ES2944632T3 - Gen Rf3 restaurador de tipo S de la esterilidad masculina citoplasmática (CMS) del maíz - Google Patents

Abstract

Se describe una proteína recientemente identificada que está codificada por una secuencia de polinucleótidos asociada con la actividad restauradora de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3). El gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática se puede insertar a través de la introgresión de reproducción en genomas de plantas para restaurar la esterilidad masculina citoplasmática en las plantas. Otras aplicaciones de la secuencia de polinucleótidos recientemente identificada asociada con la actividad restauradora de la esterilidad masculina citoplasmática incluyen una mutación (rf3) que da como resultado la esterilidad masculina citoplasmática. El gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática puede insertarse a través de la introgresión de reproducción en los genomas de las plantas para dar como resultado la esterilidad masculina citoplasmática en las plantas. Los métodos para detectar el restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y las secuencias del gen de la esterilidad masculina citoplasmática (rf3) se describen adicionalmente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Gen Rf3 restaurador de tipo S de la esterilidad masculina citoplasmática (CMS) del maíz

CAMPO DE LA DIVULGACIÓN

La divulgación se refiere al aislamiento y la identificación de secuencias de proteínas que están codificadas por las secuencias génicas del restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y de la esterilidad masculina citoplasmática (rf3), y a métodos de detección de secuencias génicas del restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y de la esterilidad masculina citoplasmática (rf3) en plantas. Además, la divulgación se refiere al campo del cultivo de plantas para introducir las secuencias génicas del restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y la esterilidad masculina citoplasmática (rf3) en las plantas de la progenie.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esterilidad masculina citoplasmática (CMS, por sus siglas en inglés) es la incapacidad heredada por la madre para producir polen funcional y se ha utilizado con éxito en la producción comercial de semillas híbridas, evitando así los inconvenientes de la emasculación manual o mecánica. (Kaul, M.L.H. 1988. Male sterility in higher plants. Springer-Verlag, Berlin). Se han identificado más de 40 fuentes de CMS y se han clasificado en tres grupos principales: citoplasma tipo CMS-T (Texas), CMS-S (USDA) y CMS-C (Charrua). (Beckett, J. B., Crop Sci., 11:724-726, 1971).

Los genes restauradores Rf, que imparten y restauran la fertilidad a las plantas que tienen esterilidad masculina citoplásmica, se han clonado o mapeado en alta resolución de varias especies vegetales. Hasta la fecha, se han clonado o mapeado a alta resolución once genes Rf. La mayoría de los genes restauradores clonados, excepto Rf2 y Rf4 en el maíz y Rf17 y Rf2 en el arroz, codifican diferentes proteínas de repetición de pentatricopéptido (PPR, por sus siglas en inglés). Las proteínas PPR contienen dos a 27 repeticiones de 35 aminoácidos, denominadas motivos PPR (Small, I.D. y Peeters, N., Trends Biochem. Sci., 25:46-47, 2000). Muchas proteínas PPR están fijadas como objetivo a las mitocondrias en donde están situados los genes y productos asociados con la CMS (Lurin, C. et al., Plant Cell, 16:2089-2103, 2004).

