proteínas PPR podem conter um peptídeo de direcionamento mitocondrial, mas normalmente não possuem domínios adicionais. Os membros desta classe têm funções na maioria dos aspectos da expressão do gene de organela. As proteínas PPR da classe PLS têm três tipos diferentes de motivos PPR, que variam no comprimento; P (35 aminoácidos), L (longa, 35–36 aminoácidos) e S (curta, ∼31 aminoácidos), e os membros dessa classe são considerados como funcionando principalmente na edição de RNA. Os subtipos da classe PLS são categorizados com base nos domínios C- terminais adicionais que possuem (revisto por Manna et al., 2015, Biochimie 113, p93-99, incorporado ao presente por referência).

[048] A maioria dos genes de restauração de fertilidade (Rf) vem de um pequeno clado de genes codificando proteínas de repetição de pentatricopeptídeo (PPR) (Fuji et al., 2011, PNAS 108(4), 1723-1728 - incorporado ao presente por referência). Genes PPR que funcionam como genes de restauração de fertilidade (Rf) são referidos em Fuji (supra) como genes Rf-PPR. Eles são compreendidos primeiramente de arranjos em tandem de 15-20 motivos PPR, cada composto de 35 aminoácidos.

[049] A maioria dos genes Rf-PPR pertencem a subfamília Rf- PPR classe-P, embora genes Rf-PPR da classe PLS também tenham sido identificados. Altas taxas de substituição observadas para aminoácidos particulares dentro de, diferentemente motivos PPR muito conservados, indicando seleção diversificada, levaram à conclusão de que estes resíduos podem estar diretamente envolvidos na ligação a alvos de RNA. Isso levou a proposição de um “código PPR” que permite a previsão de alvos de RNA de proteínas PPR que ocorrem naturalmente assim como a projeção de proteínas PPR sintéticas que podem ligar-se a moléculas de RNA de interesse, de modo que a especificidade de sequência é garantida por padrões distintos de ligação de hidrogênio entre cada base de RNA e as cadeias laterais de aminoácido nas posições 5 e 35 no motivo PPR alinhado (vide, por exemplo, Melonek et al., 2016, Nat Sci Report 6:35152, Barkan et al., 2012, PLoS Genet 8(8): e1002910; Barkan e Small 2014, Annu. Rev. Plant Biol. 65:415–442 (https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-040159); Miranda, McDermott, e Barkan 2017, Nucleic Acids Res. 46, 2613–2623 (https://doi.org/10.1093/nar/gkx1288); Shen et al. 2016, Nat. Commun. 7, 11285 (https://doi.org/10.1038/ncomms11285); e particularmente, Yagi Y, Hayashi S, Kobayashi K, Hirayama T, Nakamura T (2013) Elucidation of the RNA Recognition Code for Pentatricopeptide Repeat Proteins Involved in Organelle RNA Editing in Plants. PLoS ONE 8(3): e57286.

doi:10.1371/journal.pone.0057286, todos incorporados ao presente pela referência).

[050] Consequentemente, um alelo funcional e um gene PPR, como usado na presente invenção, refere-se a um alelo de um gene PPR que é um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo como descrito no presente, isto é, que quando expressado em uma planta de cereal (sexualmente compatível) tem a capacidade de restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G. Tal alelo funcional de um gene Rf-PPR é referido também como um gene PPR-Rf (ou gene Rf-PPR), que por sua vez codifica uma proteína PPR-Rf (ou Rf-PPR).

[051] Embora não se pretenda limitar a invenção a um modo de ação específico, acredita-se que um alelo de gene restaurador funcional codifica um polipeptídeo, como uma proteína PPR que tem a capacidade de se ligar (especificamente) ao transcrito orf256 mitocondrial (SEQ ID NO: 2) responsável pelo fenótipo CMS. Ao eliminar ou interferir de outra forma com o mRNA orf256, o fenótipo CMS pode ser revertido. Conforme utilizado na presente invenção, “ligar-se a” ou “ligar-se especificamente a” ou “reconhecer (especificamente)” significa que, de acordo com o código PPR descrito acima, a proteína PPR contém uma série de motivos PPR com resíduos específicos nas posições 5 e 35 e que são ordenados de forma a serem capazes de se ligar a um mRNA alvo, tal como o mRNA orf256, de uma maneira específica para a sequência (sequência-específica) ou preferencial para a sequência.

[052] Alternativamente, o alelo de gene restaurador funcional pode codificar um polipeptídeo, como uma proteína PPR que tem a capacidade de se ligar (especificamente) a outros mRNAs mitocondriais ou mRNAs quiméricos responsáveis pela letalidade do pólen e fenótipo CMS. O alelo de gene restaurador funcional também pode codificar um polipeptídeo, como uma proteína PPR que tem a capacidade de ligar-se (especificamente) a vários mRNAs mitocondriais, influenciando a transcrição, etc. Por outro modo de ação alternativo, o alelo de gene restaurador funcional pode codificar um polipeptídeo, como uma proteína PPR que é capaz de formar um complexo com proteínas de interação adicionais, como uma proteína rica em glicina (GRP), uma hexoquinase ou DUF-WD40, para direcionar a quebra ou clivagem de mRNAs orf256 e/ou de outros mRNAs mitocondrial citotóxicos ou plastídicos, ou para inibir a sua transcrição, ou para inibir a tradução dos peptídeos quiméricos citotóxicos responsáveis pelo fenótipo CMS.

[053] Por exemplo, o alelo de gene restaurador funcional pode codificar uma proteína PPR contendo motivos PPR com resíduos específicos nas posições 5 e 35, de modo a reconhecer uma sequência alvo com mRNA orf256. Em um exemplo, a sequência de reconhecimento prevista de Rf1-PPR- 09 descrita na presente invenção pode ser definida por uma matriz de probabilidade (conforme descrito em Yagi et al., 2013, supra) e verificou-se ser 5’- ATTTGTCTATTTTTCT -3’ (SEQ ID NO: 3). Tal sequência localiza-se a uma nucleotídeos 105 -121 a jusante do códon de iniciação ATG de SEQ ID NO: 2 (orf256 posição 192-207). Sem a intenção de limitar a invenção a um modo de ação específico, um possível mecanismo para o modo de ação da proteína Rf1-PPR-09 pode ser o bloqueio da tradução do transcrito orf256 citotóxico e o direcionamento da transcrição para a transcrição de coxI. Sabe-se que em linhagens de T. aestivum contendo CMS tipo G, há produção de transcritos de mRNA quiméricos longos que abrangem as sequências dos genes orf256 e cox1 em um único mRNA quimérico, levando à tradução de orf256 e, portanto, à produção da proteína ORF256 citotóxica. Em linhagens restauradas de T.

aestivum contendo CMS tipo G, então ainda há transcrição do RNA longo orf256 - coxI, mas não mais a tradução da proteína ORF256. Presume-se que a ligação de Rf1-PPR-09 ao seu sítio alvo impede a tradução do ORF256 no mRNA quimérico longo. (Rathburn HB, & Hedgcoth C, A chimeric open reading frame in the 5' flanking region of coxI mitochondrial DNA from cytoplasmic male-sterile wheat., Plant Mol Biol. maio de 1991;16(5):909-12.; Song J, & Hedgcoth C., Influence of nuclear background on transcription of a chimeric gene (orf256) and CoxI in fertile and cytoplasmic male sterile wheats. Genome.

abril de 1994; 37(2):203-9.; Song J & Hedgcoth C., A chimeric gene (orf256) is expressed as protein only in cytoplasmic male-sterile lines of wheat., Plant Mol Biol. outubro de 1994;26(1):535-9.; Hedgcoth C, el-Shehawi AM, Wei P, Clarkson M, Tamalis D., A chimeric open reading frame associated with cytoplasmic male sterility in alloplasmic wheat with Triticum timopheevii mitochondria is present in several Triticum and Aegilops species, barley, and rye. Curr Genet. agosto de 2002;41(5):357-65)).

[054] Além disso, as proteínas PPR podem trabalhar em conjunto com outras proteínas PPR, que podem ser codificadas por um gene no mesmo locus Rf e/ou por um gene localizado em qualquer um dos outros loci Rf, incluindo o locus Rf3 identificado no cromossomo 1B (descrito no documento WO2017/158127). Em um exemplo de realização, o gene Rf1_PPR_09 é usado em plantas de cereais, como plantas de trigo, em combinação com um ou mais dos loci Rf ou genes Rf selecionados a partir do grupo de Rf2, Rf3, Rf4, Rf5, Rf6, Rf7 e Rf8; tal como em combinação com Rf3 e Rf6, em combinação com Rf3 e Rf7, em combinação com Rf4 e Rf6, em combinação com Rf4 e Rf7, ou em combinação com Rf3 e Rf4. Em um exemplo de realização, tal combinação de loci Rf ou genes Rf com o gene Rf1_PPR-09 da invenção ocorre no mesmo locus no genoma do trigo (por exemplo, por translocação, transformação ou manipulação genética em um locus).

[055] Um gene restaurador funcional ou alelo pode, por exemplo, compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou codificar um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[056] Um alelo de gene restaurador funcional pode, por exemplo, codificar também uma proteína PPR, tendo uma ou mais mutações (inserção, deleção, substituição) que podem afetar o mRNA ou a estabilidade da proteína, por exemplo, uma mutação que aumenta o mRNA ou a estabilidade da proteína, resultando assim em uma expressão aumentada de proteína PPR, especialmente durante o desenvolvimento inicial do pólen e meiose, como na antera ou, mais especificamente, no tapetum ou micrósporos em desenvolvimento.

[057] Em um exemplo de realização, o alelo de gene restaurador funcional é um alelo funcional do gene Rf-PPR que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 desde a posição nucleotídica 55 até a posição nucleotídica 2433, ou SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 5. O alelo de gene restaurador funcional pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é substancialmente idêntica (conforme definido neste documento) à SEQ ID NO: 4, tal como tendo pelo menos 85%, 85,5%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 até a posição nucleotídica 2433. A porcentagem de identidade de sequência é preferencialmente calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433. O alelo de gene restaurador funcional também pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. A porcentagem de identidade de sequência é preferencialmente calculada ao longo de todo o comprimento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

[058] Em um exemplo de realização adicional, o referido alelo de gene restaurador funcional é um alelo de gene restaurador funcional como presente em (e como derivável de) ao menos o número de acesso PI 583676 (USDA National Small Grains Collection, também conhecido como Dekalb 582M e registrado como US PVP 7400045).

[059] A invenção descreve ainda um método para produzir uma planta de cereal (por exemplo, trigo) que compreende um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, compreendendo as etapas de; a. cruzar uma primeira planta de cereal que compreende um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A e possuindo uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5, com uma segunda planta; b. identificar (e opcionalmente selecionar) uma progênie vegetal compreendendo, ou compreendendo e transcrevendo, o alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizada no cromossomo 1A, identificando uma progênie vegetal compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5.

[060] Também é provido um método para produzir uma planta de cereal compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A, compreendendo as etapas de; a. cruzar uma primeira planta de cereal homozigótica para um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A e possuindo uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5, com uma segunda planta de cereal; b. obter uma progênie vegetal, em que a referida progênie compreende o alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A definido na etapa (a).

[061] A referida segunda planta de cereal pode ser uma planta não compreendendo um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A, incluindo uma planta de cereal que não transcreve ou expressa o gene restaurador identificado.

