CN106062192A - 玉米细胞质雄性不育(cms)s型恢复基因rf3 - Google Patents

玉米细胞质雄性不育(cms)s型恢复基因rf3 Download PDF

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Abstract

描述了一种新鉴定的与细胞质雄性不育恢复活性(Rf3)相关的多核苷酸序列所编码的蛋白质。该细胞质雄性不育恢复基因可通过育种基因渗入而插入植物基因组中，以恢复植物中的细胞质雄性不育。该新鉴定的与细胞质雄性不育恢复活性相关的多核苷酸序列的其他应用包括导致细胞质雄性不育的突变(rf3)。该细胞质雄性不育恢复基因可通过育种基因渗入而插入植物基因组中，从而导致植物中的细胞质雄性不育。进一步描述了检测细胞质雄性不育恢复基因序列(Rf3)和细胞质雄性不育基因序列(rf3)的方法。

Description

玉米细胞质雄性不育(CMS)S型恢复基因RF3
对相关申请的相互援引
本申请要求2013年12月31日提交的美国临时申请系列号61/922,344在35USC§119(e)下的权益，其全部公开内容通过提述并入本文。
对以电子方式提交的序列表的援引
该序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，其文件名为“74583_ST25.txt”，建立日期为2014年12月30日，大小为42千字节，并且与本说明书同时提交。包括在此ASCII格式文件中的序列表是说明书的一部分并通过提述完整并入本文。
公开领域
本公开涉及由细胞质雄性不育恢复基因(Rf3)和细胞质雄性不育基因(rf3)基因序列编码的蛋白质序列的分离和鉴定，以及用于检测植物中细胞质雄性不育恢复(Rf3)和细胞质雄性不育(rf3)基因序列的方法。此外，本公开涉及将细胞质雄性不育恢复(Rf3)和细胞质雄性不育(rf3)基因序列导入后代植物中的植物育种领域。
发明背景
细胞质雄性不育(CMS)是母系遗传的功能性花粉产生无能，其已经成功被用于杂交种子的商业生产，以避免人工去雄或机械去雄的不足(Kaul,M.L.H.1988.Malesterility in higher plants.Springer-Verlag,Berlin)。已经鉴定了40多种CMS来源，并分类为三个主要的组：CMS-T(Texas)、CMS-S(USDA)和CMS-C(Charrua)型细胞质。(Beckett,J.B.,Crop Sci.,11:724-726,1971)。
已经从若干植物物种克隆了对细胞质雄性不育植物恢复和赋予育性的Rf恢复基因，或以高分辨率进行了作图。到目前为止，有十一种Rf已经被克隆或以高分辨率进行了作图。除了玉米中的Rf2和Rf4以及水稻中的Rf17和Rf2之外，大多数克隆的恢复基因编码不同的三角状五肽重复区(PPR)蛋白。PPR蛋白含有一种35个氨基酸的区域的2至27个重复，该区域称为PPR基序(Small,I.D.和Peeters,N.，Trends Biochem.Sci.,25:46-47,2000)。许多PPR蛋白靶向CMS相关基因和产物所在的线粒体(Lurin,C.等人，Plant Cell,16:2089-2103,2004)。
在玉米中，编码具有CMS的S型细胞质的恢复系的基因表现为配子体性状。具有CMS-S型细胞质的玉米植物被单个显性基因Rf3所恢复，该基因借助标志物序列被定位到2号染色体上具有几个厘摩长度的基因组片段上。(Kamps和Chase,Theor.Appl.Genet.,95:525–531,1997；Tie,S.,Xia,J.,Qiu,F.和Zheng,Y.Plant Mol.Biol.,24:71-80,2006；Zhang,Z.和Zheng Y.Mol.Gen.Genomics.,276:162-169,2006)。传统的育种应用部署了与Rf3和rf3等位基因远距离相关的标志物的使用，以分别恢复或提供玉米植物中的细胞质雄性不育(Laughnan,J.R.和Gabay,S.J.1978.Nuclear and cytoplasmic mutations to fertilityin S male-sterile maize.pp.427-446.In:Maize Breeding and Genetics)。此外，杂合(Rf3/rf3)CMS-S植物是半可育的，其散布大约50％的含rf3等位基因的败育的空瘪花粉和大约50％的含Rf3等位基因的充满淀粉的能育花粉。Rf3/rf3植物中的rf3等位基因不能通过不育花粉传递给后代，并且产生F2代不育植物(Tie等人，Plant Mol.Biol.Rep.,24:71-80,2006)。这种遗传类型使得难于从F2定位群体采集准确的表型数据。正因如此，传统的使用和鉴定Rf3基因的显性和隐性等位基因的方法是劳动力和时间密集的。
因此，对于可用于分离和鉴定由细胞质雄性不育恢复基因(Rf3)和细胞质雄性不育基因(rf3)序列编码的蛋白质序列的组合物和方法、以及检测植物中细胞质雄性不育恢复基因(Rf3)和细胞质雄性不育基因(rf3)序列的方法存在着需要。
相应地，本公开提供了用于分离和鉴定由导致细胞质雄性不育恢复表型的Rf3等位基因编码的多核苷酸和蛋白质序列、以及由导致细胞质雄性不育表型的rf3等位基因编码的后续序列修饰的替代方法。这些序列的发现可以在细胞质雄性不育系统中得到应用，用于进行许多作物物种的杂交植物育种。因此，这个系统的应用可节省成本和增加效率。例如，可以利用在玉米中部署细胞质雄性不育系统，取代玉米植物去雄避免自花授粉这一昂贵且费力的任务。
前述关于相关技术及其相关局限性的实例只是说明性的，而不是排他性的。通过阅读本说明书，本领域的技术人员容易想到相关技术的其他局限性。
发明简述
本公开提供了包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案的若干方面，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的分离的多肽具有细胞质雄性不育活性。
在其他方面，本公开涉及包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:5的分离的多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在实施方案的方面，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的分离的多肽具有细胞质雄性不育恢复活性。
在另外的方面，本主题公开涉及产生后代细胞质雄性不育植物的方法。在其他方面，本主题公开提供了用于恢复后代细胞质雄性不育植物的育性的方法。在后续的方面，本主题公开涉及检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法。此外，本主题公开的其他方面涉及检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法。
除了上述示例性方面和实施方案之外，通过研究下面的描述将易于想到进一步的方面和实施方案。
附图简述
图1展示了Rf3等位基因的连锁图和QTL位置以及在2号染色体2上的对应性状。
图2展示了Rf3编码序列的多核苷酸序列比对。从4XP811和7SH382ms植物获得的序列与纯合隐性(rf3/rf3)的细胞质雄性不育植物对应。从LH60和MBB56植物获得的序列与纯合显性((Rf3/Rf3))的经恢复的细胞质雄性能育植物对应。在比对上方的星号指示导致隐性rf3等位基因并编码细胞质雄性不育性状的碱基对修饰。这种变化，从SEQ ID NO:6；5’-ATTGTTTTATTCAGT-3’到SEQ ID NO:2；5’-ATTGTTTTCTTCAGT-3’(其中加下划线的碱基对指示突变的序列)，导致恢复功能的丧失和细胞质雄性不育表型的获得。
图3展示了Rf3编码序列的蛋白质序列比对。从4XP811和7SH382ms植物获得的序列与纯合隐性(rf3/rf3)的细胞质雄性不育植物对应。从LH60和MBB56植物获得的序列与纯合显性((Rf3/Rf3))的恢复的细胞质雄性能育植物对应。在比对上方的星号指示导致隐性rf3等位基因并编码细胞质雄性不育性状的氨基酸残基修饰。这种改变，从SEQ ID NO:5；IVLFS到SEQ ID NO:1；IVFFSS(其中加下划线的氨基酸残基指示突变的序列)，导致恢复功能的丧失和细胞质雄性不育表型的获得。
序列简述
SEQ ID NO:1提供了其中Leu被修饰为Phe(加下划线)的蛋白质基序(IVFFSS)，由此导致恢复功能的丧失和rf3等位基因的细胞质雄性不育表型的获得。
SEQ ID NO:2提供了编码SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:3提供了从细胞质雄性不育玉米系——玉米栽培种4XP811获得的rf3等位基因的蛋白质序列。
SEQ ID NO:4提供了编码从细胞质雄性不育玉米系——玉米栽培种4XP811获得的rf3等位基因的cDNA多核苷酸序列。
SEQ ID NO:5提供了蛋白质基序(IVLFSS)，其中Leu(加下划线)氨基酸残基的保留导致恢复功能(Rf3等位基因的雄性能育表型)。
SEQ ID NO:6提供了编码SEQ ID NO:5的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:7提供了从恢复的能育玉米系——玉米栽培种LH60获得的Rf3等位基因的蛋白质序列。
SEQ ID NO:8提供了编码从恢复的能育玉米系——玉米栽培种LH60获得的Rf3等位基因的cDNA多核苷酸序列。
SEQ ID NO:9提供了从细胞质雄性不育玉米系——玉米栽培种7SH382MS获得的rf3等位基因的蛋白质序列。
SEQ ID NO:10提供了编码从细胞质雄性不育玉米系——玉米栽培种7SH382MS获得的rf3等位基因的cDNA多核苷酸序列。
SEQ ID NO:11提供了从恢复的能育玉米系——玉米栽培种MBB56获得的Rf3等位基因的蛋白质序列。
SEQ ID NO:12提供了编码从恢复的能育玉米系——玉米栽培种MBB56获得的Rf3等位基因的cDNA多核苷酸序列。
SEQ ID NO:13到SEQ ID NO:18提供了用于检测显性和隐性Rf3等位基因的引物和探针。
发明详述
概述
本公开提供了包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在实施方案的方面，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的分离的多肽具有细胞质雄性不育活性。
在其他方面，本公开涉及包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:5的分离的多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在实施方案的方面，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的分离的多肽具有细胞质雄性不育恢复活性。
在另外的方面，本主题公开涉及产生后代细胞质雄性不育植物的方法。在其他方面，本主题公开提供了用于恢复后代细胞质雄性不育植物的育性的方法。在后续的方面，本主题公开涉及检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法。此外，本主题公开的其他方面涉及检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法。
II.条款清单
本文中提供了本发明的实施方案，其进一步通过以下列举的条款加以描述：
1.一种包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的分离的多肽。
2.一种由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的分离的多肽。
3.一种基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的分离的多肽。
4.条款1的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
5.条款1的分离的多肽，其由与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
6.条款1的分离的多肽，其基本上由与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
7.条款1或条款4的分离的多肽序列，其中所述多肽具有细胞质雄性不育活性。
8.一种包含条款1的多肽的细胞。
9.条款8的细胞，其中该细胞是植物细胞。
10.一种包含条款9的植物细胞的植物。
11.条款10的植物，其中该植物是单子叶植物。
12.条款11的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
13.一种从条款10的植物获得的种子。
14.一种编码条款1的多肽的合成核酸序列。
15.条款14的合成核酸序列，其包含序列SEQ ID NO:2。
16.条款14的合成核酸序列，其由序列SEQ ID NO:2组成。
17.条款14的合成核酸序列，其基本上由序列SEQ ID NO:2组成。
18.条款14的合成核酸序列，其包含与序列SEQ ID NO:4的至少90％序列同一性。
19.条款14的合成核酸序列，其由序列SEQ ID NO:4组成。
20.条款14的合成核酸序列，其基本上由序列SEQ ID NO:4组成。
21.一种多核苷酸，其包含条款14的合成核酸序列。
22.条款21的多核苷酸，其中该多核苷酸与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
23.条款22的多核苷酸，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
24.一种细胞，其包含条款21的多核苷酸。
25.一种载体，其包含条款14的合成核酸序列。
26.一种细胞，其包含条款25的载体。
27.条款1的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
28.条款1的分离的多肽，其由与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
29.条款1的分离的多肽，其基本上由与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
30.条款27的分离的多肽序列，其中该多肽具有细胞质雄性不育活性。
31.一种包含条款27的多肽的细胞。
32.条款31的细胞，其中该细胞是植物细胞。
33.一种植物，其包含条款32的植物细胞。
34.条款33的植物，其中该植物是单子叶植物。
35.条款34的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
36.一种从条款33的植物获得的种子。
37.一种合成核酸序列，其编码条款27的多肽。
38.条款37的合成核酸序列，其包含与序列SEQ ID NO:10的至少90％序列同一性。
39.条款37的合成核酸序列，其由SEQ ID NO:10的序列组成。
40.条款37的合成核酸序列，其基本上由SEQ ID NO:10的序列组成。
41.一种多核苷酸，其包含条款37的合成核酸序列。
42.条款41的多核苷酸，其中该多核苷酸与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
43.条款42的多核苷酸，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
44.一种细胞，其包含条款41的多核苷酸。
45.一种载体，其包含条款37的合成核酸序列。
46.一种细胞，其包含条款45的载体。
47.条款35的植物，其中该植物具有CMS-S型细胞质。
48.一种产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括下列步骤：
使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:4而言为纯合的细胞质雄性不育亲本植物，并且该雄性亲本植物是能育亲本植物；
从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:4而言是纯合的；
种植该后代种子；并且，
培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性不育植物，其中该后代细胞质雄性不育植物对于SEQ ID NO:4而言是纯合的。
49.条款48的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。
50.条款49的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该单子叶植物是玉米植物。
51.条款48的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。
52.条款48的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物对于SEQID NO:8而言是纯合或杂合的。
53.条款48的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。
54.条款48的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括下列步骤：
e)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
f)选择具有所述期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
g)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
h)选择具有所述期望性状的回交后代植物；并且，
i)重复步骤(g)和(h)连续三次或更多次，以产生包含所述期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
55.条款53的用于产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
56.一种产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:10而言为纯合的细胞质雄性不育亲本植物，并且该雄性亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:10而言是纯合的；
c)种植该后代种子；并且，
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性不育植物，其中该后代细胞质雄性不育植物对于SEQ ID NO:10而言是纯合的。
57.条款56的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。
58.条款57的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该单子叶植物是玉米植物。
59.条款56的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。
60.条款56的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物对于SEQID NO:8而言是纯合或杂合的。
61.条款56的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。
62.条款56的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括下列步骤：
