CN112166192A - 包含小麦g型胞质雄性不育恢复基因的植物及其用途 - Google Patents

Abstract

描述了选择或产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的禾谷类植物的方法和用于其中的核酸和/或多肽。

Description

包含小麦G型胞质雄性不育恢复基因的植物及其用途

发明领域

本发明总体上涉及植物育种及分子生物学领域并且涉及一种选择或产生包含的禾谷类植物(cereal plant)的方法和用于其中的核酸。

背景技术

胞质雄性不育(CMS)是在商业化杂交种子生产背景下禾谷植物如小麦中主要的目的性状(Kihara,1951,Cytologia 16,177–193)；Wilson和Ross,Wheat Inf Serv.(Kyoto)14:29–30,1962；Lucken,1987(Hybrid wheat.引自Wheat and wheat improvement.编者E.G.Heyne.American Society of Agronomy,Madison,Wis.)；Sage,1976,Adv.Agron.28,265–298)。作为普通小麦(Triticum aestivum)中雄性不育的诱导物，广泛地研究了提莫非维小麦(Triticum timopheevii)(G型)和粘果山羊草(Aegilops kotschyi)(K型)的细胞质，原因在于极少的有害影响(Kaul,Male sterility in higher plants.SpringerVerlag,Berlin 1988；Lucken,1987,上文；Mukai and Tsunewaki,Theor.Appl.Genet.54,1979)。

在使用G型细胞质的杂交种子生产系统中，胞质雄性不育的恢复是关键问题。大部分六倍体小麦变种并不天然地含有能育性恢复(“Rf”)基因(Ahmed等人2001,Genes andGenetic Systems 76,33-38)。在提莫非维小麦(T.timopheevii)复杂恢复体系中，已经报道八个Rf基因座恢复了胞质雄性不育的提莫非维小麦细胞质的能育性，并且已经将这些基因座的染色体位置确定为：Rf1(Chr 1A)、Rf2(Chr 7D)、Rf3(Chr 1B)、Rf4(Chr 6B)、Rf5(Chr 6D)、Rf6(Chr 5D)、Rf7(Chr 7B)和Rf8(Tahir和Tsunewaki,1969,Jpn J Genet 44:1-9；Yen等人,Can.J.Genet.Cytol.11,531-546,1969；Bahl&Maan,Crop Sci.13,317-320,1973；Du等人Crop Sci,31:319-22,Crop 1991；Sinha等人,Genetica 2013,http://dx.doi.org/10.1007/s10709-013-9742-5)。Ma等人(Genome34:727-732,1991)将Rf基因座从伞穗山羊草(Aegilops umbellulata)转移到小麦；建立了Rf基因座位于染色体6AS或6BS上的两个独立的易位系(来自Zhou等人,2005,Euphytica 141(1-2):33–40,doi:10.1007/s10681-005-5067-5)。

Zhang等人(Acta Genetica Sinica 06/2003；30(5):459-64.)描述了恢复系7269-10中位于1AS上的Rf基因座，且SSR标记Xgwm136和这个Rf基因之间的遗传距离是6.7cM。

WO2017158126A1和WO2017158128A1已经提供更精确的标记来鉴定和追踪染色体1AS上的Rf1基因座，例如存在于小麦品系PI 583676(USDA美国小粒谷类作物保藏中心)中的。

Geyer等人(2017,Molecular Genetics and Genomics,https://doi.org/10.1007/s00438-017-1396-z,11/2017上线)将相同的Rf基因座定位为恢复系R3、R113和L19中的Rf1并且估计了其在群体中的影响。

然而仍然存在鉴定额外和/或备选Rf基因的需求，所述基因可以用来开发含有提莫非维小麦细胞质的小麦中能育性恢复的改进方法，包括与其他鉴定的Rf基因组合使用。本发明通过公开来自染色体1A上Rf1基因座的Rf基因，做出贡献。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供(分离或修饰的)核酸分子，所述核酸分子编码小麦G型胞质雄性不育的功能能育恢复基因(Rf)等位体，其中功能恢复基因等位体是包含于SEQ ID NO:1的核苷酸序列内的三角状五肽重复序列蛋白质(PPR)基因的功能等位基因。功能恢复基因可以包含选自以下的核苷酸序列：与SEQ ID NO:4的第55位核苷酸至第2433位核苷酸具有至少85％序列同一性的核苷酸序列；与SEQ ID NO:4具有至少85％序列同一性的核苷酸序列；或编码包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。功能恢复基因等位体可以编码能够与ORF256的mRNA结合、优选地与包含SEQID NO:2的nt 105–121的核苷酸序列结合的PPR蛋白，不过PPR蛋白也可以能够与orf256上的其他位点或与其他线粒体转录物或肽和/或细胞器转录物或肽相互作用，并且可以从USDA登录号PI 583676可获得。在有Rf1功能恢复者的小麦系中，SEQ ID NO.4的核苷酸序列也可以比非Rf1株系中转录至少2倍更高、或至少5倍更高或至少10倍更高，不过在大部分情况下，观察到的差异由有Rf1功能恢复者的小麦系中明显检出转录和非Rf1株系中无可检出转录组成。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种(分离或修饰的)多肽，其由本文所描述的核酸分子编码，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有、优选地在该多肽的整个长度范围内具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的又一个实施方案中，提供一种嵌合基因，所述嵌合基因包含以下有效连接的元件(a)植物可表达启动子；(b)包含本文中所描述核酸分子的或编码本文中所述多肽的核酸；和任选地(c)在植物细胞中有功能的转录终止和多腺苷酸化区域，其中有效连接的元件中至少一者相对于至少一个其他元件是异源的，或含有修饰的序列。因此，植物可表达启动子(a)可以相对于编码本文中所述多肽的核酸(b)是异源的，或可以相对于转录终止和多聚腺苷化区(c)是异源的，当后者存在时，或编码本文中所述多肽的核酸(b)可以相对于转录终止和多聚腺苷化区(c)是异源的，当后者存在时。植物可表达启动子可以有能力指导有效连接的核酸至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间如在花药或更具体地在绒毡层或正在发育的小孢子中表达。

本发明还提供了包含本文中所描述的核酸分子或多肽或嵌合基因的禾谷类植物细胞或禾谷类植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，优选地其中多肽、核酸或嵌合基因在每种情况下相对于植物细胞或植物或种子是异源的。

本发明的又一个实施方案是提供一种用于产生包含用于小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的禾谷类植物细胞或植物或其种子如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，或用于增加禾谷类植物或细胞如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞或植物提供本文中所描述的核酸分子或嵌合基因，其理解为所述提供步骤包括通过转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变来提供。核酸分子或嵌合基因可以转录至少2倍更高。

本发明还提供一种用于产生具有小麦G型胞质雄性不育的恢复能力的禾谷类植物细胞或植物或其种子如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：包括在植物细胞或植物或种子中提供或表达一种或多种如本文所述的多肽或增加其表达。可以通过修饰植物的基因组以包含本文中所描述的核酸分子或嵌合基因而提供Rf-PPR多肽，其中修饰步骤包括转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变。本文还提供编码Rf-PPR蛋白如(修饰或分离的)Rf1-PPR-09蛋白的修饰的核酸，其中所述核酸是通过基因组编辑或诱变(例如，EMS诱变)修饰的。

还提供一种用于将非恢复禾谷类植物如小麦植物转化成小麦G型胞质雄性不育的恢复植物的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，包括修饰植物的基因组以包含本文中所描述的核酸分子或嵌合基因的步骤，其中所述修饰步骤包括通过转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变来修饰。

在另一个实施方案中，提供一种用于将非恢复禾谷类植物如小麦植物转化成小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)的恢复植物的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，包括修饰植物的基因组以增加植物中如本文所述的多肽表达的步骤。

本发明还提供根据本文中所述方法获得的禾谷类植物细胞或禾谷类植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，优选地其中植物具有增加的小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力，优选地其中描述的Rf-PPR多肽至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间，如在花药或更具体地，绒毡层或发育着的小孢子中表达。植物细胞、植物或种子可以是杂交植物细胞、植物或种子。在一个实施方案中，相比于在所述植物中用SEQ ID NO:1或4的核酸序列或SEQ ID NO:5的蛋白质序列获得的恢复，这种植物具有修饰过的Rf1_PPR_09核酸和/或蛋白质，带来禾谷类(如小麦)植物中G型CMS的恢复改进。

在本发明的又一个实施方案中，提供一种用于选择小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物或用于产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物的方法，所述方法包括步骤(a)(如通过转录分析)鉴定包含SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列的核苷酸序列的存在、表达或转录；和任选地选择包含、表达或转录该核苷酸序列的植物。

本发明也提供一种在G型胞质雄性不育禾谷类植物的后代中恢复能育性或从G型胞质雄性不育禾谷类亲本植物产生能育后代植物的方法，所述方法包括步骤(a)提供从雌性禾谷类亲本植物与雄性禾谷类亲本植物杂交获得的后代植物群体，其中雌性亲本植物是G型胞质雄性不育禾谷类植物，并且其中雄性亲本植物包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，所述功能恢复基因等位体包含或转录SEQ ID NO:1(部分地)或SEQ ID NO:4的核苷酸序列；(b)在群体中鉴定包含或转录SEQ ID NO:1(部分地)或SEQ ID NO:4的核苷酸序列的能育后代植物；和任选地(c)选择能育后代植物；和任选地(d)繁殖能育后代植物。

作为本发明的另一个实施方案，提供一种用于鉴定和/或选择包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类(例如小麦)植物的方法，所述方法包括步骤(a)：在植物中鉴定或检测如本文中提供的核酸或PPR多肽或嵌合基因的存在、表达或转录并且任选地选择包含、表达或转录该核酸或多肽或嵌合基因的植物。

本发明的目的还是提供用于产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物(例如小麦)的方法，所述方法包括步骤(a)：使如本文所描述或提供的第一禾谷类植物与第二禾谷类植物杂交；和(b1)鉴定包含、表达或转录小麦G型胞质雄性不育的包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的功能恢复基因等位体的后代植物；或(b2)鉴定并且选择包含、表达或转录小麦G型胞质雄性不育的包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的功能恢复基因等位体的后代植物。

本发明的又一目的是提供一种用于产生杂交种子的方法，所述方法包括步骤：(a)提供一种雄性禾谷类亲本植物，如本文中提供的小麦植物，所述植物包含或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，其中功能恢复基因等位体优选地以纯合形式存在；(b)提供一种其是G型胞质雄性不育禾谷类植物的雌性禾谷类亲本植物，和(c)使雌性禾谷类亲本植物与雄性禾谷类亲本植物杂交；或(a)提供一种雄性禾谷类亲本植物，如本文中提供的小麦植物，所述植物包含或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，其中功能恢复基因等位体优选地以纯合形式存在；(b)提供一种其是G型胞质雄性不育禾谷类植物的雌性禾谷类亲本植物，(c)使雌性禾谷类亲本植物与雄性禾谷类亲本植物杂交；并且(d)收获种子。

本发明也提供如本文所描述的核酸用于鉴定一个或多个其他小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的用途。

还提供如本文所描述的核酸，多肽或嵌合基因用于鉴定植物包含和/或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的用途。

如本文所述的包含和/或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的植物可以用于G型胞质雄性不育禾谷类植物(如小麦植物)的后代中恢复能育性，和/或产生杂交种子或杂交禾谷类植物(如小麦种子或植物)群体。

附图简述

图1：(A)-已鉴定的Rf1-PPR-09基因的预测基因结构。@表示CDS，#表示5’UTR并且*表示3’UTR。(B)已鉴定的Rf1-PPR-09基因的氨基酸序列，其显示转运肽(斜体)和包含RNA识别中所暗示的第5位和第35位氨基酸(粗体)的PPR基序(按交替方式加下划线和不加下划线)。(C)具有PPR基序的Rf1-PPR-09多肽的结构的图示。