[062] Em um exemplo de realização adicional, a invenção provê um método para produzir sementes de cereal híbridas F1 ou plantas de cereal híbridas F1, compreendendo as etapas de: a. fornecer uma planta parental de cereal macho (por exemplo, trigo) que compreende, ou que compreende e expressa, um alelo de gene restaurador funcional para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A e tendo uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 desde a posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à

SEQ ID NO: 5; b. cruzar a referida planta parental macho com uma planta parental de cereal (por exemplo, trigo), em que a planta parental feminina é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G; e c. opcionalmente coletar sementes híbridas do referido cruzamento.

[063] As semente e plantas híbridas F1 compreendem preferivelmente pelo menos um alelo marcador ligado a um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A conforme aqui descrito, e as plantas F1 cultivadas a partir das sementes são, portanto, férteis. Preferivelmente, a planta parental masculina é homozigótica para o referido um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A.

[064] No método acima, a planta parental masculina usada para cruzamento pode ser selecionada ou identificada pela análise da presença, ou transcrição, ou expressão, de uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 para a posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5.

[065] A invenção também fornece plantas de cereais, tais como plantas de trigo, obtidas por qualquer um dos métodos acima, em que a referida planta de cereal compreende, expressa ou transcreve uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 para a posição nucleotídica 2433, ou um sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5.

[066] Tais plantas podem conter o alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo em um contexto genômico diferente, e podem, por exemplo, ser desprovidas da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 1 à posição 1000 e/ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 6467 à posição 7923, ou sendo desprovida de qualquer uma das seguintes sequências de nucleotídeos, ou combinações das mesmas: a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 1 à posição 500, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 1 à posição 1000, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 6467 à posição 7000, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 desde a posição 7000 à posição 7500 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição 7500 à posição 7923.

[067] Também são fornecidas partes de plantas, células vegetais e sementes de plantas de cereais de acordo com a invenção que compreendem ou que compreendem e expressam o alelo gênico funcional restaurador. As plantas, partes de plantas, células vegetais e sementes da invenção também podem ser plantas, partes de plantas, células vegetais ou sementes híbridas.

[068] Também é fornecido um método para determinar a presença ou ausência de um alelo de gene restaurador funcional para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizada no cromossomo 1A, ou seu estado de zigosidade, em uma amostra biológica de uma planta de cereal, compreendendo o fornecimento de DNA genômico da referida amostra biológica e a análise do referido DNA quanto à presença ou ausência ou estado de zigosidade de uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5.

[069] Também é fornecido um método para a identificação e/ou seleção de uma planta de cereal (por exemplo, trigo) compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo as etapas de: a. identificar ou detectar na referida planta a presença do ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5 ou o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5; b. e opcionalmente selecionar a referida planta compreendendo o referido ácido nucleico ou polipeptídeo.

[070] Igualmente, a identificação ou detecção pode envolver a obtenção de uma amostra biológica (por exemplo, proteína) ou DNA genômico e a determinação da presença do ácido nucleico ou polipeptídeo de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica, como hibridização, PCR, RT-PCR, Southern blotting, sequenciamento Southern, métodos de detecção SNP (por exemplo, como descrito na presente invenção), western blotting, ELISA e etc, por exemplo, com base nas sequências aqui fornecidas.

[071] A invenção provê também o uso da(s) sequência(s) do gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A para a identificação de pelo menos um marcador adicional compreendendo um alelo ligado ao referido gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A. Tais marcadores estão também geneticamente ligados ou intimamente ligados ao gene restaurador, e também estão dentro do escopo da invenção. Os marcadores podem ser identificados por qualquer uma de uma variedade de técnicas de mapeamento físico ou genético. Os métodos para determinar se marcadores estão geneticamente ligados a um gene restaurador são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, por exemplo, mapeamento de intervalo (Lander e Botstein, (1989) Genetics 121:185), mapeamento de regressão (Haley e Knott, (1992) Heredity 69:315) ou mapeamento MQM (Jansen, (1994) Genetics 138:871), mapeamento rMQM.

Além disso, tais técnicas de mapeamento físico como o passeio de cromossomo “chromossome walking”, mapeamento e montagem de contig, ressequenciamento de amplicons, sequenciamento de transcriptoma, captura e sequenciamento direcionados, sequenciamento de próxima geração e similares, podem ser empregadas para identificar e isolar sequências adicionais úteis como marcadores no contexto da presente invenção.

[072] A invenção fornece ainda o uso de uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 5, ou a utilização de um polipeptídeo substancialmente idêntico à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 para a identificação de uma planta compreendendo o referido gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo ou para a produção de semente híbrida.

[073] Também é fornecido o uso de uma planta obtida por qualquer um dos métodos aqui descritos e compreendendo pelo menos um alelo marcador ligado a um gene restaurador funcional para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo localizado no cromossomo 1A, conforme descrito no presente documento, para restaurar a fertilidade em uma progênie de planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, tal como uma planta de trigo, ou para a produção de uma população de plantas de cereal híbridas, tal como uma população de plantas de trigo.

[074] É fornecida ainda uma molécula de ácido nucleico recombinante, especialmente uma molécula de DNA recombinante, que compreende um gene restaurador funcional como descrito na presente invenção. Em um exemplo de realização, a molécula de DNA recombinante compreende um promotor que pode ser expresso em planta, de preferência um promotor de planta heterólogo, operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos com identidade substancial como a definida na presente invenção para uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, ou para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, ou que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. A molécula de DNA recombinante pode opcionalmente compreender uma terminação da transcrição e região de poliadenilação, de preferência funcional em células vegetais. Além disso, é fornecido um vetor de DNA compreendendo o DNA recombinante. A molécula de DNA recombinante ou vetor de DNA pode ser uma molécula de ácido nucleico isolada ou modificada.

O DNA que compreende o gene restaurador funcional pode estar em um micro- organismo, tal como em uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium ou E. coli).

[075] O termo “heterólogo” refere-se à relação entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou proteína que são derivadas de diferentes fontes. Por exemplo, um promotor é heterólogo em relação a uma sequência de ácido nucleico operacionalmente ligada, tal como uma sequência codificante, se essa combinação normalmente não for encontrada na natureza. Além disso, uma sequência específica pode ser “heteróloga” em relação a uma célula ou organismo na qual está inserida (ou seja, não ocorre naturalmente nessa célula ou organismo específico). Em um exemplo de realização, o termo “heterólogo”, tal como utilizado na presente invenção, quando se refere a um ácido nucleico ou proteína que ocorre em uma determinada espécie de planta, inclui também um ácido nucleico ou proteína cuja sequência foi modificada ou mutada em comparação com a sequência de ácido nucleico ou proteína previamente existente que ocorre nas referidas espécies de plantas. Portanto, após a deleção, adição ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ácido nucleico ou um ou mais aminoácidos em uma sequência de proteína que ocorre em uma planta de trigo (por exemplo, modificar um promotor nativo para incluir elementos reguladores que aumentam a transcrição, como um elemento potenciador, ou a modificação de um promotor nativo, por inativação ou remoção de certos elementos reguladores negativos, tais como elementos repressores ou sítios alvo para miRNAs ou lncRNAs), uma proteína ou ácido nucleico modificado também é considerado heterólogo em relação à planta de trigo ou às sequências funcionalmente ligadas.

[076] O alelo de gene restaurador funcional também pode codificar uma proteína PPR com uma mutação em um domínio α-helicoidal de um motivo PPR, como uma mutação que afeta a formação de grampo de cabelo entre duas das α-hélices que constituem um motivo PPR.

[077] O alelo de gene restaurador funcional também pode codificar uma proteína PPR com uma mutação que afeta a dimerização da proteína PPR. Verificou-se, por exemplo, que a proteína de “Montagem de Tilacoide 8” (THA8) é uma proteína de repetição de pentatricopeptídeo (PPR) de ligação ao RNA necessária para a junção da transcrição de ycf3, um gene envolvido na biogênese de membrana tilacoide do cloroplasto. A THA8 forma um dímero assimétrico uma vez ligado ao RNA de fita única, com o RNA ligado na interface de dímero. Essa formação do complexo dímero é mediada pelos motivos 1 e 2 PPR N-terminais e os motivos 4 e 5 C-terminais (Ke et al., 2013,

Nature Structural & Molecular Biology, 20,1377–1382).

[078] O alelo de gene restaurador funcional também pode codificar uma proteína PPR que, quando expressa, é direcionada para a mitocôndria ou outra organela. Isso pode ser conseguido, por exemplo, pela presença de uma sequência de direcionamento mitocondrial ou peptídeo de sinal mitocondrial (funcional em planta), ou peptídeo de trânsito mitocondrial.

Um sinal de direcionamento mitocondrial é um peptídeo de 10-70 aminoácidos de comprimento que direciona uma proteína recentemente sintetizada para as mitocôndrias, tipicamente encontrado no N-terminal. Os peptídeos de trânsito mitocondriais são ricos em aminoácidos positivamente carregados, mas normalmente não têm cargas negativas. Eles têm o potencial para formar α- hélices anfipáticas em ambientes não aquosos, tais como membranas. Os sinais de direcionamento mitocondrial podem conter sinais adicionais que dirigem subsequentemente a proteína a regiões diferentes das mitocôndrias, tais como a matriz mitocondrial. Assim como os peptídeos de sinal, os sinais de direcionamento mitocondrial são clivados uma vez que o direcionamento é concluído. Os peptídeos de trânsito mitocondrial são descritos, por exemplo, em Shewry e Gutteridge (1992, Plant Protein Engineering, 143-146, e referências aí citadas), Sjoling e Glaser (Trends Plant Sci Volume 3, Edição 4, 1 de abril de 1998, Pág. 136-140), Pfanner (2000, Current Biol, Volume 10, Edição 11, páginas R412-R415), Huang et al (2009, Plant Phys 150(3): 1272– 1285), Chen et al. (1996, PNAS, Vol. 93, páginas 11763-11768), Fujii et al.

(Plant J 2016, 86, 504–513). A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 da posição 1 à posição 48 é um exemplo dessa sequência de direcionamento mitocondrial.

[079] Em outro exemplo de realização, o referido alelo de gene restaurador funcional codificado pela referida molécula de ácido nucleico (isolada) pode ser obtido a partir do número de acesso USDA PI 583676.

[080] Também é fornecido um polipeptídeo (isolado ou modificado) codificado pela molécula de ácido nucleico como descrito acima, sendo o polipeptídeo uma proteína restauradora funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[081] O alelo de gene restaurador funcional também pode ser clonado e um gene quimérico pode ser produzido, por exemplo, ligando operacionalmente um promotor expressável em planta ao alelo de gene restaurador funcional e, opcionalmente, uma região final 3' envolvida na terminação da transcrição e poliadenilação funcional em plantas. Esse gene quimérico pode ser introduzido em uma célula vegetal e a célula vegetal pode ser regenerada em uma planta inteira para produzir uma planta transgênica.

Em um aspecto, a planta transgênica é uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, de acordo com qualquer método bem conhecido no estado da técnica.

[082] Assim, em um exemplo de realização particular, é fornecido um gene quimérico compreendendo uma molécula de ácido nucleico (isolada ou modificada) que codifica o alelo de gene restaurador funcional como descrito acima, operacionalmente ligado a um promotor expressável em planta heterólogo e, opcionalmente, uma terminação 3' e região de poliadenilação.