e)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
f)选择具有所述期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
g)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
h)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
i)重复步骤(g)和(h)连续三次或更多次，以产生包含所述期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
63.条款61的用于产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
64.一种恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法包括：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:8而言为纯合或杂合的细胞质雄性不育亲本植物，并且其中该细胞质不育亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的；
c)种植该后代种子；
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性能育植物；并且，
e)恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性，其中该后代细胞质雄性能育植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
65.条款64的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。
66.条款65的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该单子叶植物是玉米植物。
67.条款64的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。
68.条款64的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雄性亲本植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
69.条款64的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法进一步包括将期望性状导入细胞质雄性不育植物中。
70.条款64的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法进一步包括：
f)使所述后代细胞质雄性不育植物与另一种包含期望性状的植物杂交以产生F1后代植物；
g)选择具有所述期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
h)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
i)选择具有所述期望性状的回交后代植物；并且，
j)连续重复步骤(h)和(i)三次或更多次以产生包含期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
71.条款69的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
72.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
73.一种分离的多肽，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
74.一种分离的多肽，其基本上由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
75.条款72的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
76.条款72的分离的多肽，其由与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
77.条款72的分离的多肽，其基本上由与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
78.条款72或条款75的分离的多肽序列，其中所述多肽具有细胞质雄性不育恢复活性。
79.一种细胞，其包含条款72的多肽。
80.条款79的细胞，其中该细胞是植物细胞。
81.一种植物，其包含条款80的植物细胞。
82.条款81的植物，其中该植物是单子叶植物。
83.条款82的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
84.条款83的植物，其中该植物具有CMS-S型细胞质。
85.一种从条款81的植物获得的种子。
86.一种合成核酸序列，其编码条款72的多肽。
87.条款86的合成核酸序列，其包含序列SEQ ID NO:8。
88.条款86的合成核酸序列，其由序列SEQ ID NO:8组成。
89.条款86的合成核酸序列，其基本上由序列SEQ ID NO:8组成。
90.条款86的合成核酸序列，其包含序列SEQ ID NO:6。
91.条款86的合成核酸序列，其其由序列SEQ ID NO:6组成。
92.条款86的合成核酸序列，其基本上由序列SEQ ID NO:6组成。
93.一种基因表达盒，其包含条款86的合成核酸序列。
94.条款93的基因表达盒，其中该合成核酸序列与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
95.条款94的基因表达盒，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
96.一种包含条款93的基因表达盒的细胞。
97.一种包含条款86的合成核酸序列的载体。
98.一种包含条款97的载体的细胞。
99.一种恢复细胞质雄性不育植物的育性的方法，该方法包括下列步骤：
用条款86的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；并且，
表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达恢复细胞质雄性不育植物的育性。
100.一种改变细胞质雄性不育植物中的植物形态学的方法，该方法包括下列步骤：
用条款86的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；并且，
表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达改变细胞质雄性不育植物的植物形态。
101.一种检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，该方法包括下列步骤：
从植物、植物组织、植物部分、或植物细胞分离基因组多核苷酸样品；
向该基因组多核苷酸样品添加一组寡核苷酸引物；
对该基因组多核苷酸样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；并且，
检测至少一种扩增产物，其中该扩增产物指示植物中的细胞质雄性不育恢复性状的存在。
102.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该组寡核苷酸引物选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、和SEQ ID NO:30。
103.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物包含SEQ ID NO:6。
104.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物由SEQ ID NO:6组成。
105.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物基本上由SEQ ID NO:6组成。
106.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物包含SEQ ID NO:8的片段。
107.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物由SEQ ID NO:8的片段组成。
108.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物基本上由SEQ ID NO:8的片段组成。
109.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物包含SEQ ID NO:12的片段。
110.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物由SEQ ID NO:12的片段组成。
111.条款101的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物基本上由SEQ ID NO:12的片段组成。
112.检测包含条款101的细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物被定量。
113.检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，该方法包括下列步骤：
使用细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)、正向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:28)和反向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:29)对基因组多核苷酸样品进行第一扩增过程，其中从细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)释放第一荧光染料；
使用参考探针(SEQ ID NO:36)、正向参考引物(SEQ ID NO:34)和反向参考引物(SEQ ID NO:35)对基因组多核苷酸样品进行第二扩增过程，其中从参考探针(SEQ ID NO:36)释放第二荧光染料；并且，
定量第一荧光染料对第二荧光染料的相对强度，以检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平。
114.条款113的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一和第二扩增过程是使用带有不同荧光染料的探针在单个PCR测定管中进行的。
115.条款113的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，该方法进一步包括下列步骤：
d)将PCR溶液上样到单个PCR测定管中，该PCR溶液包含具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶、脱氧核苷酸、引物、探针、缓冲液、和基因组多核苷酸样品；
e)扩增该PCR溶液，其中该PCR溶液在扩增条件下被处理，使得该聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割所述探针，由此释放发光的荧光染料；并且，
f)测量在扩增过程中从荧光染料发出的光。
116.条款113的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该细胞质雄性不育性状探针包含第一荧光染料和第一淬灭剂。
117.条款116的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一荧光染料选自下组：HEX荧光染料、VIC荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。
118.条款116的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、IowaBlack RQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。
119.条款113的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该参考探针包含第二荧光染料和第二淬灭剂。
120.条款119的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第二荧光染料选自下组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、VIC荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。
121.条款119的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第二淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、IowaBlack RQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。
122.条款113或条款101的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该基因组多核苷酸样品包含从植物、植物组织、植物部分、或植物细胞分离的mRNA所产生的cDNA。
123.一种包含条款4的多肽的细胞。
124.条款123的细胞，其中该细胞是植物细胞。
125.一种包含条款124的植物细胞的植物。
126.条款125的植物，其中该植物是单子叶植物。
127.条款126的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
128.一种从条款125的植物获得的种子。
129.一种编码条款4的多肽的合成核酸序列。
130.条款129的合成核酸序列，其包含与序列SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的序列。
131.条款129的合成核酸序列，其由序列SEQ ID NO:4组成。
132.条款129的合成核酸序列，基本上由序列SEQ ID NO:4组成。
133.一种包含条款129的合成核酸序列的多核苷酸。
134.条款133的多核苷酸，其中该多核苷酸与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
135.条款134的多核苷酸，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
136.一种包含条款133的多核苷酸的细胞。
137.一种包含条款129的合成核酸序列的载体。
138.一种包含条款137的载体的细胞。
139.条款125的植物，其中该植物具有CMS-S型细胞质。
III.术语
除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与涉及本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，以包含定义的本申请为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，其复数术语应包括单数。出于所有目的，本文中提及的所有出版物、专利和其他参考文献通过提述完整并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地通过提述并入本文一样，除非指明只有专利或专利出版物的特定部分通过提述并入本文。
为了进一步阐明本发明，提供了以下术语、缩写和定义。
如本文中使用的，术语“包含”(“comprises”)、“包括”(“comprising”)、“包含”(“includes”)、“包括”(“including”)、“具有”(“has”)、“具有”(“having”)、“含有”(“contains”)或“含有”(“containing”)或它们的任何其他变型均旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含列出的要素的组合物、混合物、工艺、方法、物品、或装置不一定仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或装置固有的其他要素。此外，除非明确相反地说明，“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，通过任何一种以下情况来满足条件A或B：A是真实的(或存在)且B是虚假的(或不存在)，A是虚假的(或不存在)且B为真实的(或存在)以及A和B都是真实的(或存在)。
并且，在本披露的实施方案的要素或部件之前的不定冠词“a”和“an”对于实例，即，出现的要素或部件的数量旨在是非限制性的。因此，“一”或“一个”应该被理解为包括一个或至少一个，并且要素或部件的单数词语形式还包括复数形式，除非所述数字明显意指单数。
如本文中使用的术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指任何的特定发明的单个实施方案，而是涵盖在本申请中公开的所有可能的实施方案。
如本文中使用的，术语“植物”包括整个植物及植物的任何后代、细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(如花粉、胚、花、果实、茎芽(shoot)、叶、根、茎、和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或者任何其他被组织成一定结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且可能能够再生出与该植物具有基本上相同的基因型的植物。与之相反，一些植物细胞不能够再生而产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和根砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
植物细胞是植物的结构和生理单元，包括没有细胞壁的原生质体细胞和具有细胞壁的植物细胞。植物细胞可以是分离的单细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散型(friable)愈伤组织和培养细胞)，并且可以是更高级有组织单元的一部分(例如，植物组织、植物器官、和植物)。因此，植物细胞可以是原生质体、配子产生细胞、或可以再生成完整植物的细胞或细胞集合。因此，包含多个植物细胞并能够再生为完整植物的种子，在本文的实施方案中被认为是“植物细胞”。
如本文中使用的，术语“分离的”是指这样的生物学组分(包括核酸或蛋白质)，其已经从该组分所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)分离、分开产生。
如本文中使用的，关于核酸分子的术语“纯化的”并不要求绝对的纯度(比如同质制剂)；相反，其代表该序列比其天然细胞环境相对更纯的含义(与天然水平相比，这个水平例如，就浓度或基因表达水平而言应当至少高2-5倍)。所要求的DNA分子直接地获自总DNA或获自总RNA。另外，cDNA克隆并非天然存在，而是优选地经由部分纯化的、天然存在的物质(信使RNA)的操作获得。从mRNA构建cDNA文库涉及文库的创建。通过进行携带该cDNA文库的克隆选择，可从该文库产生单独的cDNA克隆。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和选择独特的cDNA克隆的过程导致天然信息的大约106倍纯化。同样，可将启动子或基因DNA序列克隆到质粒中。这样的克隆并非天然存在，而是优选地经由部分纯化的、天然存在的物质(比如基因组DNA文库)的操作获得。因此，至少一个数量级、优选两个或三个数量级、更优选四个或五个数量级的纯化在这些技术中受到青睐。