图2：Rf1-PPR-09基因在6个对比的各自具有/没有Rf1基因座的NIL对之间，以及在不含有Rf1基因座的对照株系和Rf1供体株系中的平均相对表达水平。用精细定位记标记做KASP基因分型后鉴定含有Rf1的后代，并进行表型分型以证实能育性恢复。

发明详述

本发明描述了鉴定位于染色体1A(短臂1AS)上小麦G型胞质雄性不育(即，含有提莫非维小麦细胞质的株系)的功能恢复(Rf)基因以及测Rf基因的方法。这些方法可以用于标记辅助选择(MAS)包含位于染色体1A上的所述功能恢复基因的禾谷类植物，如小麦。对该基因的鉴定因此在杂交种子生产方法中特别有用，因为它可以例如用于在拥有G型胞质雄性不育的植物的后代中恢复能育性的方法中，由此从G型胞质雄性不育亲本植物产生能育后代植物。同样，本公开还允许鉴定缺乏所期望基因的植物，从而可以鉴定非恢复植物，并且例如，从后续的杂交繁育消除之。对染色体1AS上作为Rf1基因座基础的恢复基因的鉴定进一步允许定向工程化，以例如增加其表达，或活性增加，或作为Rf1基因座基础的基因与其他恢复基因座或基因定向组合。

在植物育种中，了解作为Rf1基因座基础的基因的另一个用途是通过回交育种，辅助轮回亲本基因型的恢复。回交育种是使后代与其亲本之一回返杂交的过程。通常出于以下目的进行回交：将一个或几个来自供体亲本的基因座渐渗入轮回亲本的其他方面是合乎需要的遗传背景。进行的回交的轮次越多，轮回亲本对所产生变种的遗传贡献越大。经常必需如此，因为供体亲本植物可能在其他方面不合乎需要，例如，由于产量低、多产性低等不合乎需要。与之相反，作为加强的育种程序的结果，变种可以具有优异的产量、多产性等，仅在一个所需性状(如能育性恢复)方面有缺陷。如技术人员理解，可以进行回交以选择或反选择性状。例如，在本发明中，可以选择恢复基因以繁育恢复系或可以反选择恢复基因以繁育保种者(雌池)系。

染色体1A上的Rf1基因座定位到沿染色体1A在约15.6cM的区间中的区段。进一步的精细定位收窄1A-区至约1.9cM的区间(沿染色体1A从30.9至32.8cM)(参见公开的PCT申请WO2017/158126–通过引用方式完整并入本文作为参考)。

与本发明有关的雄性不育指植物不能或部分地不能产生有功能的花粉或雄性配子。这可以归因于天然或人工引入的遗传素质或人类对田间植物的干预。在另一方面，雄性能育涉及能够产生足够水平、优选地正常水平有功能花粉和雄性配子的植物。雄性不育/能育性可以在自交(例如通过穗头套袋以引起自我受精)时在能育/有活力结实率方面反映出来。同样，与因杂交(或自交)完全能育植物而产生的结实率相比时，也可以根据雄性不育植物与携带功能恢复基因的植物杂交的结实率描述能育性恢复。部分不能产生花粉或雄性配子优选地指自交时产生少于20％、少于15％或少于10％、或甚至少于5％能育种子的植物。

雄性亲本或花粉亲本是提供雄性配子(花粉)供受精的亲本植物，而雌性亲本或种子亲本是提供雌性配子供受精的植物，所述雌性植物是一个携带种子的植物。

如本文所用的胞质雄性不育或“CMS”指基于胞质和母系遗传的雄性不育。CMS是植物中因胞核和线粒体特异性相互作用所致的完全或部分雄性不育并借助细胞质母系遗传。雄性不育是植物不能或部分不能产生有功能的花药、花粉或雄性配子，尽管CMS植物仍产生有活力的雌性配子。部分不能产生花粉或雄性配子优选地指自交时产生少于20％、少于15％或少于10％、或甚至少于5％能育种子的植物。胞质雄性不育在农业中用于促进杂交种子产生。胞质雄性不育(“CMS”)由线粒体基因组中的一个或多个突变引起(称作“不育细胞质”)并且作为显性、母系传递性状遗传。对于杂交种子生产中待用的胞质雄性不育，种子亲本必须含有不育细胞质并且花粉亲本必须含有(核)恢复基因(Rf基因)，以恢复从杂交种子培育的杂交植物的能育性。因此，这类Rf基因优选地是至少部分显性的、最优选地显性的，以便在后代中具有足够的恢复能力。

如本文所用，“小麦G型胞质雄性不育”指这样的提莫非维小麦细胞质，其引入普通小麦(即Triticum aestivum)时可以赋予雄性不育，因而产生携带普通小麦核基因、但携带雄性不育的提莫非维小麦细胞质的植物。作为普通小麦中雄性不育的诱导物，已经广泛地研究了提莫非维小麦细胞质(G型)(Wilson和Ross,Genes Genet.Syst.1962,上文；Kaul,Male sterility in higher plants.Springer Verlag,Berlin.1988；Lucken,Hybridwheat.引自Wheat and wheat improvement.E.G.Heyne编著.American Society ofAgronomy,Madison,Wis,1987；Mukai和Tsunewaki,Theor.Appl.Genet.54,153-60,1979；Tsunewaki,Jpn.Soc.Prom.Sci.(Tokyo),49-101,1980(引自：Tsunewaki K.(编者)Geneticdiversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops；Tsunewaki等人,GenesGenet.Syst.71,293-311,1996)。提莫非维小麦细胞质赋予的CMS表型的起源涉及一个称作orf256的新嵌合基因/转录物表达，所述嵌合基因/转录物位于cox1序列上游并且随明显正常的cox1基因共转录。针对预测自orf256核苷酸序列的多肽序列制备的抗血清识别到一种在CMS系中存在、但亲本系或恢复系中不存在的7kDa蛋白质(Song和Hedgcoth,Genome 37(2),203–209,1994；Hedgcoth等人,Curr.Genet.41,357–365,2002)。

如本文所用，“小麦G型胞质雄性不育的恢复基因功能等位体”或“小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因座”或“小麦G型胞质雄性不育的恢复QTL”表示具有在G型胞质雄性不育(“CMS”)的杂交后代(即，携带普通小麦核基因、但细胞质来自提莫非维小麦的株系)中恢复能育性的能力的等位体。对抗G型细胞质的恢复例如已经由Robertson和Curtis(CropSci.7,493–495,1967)、Yen等人(Can.J.Genet.Cytol.11,531-546,1969)、Bahl和Maan(Crop Sci.13,317-320,1973)、Talaat等人(Egypt.J.Genet.2,195–205,1973)、Zhang等人(2003,上文)、Ma和Sorrels(1995,上文)、Kojima(1997,上文)、Ahmed等人(2001,上文)、Zhou等人(2005,上文)描述。这类恢复基因或等位基因也称作Rf基因和Rf等位基因。如至少在实施例中所描述的那样，与经鉴定不包含Rf1基因座的小麦系相比或与非恢复小麦系相比时，本文中所述的恢复基因还在经鉴定包含Rf1基因座的小麦系中、尤其在发育着的穗中表达更高。与经鉴定不包含恢复Rf1基因座的小麦系中恢复基因的平均相对表达水平(尤其发育着的穗中的平均相对表达水平)相比，经鉴定包含恢复Rf1基因座的小麦系中恢复基因的平均相对表达水平从约2倍至至少约25倍更高，如7倍和12倍之间更高。通常，该比率是约10倍更高。预期与经鉴定不包含恢复Rf1基因座的小麦系相比时，经鉴定包含恢复Rf1基因座的小麦系中Rf1基因编码的蛋白质水平也增加并且可以同等地是至少2倍更高，或在约2倍至至少约25倍之间更高，如在7倍和12倍之间更高。

术语“保种者”指与CMS植物杂交时不恢复能育性并在后代中维持不育的植物。保种者用来繁殖CMS系，并且也可以称作非恢复系。保种系具有与CMS系相同的核基因(即不含有功能性Rf基因)，但在造成植物中雄性不育的胞质因子组成方面有差异，即保种者具有“能育性”细胞质。因此当雄性不育系与其保种者杂交时，将获得具有相同雄性不育基因型的后代。

术语“禾谷类”和“禾谷类植物”指单子叶禾本科(Poaceae)的成员，其中栽培所述成员以得到其籽粒的可食用组分。这些籽粒包含胚乳、胚芽和麸糠组成。玉米、小麦和稻合计占超过80％的全球籽粒产量。禾谷类植物家族的其他成员包括黑麦、燕麦、大麦、黑小麦、高粱、野生稻、斯佩耳特小麦、单粒小麦、二粒小麦、硬粒小麦和远古硬质小麦(kamut)。“雌性禾谷类植物”或“胞质雄性不育禾谷类植物”是包含如本文所述造成雄性不育的细胞质的禾谷类植物。

在一个实施方案中，本发明的禾谷类植物是包含至少A基因组或相关基因组的禾谷类植物，如六倍体小麦(普通小麦；ABD)、斯佩耳特小麦(斯佩耳特小麦(Triticumspelta)；ABD)、硬粒小麦(硬粒小麦(T.turgidum)；AB)、大麦(Hordeum vulgare；H)和黑麦(黑麦(Secale cereale)；R)。在一个具体实施方案中，本发明的禾谷类植物是小麦(T.aestivum；ABD)。

一种检测SNP记标记的特别有用的测定法例如是KBioscience竞争性等位基因-特异性PCR(KASP，参见www.kpbioscience.co.uk)。为了开发KASP-测定法，选择SNP上游的70碱基及其下游70个碱基对，并且设计二个等位基因特异性正向引物和一个等位基因特异性反向引物。关于KASP测定方法，参见，例如Allen等人,2011,Plant Biotechnology J.9,1086-1099，尤其第1097-1098页。

鉴定的染色体区段及其标记记的位置在表示为重组频率或图谱单位时，在本文中作为一般信息提供。使用特定的小麦群体，获得本文所述的实施方案。因此，参考使用的群体，将具体区段和标记的位置表示为图谱单位。预期以图谱单位给出的具体区段和标记的数目可以在栽培品种之间变动并且不是DNA区段和标记的必需定义的部分，否则的话例如通过核苷酸序列描述DNA区段和标记。

如本文所用，术语“基因座”(复数形式：基因座(loci))指基因组上(例如，染色体上)的某个地点或位置，其中存在例如基因或遗传标记。如本文所用，QTL(数量性状基因座)指基因组上与可度量特征(即，性状)对应的位置，如Rf基因座。

如本文中所用，术语“等位基因”，如在基因的等位体中，意指基因或特定基因座的任意一个或多个备选形式。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座(基因座的复数式)处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上或可能存在于同源染色体上。

如本文中所用，术语“同源染色体”意指这样的染色体，它们含有相同生物学特征的信息并且在相同基因座处含有相同的基因，但可能含有这些基因的不同等位基因。同源染色体是减数分裂期间配对的染色体。代表某生物的全部生物学特征的“非同源染色体”形成一个集合，并且细胞中的集合数目称作倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每条同源染色体从不同的亲本继承。在四倍体物种中，存在两组二倍体基因组，因而这两个基因组的染色体称作“同源染色体”(并且类似地，这两个基因组的基因座或基因称作同源基因座或基因)。同样地，六倍体物种具有三组二倍体基因组等。二倍体、四倍体或六倍体植物物种可以在特定基因座包含巨大数目的不同等位基因。驯化小麦物种的倍性水平从二倍体(单粒小麦(T.monococcum)，2n＝14，AA)、四倍体(硬粒小麦(T.turgidum)，2n＝28，AABB)至六倍体(普通小麦(T.aestivum)，2n＝42，AABBDD)。

如本文中所用，术语“杂合”意指两个不同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。相反，如本文中所用，术语“纯合”意指两个相同等位基因位于某个特定基因座处，但各自定位在细胞中的相应同源染色体对上的遗传情况。