[083] O uso de tal molécula de ácido nucleico (isolada ou extraída ou modificada) e/ou de tal gene quimérico e/ou de tal fragmento de cromossomo para gerar células vegetais e plantas compreendendo um alelo de gene restaurador funcional é englobado pela presente invenção. Em um aspecto, ele pode ser usado para gerar células transgênicas de cereais (por exemplo, trigo), plantas e partes de plantas ou sementes compreendendo o alelo de gene restaurador funcional e a planta possuindo a capacidade de restaurar a fertilidade contra a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, conforme descrito acima.

[084] É fornecida uma célula hospedeira ou hospedeiro, tal como uma célula vegetal (de cereal) ou planta (de cereal) ou sua semente, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta de trigo ou sua semente, compreendendo a molécula de ácido nucleico (isolada ou modificada), polipeptídeo (isolado ou modificado), ou o gene quimérico como descrito acima, em que preferencialmente o referido polipeptídeo, o referido ácido nucleico ou o referido gene quimérico em cada caso é heterólogo em relação à referida célula vegetal ou planta ou semente, ou é modificado. A célula hospedeira também pode ser uma bactéria, como E.coli ou Agrobacterium sp. tal como o A. tumefaciens.

[085] Assim, também é fornecido um método para produzir uma célula vegetal de cereal ou planta ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta ou semente da mesma, compreendendo um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou um método para aumentar capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo as etapas de fornecer a referida célula vegetal ou planta com a molécula de ácido nucleico isolada ou modificada, ou o gene quimérico como descrito na presente invenção, em que o referido fornecimento compreende transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese. A capacidade de restauração, conforme utilizado na presente invenção, significa a capacidade de uma planta de restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática tipo G. Preferencialmente, a referida planta expressa ou tem expressão aumentada do polipeptídeo de acordo com a invenção. Preferencialmente, a referida expressão (aumentada) é pelo menos durante (as fases iniciais de) o desenvolvimento de pólen e meiose, como em anteras ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento (onde a referida planta não expressou ou expressou em menor extensão o polipeptídeo antes da etapa de fornecimento).

[086] Assim, também é fornecido um método para a produção de uma célula vegetal de cereal ou planta ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta ou semente desta, com capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou um método para aumentar a capacidade de restauração para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo as etapas de aumento da expressão do polipeptídeo (isolado ou modificado) conforme descrito neste documento na referida célula vegetal ou planta ou semente. Preferencialmente, a referida expressão (aumentada) ocorre pelo menos durante (as fases iniciais de) o desenvolvimento de pólen e meiose, como em anteras ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento. Antes da etapa de expressão ou aumento da expressão, a referida planta não expressa ou expressa em menor extensão o polipeptídeo e/ou não tem ou tem em menor grau a capacidade de restabelecimento para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo. Em um exemplo de realização, a expressão do polipeptídeo como descrito na presente invenção está aumentada pela manipulação da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo restaurador, incluindo a modificação deliberada da sequência de nucleotídeos do gene que codifica o polipeptídeo restaurador, tal como o aumento do número de cópias do gene, inserção de modificações que aumentam a estabilidade do RNA transcrito a partir do gene ou do polipeptídeo expresso a partir do gene, modificações da região a montante/região promotora,

modificações da região de término da transcrição e região de poliadenilação, etc.

[087] O aumento na expressão pode ser feito provendo a planta com o fragmento de cromossomo (recombinante) ou molécula de ácido nucleico (isolada ou modificada) ou o gene quimérico como descrito aqui, de modo que o ácido nucleico que codifica o alelo de gene restaurador funcional está sob o controle de elementos regulatórios apropriados tal como um promotor dirigindo a expressão nos tecidos/células desejados, mas também provendo a planta com fatores de transcrição que, por exemplo, reconhecem (especificamente) a região do promotor e promovem transcrição, tais como efetores TAL, dCas (“dead” CAS), dCpf1 (“dead” Cpf1) etc, acoplados a acentuadores/intensificadores (enhancers) transcricionais.

[088] É descrito ainda um método para a conversão de uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, não tendo a capacidade de restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo (uma planta não restauradora) em uma planta que possui a capacidade de restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática tipo G (uma planta restauradora), compreendendo as etapas de modificação do genoma da referida planta para compreender (ou para compreender e expressar) a molécula de ácido nucleico (isolada ou modificada) ou o gene quimérico que codifica um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo conforme descrito na presente invenção, em que a referida modificação compreende transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição de genoma ou mutagênese. Preferencialmente, a referida planta expressa o polipeptídeo de acordo com a invenção, particularmente pelo menos durante (as fases iniciais de) desenvolvimento do pólen e meiose, tal como em anteras ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento. Antes da referida modificação, a referida planta não expressava ou expressava em menor grau o polipeptídeo e/ou não tinha ou tinha em menor grau a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo.

[089] Também é fornecido um método para converter uma planta de cereal não restauradora, como uma planta de trigo, em uma planta restauradora para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo as etapas de modificação do genoma da referida planta para aumentar a expressão de um polipeptídeo de acordo com a invenção na referida planta. Preferencialmente, a referida expressão (aumentada) ocorre pelo menos durante (as fases iniciais de) o desenvolvimento de pólen e meiose, como em anteras ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento. Antes da referida modificação, a referida planta não expressava ou expressava em menor grau o polipeptídeo e/ou não tinha ou tinha em menor grau a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo.

[090] A modificação do genoma para melhorar a expressão do polipeptídeo pode ser feita, por exemplo, pela modificação do promotor nativo para incluir elementos regulatórios que melhoram a transcrição, tal como um determinado elemento intensificador, mas também, pela inativação ou removendo determinados elementos regulatórios negativos, tais como elementos repressores ou sítios alvo para miRNAs ou lncRNAs. A região 5’ a montante de Rf1 incluindo o promotor está incluída na SEQ ID NO: 1 a montante do nucleotídeo 3616.

[091] Também é descrita uma célula vegetal ou planta, preferivelmente uma célula vegetal de cereal ou planta de cereal ou semente da mesma, tal como uma célula de planta de trigo ou planta ou semente da mesma, produzida de acordo com qualquer um dos métodos acima, preferivelmente em que a referida planta tem uma capacidade de restauração aumentada para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo em comparação com a referida planta antes da etapa de fornecimento ou da etapa de modificação. O uso de tal planta obtida de acordo com os métodos acima para restaurar a fertilidade na progênie de um cruzamento com uma planta com esterilidade masculina citoplasmática tipo G ou para produzir plantas híbridas ou sementes híbridas também é descrito. Tal célula vegetal, planta ou semente pode ser uma célula vegetal, planta ou semente híbrida.

[092] Edição do genoma, tal como usado na presente invenção, refere-se a modificação direcionada de DNA genômico usando enzimas sequência-específicas (tais como endonuclease, nicases, enzimas de conversão de base) e/ou ácidos nucleicos doadores (por exemplo, dsDNA, oligos) para introduzir as mudanças desejadas no DNA. As nucleases sequência-específicas que podem ser programadas para reconhecer sequências específicas de DNA incluem meganucleases (MGNs), nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras TAL (TALENs) e nucleases guiadas por RNA ou guiadas por DNA tais como Cas9, Cpf1, CasX, CasY, C2c1, C2c3, certos sistemas argonaut (vide, por exemplo, Osakabe e Osakabe, Plant Cell Physiol. 2015 Mar; 56(3):389-400; Ma et al., Mol Plant. 2016 Jul 6;9(7):961-74; Bortesie et al., Plant Biotech J, 2016, 14; Murovec et al., Plant Biotechnol J.

2017 Apr 1; Nakade et al., Bioengineered 8-3, 2017; Burstein et al., Nature 542, 37–241; Komor et al., Nature 533, 420–424, 2016; todos incorporados ao presente por referência). Os ácidos nucleicos doadores podem ser usados como um gabarito para reparar a quebra de DNA induzido por uma sequência específica de nuclease, mas também podem ser usados como tal para direcionamento de gene (sem indução de quebra de DNA) para introduzir a mudança desejada no DNA genômico.

[093] Consequentemente, usando estas tecnologias, plantas com falta de um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo (plantas não restauradoras) podem ser convertidas em plantas restauradoras fazendo as mudanças desejadas nos genes PPR existentes ou alternativamente para introduzir uma ou mais sequências que codificam proteínas Rf-PPR funcionais, por exemplo, conforme descrito na presente invenção, em uma localização genômica específica.

[094] A mutagênese como usada na presente invenção, refere-se a, por exemplo, mutagênese EMS ou mutagênese induzida por radiação e similares.

[095] Assim, células de cereal transgênicas, por exemplo, células de trigo transgênicas compreendendo em seu genoma um fragmento de cromossomo recombinante conforme descrito no presente ou uma molécula de ácido nucleico (isolada) conforme descrita no presente ou um gene quimérico conforme descrito no presente compreendendo um alelo de gene restaurador funcional tal como descrito, também são exemplos de realização da invenção.

Em um aspecto a molécula de DNA compreendendo o alelo Rf é estavelmente integrada no genoma do cereal (por exemplo, trigo).

[096] Assim, são fornecidas plantas de cereais, partes de plantas, células de planta, ou sementes das mesmas, especialmente trigo, compreendendo um fragmento de cromossomo ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção ou um polipeptídeo de acordo com a invenção ou um gene quimérico de acordo com a invenção codificando um gene restaurador funcional de acordo com a invenção, e a referida planta tendo a capacidade para restaurar a fertilidade contra esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo é fornecida na presente invenção. Em um exemplo de realização, o fragmento de cromossomo, molécula de ácido nucleico, polipeptídeo ou gene quimérico é heterólogo para a planta, como plantas de cereais transgênicas ou plantas de trigo transgênicas. Isto também inclui células de planta ou culturas de células compreendendo tal fragmento de cromossomo ou molécula de ácido nucleico, polipeptídeo ou gene quimérico, independente de se introduzidos por métodos transgênicos ou por métodos de reprodução/melhoramento. As células, por exemplo, in vitro, são regeneráveis em plantas compreendendo o fragmento de cromossomo ou gene quimérico da invenção. As referidas plantas, partes de plantas, células e sementes de plantas também podem ser plantas, partes de plantas, células ou sementes de plantas híbridas.

[097] Tais plantas também podem ser usadas como planta parental masculina em um método para produzir sementes híbridas F1 ou plantas híbridas F1, como descrito acima.

[098] Um promotor expressável em planta como usado na presente invenção pode ser qualquer promotor que dirige expressão suficiente pelo menos durante o (início do) desenvolvimento e meiose de pólen, tal como na antera ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento. Este pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo, um promotor indutível, mas também um promotor preferencial/específico de pólen, antera ou, mais especificamente tapetum ou micrósporo.