En el maíz, los genes que codifican el restaurador del citoplasma tipo S de CMS se comportan como un rasgo gametofítico. Las plantas de maíz con citoplasma de tipo CMS-S son restauradas por el único gen dominante, Rf3, que se mapeó a fragmentos genómicos de varios centimorgans de longitud en el cromosoma 2, a través de secuencias marcadoras. (Kamps y Chase, Theor. Appl. Genet., 95:525-531, 1997; Tie, S., Xia, J., Qiu, F. y Zheng, Y. Plant Mol. Biol., 24:71-80, 2006; Zhang, Z. y Zheng Y. Mol. Gen. Genomics., 276:162-169, 2006). Las aplicaciones de mejora genética tradicionales implantan el uso de marcadores que se asocian a gran distancia con los alelos Rf3 y rf3 para restaurar o proporcionar esterilidad masculina citoplasmática en plantas de maíz, respectivamente. (Laughnan, J. R. y Gabay, S. J. 1978. Nuclear and cytoplasmic mutations to fertility in S male-sterile maize, pp. 427-446. En: Maize Breeding and Genetics). Además, las plantas CMS-S heterocigóticas (Rf3/rf3) son semi-fértiles, diseminando aproximadamente un 50 % de polen colapsado abortivo que contiene el alelo rf3 y aproximadamente un 50 % de polen fértil lleno de almidón que contiene el alelo Rf3. El alelo rf3 en plantas Rf3/rf3 no se puede transferir a la progenie a través del polen estéril y generar plantas estériles en una generación F2. (Tie et al., Plant Mol. Biol. Rep., 24: 71-80, 2006). Este tipo de herencia dificulta la recopilación de datos fenotípicos precisos de una población de mapeo F2. Como tales, los métodos tradicionales para utilizar o identificar los alelos dominantes y recesivos de los genes Rf3 requieren mucho trabajo y tiempo.

Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos que puedan utilizarse para aislar e identificar secuencias de proteínas que están codificadas por las secuencias génicas del restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y de la esterilidad masculina citoplasmática (rf3), y de métodos de detección de secuencias génicas del restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática (Rf3) y de la esterilidad masculina citoplasmática (rf3) en plantas.

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento y la identificación de secuencias de polinucleótidos y proteínas codificadas por el alelo Rf3 que dan como resultado el fenotipo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, y las modificaciones de secuencia posteriores codificadas por el alelo rf3 que dan como resultado el fenotipo masculino estéril citoplasmático. El descubrimiento de estas secuencias se puede utilizar en sistemas de esterilidad masculina citoplásmica para cultivar plantas híbridas de un cierto número de especies de cultivo. Además, la aplicación de este sistema puede resultar en un ahorro de costos y en una eficiencia incrementada. Por ejemplo, la diseminación de un sistema de esterilidad masculina citoplásmica en el maíz se puede utilizar para eliminar la costosa y laboriosa tarea de despanojar las plantas de maíz para evitar la autopolinización.

Los ejemplos anteriores de la técnica relacionada y las limitaciones relacionadas con la misma pretenden ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de la técnica relacionada resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la memoria descriptiva.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 92,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3, que comprende SEQ ID NO: 1, una célula transgénica que expresa dicho polipéptido, una planta transgénica, una semilla de dicha planta, una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica dicho polipéptido, un polinucleótido, un casete de expresión génica, una célula o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico y métodos que utilizan dicho rasgo como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invención está definida por el alcance de las reivindicaciones. Cualquier contenido de la siguiente divulgación que no caiga dentro de la definición o el alcance de las reivindicaciones debe considerarse como ilustrativo, no como parte de la invención.

La presente divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3. En aspectos de una realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 tienen actividad de esterilidad masculina citoplasmática.

En otros aspectos, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En aspectos de una realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 tienen actividad restauradora de la esterilidad masculina citoplasmática.

En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para restablecer la fertilidad a una progenie de una planta con esterilidad masculina citoplasmática. En un aspecto posterior, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática. Además, otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método para detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática.

Además de los aspectos ejemplares y realizaciones arriba descritos, aspectos y realizaciones adicionales resultarán evidentes mediante el estudio de las siguientes descripciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 ilustra el mapa de enlace y la posición QTL del alelo Rf3 y el rasgo correspondiente en el cromosoma 2.

La Figura 2 ilustra un alineamiento de secuencias de polinucleótidos de las secuencias codificantes de Rf3. Las secuencias obtenidas de las plantas 4XP811 y 7SH382ms se corresponden con las plantas macho estériles citoplasmáticas que son homocigóticas recesivas (rf3/rf3). Las secuencias obtenidas de las plantas LH60 y MBB56 se corresponden con las plantas macho fértiles citoplasmáticas restauradas que son homocigóticas dominantes (Rf3/Rf3). El asterisco encima del alineamiento indica la modificación del par de bases que da como resultado el alelo rf3 recesivo y codifica el rasgo de esterilidad masculina citoplasmática. Este cambio de SEQ ID NO: 6; 5'-ATTGTTTTATTCAGT-3' a SEQ ID NO: 2; 5-ATTGTTTTCTTCAGT-3' (en donde el par de bases subrayado indica la secuencia mutada) da como resultado la pérdida de la función restauradora y la ganancia del fenotipo de esterilidad masculina citoplasmática.