特定基因或基因座的等位基因可以具有特定的外显率，即它可以是显性、部分显性、共显性、部分隐性或隐性的。显性等位基因是特定基因座或基因的变体，在生物中以杂合形式存在时，所述变体导致与纯合形式存在时相同的表型。在另一方面，隐性等位基因是等位基因的变体，其中杂合形式下，所述变体受显性等位基因支配，因此产生显性等位基因赋予的表型，而仅在纯合形式下才产生隐性表型。部分显性、共显性或部分隐性指这样的情况，其中杂合子显示作为对特定基因座或基因的一个等位基因纯合的生物和对其另一个等位基因纯合的生物的表型之间的中间表型。这种中间表型是部分或不完全显性或外显率的展示。当部分显性出现时，后代当中通常观察到一系列表型。这适用于部分隐性的等位基因。

如本文所用，“重叠群”指共同代表DNA共有区域的一组重叠DNA区段。在自下而上的测序项目中，重叠群指重叠的序列数据(读段)；在自上而下的测序项目中，重叠群指形成用来指导测序和组装的基因组物理图谱的重叠克隆。取决于语境，重叠群因此可以指克隆中所含的重叠性DNA序列和重叠的物理区段(片段)。

在又一个实施方案中，所述功能恢复基因等位体是定位在在WO2017/158126中描述的基因组区域内部的编码三角状五肽重复序列(PPR)蛋白的基因(即PPR基因)的功能等位体。

PPR蛋白基于其结构域架构分类。P类PPR蛋白拥有一般典型地由35氨基酸残基组成的多个规范的氨基酸基序，不过所述基序的范围可以在34和36个或甚至38个氨基酸之间。PPR蛋白可以含有线粒体靶向肽，但正常情况下缺少额外的结构域。这个类别的成员在细胞器基因表达的大部分方面具有功能。PLS类PPR蛋白具有三个不同类型的PPR基序，其长度各异；P(35个氨基酸)、L(长，35–36个氨基酸)和S(短，～31个氨基酸)，并且认为这个类别的成员主要在RNA编辑方面发挥作用。PLS类的各亚型基于它们拥有的额外C末端结构域归类(Manna等人,2015,Biochimie113,第93-99页综述，所述文献通过引用的方式并入本文作为参考)。

迄今鉴定的大部分能育性恢复(Rf)基因来自编码PPR蛋白的基因的小型进化枝(Fuji等人,2011,PNAS 108(4),1723-1728-通过引用的方式并入本文作为参考)。作为能育性恢复(Rf)基因发挥作用的PPR基因在Fuji(见上文)中称作Rf-PPR基因。它们主要包含串联阵列的15-20个PPR基序，所述基序每个包含约35个氨基酸。

大部分Rf-PPR基因属于P类Rf-PPR亚家族，不过也已经鉴定PLS类Rf-PPR基因。对其他方面非常保守的PPR基序内部的特定氨基酸观察到高置换率，提示多样化选择，这促成以下结论：这些残基可能直接涉及与RNA靶结合。这已经导致提出允许预测天然存在的PPR蛋白的RNA靶序列的“PPR代码”以及设计出可以结合目的RNA分子的合成的PPR蛋白，因而通过比对的PPR基序中位置2和/或5和/或35处每个RNA碱基和氨基酸侧链之间不同的氢键形成样式，确保序列特异性(参见Melonek等人,2016,Nat Sci Report 6:35152,Barkan等人,2012,PLoS Genet 8(8):e1002910；Barkan和Small 2014,Annu.Rev.Plant Biol.65:415–442(https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-040159)；Miranda,McDermott和Barkan 2017,Nucleic Acids Res.46,2613–2623(https://doi.org/10.1093/nar/gkx1288)；Shen等人2016,Nat.Commun.7,11285(https://doi.org/10.1038/ncomms11285)；并且尤其，Yagi Y,Hayashi S,Kobayashi K,Hirayama T,Nakamura T(2013)Elucidation of the RNA Recognition Code for Pentatricopeptide RepeatProteins Involved in Organelle RNA Editing in Plants.PLoS ONE 8(3):e57286.doi:10.1371/journal.pone.0057286，所述全部文献均通过引用的方式并入本文作为参考)。

因此，如本文所用，Rf-PPR基因的功能等位基因指这样的Rf-PPR基因的等位基因，其为如本文所述的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，即在(性相容)禾谷类植物中表达时，所述等位基因能够在与G型胞质雄性不育禾谷类植物杂交的后代中恢复能育性。Rf-PPR基因的这种功能等位基因也称作PPR-Rf基因(或Rf-PPR基因)，后者随后编码PPR-Rf(或Rf-PPR)蛋白。

尽管不意图将本发明限于具体作用模式，但认为功能恢复基因等位体编码多肽，如具有与负责CMS表型的线粒体orf256(SEQ ID NO:2)转录物(特异性)结合的能力的PPR蛋白。通过扫除或干扰orf256 mRNA，可以逆转CMS表型。如本文所用，“结合于”或“特异性结合于”或“(特异性)识别”意指，根据上述的PPR代码，PPR蛋白含有众多PPR基序，所述基序在位置5和35处具有特定残基并且以如此方式排序，从而能够以序列特异性或序列优选方式与靶mRNA(如orf256 mRNA)结合。

备选地，功能恢复基因等位体可以编码多肽，如具有与负责花粉致死性和CMS表型的嵌合mRNA或其他线粒体mRNA(特异性)结合的能力的PPR蛋白。功能恢复基因等位体还可以编码多肽，如具有与多个线粒体mRNA(特异性)结合、影响转录等的能力的PPR蛋白。通过另一备选的作用模式，功能恢复基因等位体可以编码多肽，如能够与额外的相互作用蛋白(如甘氨酸丰富蛋白(GRP)、己糖激酶或DUF-WD40)形成复合体，为了指导orf256和/或其他细胞毒性线粒体mRNA或质体mRNA的降解或剪切或为了抑制其转录、或为了抑制负责CMS表型的细胞毒性嵌合肽翻译的PPR蛋白。

例如，功能恢复基因等位体可以编码含有PPR基序的PPR蛋白，所述基序在位置5和35具有特定残基，从而识别orf256 mRNA内部的靶序列。在一个实例中，本文中所描述的Rf1-PPR-09的预测的识别序列可以用概率矩阵确定(如Yagi等人,2013中所描述，上文)并且发现是5’-ATTTGTCTATTTTTCT-3’(SEQ ID NO:3)。这种序列位于SEQ ID NO:2的ATG起始密码子下游的核苷酸105-121处(orf256位置192-207)。不意图将本发明限于具体作用模式，Rf1-PPR-09蛋白作用模式的可能机理可以是阻断细胞毒性orf256转录物的翻译并且指导转录向coxI转录发生。已知在含有G型CMS的普通小麦系中，在单一嵌合mRNA中产生涵盖orf256和cox1基因序列的嵌合mRNA长转录物，导致orf256翻译并且因此产生细胞毒性ORF256蛋白。在含有G型CMS的恢复的普通小麦系中，则仍存在orf256–coxI长RNA的转录，但ORF256蛋白不再翻译。假定Rf1-PPR-09与其靶位点的结合阻止嵌合的长mRNA中ORF256的翻译。(Rathburn HB和Hedgcoth C,A chimeric open reading frame in the 5'flankingregion of coxI mitochondrial DNA from cytoplasmic male-sterile wheat.,PlantMol Biol.1991May；16(5):909-12.；Song J和Hedgcoth C.,Influence of nuclearbackground on transcription of a chimeric gene(orf256)and CoxI in fertile andcytoplasmic male sterile wheats.Genome.1994Apr；37(2):203-9.；Song J和HedgcothC.,A chimeric gene(orf256)is expressed as protein only in cytoplasmic male-sterile lines of wheat.,Plant Mol Biol.1994Oct；26(1):535-9.；Hedgcoth C,el-Shehawi AM,Wei P,Clarkson M,Tamalis D.,A chimeric open reading frameassociated with cytoplasmic male sterility in alloplasmic wheat with Triticumtimopheevi mitochondria is present in several Triticum and Aegilops species,barley,and rye.Curr Genet.2002Aug；41(5):357-65)).

另外，PPR蛋白可以结合其他PPR蛋白一起工作，所述其他PPR蛋白可以由相同Rf基因座中的基因编码，和/或由位于其他Rf基因座(包括(WO2017/158127中描述的)染色体1B上鉴定的Rf3基因座)的任一者中的基因编码。在一个实施方案中，Rf1_PPR_09基因在禾谷类植物如小麦植物中与选自Rf2、Rf3、Rf4、Rf5、Rf6、Rf7和Rf8的一个或多个Rf基因座或Rf基因组合使用；如与Rf3和Rf6组合、与Rf3和Rf7组合、与Rf4和Rf6组合、与Rf4和Rf7组合或与Rf3和Rf4组合使用。在一个实施方案中，Rf基因座或Rf基因与本发明Rf1_PPR-09基因的这种组合出现在小麦基因组中的相同基因座处(例如，通过易位、转化或基因组工程化入一个基因座)。

功能恢复基因或等位体可以例如包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或编码具有SEQID NO.:5的氨基酸序列的多肽。

功能恢复基因等位体还可以例如编码具有下述一个或多个突变(插入、缺失、置换)的PPR蛋白，所述突变可以影响mRNA或蛋白质稳定性，例如增加mRNA或蛋白质稳定性的突变，因而导致PPR蛋白的表达增加，尤其在早期花粉发育和减数分裂期间增加，如在花药中或更具体地绒毡层中或正在发育的小孢子中增加。

在一个实施方案中，功能恢复基因等位体是Rf-PPR基因的功能等位基因，所述功能等位基因包含SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列、或SEQ IDNO:4、或编码SEQ ID NO:5的多肽序列的核苷酸序列。功能恢复基因等位体可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:4基本上相同(如本文定义)，诸如与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433具有至少85％、85.5％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。优选地在SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列的整个长度范围内计算序列同一性百分数。功能恢复基因等位体还可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:5具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地在SEQ ID NO:5的多肽的整个长度范围内计算序列同一性百分数。

在又一个实施方案中，功能恢复基因等位体是如至少登录号PI 583676(USDA美国小粒谷类作物保藏中心，也称作Dekalb 582M并且登记为US PVP 7400045)中那样存在(并且如可衍生自其中)的功能恢复基因等位体。

本发明进一步描述一种产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类(例如小麦)植物的方法，所述方法包括步骤：

a.使包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的第一禾谷类植物与第二植物杂交，所述功能恢复基因位于染色体1A上并且具有与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列，或具有编码包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

b.通过以下方式鉴定到(和任选地选择)包含或者包含并转录位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的后代植物：通过鉴定后代植物包含至少与SEQ IDNO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列或包含编码包含与SEQID NO:5基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

还提供一种产生禾谷类植物的方法，所述禾谷类植物包含位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，所述方法包括步骤：

a.使对于小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因是纯合的第一禾谷类植物与第二禾谷类植物杂交，所述功能恢复基因位于染色体1A上并且具有与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列，或具有编码包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

b.获得后代植物，其中所述后代植物包含步骤(a)中定义的位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体。

第二禾谷类植物可以是缺少位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的植物，包括不转录或不表达鉴定的恢复基因的禾谷类植物。

在甚至又一个实施方案中，本发明提供一种产生F1杂交禾谷类种子或F1杂交禾谷类植物的方法，所述方法包括步骤：

a.提供雄性禾谷类(例如小麦)亲本植物，所述亲本植物包含或者包含并表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，其位于染色体1A上并且具有与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列，或具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列；

b.使所述雄性亲本植物与雌性禾谷类(例如小麦)亲本植物杂交，其中雌性亲本植物是G型胞质雄性不育禾谷类植物；并且

c.任选地收集来自所述杂交的杂交种子。

F1杂交种子和植物优选地包含至少一个与如本文所描述的位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育功能恢复基因等位体连锁的标记记等位基因，并且培育自这些种子的F1植物因此是能育的。优选地，雄性亲本植物对于小麦G型胞质雄性不育的位于染色体1A上的所述功能恢复基因等位体是纯合的。