[099] Um promotor constitutivo é um promotor capaz de direcionar altos níveis de expressão na maioria dos tipos de células (de uma maneira espaço-temporal independente). Exemplos de promotores constitutivos expressáveis em plantas incluem promotores de origem bacteriana, como os promotores de octopina sintase (OCS) e nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium, mas também promotores de origem viral, como o transcrito 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Hapster et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190) ou genes do 19S RNA (Odell et al.,

1985, Nature. 6;313(6005):810-2; Patente US 5.352.605; documento WO 84/02913; Benfey et al., 1989, EMBO J. 8:2195-2202), o promotor aprimorado 2x35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299–1302; Datla et al. (1993), Plant Sci 94:139–149) promotores do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV; documento WO 97/48819, Patente US 7.053.205), 2xCsVMV (WO2004/053135) promotor do circovírus (AU 689 311), promotor do badnavírus baciliforme de cana (ScBV) (Samac et al., 2004, Transgenic Res.

13(4):349-61), promotor do vírus do mosaico da figueira (FMV) (Sanger et al., 1990, Plant Mol Biol. 14(3):433-43), promotor do vírus do trevo subterrâneo nº4 ou nº7 (WO 96/06932) e o promotor 35S aprimorado descrito nas Patentes US

5.164.316, US 5.196.525, US 5.322.938, US 5.359.142 e US 5.424.200. Entre os promotores de origem vegetal, serão mencionados os promotores do promotor da subunidade pequena ribulose-biscarboxilase/oxigenase (Rubisco) (US 4.962.028; WO99/25842) de zea mays e girassol, o promotor da histona H4 de Arabidopsis thaliana (Chabouté et aI.,Plant Mol. Biol. 8, 179-191,1987), os promotores de ubiquitina (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649, US 5.510.474) de milho, arroz e cana-de-açúcar, o promotor da actina 1 de arroz (Act-1, US 5.641.876), os promotores de histona tal coo descrito no documento EP 0 507 698 A1, o promotor da álcool desidrogenase 1 de milho (Adh-1) (a partir do site http://www.patentlens.net/daisy/promoters/242.html)).

Também o pequeno promotor de subunidade da Chrysanthemum pode ser usado se esse uso for combinado com o uso do respectivo terminador (Outchkourov et al., Planta, 216:1003-1012, 2003).

[100] Exemplos de promotores induzíveis incluem promotores regulados pela aplicação de compostos químicos, incluindo promotores regulados por álcool (consulte, por exemplo, EP 637339), promotores regulados por tetraciclina (consulte, por exemplo, a Patente US 5.464.758), promotores regulados por esteroides (consulte, por exemplo, as Patentes US

5.512.483; US 6.063.985; US 6.784.340; US 6.379.945; documento WO01/62780), promotores regulados por metal (consulte, por exemplo, a Patente US 4.601.978), mas também promotores regulados pelo desenvolvimento.

[101] Promotores ativos em pólen/micrósporos incluem, por exemplo, um promotor pólen-específico de milho (consulte, por exemplo, Guerrero (1990) MoI. Gen. Genet. 224:161 168), PTA29, PTA26 e PTAl 3 (por exemplo, consulte a Patente US 5.792.929) e conforme descrito, por exemplo, em Baerson et al. (1994 Plant MoI. Biol. 26: 1947-1959), o promotor micrósporo-específico NMT19 como, por exemplo, descrito no documento WO 97/30166. Promotores adicionais específicos para antera/pólen ou ativos na antera/pólen estão descritos, por exemplo, em Khurana et al., 2012 (Critical Reviews in Plant Sciences, 31: 359-390), e documentos WO 2005100575, WO

2008037436. Outros promotores apropriados são, por exemplo, o promotor vrn1 de cevada, tal como descrito em Alonso-Peral et al. (2001, PLoS One.

2011;6(12):e29456).

[102] Exemplos de promotores tecido-específicos incluem promotores específicos de meristema, como o promotor OSH1 de arroz (Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8117-8122) promotor da metaloteína de arroz (BAD87835.1) promotores WAK1 e WAK2 (Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318, promotor específico do tecido de espícula D5 de cevada (US 6.291.666), promotor Lem2 específico do lema/pálea da cevada (Abebe et al. (2005) Planta, 221, 170-183), promotor Pvrn1 específico da inflorescência precoce da cevada (Alonse Peral et al. 2011, PLoS ONE 6(12) e29456), promotor Pcrs4/PrA2 específico da inflorescência precoce da cevada (Koppolu et al. 2013, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 110(32) 13198-13203), promotor pkn1 específico do meristema com o íntron Act1 do arroz (Zhang et al., 1998, Planta 204: 542-549, Postma-Haarsma et al. 2002, Plant Molecular

Biology 48: 423-441) promotor específico de SAM/inflorescência de Dendrobium sp., e Pdomads1 (Yu et al. 2002, Plant Molecular Biology 49: 225– 237).

[103] Será evidente que os ácidos nucleicos e polipeptídeos identificados na presente invenção que codificam genes restauradores funcionais podem ser usados para identificar genes restauradores funcionais para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo adicionais. Assim, a invenção também provê o uso dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos (isolados) como descritos na presente invenção, tal como de SEQ ID NO: 16 ou 17, para identificar um ou mais genes restauradores funcionais adicionais para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo.

[104] Além disso, genes restauradores funcionais homólogos ou substancialmente idênticos podem ser identificados usando métodos conhecidos no estado da técnica. A sequência de nucleotídeo homóloga pode ser identificada e isolada por hibridização sob condições estringentes ou altamente estringentes usando como sonda um ácido nucleico compreendendo, por exemplo, a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4 ou parte da mesma, conforme descrito acima. Outras sequências codificando genes restauradores funcionais também podem ser obtidas pela amplificação do DNA usando oligonucleotídeos específicos para genes codificando genes restauradores funcionais como iniciadores, tais como, mas não se limitado a oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo de cerca de 20 a cerca de 50 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 4 ou seus complementos. Os genes restauradores funcionais homólogos ou substancialmente idênticos podem ser identificados in silico usando a pesquisa homóloga Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico (BLAST) com o nucleotídeo ou sequência de aminoácidos como providos na presente invenção.

[105] A funcionalidade de genes restauradores ou alelos dos mesmos, tal como identificada acima, pode ser validada, por exemplo, provendo, por exemplo, transformação ou cruzamento, tal gene restaurador sob controle de um promotor expressável por vegetal em uma planta de cereal (trigo) que não tem a capacidade de restaurar a fertilidade na progênie de uma planta de trigo com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, cruzando a planta de cereal gerada assim com uma planta de trigo estéril masculina citoplasmática tipo G e avaliando o conjunto de sementes na progênie.

Alternativamente, uma linhagem restauradora pode ser transformada com uma construção de RNAi ou editada por gene, por exemplo, com a tecnologia CRISPR-Cas ou qualquer outra nuclease específica para a sequência a fim de gerar uma perda de função que gera a planta não restauradora. Similarmente, outros meios para a mutação do gene restaurador (por exemplo, EMS, radiação γ) podem ser usados para avaliar o efeito de uma mutação de perda de função na capacidade de restauração.

[106] Em qualquer um dos exemplos de realização e aspectos descritos na presente invenção a planta pode compreender ou pode ser selecionada para compreender ou pode ser provida com outro gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo (localizado ou obtenível a partir do mesmo ou de outro cromossomo), tais como Rf2 (7D), Rf3 (1B), Rf4 (6B), Rf5 (6D), Rf6 (5D), Rf7 (7B), Rf8, 6AS ou 6BS (Tahir & Tsunewaki, 1969, supra; Yen et al., 1969, supra; Bahl & Maan, 1973, supra; Du et al., 1991, supra; Sihna et al., 2013, supra; Ma et al., 1991, supra; Zhou et al., 2005, supra).

[107] Qualquer um dos métodos, marcadores e alelos marcadores, ácidos nucleicos, polipeptídeos, gene quiméricos, plantas etc, descritos na presente invenção também podem ser usados para restaurar a fertilidade contra citoplasma tipo Sv, tal como descrito, por exemplo, em Ahmed et al 2001 (supra). Os métodos, ácidos nucleicos, polipeptídeos, genes quiméricos também podem ser úteis para restaurar a fertilidade contra outro germoplasma indutor de esterilidade masculina em trigo ou outros cereais.

DEFINIÇÕES

[108] Conforme utilizado no presente pedido, um “gene quimérico” refere-se a uma construção de ácido nucleico que não é normalmente encontrada em uma espécie de planta. Uma construção de ácido nucleico quimérica pode ser de DNA ou RNA. As expressões “construção de DNA quimérico” e “gene quimérico” são usadas de modo intercambiável para denotar um gene em que o promotor ou uma ou mais outras regiões regulatórias, tal como a região de poliadenilação e região de terminação da transcrição do gene não estão associadas na natureza com parte ou toda da região de DNA transcrita, ou um gene que está presente em um locus do genoma de uma planta no qual ele não ocorre naturalmente ou está presente em uma planta em que ele não ocorre naturalmente. Em outras palavras, o gene e a região regulatória operacionalmente ligados ou o gene e o locus genômico ou o gene e a planta são heterólogos em relação ao outro, ou seja, eles não ocorrem naturalmente juntos. Isto inclui a situação em que um ou mais dos elementos reguladores (tais como o promotor ou região a 3’ a formação final e de poliadenilação) ou a região de codificante, de um gene de trigo (tais como o gene Rf1_PPR_09 da presente invenção), é um ácido nucleico modificado (uma vez que não é normalmente encontrado no trigo e é heterólogo aos elementos do gene ao qual está operacionalmente ligado).

[109] Uma primeira sequência de nucleotídeo está “operacionalmente ligada” com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência codificante. Quando produzidas de maneira recombinante, as sequências de ácido nucleico ligado operacionalmente são no geral contíguas e, quando necessário unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma fase de leitura (por exemplo, em uma ORF policistrônica). No entanto, ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para estarem operacionalmente ligados.

[110] O “retrocruzamento” refere-se a um método de criação pelo qual um (único) traço, tal como restauração de fertilidade (Rf), pode ser transferido de um fundo genético (um “doador”) para outro fundo genético (também referido como “parental recorrente”), por exemplo, uma planta que não compreende tal gene ou locus Rf. Uma prole de um cruzamento (por exemplo, uma planta F1 obtida pelo cruzamento de uma planta contendo Rf com uma planta que não tem Rf; ou uma planta F2 ou planta F3, etc., obtida a partir da autopolinização da F1) é “retrocruzada” com a planta parental. Após retrocruzamento repetido (BC1, BC2, etc.) e opcionalmente autopolinizações (BC1S1, BC2S1, etc.), o traço de um fundo genético é incorporado ao outro fundo genético.

[111] A “seleção assistida por marcador” ou “MAS” é um processo que usa a presença de marcadores moleculares, que são geneticamente ligados a um determinado locus ou a uma região de cromossomo particular (por exemplo, fragmento de introgressão), para selecionar plantas para verificar a presença do locus ou região específica (fragmento de introgressão). Por exemplo, um marcador molecular genética e fisicamente ligado a um locus Rf, pode ser usado para detectar e/ou selecionar plantas que compreendem o locus Rf. Quanto mais próxima a ligação genética do marcador molecular é ao locus, menos provável é de que o marcador seja desassociado do locus através de recombinação meiótica.

[112] Uma “amostra biológica” pode ser uma planta ou parte de uma planta, tal como um tecido vegetal ou célula vegetal.