类似地，“合成的”代表已经在组分DNA序列中发生化学或功能变化的含义。已经“合成”的核酸分子和蛋白质包括通过PCR扩增或通过重组方法生成的核酸分子和蛋白质，其中分离的多核苷酸通过组入质粒或载体中而被进一步修饰。术语“合成的”还包括通过重组DNA方法在宿主细胞(例如，植物细胞)中制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。
在工程化基因以便在植物中表达的过程中，例如通过使用可公开获得的DNA序列数据库找到关于植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息，可以确定预期宿主植物的密码子偏倚。一旦在纸上或计算机上设计出了优化的(例如，植物优化的)DNA序列，便可以在实验室里合成出在序列上与设计的序列精确对应的实际DNA分子。可以对这些合成的核酸分子进行克隆和进行其他操作，完全如同它们来自自然或天然的来源一样。
如本文中使用的，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可以互换使用，并可包括单个核酸、多个核酸、核酸片段、变体或其衍生物、和核酸构建体(例如信使RNA(mRNA)和质粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻译的5'和/或3'序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以包括未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以由单链和双链DNA；单链区和双链区混合物DNA；单链和双链RNA；单链区和双链区混合物RNA组成。包含DNA和RNA的杂交分子可以是单链的、双链的、或单链区和双链区的混合物。前述术语还包括化学、酶学和代谢修饰形式的多核苷酸或核酸。
应当理解，具体的DNA还指其互补序列，其序列根据脱氧核糖核苷酸碱基配对的规则确定。
如本文中使用的，术语“基因”是指编码功能产物(RNA或多肽/蛋白)的核酸。基因可以包含位于编码功能产物的序列之前(5'非编码序列)和/或之后(3'非编码序列)的调节序列。
如本文中使用的，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(例如，5'非编码序列)、内部或下游(例如，3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括，例如但不限于：启动子；翻译前导序列；内含子；多腺苷酸化识别序列；RNA加工位点；效应物结合位点；和茎环结构。
如本文中使用的，术语“多肽”包括单个多肽、多个多肽、和其片段。该术语是指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸构成的任何链(一个或多个)，且不指示产物的具体长度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链、和任何其他用于指示有两个或多个氨基酸的链的术语均包含在“多肽”的定义之内，并且前述术语在本文中可以和“多肽”互换使用。多肽可以是从天然生物源分离的或者通过重组技术产生的，但是具体的多肽不一定是从特定的核酸翻译产生的。多肽可以用任何合适的方式产生，包括例如但不限于，通过化学合成。
如本文中使用的，术语“天然的”是指在自然界中发现的、并与其自身的调节序列(如果存在的话)在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。术语“内源的”是指处于生物或生物基因组中的天然位置处的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
相反，术语“异源的”是指在参考(宿主)生物的位置处通常不会发现的多核苷酸、基因或多肽。例如，异源核酸可以是通常在参考生物的不同基因组位置处被发现的核酸。作为进一步的实例，异源核酸可以是通常不会在参考生物中被发现的核酸。含有异源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物可以通过将异源多核苷酸、基因或多肽导入到宿主生物内而产生。在特定的实例中，异源多核苷酸包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列、或其部分。在特定的实例中，异源基因包括以不同于相应的天然基因的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列或其部分。例如，异源基因可以包括天然编码序列，该天然编码序列是含有非天然调节区的嵌合基因的一部分，该嵌合基因被重新导入到天然宿主内。在特定的实例中，异源多肽是以不同于相应的天然多肽的形式被重新导入到来源生物内的天然多肽。
异源基因或多肽可以是这样的基因或多肽，其包含功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列，该功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列与其他基因或多肽融合从而产生嵌合或融合的多肽或编码它的基因。基因和蛋白质的特定实施方案包括具体例举的全长序列和部分、区段、片段(包括与全长分子相比具有内部和/或末端缺失的连续片段)、变体、突变体、嵌合体、以及这些序列的融合。
如本文中使用的，术语“修饰”可以指特定参考多核苷酸内的改变，其导致由该参考多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修饰还指参考多肽中的改变，其导致参考多肽的活性减低、基本上消失、或消失。或者，术语“修饰”可以指参考多核苷酸中的改变，其导致该参考多核苷酸编码的多肽的活性增加或提高，以及参考多肽中的改变，其导致参考多肽的活性增加或提高。诸如前述的改变可以通过任何本领域众所周知的方法实现，这样的方法有若干种，包括，例如但不限于：缺失参考分子的一部分；突变参考分子(例如通过自发诱变；通过随机诱变；通过增变基因导致的诱变；和通过转座子诱变)；取代参考分子的一部分；在参考分子内插入元件；下调参考分子的表达；改变参考分子的细胞定位；改变参考分子的状态(例如通过参考多核苷酸的甲基化，和通过参考多肽的磷酸化或泛素化)；除去参考分子的辅助因子；导入靶向参考分子的反义RNA/DNA；导入靶向参考分子的干扰RNA/DNA；参考分子的化学修饰；参考分子的共价修饰；用UV辐射或X射线辐照参考分子；改变参考分子的同源重组；改变参考分子的有丝分裂重组；替换参考分子的启动子；和/或前述的任意组合。
可以通过比较参考多核苷酸或多肽的序列与同源(例如同源酵母或细菌)多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源区(保守区)或共有序列中的修饰数目最大化，来找到确定在具体实例中哪些核苷酸或氨基酸残基可以被修饰的指引。
术语“启动子”指能够控制核酸编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在实例中，受控制的编码序列位于启动子序列的3'。可以从天然基因中整体获得启动子，启动子可以包括来自天然出现的不同启动子的不同元件，或者启动子甚至可以包括合成的DNA片段。本领域的技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境或生理条件表达。所有上述启动子的实例都是已知的，并且在本领域中用于控制异源核酸的表达。指导基因在大多数细胞类型中在大部分时间里表达的启动子通常称为“组成型启动子”。此外，虽然本领域技术人员已经尝试界定调节序列的确切边界(在许多情况下未成功)，但是已经认识到，长度不同的DNA片段可能具有相同的启动子活性。特定核酸的启动子活性可以使用本领域技术人员熟悉的技术进行测定。
术语“可操作连接”是指单一核酸上的多个核酸序列的关联，其中一个核酸序列的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(例如，编码序列在启动子的转录控制之下)，启动子与编码序列就是可操作连接的。编码序列可以沿着有义和反义方向与调节序列可操作连接。
如本文中使用的，术语“表达”(“expression”或“expressing”)可以指衍生自DNA的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指mRNA翻译成多肽。如本文中使用的，术语“过表达”是指高于相同基因或相关基因的内源表达的表达。因此，如果异源基因的表达高于可比较的内源基因的表达，则该异源基因被“过表达”。
如本文中使用的，术语“转化”(“transformation”)或“转化”(“transforming”)是指核酸或其片段被转移并整合到宿主生物内，导致基因上稳定的遗传。含有转化核酸的宿主生物被称作“转基因”、“重组”或“转化”生物。已知的转化方法包括，例如：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)介导的转化；磷酸钙转化；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔；超声波方法(例如，超声波穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；用裸DNA转化；用质粒载体转化；用病毒载体转化；基因枪转化(微粒轰击)；碳化硅WHISKERS(晶须)介导的转化；气溶胶发射转化(aerosol-beaming)；和PEG介导的转化。
如本文中使用的，术语“导入”(在将核酸导入细胞的背景下)包括细胞的转化，以及包含核酸的植物与第二种植物的杂交，从而使第二种植物含有该核酸，这可以用常规植物育种技术实施。这些育种技术是本领域已知的。关于植物育种技术的讨论，见Poehlman(1995)Breeding Field Crops,第4版,AVI Publication Co.,Westport CT。
回交方法可用于将核酸导入植物。这种技术已数十年用于将性状导入植物。回交(以及其他的植物育种方法学)的描述实例可以参见，例如，Poelman(1995)，同上；和Jensen(1988)Plant Breeding Methodology,Wiley,New York,NY。在一个示例性回交方案中，将感兴趣的原始植物(以下简称“轮回亲本”)与携带要导入的核酸的第二植物(“非轮回亲本”)杂交。然后，将此杂交产生的子代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程直到获得转化植物，其中除了来自非轮回亲本的核酸之外，转化植物还复原了轮回亲本的几乎全部的期望形态和生理特征。
如本文中使用的，术语“等基因的”是指具有基本上相同的基因型(例如，在个体之间不超过1个基因不同)的两株个体植物(或其部分，比如种子、细胞)。
“结合”指大分子(例如，蛋白质和核酸之间)之间序列特异性的、非共价的相互作用。并非所有结合相互作用的成分都需要序列特异性(例如，与DNA骨架中的磷酸残基相接触)，只要相互作用作为整体是序列特异性的即可。这种相互作用一般以解离常数(Kd))为10-6M-1或者更低为特点。“亲和力”指代结合的强度：结合亲和力增加则Kd降低。
如本文中使用的，术语“质粒”和“载体”是指染色体外元件，其可携带一个或多个非细胞中心代谢部分的基因。质粒和载体通常是环状双链DNA分子。然而，质粒和载体可以是线性或环状核酸，呈单链或双链DNA或RNA，并可以衍生自任何来源，其中若干核苷酸序列被连接或重组成一个独特的构建体，其能够将启动子片段和编码DNA序列与任何合适的3'非翻译序列一起导入到细胞内。在实例中，质粒和载体可以包括自主复制序列、基因组整合序列、和/或噬菌体或核苷酸序列。
多肽和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。这些术语并非是指产物的具体长度。因此，“肽类”和“寡肽类”被包括在多肽的定义之内。这些术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化，等。另外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白、融合蛋白等被包括在多肽的含义之内。这些术语还包括其中一个或多个氨基酸类似物或非规范性或非天然氨基酸被包括在内的分子，正如可使用已知的蛋白质工程技术合成或重组表达所述分子。另外，可如本文所述通过熟知的有机化学技术衍生本发明的融合蛋白。
术语“融合蛋白”表明，所述蛋白质包括从一个以上的母本蛋白或多肽衍生的多肽组分。典型地，融合蛋白是从融合基因表达的，在所述融合基因中，编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列一起附加在框内，并且任选地由接头分开。然后，融合基因可由重组宿主细胞表达为单一的蛋白质。
IV.本发明的实施方案
在一个实施方案中，本主题公开涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在该实施方案的若干方面，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的分离的多肽具有细胞质雄性不育活性。
在另一个实施方案中，本主题公开涉及由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的分离的多肽。在另一个实施方案中，本主题公开涉及基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽由与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽基本上由与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，本公开涉及包含SEQ ID NO:1的分离的多肽的细胞。在一个方面，包含SEQ ID NO:1的分离的多肽的细胞可以是植物细胞。在另外的方面，本主题公开涉及包含含有SEQ ID NO:1的分离的多肽的植物细胞的植物。在另一个实施方案中，该植物是单子叶植物。在另外的实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在另一个实施方案中，该玉米植物具有CMS-S型细胞质。本主题公开的另外的方面涉及从包含含有SEQ ID NO:1的分离的多肽的植物细胞的植物获得的种子。
在另外的实施方案中，本公开涉及编码SEQ ID NO:1的多肽的合成核酸序列。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的多肽由SEQ ID NO:2的序列编码。在另一个实施方案中，多核苷酸包含序列SEQ ID NO:2。在另一个方面，多核苷酸由序列SEQ ID NO:2组成。在一个另外的方面，多核苷酸基本上由序列SEQ ID NO:2组成。在一个另外的方面，包含序列SEQ ID NO:2的多核苷酸与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。在又另一个方面，该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。在另一个实施方案中，本公开涉及包含进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸的细胞。在另一个实施方案中，本公开涉及包括进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸的细胞。在另一个实施方案中，本公开涉及主要包括进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸的细胞。在一个另外的实施方案中，本公开涉及包含进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸的载体。在一个另外的实施方案中，本公开涉及由进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸组成的载体。在一个另外的实施方案中，本公开涉及基本上由进一步含有序列SEQ ID NO:2的多核苷酸组成的载体。
此外，本主题公开涉及产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:4而言为纯合的细胞质雄性不育亲本植物，并且该雄性亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:4而言是纯合的；
c)种植该后代种子；并且，
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性不育植物，
其中该后代细胞质雄性不育植物对于SEQ ID NO:4而言是纯合的。
在一个另外的方面，该方法涉及产生后代细胞质雄性不育植物，其中所述雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在一个另外的实施方案中，该玉米植物具有CMS-S型细胞质。在又另一个实施方案中，该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。在后续实施方案中，玉米植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。在后续的实施方案中，该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
在又另一个方面，本主题公开涉及产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括下列步骤：
e)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
f)选择具有期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
g)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
h)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
i)连续重复步骤(g)和(h)三次或更多次以产生包含期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
本主题公开的另外方面涉及一种恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法包括：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:8而言为纯合或杂合的细胞质雄性不育亲本植物，并且其中该细胞质不育亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的；
c)种植该后代种子；
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性能育植物；并且，
e)恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性，其中该后代细胞质雄性能育植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