在上述方法中，可以通过分析以下核苷酸序列的存在、或转录、或表达，选择或鉴定用于杂交的雄性亲本植物，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同，或编码了包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列的多肽。

本发明也提供通过前述任一者方法获得的禾谷类植物，如小麦植物，所述禾谷类植物包含、表达或转录与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列，或包含、表达或转录编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列。

这类植物可以在不同的基因组背景下含有小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，并且可以例如缺少SEQ ID NO:1从位置1至位置1000的核苷酸序列和/或SEQ IDNO:1从位置6467至位置7923的核苷酸序列，或缺少以下核苷酸序列的任一者或其组合：SEQID NO:1从位置1至位置500的核苷酸序列、SEQ ID NO:1从位置1至位置1000的核苷酸序列、SEQ ID NO:1从位置6467至位置7000的核苷酸序列、SEQ ID NO:1从位置7000至位置7500的核苷酸序列或SEQ ID NO:1从位置7500至位置7923的核苷酸序列。

还提供来自根据本发明的禾谷类植物的植物部分、植物细胞和种子，其包含或者包含并表达功能恢复基因等位体。本发明的植物、植物部分、植物细胞和种子也可以是杂交植物、植物部分、植物细胞或种子。

还提供一种在禾谷类植物的生物样品中位于染色体1A上的确定小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的存在或不存或其接合性状态方法，所述方法包括从所述生物样品提供基因组DNA，并且对所述DNA分析以下核苷酸序列的存在或不存在或接合性状态，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同或编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列。

还提供一种鉴定和/或选择包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类(例如小麦)植物的方法，所述方法包括步骤：

a.在所述植物中鉴定或检测以下者的存在：核酸，其具有与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列或具有编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列；或多肽，其包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列；

b.和任选地选择包含所述核酸或多肽的所述植物。

同样地，鉴定或检测可以包括获得生物样品(例如蛋白质)或基因组DNA并且根据本领域熟知的方法，如杂交、PCR、Rt-PCR、DNA印迹法、DNA印迹加测序、SNP检测方法(例如，如本文所描述)、蛋白质印迹法、ELISA等，基于本文提供的序列的方法，确定核酸或多肽的存在。

本发明也提供小麦G型胞质雄性不育的位于染色体1A上的功能恢复基因的序列用于鉴定至少一个其他标记的用途，所述其他标记包含与小麦G型胞质雄性不育的位于染色体1A上的所述功能恢复基因连锁的等位基因。这类标记记也遗传连锁于或紧密连锁于恢复基因，并且也处于本发明的范围内。可以通过多种遗传作图或物理作图技术中的任一者鉴定标记记。确定是否标记记与恢复基因遗传连锁的方法是本领域技术人员已知的并且例如包括区间作图(Lander和Botstein,(1989)Genetics 121:185)、回归作图(Haley和Knott,(1992)Heredity 69:315)或MQM作图(Jansen,(1994)Genetics 138:871)、rMQM作图。此外，这类物理作图技术如染色体步移、重叠群作图和组装，扩增子再测序、转录组测序、定向捕获和测序、下一代测序等，可以用来鉴定和分离在本发明背景下可用作标记记的额外序列。

本发明还提供与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433基本上相同的核苷酸序列、或编码包含与SEQ ID NO:5基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的用途，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列基本上相同的多肽的用途，用于鉴定包含小麦G型胞质雄性不育的所述功能恢复基因的植物或用于产生杂交种子。

还提供植物用于恢复G型胞质雄性不育禾谷类植物(如小麦植物)的后代中能育性或产生杂交禾谷类植物(如小麦植物)群体的用途，其中所述植物通过如本文所描述的任一方法获得并且包含与如本文所述的位于染色体1A上的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的至少一个标记等位基因。

还提供包含如本文所述的功能恢复基因的重组核酸分子，尤其重组DNA分子。在一个实施方案中，重组DNA分子包含植物可表达启动子，优选地异源植物启动子，所述启动子与以下核苷酸序列有效连接：与SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列具有如本文定义的实质同一性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:4的核苷酸序列，或编码包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。重组DNA分子可以任选地包含转录终止和多聚腺苷化区，它们优选地在植物细胞中有功能。另外，提供包含重组DNA的DNA载体。重组DNA分子或DNA载体可以是分离或修饰的核酸分子。包含功能恢复基因的DNA可以处于微生物如细菌(例如农杆菌(Agrobacterium)或大肠杆菌(E.coli))中。

术语“异源”指衍生自不同来源的两个或更多个核酸序列或蛋白质序列之间的关系。例如，启动子相对于有效连接的核酸序列(如编码序列)是异源，如果这种组合正常情况下不存在于自然界中。此外，特定序列可以相对于插入该序列的细胞或生物是“异源”的(即不天然存在于这种特定细胞或生物中)。在一个实施方案中，如本文指出现在某些植物物种中的核酸或蛋白质时所用，术语“异源”还包括与出现在所述植物物种中的先前存在的核酸或蛋白质序列相比，其序列已经过修饰或突变的核酸或蛋白质。因此，在核酸中缺失、添加或置换一个或多个核苷酸或在小麦植物中出现的蛋白质序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸后(例如，修饰天然启动子以纳入增加转录的调节元件如增强子元件，或通过失活或移除某些负向调节元件如阻遏子元件或miRNAs或lncRNAs的靶位点而修饰天然启动子)，这种修饰的核酸或蛋白质也视为对小麦植物或对有效连接的序列为异源。

功能恢复基因等位体还可以编码在PPR基序的α-螺旋结构域中具有突变(如影响构成PPR基序的二个α-螺旋之间发夹形成的突变)的PPR蛋白。

功能恢复基因等位体还可以编码具有影响PPR蛋白二聚化的突变的PPR蛋白。例如已经发现，‘类囊体装配8’(THA8)蛋白质是剪接ycf3(参与叶绿体类囊体膜生物生成的基因)的转录物所需要的三角状五肽重复序列(PPR)RNA结合蛋白。THA8一旦与单链RNA结合，则形成非对称二聚体，已结合的RNA在二聚体界面处。这个二聚体复合物形成过程由N末端PPR基序1和2和C末端基序4和5介导(Ke等人,2013,Nature Structural&MolecularBiology,20,1377–1382)。

功能恢复基因等位体还可以编码在表达时靶向至线粒体或其他细胞器的PPR蛋白。这个可以例如因存在(植物中有功能的)线粒体靶向序列或线粒体信号肽或线粒体转运肽或其他的细胞器靶向信号而实现。线粒体靶向信号是长10-70个氨基酸的肽，其指引新合成的蛋白质至线粒体，一般发现于N末端。线粒体转运肽富含带正电荷的氨基酸，但通常缺少负电荷。它们具有在非水质环境(如，膜)中形成两亲性a-螺旋的潜力。线粒体靶向信号可以含有额外的信号，所述信号随后靶向蛋白质至线粒体的不同区域，如线粒体基质。如同信号肽，一旦靶向过程完成，则切除线粒体靶向信号。线粒体转运肽例如在Shewry和Gutteridge(1992,Plant Protein Engineering,143-146，及其中的参考文献)、Sjoling和Glaser(Trends Plant Sci第3卷,第4期,1998年4月1日,第136-140页)、Pfanner(2000,Current Biol,第10卷,第11期,第R412-R415页)、Huang等人(2009,Plant Phys 150(3):1272–1285)、Chen等人(1996,PNAS,第93卷,第11763-11768页),Fujii等人(Plant J 2016,86,504–513)中描述。SEQ ID NO:5从位置1至位置48的氨基酸序列是这类线粒体导引序列的实例。

在又一个实施方案中，由所述(分离的)核酸分子编码的所述功能恢复基因等位体从USDA登录号PI 583676可获得。

还提供(分离或修饰的)由如上文所述的核酸分子编码的多肽，所述多肽是小麦G型胞质雄性不育的功能恢复蛋白，或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。

也可以克隆功能恢复基因等位体并可以例如通过以下方式，产生嵌合基因：将植物可表达启动子与功能恢复基因等位体和任选地在植物中有功能的参与转录终止和多聚腺苷化的3’末端区有效连接。可以将这种嵌合基因引入植物细胞，并可以将植物细胞再生成完整植物以产生转基因植物。在一个方面，根据本领域熟知的任何方法，转基因植物是禾谷类植物，如小麦植物。

因此，在一个具体实施方案中，提供了嵌合基因，其包含(分离或修饰的)如上文所述的编码功能恢复基因等位体的核酸分子，所述核酸分子与异源性植物可表达启动子和任选地3’终止和多聚腺苷化区有效连接。

本文涵盖这种(分离或提取或修饰的)核酸分子和/或这种嵌合基因和/或这种染色体片段用于产生包含功能恢复基因等位体的植物细胞和植物的用途。在一个方面，它可以用于产生包含功能恢复基因等位体的转基因禾谷类(例如小麦)细胞、植物和植物部分或种子和能够针对如上文所述的小麦G型胞质雄性不育恢复能育性的植物。

提供宿主或宿主细胞，如(禾谷类)植物细胞或(禾谷类)植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，其包含如上文所述的(分离或修饰的)核酸分子、(分离或修饰的)多肽或嵌合基因，其中优选地所述多肽、所述核酸或所述嵌合基因在每种情况下均相对于所述植物细胞或植物或种子是异源的或被修饰的。宿主细胞例如还可以是细菌，如大肠杆菌或农杆菌属物种(Agrobacterium sp.)如根癌农杆菌(A.tumefaciens)。

因此，还提供一种用于产生禾谷类植物细胞或植物或其种子如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，所述植物细胞或植物或其种子包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：向所述植物细胞或植物提供如本文所述的分离或修饰的核酸分子或嵌合基因，其中所述提供包括转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变。如本文所用，恢复能力意指植物在与G型胞质雄性不育系的杂交的后代中恢复能育性的能力。优选地，所述植物表达本发明的多肽或具有增加的本发明多肽表达。优选地，所述表达(增加)是至少在花粉发育和减数分裂(早期阶段)期间，如在花药或更具体地绒毡层，或正在发育的小孢子中(其中在提供步骤之前，所述植物不表达或更低程度地表达该多肽)。

因此，还提供一种用于产生禾谷类植物细胞或植物或其种子如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，所述植物细胞或植物或其种子具有小麦G型胞质雄性不育的恢复能力，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育恢复能力的方法，所述方法包括步骤：在所述植物细胞或植物或种子中增加如本文所述的(分离或修饰的)多肽表达。优选地，所述表达(增加)是至少在花粉发育和减数分裂(早期阶段)期间，如在花药或更具体地绒毡层，或正在发育的小孢子中。在表达步骤或表达增加步骤之前，所述植物不表达或较低程度地表达多肽和/或没有或较低程度地具有小麦G型胞质雄性不育恢复能力。在一个实施方案中，通过工程化编码恢复多肽的核苷酸序列，增加如本文所述的多肽表达，这包括慎重地修饰编码恢复多肽的基因的核苷酸序列，诸如增加基因的基因拷贝数、插入增加从基因所转录RNA的稳定性或从基因所表达多肽的稳定性的修饰；修饰上游区域/启动子区、修饰转录终止和多聚腺苷化区等。

可以通过以下方式增加表达：向植物提供如本文所述的(重组)染色体片段或(分离或修饰的)核酸分子或嵌合基因，因而编码功能恢复基因等位体的核酸处于适宜调节元件(如在目的组织/细胞中驱动表达的启动子)的控制下，还通过下方式增加表达：向植物提供与转录增强子偶联的例如(特异性)识别启动子区并促进转录的转录因子，如TAL效应子、dCas(“死”Cas)、dCpf1(“死”Cpf1)等。