[113] “Fornecimento DNA genômico”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se ao fornecimento de uma amostra que compreende DNA genômico da planta. A amostra pode referir-se a uma amostra de tecido que foi obtida a partir da referida planta, tal como, por exemplo, uma amostra de folha, que compreende o DNA genômico da referida planta. A amostra pode referir-se adicionalmente ao DNA genômico que é obtido de uma amostra de tecido, tal como DNA genômico que foi obtido de um tecido, tal como uma amostra de folha. O fornecimento de DNA genômico pode, mas não necessariamente precisa, incluir a purificação do DNA genômico a partir da amostra de tecido. Assim, o fornecimento de DNA genômico também incluir a obtenção de material tecidual a partir de uma planta ou pedaço maior de tecido e a preparação de um extrato ou lisado bruto a partir do mesmo.

[114] Um “DNA isolado” ou “ácido nucleico isolado”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um DNA ou ácido nucleico que não ocorre no seu contexto genômico natural, independentemente do seu comprimento e sequência. O DNA isolado pode, por exemplo, se referir ao DNA fisicamente separado do contexto genômico, como um fragmento de DNA genômico. O DNA isolado também pode ser um DNA produzido artificialmente, tal como um DNA quimicamente sintetizado, ou um DNA produzido por meio de reações de amplificação, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida na técnica. O DNA isolado pode se referir ainda ao DNA presente em um contexto de DNA no qual não ocorre naturalmente. Por exemplo, DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em um plasmídeo. Além disso, o DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em outro contexto cromossômico que não o contexto no qual ele ocorre naturalmente, tal como, por exemplo, em outra posição no genoma que não a posição natural, no genoma de outra espécie que não a espécie na qual ele ocorre naturalmente ou em um cromossomo artificial. “Isolado”, conforme utilizado na presente invenção, quando se refere a uma proteína (sequência) também inclui uma proteína (sequência) que foi modificada pelo homem (por exemplo, pela modificação do ácido nucleico que codifica essa proteína) como é feito em um esforço para obter alguma melhoria da atividade da proteína (tal como a atividade de restauração). “Isolado”, conforme utilizado na presente invenção, quando se refere a um ácido nucleico (sequência) também inclui um ácido nucleico (sequência) que foi modificado pelo homem (por exemplo, pela inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucleico nativo) como é feito em um esforço para obter alguma melhoria (como melhoria na expressão de RNA ou proteína, direcionamento ou estabilidade, ou melhoria na atividade da proteína (como atividade de restauração)). Um ácido nucleico ou proteína (sequência) “modificado(a)”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um ácido nucleico ou proteína (sequência) que é diferente do ácido nucleico nativo ou proteína nativa, pela modificação ou mutação do ácido nucleico ou proteína (ou do nucleico ácido que codifica a proteína), como é feito em um esforço para a obtenção de alguma melhoria.

[115] Em um exemplo de realização da invenção, um ácido nucleico Rf1_PPR_09 tem uma sequência modificada ou mutada em comparação com a sequência na SEQ ID NO: 1 ou 4, em que o nucleotídeo em uma posição correspondente à posição nucleotídica 3286 na SEQ ID NO: 1 (ou o nucleotídeo em uma posição correspondente à posição nucleotídica 2286 da SEQ ID NO: 4) é um G, ou tem uma sequência modificada ou mutada em comparação com a sequência na SEQ ID NO: 1, em que a referida sequência modificada ou mutada tem um trecho de no máximo 6 A, de preferência 6 A, entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição nucleotídica 760 na SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização da invenção, um ácido nucleico Rf1_PPR_09 tem uma sequência modificada ou mutada em comparação com a sequência na SEQ ID NO: 1, em que o nucleotídeo em uma posição correspondente à posição nucleotídica 3286 na SEQ ID NO: 1 é um G, e em que a referida sequência modificada ou mutada tem um trecho de no máximo 6 A, de preferência 6 A, entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição nucleotídica 760 na SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, um ácido nucleico modificado ou mutado de SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1 à posição nucleotídica 1054 compreende um trecho de no máximo 6 A, de preferência 6 A, entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição nucleotídica 760 na SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, tal ácido nucleico Rf1_PPR_09 modificado ou mutado codifica uma proteína Rf1_PPR_09 modificada possuindo uma sequência de aminoácidos modificada ou mutada quando comparada com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 5.

[116] Sempre que é feita referência a uma “planta” ou “plantas” de acordo com a invenção, entende-se que também as partes da planta (células, tecidos ou órgãos, vagens, sementes, partes cortadas, como raízes, folhas, flores, pólen, etc..), a descendência das plantas que mantêm as características distintivas das plantas parentais (especialmente a capacidade de restauração), como sementes obtidas por abandono ou cruzamento, por exemplo, sementes híbridas (obtidas através do cruzamento de duas linhagens parentais consanguíneas), plantas híbridas e partes de plantas delas derivadas estão abrangidas no presente documento, exceto quando indicado de outra forma. Em alguns exemplos de realização, as células vegetais da invenção podem ser células não propagadoras.

[117] As plantas obtidas de acordo com a invenção podem ser usadas em um esquema de criação convencional para produzir mais plantas com as mesmas características ou para introduzir a característica da presença do gene restaurador de acordo com a invenção em outras variedades da mesma espécie de planta ou de uma planta relacionada, ou em plantas híbridas. As plantas obtidas podem ser adicionalmente usadas para criar material de propagação. As plantas de acordo com a invenção podem ser adicionalmente utilizadas para produzir gametas, sementes, farinha, embriões, tanto zigóticos quanto somáticos, progênie ou plantas híbridas obtidas pelos métodos da invenção. As sementes obtidas a partir das plantas de acordo com a invenção também são abrangidas pela invenção.

[118] “Criar material de propagação”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer meio conhecido no estado da técnica para produzir outras plantas, partes de plantas ou sementes e inclui, entre outros, os métodos de reprodução vegetativa (por exemplo, alporquia ou mergulhia simples, divisão, enxertia (broto), micropropagação, estolões (runners), órgãos de armazenamento como bulbos, colmos, tubérculos e rizomas, enraizamento de uma estaca (striking) ou escalonamento duplo (twin- scaling)), reprodução sexual (cruzando com outra planta) e reprodução assexuada (por exemplo, apomixia, hibridação somática).

[119] O termo “transformação”, conforme utilizado na presente invenção, significa introduzir uma sequência de nucleotídeo em uma planta de maneira a causar a expressão estável ou transitória da sequência. A transformação e a regeneração de células vegetais monocotiledôneas e dicotiledôneas são rotineiras, e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada pelo especialista. A escolha do método varia de acordo com o tipo de planta a ser transformada; os especialistas na técnica reconhecerão a adequação de métodos particulares para determinados tipos de plantas. Os métodos adequados podem incluir, mas não estão limitados a: eletroporação de protoplastos vegetais; transformação mediada por lipossomas; transformação mediada por polietileno glicol (PEG); transformação usando vírus; microinjeção de células vegetais; bombardeio de microprojéteis de células vegetais; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium.

[120] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “homólogo” ou “substancialmente idêntico” pode referir-se a sequências de nucleotídeos que são mais do que 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica pode ser 85,5%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91 %; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou 99,5% idêntica à sequência de referência (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou 4). Em um exemplo de realização, uma sequência de ácido nucleico substancialmente idêntica ou substancialmente semelhante à SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433) é mais do que 85%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou mais de 99,5% idêntica à SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à 2433), e tem um nucleotídeo G na posição nucleotídica correspondente à posição nucleotídica 2286 na SEQ ID NO: 4. Em um exemplo de realização, uma sequência de ácido nucleico substancialmente idêntica ou substancialmente semelhante à SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1055 à posição nucleotídica 3433) é mais do que 85%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou mais de 99,5% idêntica à SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1055 à 3433), e tem um nucleotídeo G na posição nucleotídica correspondente à posição nucleotídica 3286 na SEQ ID NO: 1, ou tem um trecho de no máximo 6 A, de preferência 6 A, entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição nucleotídica 760 na SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, uma sequência de ácido nucleico substancialmente idêntica ou substancialmente semelhante à SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1055 à posição nucleotídica 3433) é mais do que 85%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%;

96%; 97%; 98%; 99% ou mais de 99,5% idêntica à SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID

NO: 1 da posição nucleotídica 1055 à 3433), e tem um nucleotídeo G na posição nucleotídica correspondente à posição nucleotídica 3286 na SEQ ID

NO: 1 e tem um trecho de no máximo 6 A entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição nucleotídica

760 na SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, está incluída na invenção uma sequência de ácido nucleico substancialmente idêntica ou substancialmente semelhante à SEQ ID NO: 1 da posição 1 do nucleotídeo à posição 1054 do nucleotídeo, em que a referida sequência de ácido nucleico é superior a 85%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%;

97%; 98%; 99% ou mais de 99,5% idêntica à SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1 a 1054, e tem um trecho de no máximo 6 A, de preferência 6 A,

entre o T correspondente à posição nucleotídica 753 na SEQ ID NO: 1 e o C correspondente à posição 760 do nucleotídeo na SEQ ID NO: 1. Uma sonda também pode ser uma molécula de ácido nucleico que é “especificamente hibridizável” ou “especificamente complementar” a uma cópia exata do marcador a ser detectado (“DNA alvo”). “Especificamente hibridizável” ou

“especificamente complementar” são termos que indicam um grau suficiente complementaridade de modo que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e o DNA alvo.

A molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável.

A molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico com sequências não alvo sob condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização estringentes (rigorosas), preferivelmente condições altamente estringentes.

[121] “Condições de hibridização estringentes” podem ser usadas para identificar sequências nucleotídicas que são homólogas ou substancialmente idênticas a uma dada sequência de nucleotídeos. As condições estringentes são dependentes de sequencia e serão diferentes em circunstâncias diferentes. De modo geral, as condições estringentes são selecionadas para estarem cerca de 5ºC mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tm) para sequências específicas em uma força iônica e pH definidos.

O Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% de uma sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Normalmente, serão escolhidas condições estringentes nas quais a concentração de sal é de cerca de 0,02 molar em pH 7 e a temperatura é de pelo menos 60ºC. A diminuição da concentração de sal e/ou o aumento da temperatura aumenta a estringência. As condições estringentes para hibridizações de RNA-DNA (Northern blots usando uma sonda de, por exemplo, 100 nt) são, por exemplo, aquelas que incluem pelo menos uma lavagem em SSC 0 X a 63ºC por 20min, ou condições equivalentes.

[122] “Condições altamente estringentes” podem ser providas, por exemplo, por hibridização a 65°C em uma solução aquosa contendo SSC 6x (SSC 20x contém 3,0 M de NaCl, 0,3 M de citrato de Na, pH 7,0), Denhardt 5x (Denhardt 100X contém 2% de Ficoll, 2% de polivinil pirrolidona, 2% de albumina de soro bovino), 0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS), e 20 µg/mL de DNA de carreador desnaturado (DNA de esperma de peixe de filamento único, com um comprimento médio de 120 - 3000 nucleotídeos) como competidor não específico. Após a hibridização, a lavagem altamente estringente pode ser feita em várias etapas, com uma lavagem final (cerca de 30 min) na temperatura de hibridização em 0,2-0,1× SSC, 0,1% SDS.

[123] “Condições de estringência moderada” refere-se a condições equivalentes a hibridização na solução descrita acima, mas a cerca de 60- 62ºC. A lavagem de estringência moderada pode ser feita na temperatura de hibridização em 1x SSC, 0,1% SDS.