在一个另外的方面，该方法涉及产生后代细胞质雄性能育植物，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在又另一个实施方案中，该玉米植物具有CMS-S型细胞质。在一个另外的实施方案中，该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。在后续实施方案中，玉米植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。在另一个实施方案中，该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
在又另一个方面，本主题公开涉及产生细胞质雄性不育亲本植物的后代的方法，该方法进一步包括下列步骤：
f)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
g)选择具有期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
h)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
i)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
j)连续重复步骤(g)和(h)三次或更多次以产生包含期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
在一个实施方案中，本主题公开涉及包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，具有SEQ ID NO:5的分离的多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在该实施方案的方面，具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的分离的多肽具有细胞质雄性不育恢复活性。
在一个实施方案中，本主题公开涉及由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的分离的多肽。在一个实施方案中，本主题公开涉及基本上由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，具有SEQ ID NO:5的分离的多肽由与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。在一个另外的实施方案中，具有SEQ ID NO:5的分离的多肽基本上由与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，本公开涉及包含具有SEQ ID NO:5的分离的多肽的细胞。在一个方面，包含具有SEQ ID NO:5的分离的多肽的细胞可以是植物细胞。在另外的方面，本主题公开涉及包含含有SEQ ID NO:5的分离的多肽的植物细胞的植物。在另一个实施方案中，该植物是单子叶植物。在另外的实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在另一个实施方案中，该玉米植物具有CMS-S型细胞质。本主题公开的另外的方面涉及从包含含有SEQ IDNO:5的分离的多肽的植物细胞的植物获得的种子。
在另外的实施方案中，本公开涉及编码SEQ ID NO:5的多肽的合成核酸序列。在一个另外的实施方案中，该合成核酸序列包含序列SEQ ID NO:5。在另一个实施方案中，该合成核酸序列由序列SEQ ID NO:5组成。在一个另外的实施方案中，该合成核酸序列基本上由序列SEQ ID NO:5组成。在一个另外的实施方案中，该合成核酸序列包含序列SEQ ID NO:8。在另一个实施方案中，该合成核酸序列由序列SEQ ID NO:8组成。在一个另外的实施方案中，该合成核酸序列基本上由序列SEQ ID NO:8组成。在另一个实施方案中，基因表达盒包含SEQ ID NO:8的合成序列。在一个另外的方面，包含序列SEQ ID NO:8的基因表达盒与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。在又另一个方面，该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。在另一个实施方案中，本公开涉及包含进一步含有序列SEQ ID NO:8的基因表达盒的细胞。在一个实施方案中，本公开涉及包含由序列SEQ ID NO:8组成的基因表达盒的细胞。在一个另外的实施方案中，本公开涉及主要包括进一步含有序列SEQ ID NO:8的基因表达盒的细胞。在一个另外的实施方案中，本公开涉及包含进一步含有序列SEQ IDNO:8的多核苷酸的基因表达盒。在后续的实施方案中，本公开涉及由下述多核苷酸组成的基因表达盒，所述多核苷酸由序列SEQ ID NO:8组成。在另一个实施方案中，由下述多核苷酸组成的基因表达盒，所述多核苷酸基本上由序列SEQ ID NO:8组成。
本主题公开的另外方面涉及一种恢复细胞质雄性不育植物的育性的方法，该方法包括：
a)用编码SEQ ID NO:5的多肽的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
b)将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；并且，
c)表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达恢复该细胞质雄性不育植物的育性。
本主题公开的其他方面涉及一种改变细胞质雄性不育植物的形态的方法，该方法包括：
a)用编码SEQ ID NO:5的多肽的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
b)将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；且，
c)表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达改变细胞质雄性不育植物的形态。
在一个实施方案中，本主题公开涉及一种检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)从植物、植物组织、植物部分或植物细胞分离基因组多核苷酸样品；
b)向该基因组多核苷酸样品添加一组寡核苷酸引物；
c)对该基因组多核苷酸样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；并且，
d)检测至少一种扩增产物，其中该扩增产物指示所述植物中细胞质雄性不育性状的存在。
另外的实施方案涉及检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，包括选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、和SEQ ID NO:30的寡核苷酸引物组。在另一个实施方案中，该扩增产物包含SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，该扩增产物由SEQ ID NO:6组成。在一个另外的实施方案中，该扩增产物基本上由SEQ ID NO:6组成。另外的实施方案包括对扩增产物的定量。
本主题公开的其他方面涉及一种检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，该方法包括下列步骤：
a)使用细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)、正向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:28)和反向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:29)对基因组多核苷酸样品进行第一扩增过程，其中从细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)释放第一荧光染料；
b)使用参考探针(SEQ ID NO:36)、正向参考引物(SEQ ID NO:34)和反向参考引物(SEQ ID NO:35)对基因组多核苷酸样品进行第二扩增过程，其中从参考探针(SEQ ID NO:36)释放第二荧光染料；
c)定量第一荧光染料对第二荧光染料的相对强度，以检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平。
另外的实施方案涉及检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，包括其中该第一和第二扩增过程使用带有不同荧光染料的探针在单个PCR测定管中进行的实施方案。
在一个另外的实施方案中，检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法包括下列步骤：
d)将PCR溶液加载到单个PCR测定管中，该PCR溶液包含具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶、脱氧核苷酸、所述引物、所述探针、缓冲液、和基因组多核苷酸样品；
e)扩增该PCR溶液，其中该PCR溶液在扩增条件下被处理，使得该聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割所述探针，由此释放发光的荧光染料；并且，
f)测量在扩增过程中从荧光染料发出的光。
另外的实施方案涉及检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，包括包含第一荧光染料和第一淬灭剂的细胞质雄性不育性状探针。在后续的实施方案中，该第一荧光染料选自下组：HEX荧光染料、VIC荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。在一个另外的实施方案中，该第一淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、Iowa Black RQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。在又另一个实施方案中，该参考探针包含第二荧光染料和第二淬灭剂。在后续的实施方案中，该第二荧光染料选自下组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、VIC荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。在另一个实施方案中，该第二淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、Iowa Black RQ淬灭剂、IRDye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。在一个另外的实施方案中，该基因组多核苷酸样品包括产生自mRNA的cDNA，该mRNA分离自植物、植物组织、植物部分、或植物细胞。
在本公开的一个实施方案中，提供了包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的分离的多肽的多核苷酸供体盒。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽进一步包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在后续的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽和与SEQ ID NO:3具有85％序列同一性的多肽具有细胞质雄性不育活性。
细胞质雄性不育系统已经用于许多作物物种的杂交体育种。使用这样的不育系统可能提高成本效益和节约劳动力。例如，在玉蜀黍或玉米中，当利用细胞质雄性不育来避免自花授粉时，避免了昂贵且费力的去雄任务。由于其简单、节省成本，细胞质雄性不育系统在育种程序中的使用也是有利的。
细胞质雄性不育，一种母系遗传的性状，其在杂交行业应用最为广泛，用来使植物的雄性特征不发挥功能。在受精过程中，雌性贡献来自卵的单倍体核和几乎所有的细胞质，而雄性贡献来自花粉的单倍体核但却几乎不贡献细胞质。结果，赋予雄性不育的雌性细胞质被逐代地往下传递。细胞质中携带的影响表型(即，花药的存在或花粉的产生)的信息完全由雌性来贡献。这种类型的不育仅仅影响花粉产生；种子形成是正常的。通常，所有来自雄性不育植物的后代自身也是雄性不育的。然而，在一些情况下，雄性育性可以恢复。Pearson,O.H.(1981)Hort Sci.16:482-487。育性可以通过细胞质反转为育性而恢复，或者由能够超越细胞质的影响的细胞核恢复基因来恢复。MacKenzie等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA J35:2714-2717。特定的细胞质可以逐代传递，前提是拥有细胞质的植物在每次杂交中均为母本。
一般而言，在鉴定细胞质雄性不育的来源后，“rf”性状传递到期望的“雌性”或“A”系。缺乏不育性状和恢复因子的“维持”或“B”系用于保持和增进雌系。用携带花粉育性因子的“恢复系”或“Rf”系作为雄性对细胞质雄性不育“A”系授粉以建立杂交品种。“A”系的细胞质雄性不育植物可与来自不同品种的植物杂交以产生杂交后代。这种类型的育种程序常常被称为细胞质雄性不育-恢复系统。
有多种Rf等位基因已经得到了测序或克隆，这些等位基因例如来自玉米(玉蜀黍)的Rf2(Cui,X.,Wise,R.P.,和Schnable,P.S.1996.The Rf2nuclear restorer gene ofmale-sterile T-cytoplasm maize.Science 272:1334-1336)、来自碧冬茄属(矮牵牛)的Rf-PPR592(Bentolila,S.,Alfonso,A.A.,和Hanson,M.R.2002.A pentatricopeptiderepeat-containing gene restores fertility to male sterileplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:10887-10892)、来自萝卜(Raphanus sativus)的Rfo(Brown,G.G.,Formanova,N.,Jin,H.,Wargachuk,R.,Dendy,C.,Patil,P.,Laforest,M..,Zhang,J.F.,Cheung,W.Y.,和Landry,B.S.2003.The radish Rf Restorer gene of Oguracytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptiderepeats.Plant J.35:262-272；Desloire,S.,Gherbi,H.,Laloui,W.,Marhadour,S.,Clouet,V.,Cattolico,L.,Falentin,C.,Giancola,S.,Renard,M.,Burdar,F.,Small,I.,Caboche,M.,和Bendahmane,A.2003.Identification of the fertility restorerlocus,Rfo,in radish,as a member of the pentatricopeptide-repeat proteinfamily.EMBO Rep.4:1-7；Koizuka,N.,Imai,R.,Fujimoto,H.,Hayakawa,T.,Kimura,Y.,Kohno-Murase,J.,Sakai,T.,Kawasaki,S.,Imamura,J.2003.genetic characterizationof a pentatricopeptide repeat protein gene,orf 687,that restores fertility inthe cytoplasmic male sterile Kosena radish.Plant J.34:407-415)、来自高粱(Sorghum bicolor)的Rf1和Rf2(Klein,R.R.,Klein,P.E.,Mullet,J.E.,Minx,P.,Rooney,W.L.,和Schertz,K.F.2005.Fertility restorer locus Rf1of sorghum(Sorghumbicolor L.)encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in thecollinear region of rice chromosome 12.Theor.A..l.Genet.111:994-1012)、针对BT型CMS的来自水稻(Oryza sativa)的Rf1a和Rf1b(Kazama,T.,和Toriyama,K.2003.Apentatricopeptide repeat-containing gene that promotes the processing ofaberrant atp6RNA of cytoplasmic male-sterile rice.FEBS Lett.544:99-102；Akagi,H.,Nakamura,A.,Yokozeki-Misono,Y.,Inagaki,A.,Takahashi,H.,Mori,K.,和Fujimura,T.2004.Position cloning of the rice Rf-1gene,a restorer of BT-typecytoplasmic male sterility that encodes a mitochondria-targeting PPRprotein.Theor.Appl.Genet.108:1449-1457；Komori,T.,Ohta,/s.,Murai,N.,Takakura,Y.,Kuraya,Y.,Suzuki,S.,Hiei,Y.,Imaseki,H.,和Nitta,N.2004.Map-based cloning ofa fertility restorer gene,Rf-1in rice(Oryza sativa L.).Plant J.37:315-325；以及，Wang,Z.,Zou,Y.,Li,X.,Zhang,Q.,Chen,L.,Wu,H.,Su,D.,Chen,Y.,Guo,J.,Luo,D.,Long,Y.,Zhong,Y.,和Liu,Y.G.2006b.Cytoplasmic male sterility of rice with BoroII cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two relatedPPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing.Plant Cell 18:676-687)、针对CW型CMS的来自水稻(Oryza sativa)的Rf17(RMS)(Fujii S.&ToriyamaK.2009.Suppressed expression of RETROGRADE-REGULATED MALE STERILITY restorespollen fertility in cytoplasmic male sterile rice plants.PNAS 106:9513-9518)、来自猴面花(Mimulus guttatus)的Rf1和Rf2(Barr,C.M.,&Fishman L.2010.The Nuclearcomponent of a cytonuclear hybrid incompatibility in Mimulus maps to acluster of pentatricopeptide repeat genes.Genetics 184:455-465)、针对铅稻型CMS的来自水稻(Oryza sativa)的Rf2(Itabashi,E.,Iwata,N.,Fujii,S.,Kazama,T.和Toriyama,K.2011.The Fertility restorer gene,Rf2for lead Rice-type cytoplasmicmale sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein.The plantJournal(2011)65:359-367)、针对红莲CMS的来自水稻(Oryza sativa)的Rf5(Hu,J.,Wang,K.,Huang,W.,Liu,G.,Wang,J.,Huang,Q.,Ji,Y.,Qin,X.,Wan,L.,Zhu,R.,Li,S.,Yang,D.和Zhu,Y.2012.The Rice Pentatricopeptide Repeat Protein Rf5Restores Fertilityin Hong-Lian Cytoplasmic Male-Sterile Lines via a Complex with the Glycine-Rich Protein GRP162.The plant cell advance online publication 2012)、以及针对玉米(Zea mays)的CMS C型的Rf4(美国专利公开文本No.2012/0090047 A1)。