还描述了一种将不能够在与G型胞质雄性不育系杂交的后代中恢复能育性的禾谷类植物(如小麦植物)(非恢复植物)转化成能够在与G型胞质雄性不育系杂交的后代中恢复能育性的植物(恢复植物)的方法，所述方法包括步骤：修饰所述植物的基因组以包含(或包含并表达)(分离或修饰的)编码如本文所述的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的核酸分子或嵌合基因，其中所述修饰包括转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变，优选地转化、基因组编辑或诱变。优选地，所述植物表达本发明的多肽，尤其至少在花粉发育和减数分裂(早期阶段)期间，如在花药或更具体地绒毡层，或发育着的小孢子中表达。在所述修饰之前，所述植物不表达或较低程度地表达多肽和/或没有或较低程度地具有小麦G型胞质雄性不育恢复能力。

还提供一种用于将非恢复禾谷类植物如小麦植物转化成小麦G型胞质雄性不育的恢复植物的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育恢复能力的方法，所述方法包括步骤：修饰所述植物的基因组以增加所述植物中本发明多肽的表达。优选地，所述表达(增加)是至少在花粉发育和减数分裂(早期阶段)期间，如在花药或更具体地绒毡层，或正在发育的小孢子中。在所述修饰之前，所述植物不表达或较低程度地表达多肽和/或没有或较低程度地具有小麦G型胞质雄性不育恢复能力。

可以例如通过修饰天然启动子以包含增加转录的调节元件(如某些增强子元件)，还通过失活或移除某些负向调节元件(如阻遏子元件或miRNA或lncRNA的靶位点)，修饰基因组以增加多肽表达。包含该启动子的Rf1 5’/上游区域包含在SEQ ID NO 1中核苷酸3616的上游。

还描述了植物细胞或植物、优选地禾谷类植物细胞或禾谷类植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，其根据根据前述任一方法产生，优选地其中与提供步骤或修饰步骤之前的所述植物相比，所述植物具有增加的小麦G型胞质雄性不育恢复能力。还描述了根据以上方法获得的这种植物在与G型胞质雄性不育植物杂交的后代中恢复能育性或产生杂交植物或杂交种子的用途。这种植物细胞、植物或种子可以是杂交植物细胞、植物或种子。

如本文所用，基因组编辑指使用序列特异性酶(如核酸内切酶，切刻酶，碱基转化酶)和/或供体核酸(例如dsDNA、寡聚物)，定向修饰基因组DNA以在DNA中引入所需的改变。可以接受编程以识别特定DNA序列的序列特异性核酸酶包括大范围核酸酶(meganucleases)(MGN)、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和RNA指导或DNA指导的核酸酶如Cas9,Cpf1,CasX,CasY,C2c1,C2c3、某些基于Argonaut的系统(参见，例如Osakabe和Osakabe,Plant Cell Physiol.2015年3月；56(3):389-400；Ma等人,MolPlant.2016年7月6日；9(7):961-74；Bortesie等人,Plant Biotech J,2016,14；Murovec等人,Plant Biotechnol J.15:917-926,2017；Nakade等人,Bioengineered第8卷,第3期:265–273,2017；Burstein等人,Nature 542,37–241；Komor等人,Nature 533,420–424,2016；所述文献均通过引用的方式并入本文作为参考)。供体核酸可以用作修复序列特异性核酸酶所致DNA断口的模板，但也可以如此用于基因打靶(不引起DNA断口)，以将目的变化引入基因组DNA中。

因此，使用这些技术，通过对现有Rf-PPR基因做出所需改变或备选地在特定基因组位置处引入一个或多个编码(例如，如本文所述的)功能性Rf-PPR蛋白的完整序列，可以将缺少小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的植物(非恢复植物)转化成恢复植物。

如本文所用的诱变例如指EMS诱变或辐射所致诱变等。

本发明的一个实施方案还是转基因禾谷类细胞，例如转基因小麦细胞，所述细胞在它们的基因组中包含如所描述的(分离或修饰的)核酸分子或如所描述的嵌合基因，所述核酸分子或嵌合基因包含如所描述的功能恢复基因等位体。在一个方面，包含Rf等位基因的DNA分子稳定整合入禾谷类(例如小麦)基因组。

因此，提供禾谷类植物、植物部分、植物细胞或其种子，尤其小麦，其包含编码本发明功能恢复基因的本发明核酸分子或本发明多肽或本发明嵌合基因，所述植物具有针对小麦G型胞质雄性不育恢复能育性的能力。在一个实施方案中，核酸分子、多肽或嵌合基因对所述植物而言为异源，如转基因禾谷类植物或转基因小麦植物。这还包括包含这个核酸分子、多肽或嵌合基因的植物细胞或细胞培养物，与是否通过转基因方法或通过育种方法引入无关。细胞例如是在体外的并且可再生成包含本发明染色体片段或核酸分子或嵌合基因的植物。所述植物、植物部分、植物细胞和种子也可以是杂交植物、植物部分、植物细胞或种子。

这类植物也可以作为雄性亲本植物用于如上文所述的产生F1杂交种子或F1杂交植物的方法中。

如本文所用的植物可表达启动子可以是至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间如在花药或更具体地在绒毡层或正发育的小孢子中驱动充分表达的任何启动子。这可以例如是组成型启动子、诱导型启动子，还可以是花粉特异性、花药特异性或绒毡层特异性或小孢子特异性/偏好性启动子。

组成型启动子是能够在大多数细胞类型(以空间时间非依赖性方式)指导高水平表达的启动子。植物可表达的组成型启动子的例子包括细菌源启动子，如来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)启动子和胭脂碱合酶(NOS)启动子，还包括病毒源启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物(Hapster等人,1988,Mol.Gen.Genet.212:182-190)或19S RNA基因(Odell等人,1985,Nature.6；313(6005):810-2；美国专利号5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人,1989,EMBO J.8:2195-2202)的启动子、增强型2x35S启动子(Kay等人,1987,Science 236:1299–1302；Datla等人(1993),Plant Sci94:139–149)、木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV；WO 97/48819、US 7,053,205)、2xCsVMV(WO2004/053135)、圆环病毒(AU 689311)启动子、甘蔗杆形DNA病毒(ScBV)启动子(Samac等人,2004,Transgenic Res.13(4):349-61)、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Sanger等人,1990,Plant Mol Biol.14(3):433-43)、地三叶病毒启动子第4号或第7号(WO 96/06932)和如US 5,164,316、US 5,196,525、US 5,322,938、US 5,359,142和US 5,424,200中所述的增强型35S启动子。在植物源启动子当中，将提到以下启动子：来自玉米和向日葵的植物核酮糖-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基启动子(US 4,962,028；WO99/25842)、拟南芥组蛋白H4基因启动子(Chabouté等人,Plant Mol.Biol.8,179-191,1987)、玉米、稻和甘蔗的泛素启动子(Holtorf等人,1995,Plant Mol.Biol.29:637-649、US 5,510,474)、稻肌动蛋白1启动子(Act-1，US 5,641,876)、如EP 0 507 698 A1中所述的组蛋白启动子、玉米醇脱氢酶1启动子(Adh-1)(来自http://www.patentlens.net/daisy/promoters/242.html))。如果使用菊属(Chrysanthemum)小亚基启动子与使用相应的终止子组合，则还可以使用该启动子(Outchkourov等人,Planta,216:1003–1012,2003)。

诱导型启动子的实例包括受化学化合物施加调节启动子，包括醇调节型启动子(参见，例如EP637339)，四环素调节型启动子(参见，例如US 5464758)、类固醇调节型启动子(参见，例如US5512483；US6063985；US6784340；US6379945；WO01/62780)、金属调节型启动子(参见，例如US4601978)，还包括发育调节型启动子。

有花粉/小孢子活性的启动子例如包括玉米花粉特异性启动子(参见，例如，Guerrero(1990)MoI.Gen.Genet.224:161 168)、PTA29、PTA26和PTAl 3(参见，例如，美国专利号5,792,929)和例如Baerson等人(1994Plant MoI.Biol.26:1947-1959)中所述，例如W097/30166中所述的NMT19小孢子特异性启动子。在Khurana等人,2012(Critical Reviewsin Plant Sciences,31:359-390)、WO2005100575、WO 2008037436中描述了其他花药/花粉特异性或有花药/花粉活性的启动子。其他合适的启动子例如是大麦vrn1启动子，如Alonso-Peral等人(2001,PLoS One.2011；6(12):e29456)中所述。

组织特异性启动子的实例包括分生组织特异性启动子如稻OSH1启动子(Sato等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8117-8122)、稻金属茶碱异构体(metallothein)启动子(BAD87835.1)、WAK1和WAK2启动子(Wagner和Kohorn(2001)Plant Cell 13(2):303-318)、来自大麦的穗组织特异性启动子D5(US6291666)、来自大麦的外稃/内稃特异性Lem2启动子(Abebe等人(2005)Planta,221,170-183)、来自大麦的早期花序特异性Pvrn1启动子(Alonse Peral等人2011,PLoS ONE 6(12)e29456)、来自大麦的早期花序特异性Pcrs4/PrA2启动子(Koppolu等人2013,Proc.Natl.Acad.Sci USA,110(32),13198-13203)，来自稻的带Act1内含子的分生组织特异性pkn1启动子(Zhang等人,1998,Planta 204:542-549,Postma-Haarsma等人2002,Plant Molecular Biology 48:423-441)、来自石斛属(Dendrobium)物种Pdomads1的SAM/花序特异性启动子(Yu等人2002,Plant MolecularBiology 49:225–237)。

显而易见的是，本文鉴定的核酸和多肽可以用来鉴定其他的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因。因此，本发明还提供如本文中公开的分离或修饰的核酸或多肽(如SEQID 4)鉴定一个或多个其他的小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的用途。

另外，可以使用本领域已知的方法，鉴定同源的或基本上相同的功能恢复基因。可以通过使用如本文所述的包含例如SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其部份核酸作为探针，在严格条件或高严格条件下杂交，鉴定并分离同源核苷酸序列。也可以使用对编码功能恢复基因的基因特异的寡核苷酸作为引物，如但不限于包含来自SEQ ID NO:4或其互补序列的约20个至约50个连续核苷酸或由其组成的寡核苷酸，通过DNA扩增，获得编码功能恢复基因的其他序列。可以使用基础局部比对检索工具(BLAST)以如本文中提供的核苷酸或氨基酸序列进行同源性检索，计算机鉴定同源的或基本上相同的功能恢复基因。

可以例如通过以下方式验证如上文鉴定为的恢复基因或其等位基因的功能：在不具有恢复G型胞质雄性不育小麦植物后代的能育性的能力的禾谷类(小麦)植物中提供(例如，通过转化或杂交来提供)植物可表达启动子控制下的这种恢复基因，将因此产生的禾谷类植物与G型胞质雄性不育小麦植物杂交并在后代中评价结实率。备选地，恢复系可以用RNAi构建体转化或用例如CRISPR-Cas技术或任何其他序列特异性核酸酶进行基因编辑，从而以产生功能丧失变体，令植物未恢复。类似地，用于突变恢复基因的其他手段(例如EMS、γ-辐射)可以用来评估功能丧失突变对恢复能力的影响。

在任一个本文所述的实施方案和方面，植物可以包含或可以选择所述植物以包含或可以向其提供又一个(位于相同或另一个染色体上或可自相同或另一个染色体获得的)小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因，如Rf2(7D)、Rf3(1B)、Rf4(6B)、Rf5(6D)、Rf6(5D)、Rf7(7B)、Rf8、6AS或6BS(Tahir和Tsunewaki,1969，上文；Yen等人,1969，上文；Bahl和Maan,1973，上文；Du等人,1991，上文；Sihna等人,2013，上文；Ma等人,1991，上文；Zhou等人,2005，上文)。

本文中所描述的方法、标记和标记记等位基因、核酸、多肽、嵌合基因、植物中任一者也可以用来恢复针对S^v-类型细胞质的能育性，例如Ahm等人2001(上文)中所描述。所述方法、核酸、多肽、嵌合基因也可以用来恢复小麦或其他禾谷植物中对抗其他雄性不育诱导种质的能育性。