[124] “Baixa estringência” refere-se a condições equivalentes a hibridização na solução descrita acima a cerca de 50-52ºC. A lavagem de baixa estringência pode ser feita na temperatura de hibridização em 2x SSC, 0,1% SDS. Vide também Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e Sambrook e Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).

[125] Para os fins da presente invenção, a “identidade de sequência” de duas sequências relacionadas de nucleotídeos ou aminoácidos, expressa em porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas sequências idealmente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) divididos pelo número de posições comparadas. Uma lacuna (ou gap), isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos. O “alinhamento ótimo” de duas sequências é encontrado pelo alinhamento das duas sequências ao longo de todo o comprimento de acordo com o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) em The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276— 277; vide, por exemplo, http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) usando configurações padrão (penalidade por abertura de lacuna = 10 (para nucleotídeos) / 10 (para proteínas) e penalidade por extensão de lacunas = 0,5 (para nucleotídeos) / 0,5 (para proteínas)). Para nucleotídeos a matriz de pontuação (scoring matrix) padrão é EDNAFULL e para proteínas a matriz de pontuação é EBLOSUM62. É evidente que sempre que as sequências nucleotídicas das moléculas de RNA são definidas por referência à sequência nucleotídica das moléculas de DNA correspondentes, a timina (T) na sequência nucleotídica deve ser substituída pelo uracila (U). Se a referência é feita às moléculas de RNA ou DNA, ficará claro a partir do contexto do presente pedido.

[126] Conforme utilizado na presente invenção, “compreendendo” deve ser interpretado como especificando a presença de recursos, números inteiros, etapas ou componentes declarados, conforme referido, mas não impede a presença ou adição de um ou mais recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles efetivamente citados, ou seja, o ácido nucleico ou proteína está incorporado em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo um ácido nucleico que é definido funcional ou estruturalmente pode compreender regiões adicionais de DNA etc.

[127] Conforme usado no presente documento, “exógeno” significa ter uma origem ou causa externa, em oposição a “endógeno”. Uma molécula de ácido nucleico exógena é uma molécula de ácido nucleico que não ocorre naturalmente dentro do organismo e foi (historicamente) introduzida ou manipulada para ocorrer em um organismo.

[128] Entretanto, em determinadas jurisdições, as plantas de acordo com a invenção que foram obtidas exclusivamente por processos essencialmente biológicos podem ter a patenteabilidade excluída, em que um processo para a produção de plantas é considerado essencialmente biológico se ele consistir inteiramente em fenômenos naturais, tal como cruzamento ou seleção. As plantas de acordo com a invenção também abrangem plantas não obtidas exclusivamente por processos essencialmente biológicos.

[129] Salvo quando indicado de outra forma nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão, tal como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais e métodos-padrão para o trabalho molecular em plantas estão descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, publicado juntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications (Reino Unido). Outras referências para técnicas padrão de biologia molecular incluem Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Os materiais e métodos padrão para as reações em cadeia da polimerase também podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995), PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; e particularmente em McPherson et al. (2000), PCR - Basics: From background to bench, 1ª ed., Springer Verlag, Alemanha.

[130] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações ou divulgações públicas (incluindo publicações na Internet) mencionadas ou citadas no presente pedido são integralmente incorporadas ao presente por referência.

[131] A listagem de sequências contida no arquivo nomeado “BCS18-2006_ST25.txt”, que é de 34 kilobytes (tamanho medido no Microsoft Windows®), contendo 7 sequências, da SEQ ID NO: 1 até a SEQ ID NO: 7, é depositada com a presente invenção por envio eletrônico e incorporada ao presente por referência.

[132] A invenção será adicionalmente descrita com referência aos exemplos aqui descritos; no entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos.

[133] Na descrição e nos exemplos, é feita referência às seguintes sequências:

[134] SEQ ID NO: 1: sequência da região genômica de PI 583676 compreendendo o gene Rf1-PPR-09.

- Nt 1-1000: região genômica a montante do transcrito cDNA/mRNA de Rf1-PPR-09 - Nt 1001-1054: 5’UTR - Nt 1055-3433: CDS - Nt 3434-3956: 3’UTR parte 1 - Nt 4827-4919: 3’UTR parte 2 - Nt 5398-5515: 3’ UTR parte 3 - Nt 5662-5708: 3’ UTR parte 4 - Nt 5854-6466: 3’ UTR parte 5 - Nt 6467-7923: região genômica a jusante do transcrito cDNA/mRNA de Rf1-PPR-09 - SEQ ID NO: 2: sequência nucleotídica ORF256 - SEQ ID NO: 3: sequência alvo prevista dentro da ORF256 - SEQ ID NO: 4: cDNA/ mRNA Rf1-PPR-09 - Nt 1-54: 5’UTR - Nt 55-2433: CDS - Nt 2434-3827: 3’UTR - SEQ ID NO: 5: sequência de aminoácidos Rf1-PPR-09 - SEQ ID NO: 6: Iniciador (primer) direto (qPCR) - SEQ ID NO: 7: Iniciador (primer) reverso (qPCR)

EXEMPLOS EXEMPLO 1

MATERIAIS VEGETAIS E MAPEAMENTO GENÉTICO

[135] O QTL de Rf1 foi mapeado no cromossomo 1A conforme descrito extensivamente nos Exemplos 1 a 3 do documento WO2017158126 (incorporado ao presente por referência). Resumidamente, uma linhagem estéril masculina transportando Triticum timopheevii CMS, CMS005, e uma linhagem restauradora estéril masculina respondendo a Triticum timopheevii CMS (T.timopheevii /2* Iowin //2* Quivira, número de acesso PI 583676, USDA National Small Grains Collection; http://www.ars.usda.gov/Main/docs.htm?docid=21891, também conhecidas como Dekalb 582M e registradas como US PVP 7400045, disponíveis através do National Plant Germplasm System; https://npgsweb.ars- grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1478647), foram usadas como plantas parentais para gerar a população de mapeamento. Um mapa genético com um total de 2080 marcadores SNP foi estabelecido e cobriu todos os cromossomos do genoma do trigo. O cromossomo 1B é descrito por 108 marcadores SNP. A análise QTL foi realizada usando regressão Haley-Knott para testar o efeito da variação no desenvolvimento de semente em todos os marcadores. Um intervalo desses marcadores significativamente associados foi delineado, incluindo marcadores flanqueadores esquerdo e direito (SEQ ID NO.

2 e SEQ ID NO. 4 do documento WO2017158126). O marcador com a mais alta significância e maior efeito sobre a restauração é o marcador de pico de SEQ ID NO: 3 do documento WO2017158126. Isso delimitou o intervalo para 15,6 cM pelos marcadores de flanqueamento esquerdo e direito. Para um mapeamento fino adicional, 40 indivíduos F2 que eram heterozigotos na região QTL foram selecionados com base no fenótipo e genótipo. Um total de 2560 plantas F3 individuais foram cultivadas no campo em 2 locais. Para cada planta, sementes colocadas na cabeça principal sob um saco foram medidas. Ensaios SNP adicionais foram desenvolvidos para aumentar a densidade do marcador no intervalo QTL. Um total de 361 marcadores SNP adicionais foram usados no mapeamento da região 1A. O locus Rf1 pode ser adicionalmente delimitado a uma região de cerca de 1,9 cM (de 30,9 a 32,8 cM ao longo do cromossomo 1A).

EXEMPLO 2

BIBLIOTECAS BAC DA LINHAGEM RESTAURADORA

[136] Uma biblioteca de BAC foi construída para a linhagem restauradora de trigo referida como Rf line‘PI 583676, por digestão de alto peso molecular do gDNA 'PI583.676' com uma enzima de restrição, e transformando os fragmentos resultantes (tamanho de inserção médio ~ 80-130 Kb), em E.

coli. As sequências de marcadores SNP de mapeamento fino, ou marcadores desenvolvidos a partir da região Rf sobre o genoma de referência ‘Chinese Spring’, foram então usadas para projetar iniciadores de PCR para triagem dos clones BACs combinados (pools de BACs). Uma vez que combinações de BAC positivos para PCR foram identificadas, BACs da combinação foram individualizados e triados contra o mesmo marcador. BACs positivos para PCR individuais foram então submetidos a sequenciamento final BAC para confirmar a integridade e a presença das sequências de marcadores de triagem.

Finalmente BACs positivos verificados foram profundamente sequenciados usando tecnologia PacBio e as leituras foram montadas para uma sequência de consenso para o inserto BAC. BACs positivos, sequenciados foram então alinhados ou por montagem de novo, ou por montagem para o genoma de referência ou dispostos lado a lado usando os marcadores de triagem para gerar uma nova sequência de referência ‘PI 583676’ para a região QTL de Rf1.

A sequência de referência QTL de Rf1 ‘PI 583676’ foi então estruturalmente e funcionalmente anotada para identificar quaisquer mudanças e/ou diferenças estruturais no teor de gene e/ou polimorfismos no gene candidato capturado dentro da região relativa para o genoma de referência (não restaurador). A anotação estrutural de BACs ao longo da região Rf1 QTL usando programas de anotação de gene ab initio, bem como pelo alinhamento de sequências de trigo EST, sequências de cDNA de comprimento total de trigo, modelos de gene de trigo e restauradores de gene conhecidos de espécies ortólogas disponíveis a partir de bases de dados públicas. A anotação funcional de genes na região QTL foi realizada usando os programas Blast2GO e PLAZA, assim como consulta de literatura pública. Estes genes candidatos foram então priorizados com base em sua funcionalidade e homologia previstas, a presença de polimorfismos relativos a alelos ortólogos em linhagens não restauradoras e sua homologia com genes Rf conhecidos (Chen e Liu 2014, Annu. Rev. Plant Biol. 65 579–606; Dahan e Mireau 2013, RNA Biol. 10, 1469–1476)..

[137] A biblioteca BAC ‘PI 583676’ foi triada múltiplas vezes usando marcadores PCR desenvolvidos para marcadores de mapeamento fino, genomas de referência ou sequências BAC isoladas. Esses BACs foram sequenciados individualmente. Os BACs sequenciados foram encontrados por conterem o gene Rf-Rf1-PPR-09 aqui descrito. Estes BACs representam a sequência única do genoma 'PI 583676' para a região QTL Rf1.

[138] Em linha com a recente noção de Geyer et al. (2017, supra) que o locus Rf1 é provavelmente de origem do T. timopheevii, o gene Rf-PPR- 09 não está presente no genoma da linhagem de referência Chinese Spring.

[139] Como mostrado na Figura 1A, a estrutura do gene de Rf1- Rf-PPR-09 é constituído por um único éxon. Esta estrutura de gene relativamente simples parece ser típica para Rf -PPR.

[140] SEQ ID NO: 1 representa a sequência de DNA genômico compreendendo o gene Rf1-PPR-09.

EXEMPLO 3 ANOTAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS RF1-PPR-09

[141] Rf-PPRs conhecidos são membros da classe P de proteína PPRs, e contém até ~30 motivos PPR por proteína, com cada motivo compreendendo 35 aminoácidos (Gaborieau, Brown, e Mireau 2016, Front.