在其他实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽进一步包含与SEQ ID NO:3具有至少85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在后续的实施方案中，SEQ ID NO:1的分离的多肽和与SEQ ID NO:3具有85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％或99％序列同一性的多肽具有细胞质雄性不育活性。
如在本领域中已知的术语“同一性百分比”(或“同一性％”)是在两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸之间的关系，如通过比较这些序列所确定的。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，根据具体情况，如通过这些序列的字符串之间的匹配所确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算出，这些方法包括但不限于以下文献中公开的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University:NY(1988)；2.)Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic:NY(1993)；3.)Computer Analysis ofSequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humania:NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.编辑)Academic(1987)；以及5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton:NY(1991)。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。典型地，这样的技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸序列或氨基酸序列比较。也可以这种方式确定和比较基因组序列。一般而言，同一性是指两个多核苷酸序列或多肽序列的确切的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸对应关系。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同一性百分比进行比较。两个序列(不论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是在两个对齐的序列之间准确匹配的数量除以较短序列的长度再乘以100。参见Russell，R.和Barton，G.，“StructuralFeatures can be Unconserved in Proteins with Similar Folds,”J.Mol.Biol.244，332-350(1994)，在第337页，通过提述将其完整并入本文。
另外，确定同一性和相似性的方法被汇编在可公开获得的计算机程序中。例如，可使用Vector套件的AlignX程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)或LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行序列比对和同一性百分比计算。使用“Clustal比对方法”进行所述序列的多重比对，该方法涵盖若干种类的算法，包括相应于标记为Clustal V的比对方法(由Higgins和Sharp公开，CABIOS.5:151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992))并且发现于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.)中的“Clustal V比对方法”。就多重比对而言，默认值相应于空位罚分＝10和空位长度罚分＝10。成对比对和使用Clustal方法的蛋白序列同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，以及DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，以及DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序的序列比对后，通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“同一性百分比”是可能的。另外，可以得到“Clustal W比对方法”，并且该方法相应于标记为Clustal W的比对方法(由Higgins和Sharp描述,CABIOS.5:151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8:189-191(1992))并发现于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTMv6.1程序中。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序的序列比对后，通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“同一性百分比”是可能的。
本领域的技术人员公知，多种程度的序列同一性可用于鉴定来自其他物种的多肽，其中这样的多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者从55％至100％的任何整数百分比可用于描述本披露的实施方案，例如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％,80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。适合的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，还更优选至少200个氨基酸，且最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI)；2)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)；3)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)；和5)结合Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum＝New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，在使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考的程序的“默认值”，除非另外指明。如本文中使用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
当提及杂交技术时，用已知核苷酸序列的全部或部分作为探针，探针选择性地与来源于选定生物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体(即基因组文库或cDNA文库)中的其他相应的核苷酸序列杂交。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、质粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR扩增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多核苷酸，并且可以用可检测的基团如32P或任何其他检测标志物标记。因而，例如，可以通过标记基于本公开的实施方案的DNA序列的合成寡核苷酸而制成用于杂交的探针。用于制备杂交探针和用于构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知和公开(Sambrook等人，1989)。
本公开的实施方案的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法以鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段在某些情况下能够与其他核酸分子特异性杂交。如本文中使用的，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称这两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核酸分子的“互补序列”。如本文中使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称这些分子呈现“完全互补性”。呈现完全互补性的分子通常以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件下保持退火到彼此之上。常规的高严格条件由Sambrook等人(1989)描述。
如果两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下保持对彼此退火，则称这两个分子呈现“最小互补性”。常规的低严格条件由Sambrook等人(1989)描述。核酸分子要能充当引物或探针，仅需呈现能够在采用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构所需的最小序列互补性。
影响杂交严格性的因素对于本领域技术人员是熟知的，包括，但不限于，温度、pH、离子强度、以及有机溶剂例如像甲酰胺和二甲亚砜的浓度。如本领域技术人员已知，杂交严格性随着温度升高、离子强度降低和溶剂浓度降低而增加的。
术语“严格条件”或“严格性条件”是功能性定义的，涉及核酸探针与靶核酸(即，与特定的感兴趣核酸序列)通过如Sambrook等人(1989)在9.52-9.55处讨论的特异性杂交步骤进行的杂交。还参见Sambrook等人，1989，9.47-9.52和9.56-9.58。
通常，严格条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na+离子、通常在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M Na+离子浓度(或其他盐)，对于短探针(例如，10至50个核苷酸)，温度为至少约30℃；对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50至55℃下洗涤。中等严格条件的实例包括在37℃的40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS中杂交，在55-60℃的0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1X SSC在60至65℃下洗涤。
特异性通常取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form.)-500/L粗略估计Tm，其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对表示的杂交体的长度(Meinkoth和Wahl，1984)。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以便具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般而言，将严格条件选择为比特异性序列及其互补序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可利用低于热熔点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用低于热熔点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11℃到20℃的杂交和/或洗涤。使用所述方程、杂交和洗涤组成以及所希望的Tm，本领域普通技术人员应当了解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，使得可使用较高温度。对核酸杂交的广泛指导可见于(1997)Ausubel等人的Short Protocols in Molecular Biology，第2-40页，第三版(1997)和Sambrook等人(1989)。
在其他实施方案中，本主题公开提供了包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽的细胞。如本文中提及的，术语“细胞”涵盖能够自我复制的活体生物，并且可以是真核或原核细胞。在一些实施方案中，该细胞是植物细胞。在一些实施方案中，植物细胞可以是但不限于任何高等植物，包括双子叶植物和单子叶植物两者，以及消费性植物，包括使用其油脂的作物和植物。因此，任何植物物种或植物细胞均可以如下文中进一步描述的那样加以选择。
在一些实施方案中，根据本公开的植物细胞包括但不限于，任何高等植物，包括双子叶植物和单子叶植物两者，特别是消费性植物，包括作物。这样的植物可以包括但不限于，例如：苜蓿、大豆、棉花、油菜(也被描述为卡诺拉)、亚麻子、玉米、水稻、臂形草(brachiaria)、小麦、红花、高粱、糖用甜菜、向日葵、烟草和草坪草。因此，可以选择任何植物物种或植物细胞。在实施方案中，本文中使用的植物细胞以及由其培育或衍生的植物包括但不限于：从油菜籽(Brassica napus)可得到的细胞；印度芥菜(芥菜型油菜(Brassicajuncea))；埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)；萝卜(芜菁(Brassica rapa))；白菜(甘蓝(Brassica oleracea))；大豆(Glycine max)；亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(也描述为玉蜀黍(Zea mays))；红花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthusannuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；巴西坚果(Betholettia excelsa)；蓖麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；香菜(芫荽(Coriandrum sativum))；棉(棉属(Gossypium spp.))；花生(Arachis hypogaea)；希蒙得木(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeis guineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；大米(水稻(Oryza sativa))；南瓜(笋瓜(Cucurbita maxima))；大麦(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；大米(水稻(Oryza sativa))；小麦(小麦属(Triticum spp.)，包括硬粒小麦(Triticum durum)和普通小麦(Triticum aestivum))；和浮萍(浮萍属(Lemnaceae sp.))。在一些实施方案中，在植物物种之内的遗传背景可以变化。
在一个另外的实施方案中，本主题公开提供了包含具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的多肽的种子。在后续的实施方案中，提供了来自玉米的种子。玉米种子可被描述或称为玉米粒(kernel)，其由四个结构部分组成：(1)果皮，为保护性外层(也称作种皮或壳)；(2)胚芽(也称作胚)；(3)胚乳；和，(4)尖帽(tip cap)，其为与穗轴连接的点。本公开的另一个方面是玉米种子的一个或多个部分，如玉米种子的果皮，或在去除果皮和种皮的粘附残留部分后保留的玉米种子的胚和/或胚乳。
本主题公开还涉及rf3或Rf3玉米系的一个或多个玉米植物部分。玉米植物部分包括可以从其生成玉米植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物，在植物和/或植物部分中完整的植物DNA、植物愈伤组织、植物团、和植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、花、种子、核、穗、穗轴、叶、壳、茎、根、根尖、支柱根、侧生雄穗分枝、花药、雄穗、颖片、穗丝和分蘖，等。
在后续的实施方案中，本主题公开涉及包含SEQ ID NO:5的细胞。在其他实施方案中，该细胞是植物细胞。另外的实施方案包括包含该植物细胞的植物。在一些实施方案中，该植物可以是单子叶或双子叶植物。在其他实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。另外的实施方案包括具有CMS-S型细胞质的玉米植物。另外的实施方案包括植物部分、植物组织、或植物种子。
V.编码分离的蛋白质的多核苷酸序列
本主题公开进一步提供了编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽的合成核酸序列。在一个实施方案中，包含序列SEQ ID NO:1的多肽的合成核酸序列由SEQ ID NO:2编码。在另外的实施方案中，包含序列SEQ ID NO:3的多肽的合成核酸序列由SEQ ID NO:4编码。在后续的实施方案中，提供了与SEQ ID NO:4具有85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、或99％序列同一性的序列。在其他实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:2的合成核酸序列。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:2的合成核酸序列的多核苷酸序列可包括基因表达盒、载体、质粒、细菌人工染色体、DNA片段、寡核苷酸、引物、或探针。