定义

如本文所用，“嵌合基因”指正常情况下在植物物种中不存在的核酸构建体。嵌合核酸构建体可以是DNA或RNA。“嵌合DNA构建体”和“嵌合基因”可互换地用来指这样的基因，其中基因的启动子或一个或多个其他调节区，如转录终止和多聚腺苷化区基因在自然界中并不与转录的DNA区域的部分或全部接合，或这样的基因，其存在于植物基因组中它并不天然存在的基因座内，或存在于它并不天然存在的植物中。换句话说，基因和有效连接的调节区或者基因和基因组座位或者基因和植物彼此为异源，即它们不天然地一起出现。这包括以下情形，其中小麦基因的一个或多个调节元件(如启动子或3’末端形成和多聚腺苷化区)或编码区(如本发明的Rf1_PPR_09基因)是修饰的核酸(因为这不是小麦中正常可见的，并且对于它有效连接到的基因元件是异源的)。

第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核苷酸序列与第二核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。当重组地产生时，有效连接的核酸序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区情况下，处于相同的可读框中(例如，在多顺反子ORF中)。但是，核酸无需近邻以有效地连接。

“回交”指可以籍此将(单一)性状(如能育性恢复(Rf))从一个遗传背景(“供体”)转移入另一个遗传背景(也称作“轮回亲本”)(例如不包含这个Rf基因或基因座的植物)的育种方法。杂交后代(例如，通过含有Rf的植物与缺少Rf的植物杂交所获得的F1植物；或从F1自交获得的F2植物或F3植物等)与亲本“回交”。在反复回交(BC1、BC2等)和任选地自交(BC1S1、BC2S1等)后，将一个遗传背景的性状并入另一个遗传背景中。

“标记辅助选择”或“MAS”是利用与特定基因座或特定染色体区域(例如渐渗片段)遗传连锁的分子标记记的存在，就特定基因座或区域(渐渗片段)的存在而选择植物的方法。例如，与Rf基因座遗传和物理连锁的分子标记记可以用来检测和/或选择包含Rf基因座的植物。分子标记记基因座的遗传连锁越近，则该标记记经由减数分裂重组从该基因座脱离的可能性更小。

“生物样品”可以是植物或植物的部分如植物组织或植物细胞或植物提取物或植物部分的提取物，包括蛋白质。

如本文所用的“提供基因组DNA”指提供包含来自植物的基因组DNA的样品。样品可以指已经从所述植物获得的组织样品，如，例如，叶样品，其包含来自所述植物的基因组DNA。样品还可以指从组织样品获得的基因组DNA，如已经从组织(如叶样品)获得的基因组DNA。提供基因组DNA可以包括，但不需要包括，从组织样品纯化基因组DNA。提供基因组DNA因此还包括从植物或较大组织片获得组织材料并从中制备粗提物或裂解物。

如本文所用的“分离的DNA”或“分离的核酸”指不在其天然基因组背景下出现的DNA或核酸，无论其长度和序列是什么。分离的DNA可以例如指与其基因组背景物理分离的DNA，如基因组DNA的片段。分离的DNA也可以是人工产生的DNA，如化学合成的DNA，或如借助扩增反应(如本领域熟知的聚合酶链反应(PCR))产生的DNA。分离的DNA还可以指在其不天然存在的DNA背景下存在的DNA。例如，分离DNA可以指质粒中存在的一段DNA。另外，分离的DNA可以指另一个与它天然存在的背景不同的染色体背景下(例如在基因组中异于天然位置的另一个位置、在另一个与它天然存在的物种相异的物种的基因组中或在人工染色体中)存在的一段DNA。如本文所用，“分离的”，当指蛋白质(序列)时，还包括已经由人类由试 图获得蛋白质活性(如恢复活性)的某些改善而完成的修饰(例如通过修饰编码该蛋白质的核酸)的蛋白质(序列)。如本文所用，“分离的”，当指核酸(序列)时，还包括已经由人类由试 图获得某种改善(如RNA或蛋白质表达、靶向作用或稳定性改善或蛋白质活性(如恢复活性)改善)而完成的修饰(例如通过在天然核酸中插入、缺失或置换一个或多个核苷酸)的核酸(序列)。如本文所用，“修饰”的核酸或蛋白质(序列)指因为试图获得某种改善而完成的通 过修饰或突变该核酸或蛋白质(或编码该蛋白质的核酸)而与天然核酸或蛋白质不同的核酸或蛋白质(序列)。

在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID No.1或4中的序列相比，Rf1_PPR_09核酸具有修饰或突变的序列，其中处于对应于SEQ ID No.1中核苷酸位置3286的位置的核苷酸(或处于对应于SEQ ID No.4中核苷酸位置2286的位置的核苷酸)是G，或与SEQ ID No.1中的序列相比，具有修饰或突变的序列，其中所述修饰或突变的序列在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A、优选地具有6个A的区段。在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID No.1中的序列相比，Rf1_PPR_09核酸具有修饰或突变的序列，其中处于对应于SEQ ID No.1中核苷酸位置3286的位置的核苷酸是G，并且其中所述修饰或突变的序列在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ ID No.1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A、优选地具有6个A的区段。在一个实施方案中，具有SEQ ID NO:1从核苷酸位置1至核苷酸位置1054的修饰或突变的核酸在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A、优选地具有6个A的区段。在一个实施方案中，这种修饰或突变的Rf1_PPR_09核酸编码修饰的Rf1_PPR_09蛋白，与SEQ ID No.5中所示的序列相比时，所述的蛋白具有修饰或突变的氨基酸序列。

无论何时提到本发明的“植物”或“多个植物”时，除非另外说明，否则应当理解本文中还包括植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、分开的部分(severed parts)如根、叶、花、花粉等)、植物的仍保留亲本突出特征(尤其恢复能力)的后代、如通过自交或杂交获得的种子，例如(通过两个近交亲本系杂交获得的)杂交种子、杂交植物和从中衍生的植物部分。在一些实施方案中，本发明的植物细胞可以是非繁殖性细胞。

根据本发明获得的植物可以在常规育种方案中用来产生更多具有相同特征的植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入存在本发明的恢复基因的特征。获得的植物还可以用于产生繁殖材料。本发明的植物还可以用来产生通过本发明方法所获得的植物的配子、种子、粉、胚、合胚或体细胞胚、后代或杂交种。还涵盖从本发明植物获得的种子。

如本文所用，“产生繁殖材料”指本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子的任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、嫁(芽)接、微繁殖，匍匐茎或长匐茎、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、嵌条(striking)或插条、双鳞片)、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如无融合生殖、体细胞杂交)。

如本文所用，转化意指将核苷酸序列以引起该序列稳定表达或瞬时表达的方式引入植物。单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的转化和再生现在是例行技术，并且最适宜转化技术的选择将由实施者决定。方法的选择将随待转化植物的类型变动；本领域技术人员将确认针对给定植物类型的特定方法的适宜性。合适的方法可以包括，但不是限于植物原生质体电穿孔法；脂质体介导的转化法；聚乙二醇(PEG)介导转化法；使用病毒转化；微量注射植物细胞；微抛射体轰击植物细胞；真空浸润法；和农杆菌介导转化法。

如本文所用，术语“同源”或“基本上同一”或“基本上相似”可以指超过85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以与参考序列(例如SEQ ID NO:1或4)相同85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433)基本上相同或基本上相似的核酸序列与SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至2433)同一多于85％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或多于99.5％，并且在对应于SEQ ID NO:4中核苷酸位置2286的核苷酸位置处具有G核苷酸。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1从核苷酸位置1055至核苷酸位置3433)基本上相同或基本上相似的核酸序列与SEQ ID NO:1(或SEQ IDNO:1从核苷酸位置1055至3433)同一多于85％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或多于99.5％，并且在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置3286的核苷酸位置处具有G核苷酸，或在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ ID No.1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A、优选地具有6个A的区段。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1从核苷酸位置1055至核苷酸位置3433)基本上相同或基本上相似的核酸序列与SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:1从核苷酸位置1055至3433)同一多于85％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或多于99.5％，并且在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置3286的核苷酸位置处具有G核苷酸，并且在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ IDNo.1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A的区段。在一个实施方案中，本发明中包括与SEQ ID NO:1从核苷酸位置1至核苷酸位置1054基本上相同或基本上相似的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:1从核苷酸位置1至1054同一多于85％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或多于99.5％，并且在对应于SEQ ID NO:1中核苷酸位置753的T和对应于SEQ ID No.1中核苷酸位置760的C之间具有一个具有最多6个A、优选地具有6个A的区段。探针也可以是与待检测标记的精确副本(“DNA靶”)“可特异性杂交于”或“与之特异互补”的核酸分子。“可特异性杂交”或“特异性互补”是表示互补程度如此大，从而核酸分子和DNA靶之间出现稳定和特异性结合的术语。核酸分子不必要与其靶序列100％互补以可特异性杂交。当存在足够的互补程度以避免核酸在想要特异性结合时，例如，在严格杂交条件，优选地高严格性条件下与非靶序列非特异性结合时，核酸分子是可特异性杂交的。

“严格杂交条件”可以用来鉴定与给定的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。严格条件具有序列依赖性并且会在不同环境中不同。通常，将严格条件选择成在确定的离子强度和pH时比特定序列的热解链温度(T_m)低约5℃。T_m是(在确定的离子强度和pH下)这样的温度，在所述温度，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。一般地，选择其中盐浓度是在pH7约0.02摩尔并且温度是至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度增加严格性。用于RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的RNA印迹)例如是包括至少一次在63℃于0.2X SSC中20分钟洗涤或等同条件洗涤的那些条件。

可以例如通过以下方式提供“高严格性条件”：在65℃于含有6x SSC(20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M Na-柠檬酸盐，pH 7.0)、5x Denhardt(100x Denhardt含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特异性竞争物的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)的水溶液中杂交。在杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度于0.2-0.1×SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。

“中等严格性条件”指与上述溶液中但是在约60-62℃杂交等同的条件。中等严格性洗涤可以在杂交温度于1x SSC，0.1％SDS中进行。

“低严格性”指与上述溶液中在约50-52℃杂交等同的条件。低严格性洗涤可以在杂交温度于2x SSC，0.1％SDS中进行。还参见Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)及Sambrook和Russell(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY)。

出于本发明目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表示为百分数)指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x100)除以比较的位置的数目。空位(即，比对结果中这样的位置，其中一个残基存在于一个序列中，但不存在于另一个序列中)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS,Rice等人,2000,Trends inGenetics 16(6):276-277；例如参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970,J Mol Biol 48(3):443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且对于蛋白质，默认计分矩阵是EBLOSUM62。应当清楚，每逢RNA分子的核苷酸序列通过参照相应DNA分子的核苷酸序列定义时，该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都应当被替换为尿嘧啶(U)。是否指DNA分子或RNA分子将从本申请的上下文中显而易见。

如本文所用，“包含”应解释为特指存在如所提到的特征、整数、步骤或组分，但是不排除存在或附加一种或多种特征、整数、步骤或组分或它们的群组。因此，例如，包含一个核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所引述更多的核苷酸或氨基酸，即，包含于更大的核酸或蛋白质中。包含以结构方式或功能方式定义的核酸的嵌合基因可以包含额外的DNA区域等。

如文所用，“外源”意指与“内源”相反，具有外部来源或原因。外源核酸分子是不天然出现在生物内部并且已经(历史上)被引入或工程化以出现在生物中的核酸分子。

在某些司法管辖区，本发明的植物，即便已经通过基本上生物学的方法排他地获得，其中用于产生植物的方法如果完全由天然现象如杂交或选择组成则视为基本上生物学的，可能被从可专利性排除。本发明的植物因此还涵盖并未通过基本上生物学的方法排他性获得的那些植物。