Plant Sci. 7, 1816). Estruturalmente, proteínas PPR consistem de 2 α-hélices que formam um grampo e um super sulco, e é este super sulco que interage com uma molécula de RNA. A composição de aminoácido dos motivos PPR individuais determina o RNA nucleotídeo que é reconhecido, e o número de motivos PPR determina o comprimento da sequência de RNA no transcrito alvo. Aqui o Rf1-PPR-09 foi anotado para identificar motivos PPR e outros aspectos da sequência e os resultados estão resumidos na Fig.1 B e C.

[142] Rf1-PPR-09 consiste de 792 aminoácidos e contém 18 motivos PPR de 35 aminoácidos consecutivos, e um peptídeo de transito previsto que direciona a proteína para a mitocôndria (SEQ ID NO. 5) - isso foi previsto pelo PredSL (Evangelia et al. (2006) Geno. Prot. BioInfo Vol 4, No.1, 48-55), com uma pontuação mTP (peptídeo de direcionamento mitocondrial) (forte) de 0,999741 no PredSL). Isto é muito similar à estrutura do gene Rf-1A clonado do arroz, que tem 791 aminoácidos longos e contém 16 repetições Rf- PPR (Akagi et al. 2004, Theor. Appl. Genet. 108, 1449–1457; Komori et al.

2004, Plant J. 37, 315–325).

[143] Cada motivo PPR consiste de 2 hélices antiparalelas que formam uma estrutura em grampo que interage com uma molécula de RNA de fita única (simples). Os estudos demonstraram a existência de código de reconhecimento ligando a identidade de aminoácidos específicos dentro das repetições e a sequência de RNA alvo da proteína PPR estudada (Barkan et al.

2012, supra; Yagi et al. 2013, supra). Em particular a identidade do 2º, 5º e 35º aminoácido de cada motivo foi mostrada como sendo particularmente importante. Com base na identidade dos aminoácidos nas posições 5 e 35 no motivo PPR a sequência do transcrito alvo prevista para proteína Rf1-PPR-09 pode ser predita usando uma tabela de matriz de probabilidade conforme descrito por Yagi et al 2013, supra. Seguindo o código PPR, a sequência alvo de RNA prevista em orf256 é ATTTCTCAAATAAAAA (SEQ ID NO: 3), que pode ser encontrada no mRNA orf256 compreendendo a sequência de nucleotídeos nas posições 105 a 121 nucleotídeos a jusante do códon de iniciação ATG de orf256 (SEQ ID NO: 2 partir do nucleotídeo 192 até o nucleotídeo 207).

EXEMPLO 4

EXPRESSÃO GÊNICA E LIGAÇÃO PARA A RESTAURAÇÃO DA FERTILIDADE EM UMA POPULAÇÃO INDEPENDENTE

[144] A ligação entre a expressão do gene Rf1-PPR-09 com a fertilidade foi testada em linhagens quase isogênicas desenvolvidas a partir de uma população MAGIC de 16 vias. Essa população foi desenvolvida pelo cruzamento de 16 linhagens fundadoras, entre as quais havia uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática derivada de T. timopheevii e duas linhagens restauradoras potenciais, chamadas R1 e R2. A população MAGIC de 16 vias foi cruzada por 5 gerações e posteriormente fixada através de uma única semente descendente em F5. Ao longo do processo de fixação da linhagem, as linhagens foram genotipadas e fenotipadas quanto à fertilidade.

Isso permitiu a seleção de famílias segregadas para restauração, bem como para o mapeamento fino adicional dos loci Rf. Em F5, indivíduos com heterozigosidade no locus Rf1 previamente mapeado foram identificados e usados para criar pares de linhagens quase isogênicas (NIL) com e sem o locus Rf1 em suas progênies. Seis desses pares NIL foram selecionados, cultivados e fenotipados. Os experimentos de RNAseq e qPCR foram realizados em picos de desenvolvimento em 3 estágios de seis pares NIL e também as respectivas linhagens parentais usando os primers da Tabela 1 (SEQ ID NOs: 6 e 7). As análises de bioinformática dos dados RNA-Seq permitiu a identificação dos transcritos diferencialmente expressos entre genótipos restauradores e não restauradores. Os transcritos identificados mapeados nas regiões QTL, tinham a linhagem fundadora correta (restauradores).

TABELA 1

SEQUÊNCIAS DE INICIADORES UTILIZADOS PARA A ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA ID do Nom Tipo Região alvo Sequência 5' --> 3' SEQ Gene e (SEQ ID NO. ID NO.

1) Rf1- Fw1 Prime 3843-3862 CTAAGGGTCAGAGTAAT 6 PPR-9 r CAG Rev1 Prime 3924-3943 TGATGAGAACAAACCGG 7 r complemento TCA

[145] Conforme mostrado na Figura 2, a expressão foi encontrada exclusivamente na linhagem doadora Rf e nos NILs contendo Rf em espícula em desenvolvimento de 3,5 cm de comprimento. Nem o parental não Rf nem os segregantes tipo selvagem mostraram expressão.

EXEMPLO 5

VALIDAÇÃO GÊNICA

[146] Por mutagênese

[147] Uma população mutagenizada da linhagem restauradora é construída por mutagênese EMS. Com base no sequenciamento da região em torno do gene Rf1-PPR-09, são identificadas plantas mutantes com uma mutação inativadora no gene Rf1-PPR -09. As plantas mutantes homozigotas e seus segregantes do tipo selvagem são triados para capacidade de restauração de fertilidade. As plantas que têm um gene Rf1-PPR-09 mutado não têm mais capacidade de restauração, confirmando que o gene Rf1-PPR-09 identificado é um gene Rf funcional.

[148] Por superexpressão

[149] A sequência codificante do gene Rf1-PPR-09 candidato é clonada sob o controle de um promotor UBIQUITIN constitutivo (pUbiZm) do milho, em um vetor de expressão de T-DNA compreendendo um gene marcador selecionável bar. O vetor resultante é transformado em uma linhagem de trigo que não tem capacidade de restauração tal como a variedade transformável Fielder, não possuindo capacidade de restauração, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica para transformação de trigo (vide, por exemplo, Ishida et al Methods Mol Bio. 2015;1223:189-98). O número de cópias do transgene na planta transgênica é determinado por PCR em tempo real no gene marcador selecionável. As plantas transformadas compreendendo uma cópia única do cassete com gene Rf1-PPR-09 foram transferidas para a estufa. As plantas transgênicas T0 foram cruzadas como parentais masculinos com uma linhagem com esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo. A progênie F1 de 15 eventos foi cultivada para avaliação da restauração da produção de sementes. Todas as plantas da progênie F1 contêm o citoplasma tipo G e segregam 1:1 (hemizigótica:azigótica) quanto à presença do locus transgênico Rf1-PPR-09. A expressão do transgene no tecido foliar e em espículas em desenvolvimento de plantas F1 foi testada por qRT-PCR.

[150] A viabilidade do pólen foi avaliada por coloração com iodo para 3 plantas azigóticas e 3 hemizigóticas por evento e a formação de sementes foi registrada em todas as espículas de até 5 plantas azigóticas e até 5 plantas hemizigóticas por evento. Os resultados mostram forte restauração da fertilidade em 5 eventos, restauração da fertilidade moderada em 3 eventos e fraco ou muito fraco restabelecimento da fertilidade em dois eventos, enquanto 5 eventos não mostram restauração estatisticamente significativa do conjunto de sementes. A restauração do conjunto de sementes está fortemente correlacionada com a frequência de coloração de pólen. A Tabela 2 abaixo mostra os resultados para todos os eventos que mostram uma diferença estatisticamente significante entre o conjunto de sementes em plantas azigóticas e hemizigóticas (utilizando o teste t de duas amostras assumindo variâncias desiguais). As plantas hemizigóticas podem ser divididas em três grupos para a expressão do mRNA do transgene Rf1-PPR-09. Todas as plantas no grupo de menor expressão não mostraram, ou mostraram um conjunto de sementes muito baixo, enquanto que todas as plantas no grupo de expressão mais elevada mostraram bom conjunto de sementes. As plantas no grupo de expressão intermediária apresentaram diversos níveis de semente.

[151] Portanto, a expressão do gene Rf1-PPR-09 restaura a fertilidade de plantas de trigo com esterilidade masculina citoplasmática tipo G.

TABELA 2 RESTAURAÇÃO DE CMS TIPO G EM TRIGO POR SUPEREXPRESSÃO DE RF1-PPR-09 Capacidade de Valor p Eventos Azigótico Hemizigótico Restauração (bicaudal)* nº nº nº nº nº DP nº sem. sem. DP plantas méd. plantas méd. méd. méd.

Evento 0,002172185 1 5 5,20 6,42 5 199,60 61,61 forte Evento 0,000132577 2 5 0,00 0,00 5 226,20 34,95 forte Evento 0,016578945 3 5 0,20 0,45 5 91,40 51,40 moderada Evento 0,000420738 4 5 0,20 0,45 5 129,80 26,89 moderada Evento 5 0,00 0,00 5 244,40 38,28 forte 0,000139825

Evento 4,34558E-05 6 5 0,60 0,89 5 238,60 27,72 forte Evento 8,05854E-05 7 5 6,00 6,60 5 130,60 22,91 moderada Evento 0,018265991 8 5 0,00 0,00 5 6,40 3,71 muito fraca Evento 0,022931034 9 5 2,60 2,41 5 36,60 21,03 fraca Evento 0,001325094 10 5 1,80 3,49 5 230,80 63,93 forte * Teste t: duas amostras assumindo variâncias desiguais

[152] Por nocaute direcionado

[153] RNAs guia para edição de genes mediada por CRISPR pela marcação da sequência codificante de mRNA, preferivelmente a sequência codificante de proteína do gene Rf1-PPR-09, ou na sequência promotora imediatamente a montante do gene Rf1-PPR-09 são projetados usando, por exemplo, a ferramenta CAS-finder. Preferivelmente quatro RNAs guias únicos ou quase únicos são projetados por gene alvo. Os RNAs guias são testados para eficiência de marcação por coentrega transitória mediada por PEG do vetor de expressão de gRNA com um vetor de expressão para a respectiva nuclease, por exemplo, Cas9 ou Cpf1, sob controle de promotores apropriados, para protoplastos de uma linhagem restauradora de trigo contendo o gene Rf1-PPR-09, preferivelmente a linhagem designada como T.timopheevii número de acesso USDA: PI 583676. DNA genômico é extraído dos protoplastos após a distribuição do RNA guia e vetores de nuclease. Após a amplificação por PCR, a integridade da sequência do gene Rf1-PPR-09 alvo é verificada por sequenciamento.

[154] O um ou dois RNAs guias mais eficientes são usados para a edição estável de genes na mesma linhagem restauradora de trigo contendo também o citoplasma CMS tipo G. Para este propósito, o vetor de expressão de RNA guia selecionado, juntamente com um módulo de expressão de nuclease e um gene marcador selecionável, são introduzidos em embriões isolados da linhagem restauradora de trigo mencionada acima usando, por exemplo, bombardeio com pistola de partículas. As plantas transgênicas mostrando resistência ao agente de seleção são regeneradas usando métodos conhecidos pelos versados na técnica. Plantas T0 transgênicas contendo eventos de direcionamento de genes, preferivelmente pequenas deleções resultando em um gene Rf1-PPR-09 não funcional, são identificadas por amplificação por PCR e sequenciamento.