在另外的实施方案中，SEQ ID NO:2的合成核酸序列与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。在实施方案的一个方面，该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:2的合成核酸序列与启动子可操作连接。用于指导编码肽的核酸表达的启动子取决于具体应用。例如，可以采用许多指导基因在植物中表达的启动子。这些启动子可以选自：组成型、化学调节型、诱导型、组织特异型、和种子优选型启动子。
可供使用的植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调节元件是能够响应诱导剂而直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因的转录的调节元件。在没有诱导物时，DNA序列或基因将不被转录。特异性地结合诱导型调控元件来激活转录的蛋白因子通常以无活性的形式存在，然后其经由所述诱导物直接或间接地转化为活性形式。所述诱导物可以是化学试剂，如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加或通过病原体或疾病因子如病毒的作用间接施加的生理胁迫。特异性地结合诱导型调控元件来激活转录的蛋白因子通常以无活性的形式存在，然后其经由所述诱导物直接或间接地转化为活性形式。所述诱导物可以是化学试剂，如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加或通过病原体或疾病因子如病毒的作用间接施加的生理胁迫。可以通过向细胞或植物从外部施加诱导物，例如通过喷施、浇灌、加热或类似方法，使含有诱导型调控元件的植物细胞暴露于所述诱导物。在一些实施方案中，与启动子可操作连接的合成核酸序列可进一步包含转运肽的编码序列。转运肽的实例是本领域已知的，并包括线粒体或叶绿体靶向转运肽。
本主题公开的后续实施方案涉及包含SEQ ID NO:2的合成核酸序列的细胞。本主题公开的另外实施方案涉及包含SEQ ID NO:4的合成核酸序列的细胞。本主题公开的另外实施方案涉及包含SEQ ID NO:2的合成核酸序列的载体。本主题公开的另外实施方案涉及包含SEQ ID NO:4的合成核酸序列的细胞。在其他实施方案中，本主题公开提供了包含该载体的任何前述实施方案的细胞。
在其他实施方案中，所述载体包括质粒。质粒或载体可被描述为或称为原核载体、穿梭载体、昆虫载体、或真核载体。通常，质粒是染色体外元件，常为环形DNA，其包含复制起点和选择标志物基因。有时，具有在大肠杆菌中有功能的质粒(例如，DNA序列分析、插入物的构建、获得大量核酸)可能是优选的。可以根据预期用途(例如，在植物、动物、细菌、真菌、和原生动物中表达)选择特定的质粒。标准的细菌、植物、和动物表达质粒是本领域已知的，并在例如，美国专利公开文本20050064474A1和国际专利公开文本WO 05/084190、WO05/014791和WO03/080809中有详细说明。质粒的实例包括pUC19质粒。pUC19是小的环状双链DNA。该质粒含有能够在细菌中复制的高拷贝数复制起点并含有多克隆位点。参见Yanisch-Perron,C.,Vieira,J.and Messing,J.(1985).Gene.33,103-119。其他质粒是本领域已知且常用的。例如，pUC18、pBR322、pBR325、pBR328、pACYC184、pAT153、pUC118、和pUC119是本领域公知的质粒。
在本主题公开的另外实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的分离的多肽。在一个另外的实施方案中，SEQ ID NO:5的分离的多肽进一步包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在后续的实施方案中，SEQ ID NO:5的分离的多肽和与SEQ ID NO:7具有85％序列同一性的多肽具有细胞质雄性不育活性。
本主题公开进一步提供了编码SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的多肽的合成核酸序列。在一个实施方案中，包含序列SEQ ID NO:5的多肽的合成核酸序列由SEQ ID NO:6编码。在另外的实施方案中，包含序列SEQ ID NO:7的多肽的合成核酸序列由SEQ ID NO:8编码。在后续的实施方案中，提供了与SEQ ID NO:8具有85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、或99％序列同一性的序列。在其他实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:8的合成核酸序列。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:8的合成核酸序列的多核苷酸序列可包括基因表达盒、载体、质粒、细菌人工染色体、DNA片段、寡核苷酸、引物、或探针。
在其他实施方案中，本主题公开涉及编码具有SEQ ID NO:5的多肽的合成核酸序列。在另外的实施方案中，该合成核酸序列具有SEQ ID NO:8的序列。在另外的实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:8的合成核酸序列的基因表达盒。另外的实施方案包括这样的基因表达盒，其包含与启动子可操作连接的SEQ ID NO:8的合成核酸序列，其中该启动子在植物中有功能。在另外的实施方案中，该启动子是细胞质雄性不育启动子。另外的实施方案包括这样的细胞：其包含基因表达盒，基因表达盒包含SEQ ID NO:8的合成核酸序列。本主题公开的另外实施方案涉及包含SEQ ID NO:8的合成核酸序列的载体。在其他实施方案中，本主题公开提供了包含所述载体的细胞。
VI.RF3等位基因向后代植物中的基因渗入
本主题公开的一个实施方案提供了产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:4而言为纯合的细胞质雄性不育亲本植物，并且该雄性亲本植物是能育亲本植物；
b)从(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:4而言是纯合的；
c)种植该后代种子；并且，
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性不育植物，
其中该后代细胞质雄性不育植物对于SEQ ID NO:4而言是纯合的。
在另外的实施方案中，本主题公开涉及属于单子叶植物的雌性和雄性亲本植物。在其他实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在另外的实施方案中，该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。在实施方案的一个方面，该雄性亲本植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
在本主题公开的又一个方面，提供了产生后代植物的方法，所述方法一般地包括：使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，其中该第一亲本玉米植物或该第二亲本玉米植物中的至少一者是具有CMS-S型细胞质的细胞质雄性不育植物。在本主题公开的一些实施方案中，所述细胞质雄性不育植物是雌性，并且在其他实施方案中，所述细胞质雄性恢复植物是雄性。这些方法可以进一步用来例示产生后代种子或植物的方法，其中第一玉米植物与第二玉米植物杂交。
每当细胞质雄性不育植物或细胞质雄性恢复植物与另一不同的近交玉米杂交时，产生后代或第一代(F1)玉米杂交植物。正因为如此，通过使该细胞质雄性不育植物或该细胞质雄性恢复植物与任何第二近交玉米植物杂交，可以产生后代或F1杂交玉米植物。因此，任何用所述细胞质雄性不育植物或所述细胞质雄性恢复植物作为亲本产生的后代或F1杂交玉米植物或玉米种子均是本主题公开的实施方案。
当该细胞质雄性不育植物或该细胞质雄性恢复植物与另一种近交植物杂交以产生后代或杂种时，原亲本可用作母本植物或父本植物，杂交体具有基本上相同的特征。有时候，母系遗传而来的特征可以以不同方式表达，这取决于将哪一个亲本被决定用作雌性。然而，为了种子产量更高，以及优选的生产特征(例如，种子大小和质量最佳，或雄穗便于去除)，亲本植物之一往往被优选用作母本植物。一些植物产生更紧密的穗壳，导致更多的损失，例如由于腐烂所致的损失，或者穗壳可能过于紧密以至于穗丝无法完全从尖部抽出，这可妨碍完全授粉，导致种子产量降低。穗丝形成可能被延迟，这会对一对亲本近交系的生殖周期的时间造成不利影响。有可能一株植物中种皮特性更好，这可影响杂交种子产品的货架期。有可能一株植物花粉散布得更好，这使得该植物成为优选的雄性亲本。
在本公开的实施方案中，细胞质雄性不育植物或细胞质雄性恢复植物的第一个“杂交”步骤包括种植(优选地以授粉近距离种植)第一近交玉米植物和第二不同的近交玉米植物的种子。
另一个步骤包括栽培或培育开花的细胞质雄性不育植物或细胞质雄性恢复植物的种子。如果各亲本植物的性成熟时间不同，可以采用技术获得适当间距(nick)，即：在被指定为雌性的亲本玉米植物上的穗丝可接受花粉的过程中，确保来自指定为雄性的亲本玉米植物的花粉可用。可以采用的获得期望间距的方法包括：延迟成熟快的植物的开花，例如但不限于，延迟成熟快的种子的种植、切开或烧灼成熟快的植物的顶叶(不杀死植物)；或加快成熟慢的植物的开花，例如通过用设计用于加速萌发和生长的薄膜覆盖成熟慢的植物，或通过切开幼穗芽尖以暴露穗丝。
在一个实施方案中，用一种或多种种植者认为适当的农业化学品处理雄性不育植物或细胞质雄性恢复植物。
进一步的步骤包括在接近成熟或在成熟时从接受了花粉的植物的雌穗收获种子。在特定的实施方案中，从雌性亲本植物收获种子，并且在期望时，可以培育收获的种子以产生第一代(F1)杂交玉米植物的后代。
还有一个步骤包括干燥和调制(conditioning)种子，包括种子的处理、分筛(或分级)，和包装，以便销售给种植者进行谷物或饲料的生产。与近交种子一样，可能希望用使种子和自其生长的幼苗在暴露于不利条件时更加强壮的组合物处理杂交种子。必须提到的是，得到的后代或杂交种子可以销售给种植者用于生产谷物和饲料，但不可以用于育种或种子生产。
更进一步地，本主题公开提供了通过培育细胞质雄性不育或恢复植物上结出并收获的种子而产生的玉米后代植物，以及由该玉米后代植物产生的谷粒。
在后续的实施方案中，该公开涉及将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。在实施方案的一个方面，该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。期望性状的其他实例包括修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物而增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2624(1992)。降低的肌醇六磷酸含量：(i)导入肌醇六磷酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸盐的分解，从而对于转化的植物增加更多的游离磷酸盐。例如参见Van Hartingsveldt等人，Gene 127:87(1993)公开的黑曲霉肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列。(ii)可导入降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入与如下所述的单个等位基因相关的DNA来实现，所述单个等位基因是导致以低肌醇六磷酸水平为特征的玉米突变体的原因。参见Raboy等人，Maydica 35:383(1990)。(iii)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。参见Shiroza等人，J.Bacteriol.170:810(1988)(变形链球菌果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，Mol.Gen.Genet.200:220(1985)(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列),Pen等人，Bio/Technology 10:292(1992)(表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物的产生),Elliot等人，Plant Molec.Biol.21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等人，J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麦α淀粉酶基因的定点诱变)，和Fisher等人，Plant Physiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。另外可能期望的特征的实例包括更大的产量、更好的茎、更好的根、缩短的作物成熟时间、更好的农艺品质、更高的营养价值、更高的淀粉可提取性或淀粉可发酵性，对杀虫剂、除草剂、害虫、热和干旱、以及疾病的抗性和/或耐受性，在萌发时间、直立、生长率、成熟度和籽粒大小方面的一致性。
在一个另外的实施方案中，本主题公开涉及产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括下列步骤：
e)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
f)选择具有期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
g)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
h)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
i)连续重复步骤(g)和(h)三次或更多次，以产生包含期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
可以使用各种不同的育种方案来产生后代植物。在一种通常被称为家系法的方法中，可将亲本与另一种不同植物，诸如第二近交亲本玉米植物杂交，所述第二近交亲本玉米植物要么自身展现出一种或多种期望特征，要么赋予杂交组合选定的期望特征。如果这两种原始亲本玉米植物未提供所有的期望特征，则可将其他来源包括在育种群体中。后代植物，即，纯育的纯合近交系，也可作为起始材料用于育种或作为由此产生后代植物的源群体。
此后，收获生成的种子，选择生成的优良后代植物并进行自交或在后续世代中进行同胞交配，如进行约5个到约7个或更多个世代，直到产生近交亲本中基本上所有的差异因素均不再发生分离的世代，由此提供大量不同的纯种育种近交系。
另一种生成后代植物的实施方案通常称为回交，其中通过使亲本植物与携带编码感兴趣特定性状的基因的另一种玉米植物(称为供体或非轮回亲本)杂交以产生F1后代植物，可以将一个或多个期望性状导入细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本中。显性等位基因和隐性等位基因两者均可通过回交传递。供体植物也可以是近交体，但在最广义上可以是任何植物品种或与轮回亲本杂交能育的群体的成员。然后，选择具有期望性状的F1后代植物。然后，使选定的后代植物与细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本杂交以产生回交后代植物。此后，选择包含期望性状以及细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本的生理和形态特征的回交后代植物。重复此循环约一次到约八次，优选连续进行约3次或更多次，以产生选定的高代回交后代植物，该植物包含期望的性状，并且在相同环境的条件下培育时，具备细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本的所有生理和形态特征。示例性的期望性状包括抗虫性、提高的营养品质、蜡质淀粉、除草剂抗性、产量稳定性、产量提高、以及对细菌、真菌和病毒性疾病的抗性。植物育种领域的普通技术人员将理解，育种者使用不同的方法来帮助确定应当从分离群体中选择哪些植物，以及最终将哪些近交系用于产生商业化的杂种。除了关于种质的知识以育种者利用的其他技能之外，选择过程的一部分取决于实验设计结合统计分析的应用。实验设计和统计分析用于帮助确定哪些植物、哪些植物家族、以及最终哪些近交系和杂交组合对于感兴趣的一种或多种性状是显著更好的或不同的。实验设计方法用于评估误差，以便能够更准确地确定两个近交系或两个杂交系之间的差异。统计分析包括计算平均值、确定变异来源的统计显著性、和计算适当的方差分量。通常用百分之五和百分之一显著性水平来确定给定性状所发生的差异是真实的，还是由于环境或实验误差所致。植物育种领域的普通技术人员将知道如何评估两个植物品种的性状以确定在这些品种所表达的两个性状之间是否没有显著性差异。例如，参见Fehr,Walt,Principles ofCultivar Development,p.261-286(1987)，将其通过提述并入本文。可以使用平均性状值来确定性状差异是否显著，并且优选地在相同的环境条件下培育的植物上测量这些性状。
这种方法导致生成的后代近交植物具有轮回亲本的基本上所有期望的形态和生理特征，以及感兴趣的特定传递性状。由于这样的后代近交植物对于控制感兴趣的传递性状的基因座而言是杂合的，随后使最后一代回交世代自交，以提供针对传递性状的纯种育种后代。
可以通过使用遗传标志物，如SSR、RFLP、SNP或AFLP标志物来鉴定具有来自轮回亲本的最大遗传互补的植物，从而加速回交。
在单基因座表现为显性性状，诸如除草剂抗性性状等的情况下，可以采用直接选择。对于这种选择过程，在回交之前用除草剂喷洒初始杂交的后代。喷洒可消除任何不具有期望的除草剂抗性特征的植物，只有那些具有除草剂抗性基因的植物才用于后续的回交中。在被传递的特征是隐性等位基因的情况下，可能有必要引入对后代的测试，以确定该期望特征是否已经被成功传递。然后，对于所有额外的回交世代重复该选择过程，无论直接还是间接的选择。
本领域普通技术人员应当理解的是，回交可与家系育种结合，正如细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本与另一种玉米植物杂交的情况：生成的后代与细胞质雄性不育亲本或恢复的能育亲本回交，此后，使这次单回交的生成的后代进行近交以产生新的近交系。回交与家系育种的这种结合在例如下述情况下是有用的：少于全部的细胞质雄性不育亲本的恢复或通过常规回交获得的恢复的能育亲本特征是期望的。
在一个另外的实施方案中，本主题公开涉及一种恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法包括：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:8而言为纯合或杂合的细胞质雄性不育亲本植物，并且其中该细胞质不育亲本植物是能育亲本植物；
b)从(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的；
c)种植该后代种子；
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性能育植物；并且，
e)恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性，其中该后代细胞质雄性能育植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
该方法的另外实施方案包括：
f)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
g)选择具有所述期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