除非在实施例中另外指出，否则全部重组DNA技术均按照Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology,CurrentProtocols,USA的第1和第2卷中所述的标准方案实施。在BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合出版的Plant MolecularBiology Labfax(1993)(R.D.D.Croy)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。用于标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Brown(1998)Molecular Biology LabFax第I卷和第II卷,第2版,Academic Press(UK)。可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press中并在McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第1版,德国Springer Verlag中找到用于聚合酶链反应的标准材料和方法。

本文中提及或援引的全部专利、专利申请和出版物或公众公开(包括互联网上的出版物)通过引用的方式完整并入。

在34千字节(大小如Microsoft

中所测量)、含有7个序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7并且名为“BCS18-2006_ST25.txt”的文件中所含的序列表在此通过电子提交方式提交并且通过引用的方式并入本文。

本发明将参考本文所述的实施例进一步描述；然而，应当理解本发明不限于这类实施例。

遍及整个说明书，参考以下序列

SEQ ID NO:1：来自包含Rf1-PPR-09基因的PI 583676的基因组区域的序列

Nt 1-1000：Rf1-PPR-09的cDNA/mRNA转录物上游的基因组区域

Nt 1001-1054：5’UTR

Nt 1055-3433：CDS

Nt 3434-3956：3’UTR第1部分

Nt 4827-4919：3’UTR第2部分

Nt 5398-5515：3’UTR第3部分

Nt 5662-5708：3’UTR第4部分

Nt 5854-6466：3’UTR第5部分

Nt 6467-7923：Rf1-PPR-09的cDNA/mRNA转录物下游的基因组区域

SEQ ID NO:2：ORF256核苷酸序列

SEQ ID NO:3：ORF256内部的预测靶序列

SEQ ID NO:4：cDNA/mRNA Rf1-PPR-09

Nt 1-54：5’UTR

Nt 55-2433：CDS

Nt 2434-3827：3’UTR

SEQ ID NO:5：氨基酸序列Rf1-PPR-09

SEQ ID NO:6：正向引物(qPCR)

SEQ ID NO:7：反向引物(qPCR)

实施例

实施例1–植物材料和遗传作图

如WO2017158126(通过引用方式并入本文作为参考)的实施例1至3中充分描述的那样将Rf1 QTL定位于染色体1A上。简而言之，使用携带提莫非维小麦CMS(CMS005)的雄性不育系和对应于提莫非维小麦CMS的雄性不育恢复系(提莫非维小麦/2*Iowin//2*Quivira，登录号PI 583676，USDA美国小粒谷类作物保藏中心；http://www.ars.usda.gov/Main/docs.htm？docid＝21891，也称作Dekalb582M并且登记为US PVP 7400045，通过美国植物种质系统https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx？id＝1478647可获得)作为亲本以产生定位群体。建立具有总计2080个SNP标记的遗传图并且它覆盖小麦基因组的全部染色体。染色体1A由108个SNP标记描述。使用Haley-Knott回归，实施QTL分析以测试涵盖全部标记的结实率变异的影响。描述了具有显著相关标记(包括左侧翼标记和右侧翼标记(WO2017158126的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4))的区间。具有最高显著性并对恢复影响最大的标记是WO2017158126的SEQ ID NO.3的峰标记。依据左侧翼标记和右侧翼标记，这将区间界定至15.6cM。为了进一步精细定位，基于表型和基因型，选择40个在QTL区域中杂合的F2个体。田间在2个位置培育总计2560株独立F3植物。对每株植物，测量套袋下主穗上的结实率。开发了额外的SNP测定法以增加QTL区间中的标记密度。1A区域定位时使用了总计361个额外的SNP标记。Rf1基因座可以进一步界定至约1.9cM的区域(沿染色体1A从30.9至32.8cM)。

实施例2–恢复系的BAC文库

：通过限制性酶消化高分子量‘PI 583676’gDNA并将所得到的片段(插入物平均大小约80–130Kb)转化入大肠杆菌，构建称作‘PI 583676’的小麦恢复系的BAC文库。精细定位的SNP标记序列或从‘小麦中国春’参考基因组上相对应的Rf区域开发的标记随后用来设计PCR引物以筛选汇集的BAC克隆。一旦已经鉴定PCR阳性BAC汇集物，则将来自汇集物的BAC个体化并用相同标记再次筛选。各个独立的PCR阳性BAC随后接受BAC末端测序，以确认完整性和存在筛选标记序列。最后，使用PacBio技术，对验证的阳性BAC深度测序并且组装读段以产生BAC插入物的共有序列。随后将已测序的阳性BAC通过从头组装法或通过比照参考基因组组装法比对或利用筛选标记叠覆，以产生Rf1 QTL区域的新‘PI 583676’参考序列。随后对‘PI 583676’Rf1 QTL参考序列进行结构和功能注释，以鉴定该区域内部相对于(非恢复)参考基因组所捕获的候选基因中基因内容和/或多态性的任何结构性变化和/或差异。使用从头计算基因注释程序以及通过比对从公共数据库可获得的小麦EST序列、小麦全长cDNA序列、小麦基因模型和来自直系同源物种的已知恢复基因，对跨Rf1 QTL区域装配的BAC进行结构性注释。使用Blast2GO和PLAZA软件程序并咨询已发表的文献实施QTL区域中基因的功能性注释。随后将这些候选基因基于其预测功能、相对于非恢复系中直系同源等位体的多态性存在情况及其与已知Rf基因的同源性，区分优先度(Chen和Liu 2014,Annu.Rev.Plant Biol.65579–606；Dahan和Mireau 2013,RNA Biol.10,1469–1476)。

使用从精细定位标记、参考基因组或分离的BAC序列开发的PCR标记多次筛选‘PI583676’BAC文库。对这些BAC逐一测序。发现测序的BAC含有本文中所描述的Rf-Rf1-PPR-09基因。这些BAC代表Rf1 QTL区域的独特‘PI 583676’基因组序列。

与Geyer等人(2017，上文)的Rf1基因座很可能具有提莫非维小麦来源的最新注释一致的是，Rf-PPR-09基因不存在于小麦中国春参考基因组中。

如图1A中所示，Rf1-Rf-PPR-09的基因结构由单一外显子组成。这种相对简单的基因结构似乎对Rf-PPR是典型的。

SEQ ID NO:1表示包含Rf1-PPR-09基因的基因组DNA序列。

实施例3–RF1-PPR-09氨基酸序列注释

已知的Rf-PPR是P类PPR蛋白的成员，并且每个蛋白质含有多达约30个PPR基序，其中每个基序包含35个氨基酸(Gaborieau,Brown和Mireau 2016,Front.Plant Sci.7,1816)。结构上，PPR蛋白由2个形成发夹的α-螺旋和一个超级沟组成，并且正是这个超级沟与RNA分子相互作用。各个PPR基序的氨基酸组成决定识别RNA哪个核苷酸，并且PPR基序的数目决定靶转录物上RNA序列的长度。这里，注释Rf1-PPR-09以鉴定PPR基序和其他序列特征并且在图1B和C中总结结果。

Rf1-PPR-09由792个氨基酸组成并且含有18个连续的35个氨基酸PPR基序，和靶向线粒体导引蛋白质的预测转运肽(SEQ ID NO:5)–通过PredSL(Evangelia等人(2006)Geno.Prot.BioInfo第4卷,第1期,48-55)预测这点，PredSL中具有0,999741的(强)mTP(线粒体靶向肽)评分)。这十分类似于克隆自稻的Rf-1A基因的结构，其长度791个氨基酸并含有16个Rf-PPR重复序列(Akagi等人2004,Theor.Appl.Genet.108,1449–1457；Komori等人2004,Plant J.37,315–325)。

每个PPR基序由2个反平行螺旋组成，所述反平行螺旋形成与单链RNA分子相互作用的发夹结构。研究已经显示，识别代码的存在将重复序列内部特定氨基酸的身份和所研究PPR蛋白的靶RNA序列联系(Barkan等人,2012,上文；Yagi等人,2013,上文)。(Barkan和Small 2014,上文)。特别地，已经显示每个基序的第2、第5和第35氨基酸的身份尤其重要。基于Rf-PPR基序中位置2、5和35处氨基酸的身份，可以使用如Yagi等人2013上文所描述的概率矩阵表，预测Rf1-PPR-09蛋白的靶转录物。遵循PPR代码，orf256上的预测RNA靶序列是ATTTCTCAAATAAAAA(SEQ ID No.3)，其可以在orf256 mRNA中找到，所述mRNA将这一核苷酸序列包含在位于orf256的ATG起始密码子下游的位置105至121处(SEQ ID No.:2从核苷酸192至核苷酸207)。

实施例4-独立群体中基因表达和与能育性恢复联系

在开发自一个16路MAGIC群体的近等基因系中检验Rf1-PPR-09基因表达与能育性之间的联系。通过互交16个奠基者系开发这个群体，这些奠基者系当中存在一个具有衍生自提莫非维小麦的胞质雄性不育的株系和两个称作R1和R2的潜在恢复系。使16路MAGIC群体互交5代并且随后通过单子传代法至F5来固定。在整个株系固定过程期间，对株系进行能育性的基因分型和表型分型。这允许选择对恢复作用分离的家族以及允许额外精细定位Rf基因座。在F5，鉴定在先前定位的Rf1基因座处有杂合性的个体并且用来建立多个在其后代中具有和没有Rf1基因座的近等基因系(NIL)对。选择这样的六NIL对，培育并作表型分型。使用表1的引物(SEQ ID NOs:6和7)，对来自六个NIL对和还来自相应亲本系的处于3阶段的发育的穗进行RNAseq和qPCR实验。对RNAseq数据的生物信息学分析允许鉴定恢复基因型和非恢复基因型之间差异性表达的转录物。定位至QTL区域中的鉴定的转录物具有正确(恢复)的奠基者系。

表1.用于基因表达分析的引物序列

如图2中所示，在Rf供体系中和含有Rf的NIL中3.5cm长度的发育着的穗中排他性地发现了表达。非Rf亲本和野生型分离子均不显示表达。

实施例5–基因验证

通过诱变

通过EMS诱变构建诱变的恢复系群体。基于对Rf1-PPR-09基因周围区域的测序，鉴定了在Rf1-PPR-09基因中具有失活性突变的突变植物。对纯合突变植物及它们的野生型分离子筛选能育性恢复能力。具有失活突变体Rf1-PPR-09基因的植物不再具有恢复能力，证实了鉴定的Rf1-PPR-09基因是有功能的Rf基因。

通过过表达

将Rf1-PPR-09基因的编码序列克隆到包含bar选择标记基因的T-DNA表达载体中，处于来自玉米的组成型泛素启动子(pUbiZm)控制下。根据本领域熟知的小麦转化方法(参见例如Ishida等人Methods Mol Biol.2015；1223:189-98)，所得到的载体用来转化没有恢复能力的可转化小麦品种Fielder。通过对选择标记基因的实时PCR确定转基因植物中转基因的拷贝数。将包含单拷贝Rf1-PPR-09基因盒的转化的植物转移至温室。将转基因T0植物作为雄性亲本与G型胞质雄性不育小麦系杂交。培育15个事件的F1后代以评估种子产生的恢复。全部F1后代植物均含有G型细胞质并对Rf1-PPR-09转基因基因座的存在1:1分离(半合子:不成对)。通过qRT-PCR测试F1植物的叶组织中和发育着的幼穗中转基因的表达。

通过对每个事件3株不成对植物和3株半合子植物进行碘染色，评价花粉活力，并且记录每个事件多至5株不成对植物和多至5株半合子植物的全部穗的结实率。结果显示5个事件中能育性强力恢复，3个事件中能育性中度恢复并且2个事件中能育性微弱或非常微弱地恢复，而5个事件未显示结实率的统计学上显著的恢复。结实率恢复与花粉染色频率强相关。下表2显示全部事件的结果，显示不成对植物中和半合子植物中的结实率之间有统计显著差异(使用t检验，双样本，假定不等方差)。半合子植物可以按Rf1-PPR-09转基因的mRNA表达分成三个组。最低表达组中的全部植物不显示或显示十分低的结实率，而最高表达组中的全部植物均显示良好的结实率。中等表达组中的植物显示多样的结实率水平。