[155] Plantas transgênicas T0 contendo o citoplasma CMS tipo G e contendo provavelmente um nocaute funcional do gene Rf1-PPR-09, preferivelmente no estado homozigótico, mas alternativamente no estado heterozigótico, são cruzadas como parentais femininos para uma linhagem de trigo primavera com citoplasma normal e sem genes PPR-Rf. A progênie F1 dos cruzamentos contém o citoplasma “CMS” tipo G e 50% (no caso de T0 heterozigótico) ou 100% (no caso do T0 homozigótico) da progênie F1 terá falta de uma versão funcional do gene Rf-PPR. As plantas F1 com falta de um gene Rf PPR funcional são identificadas usando ensaios PCR genômicos. As plantas F1 mostram perda parcial ou completa de fertilidade masculina devido ao nocaute do gene Rf1-PPR-09.

[156] O nível de fertilidade masculina na progênie F1 com falta de uma versão funcional do gene Rf1-PPR-07 é testado usando quatro ensaios diferentes. No primeiro ensaio a proteína ORF256 mitocondrial é quantificada por Western blot usando anticorpos policlonais contra proteína ORF256 sintética. O nocaute de um gene Rf1-PPR-09 leva ao acúmulo aumentado da proteína ORF256. No segundo ensaio o acúmulo de pólen e viabilidade de pólen são quantificados usando o dispositivo AmphaZ30. O nocaute de um gene Rf1-PPR-09 leva a números menores de pólen viável. No terceiro ensaio a integridade de tecidos de anteras é inspecionada microscopicamente. O nocaute de um gene Rf1-PPR-09 leva a deteriorização precoce da camada de tapetum. No quarto ensaio o conjunto de sementes por espiga de autopolinização é quantificado. O nocaute de um gene Rf1-PPR-09 candidato funcional leva a um número reduzido de grãos por espiga. Em todos os testes a progênie F1 dos cruzamentos de plantas Rf não editado para a mesma linhagem de trigo da primavera serve como um controle.

[157] Alternativamente, os RNAs guia para edição de genes mediada por CRISPR direcionados à região promotora compreendida na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 da posição nucleotídica 1 à 3000 são projetados e testados em protoplastos de trigo de uma linhagem de trigo de interesse da maneira descrita acima. O um ou dois RNAs guia mais eficientes são usados para edição de genes estável na mesma linhagem de trigo como descrito acima, mas, adicionalmente, o DNA de reparo compreendendo a subestação, inserção ou deleção de interesse (de um ou mais nucleotídeos) entre as sequências de flanqueamento homólogas ao DNA alvo também é introduzido. As plantas que compreendem a região a montante editada são identificadas por amplificação e sequenciamento por PCR e testadas quanto ao nível de fertilidade masculina conforme descrito acima.

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO que codifica um alelo de gene restaurador funcional da esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizada pelo referido alelo de gene restaurador funcional ser um alelo funcional de um gene Rf-PPR compreendido dentro da sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1.

   2. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido alelo de gene restaurador funcional compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de: a. uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do nucleotídeo na posição 55 ao nucleotídeo na posição 2433; preferencialmente ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 4 a partir do nucleotídeo na posição 55 ao nucleotídeo na posição 2433.

   b. uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4; de preferência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 4 a partir do nucleotídeo na posição 55 ao nucleotídeo na posição 2433, ou c. uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, de preferência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO:

   5.

   3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo referido alelo de gene restaurador funcional codificar uma proteína PPR capaz de se ligar ao mRNA de ORF256, de preferência a uma sequência de nucleotídeos que compreende os nt 192-

   207 da SEQ ID NO: 2.

   4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo referido alelo de gene restaurador funcional poder ser obtido a partir do número de acesso USDA de PI 583676.

   5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo referido alelo de gene restaurador funcional compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou codificar o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

   6. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por ser uma molécula de ácido nucleico isolada.

   7. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por ser uma molécula de ácido nucleico exógena.

   8. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por ser uma molécula de ácido nucleico quimérica ou recombinante.

   9. POLIPEPTÍDEO caracterizado por ser codificado pela molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, de preferência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NO: 5.

   10. GENE QUIMÉRICO, caracterizado por compreender os seguintes elementos operacionalmente ligados; a. um promotor expressável em vegetal; b. um ácido nucleico compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou codificando o polipeptídeo definido na reivindicação 9; e opcionalmente c. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação funcional em células vegetais, em que pelo menos um dos referidos elementos operacionalmente ligados é heterólogo com relação a um ou mais outro elemento.

   11. GENE QUIMÉRICO de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo referido promotor ser capaz de direcionar a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado pelo menos durante o desenvolvimento (precoce) e meiose do pólen, tal como na antera ou, mais especificamente, tapetum ou micrósporos em desenvolvimento.

   12. CÉLULA VEGETAL de cereal ou planta de cereal ou semente da mesma, tal como uma célula de planta de trigo ou planta ou semente da mesma, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, o polipeptídeo como definido na reivindicação 9 ou o gene quimérico como definido na reivindicação 10 ou 11, em que o referido polipeptídeo, ácido nucleico ou gene quimérico em cada caso é heterólogo com relação a referida célula vegetal ou planta ou semente.

   13. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGETAL de cereal ou planta ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal ou planta de trigo ou semente da mesma, caracterizado por compreender um gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou por aumentar a capacidade de restauração para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo (“CMS”) em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, compreendendo a etapa de fornecer à referida célula vegetal ou planta a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações de 1 a

   8 ou o gene quimérico de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a referida etapa de fornecimento compreende o fornecimento por transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese.

   14. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGETAL ou planta de cereal ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal ou planta de trigo ou semente da mesma, com capacidade de restauração para a esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, ou por aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, caracterizado por compreender as etapas de fornecimento de um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9 ou de aumento da expressão de um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9 na referida célula vegetal ou planta ou semente.

   15. MÉTODO PARA CONVERTER UMA PLANTA de cereal não restauradora em uma planta restauradora para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração para a esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, caracterizado por compreender a etapa de modificar o genoma da planta para compreender e/ou expressar a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 ou o gene quimérico da reivindicação 10 ou 11, em que a referida etapa de modificação compreende modificação por transformação, cruzamento, retrocruzamento, edição do genoma ou mutagênese.

   16. MÉTODO PARA CONVERTER UMA PLANTA de cereal não restauradora em uma planta restauradora para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo, ou para aumentar a capacidade de restauração para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo em uma planta de cereal, tal como uma planta de trigo, caracterizado por compreender as etapas de modificação do genoma da referida planta para fornecer ou aumentar a expressão de um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9 na referida planta.

   17. CÉLULA VEGETAL de cereal ou planta de cereal ou semente da mesma, tal como uma célula vegetal de trigo ou planta ou semente da mesma, caracterizada por ser obtida de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, de preferência, em que a referida planta tem uma capacidade de restauração aumentada para esterilidade masculina citoplasmática (“CMS”) tipo G de trigo.

   18. CÉLULA VEGETAL ou planta ou semente de cereal, de acordo com a reivindicação 12 ou 17, caracterizada pelo polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9 ser expresso, pelo menos, durante o desenvolvimento do pólen (precoce) e meiose, tal como na antera ou, mais especificamente, o tapetum, ou o desenvolvimento dos micrósporos.

   19. CÉLULA VEGETAL ou planta ou semente de cereal, de acordo com a reivindicação 12, 17 ou 18, caracterizada por ser uma célula vegetal, planta ou semente híbrida.

   20. MÉTODO PARA SELECIONAR UMA PLANTA de cereal compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo ou para a produção de uma planta de cereal compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizado por compreender as etapas de: a. identificar a presença, ou expressão, ou transcrição, de uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433, de preferência medindo o nível de RNA transcrito da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433 ou pela detecção de pelo menos parte da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição nucleotídica 55 à posição nucleotídica 2433 através de métodos de detecção de DNA; e opcionalmente b. selecionar a planta que compreende e expressa o referido pelo menos um alelo marcador, em que a referida planta compreende o referido gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, preferencialmente localizado no cromossomo 1A.

   21. MÉTODO PARA RESTAURAR A FERTILIDADE em uma progênie de uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G ou para a produção de uma progênie vegetal fértil a partir de uma planta parental de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma população de plantas descendentes obtidas a partir do cruzamento de uma planta parental de cereal feminina com uma planta parental de cereal masculina, em que a planta parental feminina é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G e em que a planta parental masculina compreende e/ou expressa um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4; b. identificar na referida população uma progênie vegetal fértil compreendendo e/ou expressando a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4; e opcionalmente c. selecionar a referida progênie vegetal fértil; e opcionalmente d. propagar a progênie vegetal fértil.

   22. MÉTODO PARA IDENTIFICAR E/OU SELECIONAR UMA PLANTA de cereal (por exemplo, trigo) que compreende um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizado por compreender as etapas de: a. identificar ou detectar na referida planta a presença, a expressão ou a transcrição de um ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, ou do gene quimérico da reivindicação 10 ou 11.

   b. e, opcionalmente, selecionar a referida planta compreendendo ou expressando ou transcrevendo o referido ácido nucleico ou polipeptídeo ou gene quimérico.

   23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo referido polipeptídeo ser expresso pelo menos durante o desenvolvimento (precoce) do pólen e meiose, tal como em anteras ou, mais especificamente, tapetum, ou micrósporos em desenvolvimento.

   24. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA de cereal, tal como trigo, compreendendo um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizado por compreender as etapas de; a. cruzar uma primeira planta de cereal, tal como uma planta de trigo de qualquer uma das reivindicações 12, 17 ou 18 com uma segunda planta de cereal; b. identificar e opcionalmente selecionar uma progênie vegetal compreendendo ou expressando um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.

   25. MÉTODO PARA PRODUZIR SEMENTES híbridas, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma planta de cereal masculina parental, tal como uma planta de trigo, de acordo com a reivindicação 12, 17 ou 18, em que a referida planta compreende ou expressa o referido alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, em que o referido alelo de gene restaurador funcional está preferencialmente presente na forma homozigótica; b. fornecer uma planta parental de cereal feminina que é uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G; c. cruzar a referida planta de cereal parental feminina com a referida planta de cereal parental masculina; e opcionalmente d. coletar as sementes.

   26. USO do ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por ser para identificar um ou mais alelos de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G.

   27. USO do ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, do polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, do gene quimérico de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por ser para a identificação de uma planta que compreende um alelo de gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo.

   28. USO de uma planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 17 ou 18, ou de uma planta obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, em que a referida planta compreende o referido gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizado por ser para restaurar a fertilidade em uma progênie de uma planta de cereal com esterilidade masculina citoplasmática tipo G, tal como uma planta de trigo.

   29. USO de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 17 ou 18, ou de uma planta obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, em que referida planta compreende o referido gene restaurador funcional para esterilidade masculina citoplasmática tipo G de trigo, caracterizado por ser para produzir sementes híbridas ou uma população de plantas de cereais híbridas, tal como sementes ou plantas de trigo.

   30. MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 em uma planta de cereal, caracterizado por compreender a modificação do genoma, de preferência a modificação direcionada ou manipulação do genoma.

   31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela expressão ser aumentada em pelo menos 2 vezes.

   32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela expressão ser aumentada em pelo menos 10 vezes.

   33. CÉLULA VEGETAL, caracterizada por compreender um gene quimérico que codifica um polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

   34. CÉLULA VEGETAL, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por ser uma célula vegetal de trigo.