h)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
i)选择具有所述期望性状的回交后代植物；并且，
j)连续重复步骤(h)和(i)三次或更多次以产生包含所述期望性状的选定的第四代或更高代的回交后代植物。
在另外的实施方案中，本主题公开涉及属于单子叶植物的雌性和雄性亲本植物。在其他实施方案中，该单子叶植物是玉米植物。在另外的实施方案中，该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。在该实施方案的一个方面，该雄性亲本植物对于SEQ IDNO:8而言是纯合或杂合的。在后续的实施方案中，该公开涉及将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。在实施方案的一个方面，该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
VII.用于检测Rf3和rf3等位基因的测定法
可以采用不同的测定法来检测在本公开的某些实施方案中描述的编码Rf3和rf3等位基因的多核苷酸。下面的技术在多种情况下有用，并且在一个实施方案中，可用于检测植物细胞中编码Rf3或rf3等位基因的核酸分子和/或多肽的存在。例如，分子的存在可以通过多种方法加以确定，包括使用序列的引物或探针、检测编码的蛋白质的ELISA测定、检测蛋白质的Western印迹、或检测RNA或DNA的Northern或Southern印迹。可以采用用于检测编码Rf3和rf3等位基因的多核苷酸的酶学测定。另外，可以使用本领域中确立的程序产生能够检测Rf3或rf3蛋白质存在的抗体。也可以使用另外的技术，例如原位杂交、酶染色、以及免疫染色，来检测编码Rf3和rf3等位基因的多核苷酸在特异性植物器官和组织中的存在或表达。可在植物的某些组织中或在某些发育阶段选择性地表达编码Rf3和rf3等位基因的多核苷酸，或者可基本上沿植物的整个生命周期在基本上所有植物组织中表达编码Rf3和rf3等位基因的多核苷酸。然而，任何组合表达模式也是可应用的。
在一个实施方案中，本公开涉及通过其中生成扩增产物或扩增子的扩增反应检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法。检测到扩增子的不存在可指示植物是否分别含有基因序列的Rf3或rf3等位基因。
各种测定法可以和该扩增反应联合使用，并且被考虑作为本公开的实施方案。下面的技术在多种情况下有用，并且在一个实施方案中，可用于检测植物细胞中核酸分子和/或编码多肽的存在。例如，可以多种方式确定分子的存在，包括使用该序列的引物或探针。可在植物的某些组织中或在某些发育阶段选择性地表达Rf3或rf3等位基因，或者贯穿植物的整个生命周期在基本上所有植物组织中表达Rf3或rf3等位基因。然而，任何组合表达模式也是可应用的。
可通过任何适合的手段进行核酸序列的扩增。总体上参见Kwoh等人，Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。适合的扩增技术的实例包括但不限于，聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增(总体上参见G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,392-396(1992)；G.Walker等人，Nucleic Acids Res.20,1691-1696(1992))、基于转录的扩增(参见D.Kwoh等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86,1173-1177(1989))、自我持续序列复制(或“3SR”)(参见J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878(1990))、Qβ复制酶系统(参见P.Lizardi等人，BioTechnology 6,1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或“NASBA”)(参见R.Lewis,Genetic Engineering News 12(9),1(1992))、修复链反应(或“RCR”)(参见R.Lewis，上文)、和自返式(boomerang)DNA扩增(或“BDA”)(参见R.Lewis，上文)。聚合酶链反应通常是优选的。
“扩增”是涉及核酸复制的一种特定情况，其涉及模板特异性。它与非特异性模板复制(即，依赖于模板但不依赖特异性模板的复制)相对。这里的模板特异性区别于复制保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常是就“靶”特异性而言描述的。靶序列是在它们从其他核酸分选出意义上的“靶”。主要针对这种分选而设计扩增技术。
如本文中使用的，术语“聚合酶链式反应”和“PCR”通常是指用于增加基因组DNA混合物中的一段靶序列的浓度而不用克隆或纯化的方法(美国专利4,683,195；4,683,202；和4,965,188；通过提述并入本文)。这个扩增靶序列的过程包括将过量的两个寡核苷酸引物导入含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶的存在下进行一些列精确的热循环。这两个引物与它们的双链靶序列的对应链互补。为了实施扩增，使混合物变性，然后使引物退火到它们的靶分子内的互补序列上。退火之后，用聚合酶延伸引物，从而形成新的互补链对。可以多次重复变性、引物退火和聚合酶延伸步骤(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多个“循环”)，以获得高浓度的期望靶序列的扩增区段。期望靶序列的扩增区段的长度是由引物相对于彼此的相对位置决定的，因此，这个长度是可控的参数。由于该过程的重复性，该方法被称为“聚合酶链式反应”(在下文中的“PCR”)。由于靶序列的期望扩增区段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，所以说它们是经PCR扩增的。
术语“多个”在本文中用于意指两个或更多个，例如，三个、四个、五个或更多个，包括十个、二十个、五十个或更多个多核苷酸、核酸探针，等。
术语“逆转录酶”或“RT-PCR”是指以mRNA为起始材料的PCR类型。利用逆转录酶，起始mRNA被酶促转化为互补DNA或“cDNA”。然后，cDNA被用作“PCR”反应的“模板”。
在一个实施方案中，对扩增反应定量。在其他实施方案中，利用标识概貌(signature profile)对扩增反应定量，其中标识概貌选自解链温度或荧光标识谱。在另外的实施方案中，利用ΔΔCt法对扩增反应定量。
编码Rf3和rf3基因的多核苷酸或其区段可以用作PCR扩增引物。在进行PCR扩增的过程中，可容许引物与模板之间一定程度的错配。因此，例示引物的突变、缺失和插入(特别是在5'端的核苷酸添加)也落在本主题公开的范围内。可以通过普通技术人员已知的方法在给定的引物中产生突变、插入和缺失。
检测方法的另一个实例是焦磷酸测序技术，如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述。在该方法中，设计与相邻的基因组DNA和插入物DNA接点重叠的寡核苷酸。将该寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸和萤光素的存下在进行温育。逐一地添加各种dNTP，掺入产生光信号，测量该光信号。光信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在(该技术被用于初始测序，而不用于检测已知的特定基因)。
分子信标已被描述用于序列检测。简要地说，设计与侧翼基因组和插入物DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有使荧光部分和淬灭部分保持非常靠近的二级结构。FRET探针和PCR引物在热稳定聚合酶和dNTP的存在下进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针的二级结构消除以及荧光部分和淬灭部分的空间分离。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交导致的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
水解探针测定，或者也称作(Life Technologies,Foster City,Calif.)，是一种检测和定量DNA序列之存在的方法。简要地说，设计FRET寡核苷酸探针，其具有一段在转基因内的寡聚体，一段在侧翼基因组序列内的寡聚体，用于事件特异性检测。对FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列内，一个引物在侧翼基因组序列内)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下进行循环。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的淬灭部分被切断并释放。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交导致的侧翼/转基因插入序列的存在。
ELISA或酶联免疫测定自1971年以来已为人所知。一般来说，将溶解在缓冲液中的抗原包被在塑料表面上。当添加血清时，抗体可以附着在固相上的抗原上。当这些抗体与酶缀合时，抗体的存在与否可以得到证明。加入适当的底物可以检测结合的缀合物的量，后者可以被定量。一种常见的ELISA测定法是使用生物素化的抗-(蛋白质)多克隆抗体和碱性磷酸酶缀合物的方法。例如，用于定量测定漆酶水平的EILSA可以是一种抗体夹心测定法，其采用商购的多克隆兔抗体。该抗体与碱性磷酸酶缀合以便于检测。另一个实例中是用于检测胰蛋白酶或胰蛋白酶原的ELISA测定法，其使用生物素化的抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多克隆抗体、以及链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物。
测定是检测和定量DNA序列之存在的方法。简要地说，利用被称为测定系统的基于聚合酶链反应(PCR)的测定，筛选了包含靶向的基因组基因座的基因组DNA样品。在主题公开的实践中使用的测定可利用含有多种引物的PCR测定混合物。在PCR测定混合物中使用的引物可包括至少一个正向引物和至少一个反向引物。正向引物含有相应于DNA多核苷酸序列的特定区域的序列，并且反向引物含有相应于第二DNA多核苷酸序列的特定区域的序列。另外，在PCR测定混合物中使用的引物可包括至少一个正向引物和至少一个反向引物。例如，PCR测定混合物可利用相应于两个不同等位基因的两个正向引物和一个反向引物。正向引物之一含有相应于内源基因组序列的特定区域的序列。第二正向引物含有相应于供体DNA多核苷酸的特定区域的序列。反向引物含有相应于基因组序列的特定区域的序列。这样的用于检测扩增反应的测定是本主题公开的实施方案。
在一些实施方案中，该荧光信号或荧光染料选自下组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、和ROX荧光染料。
在其他实施方案中，该淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、Iowa Black RQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。
在其他实施方案中，使用适合的第二荧光DNA染料进行扩增反应，所述第二荧光DNA染料能够在流式细胞术可检测的浓度范围内使细胞DNA染色，并且具有通过实时热循环仪可检测的荧光发射光谱。本领域普通技术人员应当理解的是，其他核酸染料是已知的并且正在被不断地鉴定。可以采用具有适当激发和发射光谱的任何适合的核酸染料，如SYTOXSYBR和在一个实施方案中，以少于10μM、少于4μM、或少于2.7μM使用第二荧光DNA染料
在各种实施方案中，进行其他已知的检测方法来检测Rf3或rf3等位基因。
Southern分析是一种常用的检测方法，其中DNA用限制性核酸内切酶切割，并在琼脂糖凝胶上分级，以通过分子量分离DNA，然后转移到尼龙膜上。然后，与用32P(或其他探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。
类似地，Northern分析采用类似的方案，其中RNA用限制性核酸内切酶切割，并在琼脂糖凝胶上分级，以通过分子量分离RNA，然后转移到尼龙膜上。然后，与用32P(或其他探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。从感兴趣组织分离的RNA(例如，mRNA)的分析能够指示相对表达水平。典型地，如果mRNA存在或mRNA的量增加，则可以假设相应的转基因被表达。Northern分析、或其他mRNA分析方案，可以用于确定被导入的转基因或天然基因的表达水平。
在Western分析中，不是分离DNA/RNA，而是提取感兴趣的蛋白质并置于丙烯酰胺凝胶上。随后把蛋白质印迹到膜上并与标记物质接触。参见，例如，Hood等人，“CommercialProduction of Avidin from Transgenic Maize；Characterization of Transformants,Production,Processing,Extraction and Purification”Molecular Breeding 3:291-306(1997)；Towbin等人，(1979)“Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications”Proc Natl Acad Sci USA 76(9):4350-4354；Renart等人，“Transfer of proteins fromgels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera:a method forstudying antibody specificity and antigen structure”Proc Natl Acad Sci USA 76(7):3116-3120。
在以下实施例中进一步例证本主题公开的实施方案。但应当理解，这些实施例仅作为举例说明给出。根据以上实施方案以及以下实施例，本领域技术人员可确定本公开的必要特征，并且可以做出本公开的实施方案的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件而不脱离其精神和范围。因此，除了那些本文中所示和描述的之外，根据前面的描述，本公开的实施方案的各种修改对于本领域技术人员将是容易想到的。这些修改也预期落入所附权利要求书的范围内。以下是作为举例说明提供的，而非意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：用于Rf3等位基因的定位和精细解析的回交1群体的开发
产生了一个回交1(BC1)群体，并利用该群体和开发的分子标志物，通过连锁图谱分析对Rf3编码序列定位。通过使一个玉米细胞质雄性不育系——玉米栽培种4XP811(美国专利7,135,629；其含有纯合的隐性rf3等位基因)与一个玉米恢复系——玉米栽培种MBB56(含有至少一个显性Rf3等位基因)杂交，然后使后代与玉米细胞质雄性不育系——玉米栽培种4XP811回交，从而建立定位群体。所得的玉米后代群体含有275个个体，这些个体对于Rf3(显性)和rf3(隐性)等位基因具有不同程度的接合性。
根据两种方法将所得的玉米植物进行表型分类。第一种方法涉及观察玉米植物在田间的花粉散布。观察能育植物的在穗丝发育和花粉散布开始之前被物理暴露的花药的生长和发育。观察细胞质雄性不育植物的花药生长和发育的延迟。在穗丝发育中期为止(例如，在穗丝开始发育之后约7天)，花药没有被物理暴露。
第二种方法涉及用1％KI-I2染色剂测定花粉粒的活力。当用KI-I2染色剂将能育植物的花粉染色时，花粉吸收KI-I2染色剂，由此产生均匀染色的花粉。众所周知，来自能育植物的花粉充满淀粉，KI-I2染色剂可附着于淀粉之上。当来自细胞质雄性不育植物的花粉被染色时，花粉不吸收KI-I2染色剂，由此产生未染色的花粉。细胞质雄性不育植物的花粉包括含有低水平淀粉的空瘪花粉，而KI-I2染色剂无法与花粉中存在的微量淀粉结合。表1提供了来自BC1定位群体的详细分离信息。
表1：BC1定位群体的表型数据。
所得数据指示，采用单基因分离模型，BC1群体的育性分离符合能育植物:不育植物的理论比1:1(X2＝1.39[α(0.05)＝3.84])。数据进一步表明，携带一个恢复基因Rf3的MBB56系的种质和4XP811种质对于rf3基因而言是纯合的。
实施例2：RF3的标志物辅助基因组定位
用分子标志物筛选BC1群体，从而以高解析度鉴定与RF3等位基因对应的基因座。选择了一组482个SNP标志物(均匀分布在整个基因组上)将BC1定位群体进行基因分型。根据此测定，利用JoinMap 4.0softwareTM(Van Ooijen JW:JoinMap 4.Software for thecalculation of genetic linkage maps in experimental populations KyazmaBV.Netherlands:Wageningen；2006)，使用437个SNP标志物(包括四个来自PPR2的基于PCR的标志物、432个基于SNP的全基因组的标志物、和一个基于BC1定位群体的不育-能育表型的标志物)来建立遗传连锁。利用遗传连锁图谱、表型数据、和基因型数据，使用Map QTL6.0TM软件(Van Ooijen JW:MapQTL 6.Wageningen,Netherlands:Software for themapping of quantitative trait loci in experimental populations of diploidspecies Kyazma BV；2009)，进行了全基因组QTL分析。结果显示，所有PPR2基因特异性标志物均与RF3基因座共分离。经确定，RF3基因座的基因组位置位于2号染色体上，在玉米基因组的一个1.3Mb基因组区间中(参见图1)。
实施例3：全基因组测序以鉴定RF3基因序列
为了进一步鉴定特异性Rf3恢复基因序列和具有导致细胞质雄性不育的rf3修饰的基因序列，利用新一代测序(NGS)技术进一步研究Rf3基因座。利用NGS测序，确定了两个玉米CMS-S系和两个玉米恢复系的基因组序列。两个CMS-S系(4XP811和7SH382ms)和两个恢复系(LH60和MBB56)用于全基因组测序分析。
在将测过序的基因组区与来自玉米栽培种B73的参考基因组(可在www.maizegdb.org获得)的注释序列比较之后，在2号染色体上在1.3Mb的基因组区间内鉴定了总共10个PPR基因(依次注释为PPR 1-10)。与PPR2对应的全长编码序列并不存在于注释的玉米栽培种B73基因组中，且不能预测为全长功能基因。结果，根据与玉米栽培种Mo17的参考基因组(在www.maizegdb.org可获得)的序列比较获得了PPR2的全基因序列。基于两个CMS-S系和两个恢复系的全基因组测序数据，将所得的10个PPR基因的序列(PPR2具有两个序列，来自玉米栽培种B73系的第一序列和来自玉米栽培种Mo17系的第二序列)组装起来以提供参考序列信息。
然后，在CMS-S系、恢复系、和所有这些PPR基因的参考基因组序列之间比对这些序列。使用SoftberryTM软件(Softberry Inc.,Mount Kisco,NY)完成PPR基因组序列的编码序列预测(例如，其中去除了内含子序列的cDNA)，获得并比对了预测的cDNA和对应的蛋白质序列。根据比对的PPR基因的基因组序列鉴定了基因组序列变异，并加以记录。当将CMS-S和恢复系之间比对cDNA和蛋白质序列以及参考序列时，观察到在PPR2序列内的大多数变异导致沉默突变(参见图2和图3)。鉴定了在PPR2序列中导致氨基酸残基修饰的变异，并建立了RT-PCR测定法来检测和扩增这些修饰(例如，突变)。