因此，Rf1-PPR-09基因的表达恢复了G型胞质雄性不育小麦植物的能育性。

表2：小麦中通过过表达Rf1-PPR-09恢复G型CMS

*t检验：双样品，假定不等方差

通过靶向敲除

通过使用例如CAS-finder工具设计CRISPR介导基因编辑的向导RNA，其靶向Rf1-PPR-09基因的mRNA编码序列、优选地蛋白质编码序列，或Rf1-PPR-09基因的紧邻上游启动子序列。优选地，每个靶基因设计四个独特或近乎独特的向导RNA。通过PEG介导的瞬时共递送适宜启动子控制下的gRNA表达载体连同相应核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的表达载体，测试向导RNA向含有候选Rf1-PPR-09基因的小麦恢复系，优选地命名为提莫非维小麦USDA登录号PI 583676的品系的原生质体的靶向效率。在递送向导RNA和核酸酶载体后，从原生质体提取基因组DNA。在PCR扩增后，通过测序评估靶向的Rf1-PPR-09基因序列的完整性。

一个或两个最有效的向导RNA用于也含有G型CMS细胞质的相同小麦恢复系中的稳定基因编辑。为此目的，使用例如粒子枪轰击法，将选定的向导RNA表达载体连同核酸酶表达模块和选择标记基因一起引入从前文提到的小麦恢复系分离的胚。使用本领域技术人员已知的方法，再生显示选择剂抗性的转基因植物。转通过PCR扩增和测序，鉴定含有基因打靶事件、优选地产生无功能的Rf1-PPR-09基因的小缺失的转基因T0植物。

含有G型CMS细胞质和可能含有、优选地以纯合态含有、但备选地以杂合态含有Rf1-PPR-09基因功能性敲除的转基因T0植物作为雌性亲本与具有正常细胞质且无PPR-Rf基因的春小麦品系杂交。这些杂交的F1后代含有G型“CMS”细胞质并且50％(在杂合T0的情况下)或100％(在纯合T0的情况下)的F1后代将缺少功能性形式的Rf-PPR靶基因。使用基因组PCR测定法，鉴定缺少有功的Rf-PPR靶基因的F1植物。F1植物显示因敲除Rf1-PPR-09基因所致的雄性能育性部分或完全丧失。

使用四个不同测定法，在缺少功能性形式的Rf1-PPR-07基因的F1后代中测试雄性能育性水平。在第一种测定法中，使用针对合成的ORF256蛋白产生的多克隆抗体，在蛋白质印迹上定量线粒体ORF256蛋白。敲除Rf1-PPR-09基因导致ORF256蛋白积累增加。在第二种测定法中，使用AmphaZ30装置定量花粉积累和花粉活力。敲除Rf1-PPR-09基因导致有活力花粉的数目较低。在第三种测定法中，显微镜检查花药组织的完整性。敲除Rf1-PPR-09基因导致绒毡层早期劣化。在第四种测定法中，定量源于自我授粉的每穗结实率。敲除Rf1-PPR-09基因导致每穗籽粒数降低。在全部试验中，来自未编辑的Rf植物与相同春小麦系杂交的F1后代充当对照。

备选地，设计了靶向包含于SEQ ID NO:1从核苷酸位置1至3000的核苷酸序列内部的启动子区的用于CRISPR介导基因编辑的向导RNA并且在目的小麦系的小麦原生质体中按如上描述的方式测试。一个或两个最有效的向导RNA用于如文所述的相同小麦系中的稳定基因编辑。但是额外地，还在同源于靶DNA的侧翼序列之间引入了包含目的置换、插入或缺失(一个或多个核苷酸)的修复DNA。通过PCR扩增和测序鉴定包含编辑的上游区域的植物，并对其测试如文所述的雄性能育性的水平。

背景参考文献

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Ding,J.,Lu,Q.,Ouyang,Y.,Mao,H.,Zhang,P.,Yao,J.,Xu,C.,Li,X.,Xiao,J.和Zhang,Q.(2012).A long noncoding RNA regulates photoperiod-sensitive malesterility,an essential component of hybrid rice.Proc.Natl.Acad.Sci.109,2654–2659.

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Xia,R.,Meyers,B.C.,Liu,Z.,Beers,E.P.,Ye,S.和Liu,Z.(2013).MicroRNASuperfamilies Descended from miR390 and Their Roles in Secondary SmallInterfering RNA Biogenesis in Eudicots.Plant Cell Online 25,1555–1572.

Claims (34)

1.编码小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的核酸分子，其中所述功能恢复基因等位体是包含于SEQ ID NO:1的核苷酸序列之内的Rf-PPR基因的功能等位基因。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述功能恢复基因等位体包含选自以下的核苷酸序列：

a.核苷酸序列，其与SEQ ID NO:4的第55位核苷酸至第2433位核苷酸具有、优选地在SEQ ID NO:4第55位核苷酸至第2433位核苷酸的整个长度范围内具有至少85％序列同一性；

b.核苷酸序列，其与SEQ ID NO:4具有、优选地在SEQ ID NO:4的第55位核苷酸至第2433位核苷酸的整个长度范围内具有至少85％序列同一性，或

c.编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:5具有、优选地在SEQ ID NO:5的整个长度范围内具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸分子，其中所述功能恢复基因等位体编码能够与ORF256的mRNA结合、优选地与包含SEQ ID NO:2的第192-207位核苷酸的核苷酸序列结合的PPR蛋白。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述功能恢复基因等位体从USDA登录号PI 583676可获得。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子，其中所述功能恢复基因等位体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:5的多肽。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其是分离的核酸分子。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其是外源核酸分子。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其是嵌合或重组核酸分子。

9.多肽，其由权利要求1至5中任一项的核酸分子编码或包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有、优选地在SEQ ID NO:5的整个长度范围内具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

10.嵌合基因，其包含以下有效连接的元件：

a.植物可表达启动子；

b.核酸，其包含权利要求1-5中任一项的核酸分子或编码权利要求9的多肽；和任选地

c.在植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷化区。

其中所述有效连接的元件至少之一相对于一个或多个其他元件是异源的。

11.根据权利要求10所述的嵌合基因，其中所述启动子能够指导有效连接的核酸至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间诸如在花药或更具体地绒毡层或正在发育的小孢子中表达。

12.禾谷类植物细胞或禾谷类植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，其包含和/或表达权利要求1至8中任一项的核酸分子、根据权利要求9的多肽或权利要求10或11的嵌合基因，其中所述核酸、所述多肽或所述嵌合基因在每种情况下均相对于所述植物细胞或植物或种子是异源的。

13.用于产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因的禾谷类植物细胞或植物或其种子诸如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：向所述植物细胞或植物提供权利要求1至8中任一项的核酸分子或权利要求10或11的嵌合基因，其中所述提供步骤包括通过转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变来提供。

14.用于产生具有小麦G型胞质雄性不育的恢复能力的禾谷类植物细胞或植物或其种子诸如小麦植物细胞或植物或其种子的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：在所述植物细胞或植物或种子中提供根据权利要求9的多肽或增加根据权利要求9的多肽的表达。

15.用于将非恢复禾谷类植物如小麦植物转化成小麦G型胞质雄性不育的恢复植物的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：修饰所述植物的基因组以包含和/或表达权利要求1至8中任一项的核酸分子或权利要求10或11的嵌合基因，其中所述修饰步骤包括通过转化、杂交、回交、基因组编辑或诱变来修饰。

16.用于将非恢复禾谷类植物如小麦植物转化成小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)的恢复植物的方法，或用于增加禾谷类植物如小麦植物中小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力的方法，所述方法包括步骤：修饰所述植物的基因组以提供或增加所述植物中权利要求9的多肽的表达。

17.根据权利要求13至16中任一项的方法获得的禾谷类植物细胞或禾谷类植物或其种子，如小麦植物细胞或植物或其种子，优选地其中所述植物具有增加的小麦G型胞质雄性不育(“CMS”)恢复能力。

18.根据权利要求12或17所述的禾谷类植物细胞、植物或种子，其中根据权利要求9的多肽至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间诸如在花药或更具体地绒毡层或正在发育的小孢子中表达。

19.根据权利要求12、17或18所述的禾谷类植物细胞、植物或种子，其是杂交植物细胞、植物或种子。

20.选择包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物或产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物的方法，所述方法包括步骤：

a.鉴定包含SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列的核苷酸序列的存在、或表达、或转录，优选地通过测量从SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列转录的RNA的水平或通过用DNA检测方法检测SEQ ID NO:4从核苷酸位置55至核苷酸位置2433的核苷酸序列的至少一部分来鉴定；并且任选地

b.选择包含并表达所述至少一个标记等位基因的植物，其中所述植物包含小麦G型胞质雄性不育的所述功能恢复基因，优选地位于染色体1A上。

21.在G型胞质雄性不育禾谷类植物的后代中恢复能育性或从G型胞质雄性不育禾谷类亲本植物产生能育后代植物的方法，所述方法包括步骤：

a.提供从雌性禾谷类亲本植物与雄性禾谷类亲本植物杂交获得的后代植物群体，其中雌性亲本植物是G型胞质雄性不育禾谷类植物，并且其中雄性亲本植物包含和/或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

b.鉴定所述群体中的包含和/或表达SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核苷酸序列的能育后代植物；和任选地

c.选择所述能育后代植物；和任选地

d.繁殖能育后代植物。

22.鉴定和/或选择包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类(例如小麦)植物的方法，包括步骤：

a.在所述植物中鉴定或检测权利要求1至5中任一项的核酸、或权利要求9的多肽或权利要求10或11所述的嵌合基因的存在、表达或转录。

b.和任选地选择包含或表达或转录所述核酸或多肽或嵌合基因的所述植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多肽至少在(早期)花粉发育和减数分裂期间如在花药或更具体地绒毡层或正在发育的小孢子中表达。

24.产生包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的禾谷类植物(例如小麦)的方法，包括步骤：

a.将权利要求12、17或18中任一项的第一禾谷类植物如小麦植物与第二禾谷类植物杂交；

b.鉴定和任选地选择后代植物，所述后代植物包含或表达小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

25.产生杂交种子的方法，包括步骤：

a.提供根据权利要求12、17或18的雄性禾谷类亲本植物，如小麦植物，所述植物包含或表达小麦G型胞质雄性不育的所述功能恢复基因等位体，其中所述功能恢复基因等位体优选地以纯合形式存在；

b.提供其是G型胞质雄性不育禾谷类植物的雌性禾谷类亲本植物；

c.将所述雌性禾谷类亲本植物与所述雄性禾谷类亲本植物杂交；并且任选地

d.收获种子。

26.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸的用途，用于鉴定一个或多个其他小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体。

27.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸、根据权利要求9所述的多肽或权利要求10或11所述的嵌合基因的用途，用于鉴定包含小麦G型胞质雄性不育的功能恢复基因等位体的植物。

28.根据权利要求12、17或18中任一项所述的植物或通过权利要求13至16中任一项的方法获得的植物的用途，所述植物包含小麦G型胞质雄性不育的所述功能恢复基因，用于在G型胞质雄性不育禾谷类植物(如小麦植物)的后代中恢复能育性。

29.根据权利要求12、17或18中任一项所述的植物或通过权利要求13至16中任一项所述的方法获得的植物的用途，所述植物包含小麦G型胞质雄性不育的所述功能恢复基因，用于产生杂交禾谷类植物的杂交种子或群体，如小麦种子或植物。

30.一种通过修饰基因组、优选地基因组的定向修饰或工程化，增加禾谷类植物中多肽表达的方法，所述多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

31.根据权利要求30所述的方法，其中表达增加至少2倍。

32.根据权利要求30所述的方法，其中表达增加至少10倍。

33.包含编码多肽的嵌合基因的植物细胞，所述多肽与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

34.根据权利要求33所述的植物细胞，其是小麦植物细胞。

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