遗传连锁作图和NGS的结果指示，Rf3等位基因和后续的CMS表型是位于2号染色体上的一个单基因的结果。如同大多数克隆的Rf基因一样，Rf3最可能是PPR基因。来自玉米栽培种LH60的恢复者Rf3-PPR基因(SEQ ID NO:8)被鉴定为存在于育性恢复植物表型中，并且编码具有814个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:7)。另外，来自玉米栽培种MBB56的恢复者Rf3-PPR基因(SEQ ID NO:12)的部分多核苷酸片段被鉴定为存在于育性恢复植物表型中，并且编码氨基酸蛋白质片段(SEQ ID NO:11)。发现一种氨基酸基序SEQ ID NO:5(IVLFSS)，其由SEQ ID NO:6(5’-ATTGTTTTATTCAGT-3’)编码，是来自玉米栽培种LH60野生型Rf3-PPR基因和来自玉米栽培种MBB56的Rf3-PPR基因所共有的。
来自玉米栽培种4XP811的突变的细胞质雄性不育rf3-PPR基因(SEQ ID NO:4)被鉴定为存在于细胞质雄性不育植物表型中，并且编码具有814个氨基酸的蛋白质(SEQ IDNO:3)。另外，来自玉米栽培种7SH382ms的细胞质雄性不育rf3-PPR基因(SEQ ID NO:10)被鉴定为存在于细胞质雄性不育植物表型中，并且编码具有814个氨基酸的蛋白质(SEQ IDNO:9)。发现由SEQ ID NO:2(5’-ATTGTTTTCTTCAGT-3’)编码的氨基酸基序SEQ ID NO:1(IVFFSS)是来自玉米栽培种4XP811的Rf3-PPR基因和与来自玉米栽培种7SH382ms的Rf3-PPR基因两者所共有的。
实施例4：通过实时PCR的RF3-PPR2的表达分析
为了验证Rf3-PPR2蛋白的表达是否与S-CMS玉米的育性恢复相关，进行实时PCR(RT-PCR)测定法，以定量测定在能育植物中的Rf3-PPR2基因以及在CMS植物中的rf3-PPR2基因的表达模式。基于Rf3-PPR2蛋白编码基因的多核苷酸序列中包含Rf3-PPR2蛋白中的变异的氨基酸的多个部分，设计了若干特异性的引物对和探针(表2)。从各个植物系提取总RNA。从两个品系：4XP811(细胞质雄性不育)和LH60(恢复系)、来源于2号染色体长臂的1.3-Mb区域发生分离的F2雌穗之F3个体、以及三个商业玉米系提取这些样品。完成测定对Rf3-PPR2基因的表达定量。通过与玉米内部对照基因EFα1比较来定量表达水平。(Czechowski T等人，Plant Physiol.,Sep；139(1):5-17,2005)。
表2：用于RF3玉米植物的RT-PCR的引物和探针
在温室中培育要通过测定进行分析的植物。从7周龄(刚好在抽雄之前)和10周龄(在授粉之后)的植物采集叶组织。还收集了具有发育中的花药/花粉并有散布花粉(在能育植物中)的雄穗组织。使用Qiagen RNeasy Plant Mini KitTM提取总RNA，并使用Qiagen QuantiTect Reverse Transcription KitTM(Qiagen,Carlsbad,CA)合成cDNA。对于RT-PCR，使用玉米延伸因子α-1(EF α1)的表达作为内部对照。委托Applied Biosystems(Foster City,CA)合成Rf3-PPR2和EFα1的引物、具有FAM或VIC染料和Minor GrooveBinding Non Fluorescence QuencherTMI(MGBNFQ)淬灭剂的双标记探针。使用基因分型母预混物(Applied Biosystems,Foster City,CA)建立10μl的PCR反应，并在Roche LightCycler 480TM热循环仪(Roche,Indianapolis,IN)上进行PCR。PCR程序为以在95℃激活Taq酶10分钟启动，随后是50次在95℃持续10秒和在58℃持续38秒的循环。在每个循环结束时记录荧光信号。使用ΔΔCT法计算Rf3-PPR2对EFα1的相对表达水平。
基于导致Rf3-PPR2基因内的氨基酸改变的修饰，设计了七种测定(参见表2)。令人惊讶的是，仅有CMS-S9测定扩增出了这样的扩增子：其分别对应于能育恢复系和细胞质雄性不育系中的Rf3或rf3基因序列的存在。这个测定能够鉴定出导致rf3细胞质雄性不育表型的单碱基对修饰(例如，突变)。这样，可以利用这个单碱基对修饰来区分rf3细胞质雄性不育和Rf3恢复的能育植物。尽管在rf3系中存在很多氨基酸突变，但只有含SEQID NO:1基序的植物才可观察到rf3细胞质雄性不育植物。
定量RT-PCR的结果显示，在所有测试的生长阶段，在对于恢复等位基因而言是纯合的或杂合的恢复亲本LH60和F3植物中，含SEQ ID NO:5基序的植物表达Rf3。然而，Rf3在CMS-S亲本、rf3等位基因纯合的F3、以及商业玉米系中不表达。值得注意的是，Rf3表达水平在Rf3纯合(Rf3/Rf3)和杂合(Rf3/rf3)的F3个体之间是可区别的，这可以解释为什么纯合(Rf3/Rf3)植物散布充填100％淀粉的能育花粉，而杂合(Rf3/rf3)植物散布大约充填50％淀粉的能育花粉。最后，Rf3-PPR2基因，其可恢复S型CMS细胞质，在含有未成熟花粉的雄花穗组织、以及叶组织中均表达。
虽然本发明的各方面已经在某些实施方案进行了描述，但是它们在本公开的精神和范围内可被进一步修改。因此，本申请意图涵盖使用其一般原理的本发明实施方案的任何变化、用途或适应性修改。此外，本申请意图涵盖通过这些实施方案所涉及的领域中的已知或习惯做法可以获得的、并且落在所附权利要求的范围之内的相对于本公开的偏离。

Claims (67)

1.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或权利要求2的分离的多肽序列，其中所述多肽具有细胞质雄性不育活性。
4.一种包含权利要求1的多肽的细胞。
5.权利要求4的细胞，其中该细胞是植物细胞。
6.一种包含权利要求5的植物细胞的植物。
7.权利要求6的植物，其中该植物是单子叶植物。
8.权利要求7的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
9.一种从权利要求6的植物获得的种子。
10.一种合成核酸序列，其编码权利要求1的多肽。
11.权利要求10的合成核酸序列，其包含SEQ ID NO:2的序列。
12.一种多核苷酸，其包含权利要求10的合成核酸序列。
13.权利要求12的多核苷酸，其中该多核苷酸与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
14.权利要求13的多核苷酸，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
15.一种包含权利要求12的多核苷酸的细胞。
16.一种包含权利要求10的合成核酸序列的载体。
17.一种包含权利要求16的载体的细胞。
18.一种产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:4而言为纯合的细胞质雄性不育亲本植物，且其中该雄性亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:4而言是纯合的；
c)种植该后代种子；并且，
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性不育植物，其中该后代细胞质雄性不育植物对于SEQ ID NO:4而言是纯合的。
19.权利要求18的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。
20.权利要求19的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中所述单子叶植物是玉米植物。
21.权利要求18的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。
22.权利要求18的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该雄性亲本植物对于SEQID NO:8而言是纯合或杂合的。
23.权利要求18的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括将期望性状导入后代细胞质雄性不育植物中。
24.权利要求18的产生后代细胞质雄性不育植物的方法，该方法进一步包括下列步骤：
e)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
f)选择具有期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
g)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
h)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
i)连续重复步骤(g)和(h)三次或更多次以产生包含期望性状的选定的第四或更高代的回交后代植物。
25.权利要求23的用于产生后代细胞质雄性不育植物的方法，其中该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
26.一种恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法包括：
a)使雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中该雌性亲本植物是对于SEQ ID NO:8而言为纯合或杂合的细胞质雄性不育亲本植物，并且其中该细胞质不育亲本植物是能育亲本植物；
b)从步骤(a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的；
c)种植该后代种子；
d)培育该后代种子，其中该后代种子产生后代细胞质雄性能育植物；并且，
e)恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性，其中该后代细胞质雄性能育植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
27.权利要求26的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雌性和雄性亲本植物是单子叶植物。
28.权利要求27的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中所述单子叶植物是玉米植物。
29.权利要求26的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雄性亲本植物相对于该雌性亲本植物是等基因的。
30.权利要求26的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该雄性亲本植物对于SEQ ID NO:8而言是纯合或杂合的。
31.权利要求26的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法进一步包括将期望性状导入细胞质雄性不育植物中。
32.权利要求26的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，该方法进一步包括：
f)使该后代细胞质雄性不育植物与包含期望性状的另一植物杂交以产生F1后代植物；
g)选择具有期望性状的F1后代植物以产生选定的F1后代植物；
h)使该选定的F1后代植物与该后代细胞质雄性不育植物杂交以产生回交后代植物；
i)选择具有期望性状的回交后代植物；并且，
j)连续重复步骤(h)和(i)三次或更多次以产生包含期望性状的选定的第四或更高代的回交后代植物。
33.权利要求31的恢复细胞质雄性不育亲本植物的后代的育性的方法，其中该期望性状选自下组：杀虫抗性性状、耐除草剂性状、抗病性性状、产量增加性状、营养品质性状、农艺增进性状、及其组合。
34.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
35.权利要求34的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
36.权利要求34或权利要求35的分离的多肽序列，其中所述多肽具有细胞质雄性不育恢复活性。
37.一种包含权利要求34的多肽的细胞。
38.权利要求37的细胞，其中该细胞是植物细胞。
39.一种包含权利要求38的植物细胞的植物。
40.权利要求39的植物，其中该植物是单子叶植物。
41.权利要求40的植物，其中该单子叶植物是玉米植物。
42.权利要求40的植物，其中该植物具有CMS-S型细胞质。
43.一种从权利要求39的植物获得的种子。
44.一种合成核酸序列，其编码权利要求34的多肽。
45.权利要求44的合成核酸序列，其包含SEQ ID NO:8的序列。
46.一种基因表达盒，其包含权利要求44的合成核酸序列。
47.权利要求46的基因表达盒，其中该合成核酸序列与启动子可操作连接，其中该启动子在植物中有功能。
48.权利要求47的基因表达盒，其中该启动子是植物细胞质雄性不育启动子。
49.一种包含权利要求46的基因表达盒的细胞。
50.一种包含权利要求44的合成核酸序列的载体。
51.一种包含权利要求50的载体的细胞。
52.一种恢复细胞质雄性不育植物的育性的方法，该方法包括下列步骤：
a)用包含权利要求44的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
b)将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；并且，
c)表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达恢复该细胞质雄性不育植物的育性。
53.一种改变细胞质雄性不育植物中的植物形态的方法，该方法包括下列步骤：
a)用包含权利要求44的合成核酸序列转化细胞质雄性不育植物；
b)将该合成核酸序列整合到该细胞质雄性不育植物的基因组中；并且，
c)表达该合成核酸序列，其中该合成核酸序列的表达改变该细胞质雄性不育植物中的植物形态。
54.一种检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，该方法包括下列步骤：
a)从植物、植物组织、植物部分或植物细胞分离基因组多核苷酸样品；
b)向该基因组多核苷酸样品添加一组寡核苷酸引物；
c)对该基因组多核苷酸样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；并且，
d)检测至少一种扩增产物，其中该扩增产物指示植物中的细胞质雄性不育恢复性状的存在。
55.权利要求54的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该组寡核苷酸引物选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、和SEQ ID NO:30。
56.权利要求54的检测包含细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物包含SEQ ID NO:6。
57.检测包含权利要求54的细胞质雄性不育恢复性状的植物的方法，其中该扩增产物被定量。
58.检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，该方法包括下列步骤：
a)使用细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)、正向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:28)和反向细胞质雄性不育恢复性状引物(SEQ ID NO:29)对基因组多核苷酸样品进行第一扩增过程，其中从所述细胞质雄性不育恢复性状探针(SEQ ID NO:30)释放第一荧光染料；
b)使用参考探针(SEQ ID NO:36)、正向参考引物(SEQ ID NO:34)和反向参考引物(SEQID NO:35)对基因组多核苷酸样品进行第二扩增过程，其中从所述参考探针(SEQ ID NO:36)释放第二荧光染料；
c)定量第一荧光染料对第二荧光染料的相对强度，以检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平。
59.权利要求58的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一和第二扩增过程是使用带有不同荧光染料的探针在单个PCR测定管中进行的。
60.权利要求58的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，该方法进一步包括下列步骤：
d)将PCR溶液装载到单个PCR测定管中，该PCR溶液包含：具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶、脱氧核苷酸、所述引物、所述探针、缓冲液、和所述基因组多核苷酸样品；
e)扩增该PCR溶液，其中该PCR溶液在扩增条件下被处理，使得该聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割所述探针，由此释放出发光的荧光染料；并且，
f)测量在扩增过程中从所述荧光染料发出的光。
61.权利要求58的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该细胞质雄性不育性状探针包含第一荧光染料和第一淬灭剂。
62.权利要求61的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一荧光染料选自下组：HEX荧光染料、VIC荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。
63.权利要求61的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第一淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、Iowa BlackRQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。
64.权利要求58的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该参考探针包含第二荧光染料和第二淬灭剂。
65.权利要求64的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第二荧光染料选自下组：HEX荧光染料、FAM荧光染料、VIC荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy 3荧光染料、Cy 3.5荧光染料、Cy 5荧光染料、Cy 5.5荧光染料、Cy 7荧光染料、或ROX荧光染料。
66.权利要求64的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该第二淬灭剂选自下组：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa Black FQ淬灭剂、Iowa BlackRQ淬灭剂、IR Dye QC-1淬灭剂、MGB淬灭剂、或Blackhole淬灭剂。
67.权利要求58或权利要求54的检测细胞质雄性不育恢复性状的表达水平的方法，其中该基因组多核苷酸样品包含从植物、植物组织、植物部分或植物细胞分离的mRNA产生的cDNA。
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