La Figura 3 ilustra un alineamiento de secuencias de proteínas de las secuencias codificantes de Rf3. Las secuencias obtenidas de las plantas 4XP811 y 7SH382ms se corresponden con las plantas macho estériles citoplasmáticas que son homocigóticas recesivas (rf3/rf3). Las secuencias obtenidas de las plantas LH60 y MBB56 se corresponden con las plantas macho fértiles citoplasmáticas restauradas que son homocigóticas dominantes (Rf3/Rf3). El asterisco encima del alineamiento indica la modificación del residuo de aminoácido que da como resultado el alelo rf3 recesivo y codifica el rasgo de esterilidad masculina citoplasmática. Este cambio ^{de SEQ ID NO: 5; IVLFS a SEQ ID n}O: ^{1; IVFFSS (en donde el residuo de aminoácido subrayado indica la} secuencia mutada) da como resultado la pérdida de la función restauradora y la ganancia del fenotipo de esterilidad masculina citoplasmática.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 proporciona el motivo proteico (IVFFSS) en el que Leu se modifica a Phe (subrayado), dando con ello como resultado la pérdida de la función restauradora y la ganancia del fenotipo de esterilidad masculina citoplasmática del alelo rf3.

SEQ ID NO: 2 proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO:3 proporciona la secuencia de proteína para el alelo rf3 obtenido de la línea de maíz con esterilidad masculina citoplasmática, Zea mays c.v. 4XP811.

La SEQ ID NO:4 proporciona la secuencia de polinucleótidos ADNc para el alelo rf3 obtenido de la línea de maíz con esterilidad masculina citoplasmática, Zea mays c.v. 4XP811.

La SEQ ID NO: 5 proporciona el motivo proteico (IVLFSS) en el que la conservación del residuo de aminoácido Leu (subrayado) da como resultado una función restauradora, fenotipo de fertilidad masculina del alelo Rf3. La SEQ ID NO: 6 proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 7 proporciona la secuencia de proteína para el alelo Rf3 obtenido de la línea de maíz fértil restaurada, Zea mays c.v. LH60.

La SEQ ID NO: 8 proporciona la secuencia de polinucleótidos ADNc que codifica el alelo Rf3 obtenido de la línea de maíz fértil restaurada, Zea mays c.v. LH60.

La SEQ ID NO:9 proporciona la secuencia de proteína para el alelo rf3 obtenido de la línea de maíz con esterilidad masculina citoplasmática, Zea mays c.v. 7SH382MS.

La SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de polinucleótidos de ADNc que codifica el alelo rf3 obtenido de la línea de maíz con esterilidad masculina citoplasmática, Zea mays c.v. 7SH382MS.

La SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de proteína para el alelo Rf3 obtenido de la línea de maíz fértil restaurada, Zea mays c.v. MBB56.

La SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de polinucleótidos de ADNc que codifica el alelo Rf3 obtenido de la línea de maíz fértil restaurada, Zea mays c.v. MBB56.

La SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 18 proporcionan cebadores y sondas utilizados para la detección de los alelos Rf3 dominantes y recesivos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

i. Resumen

La presente divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:3. En aspectos de una realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 tienen actividad de esterilidad masculina citoplasmática.

En otros aspectos, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En aspectos de una realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 tienen actividad restauradora de la esterilidad masculina citoplasmática.

En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para restablecer la fertilidad a una progenie de una planta con esterilidad masculina citoplasmática. En un aspecto posterior, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática. Además, otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método para detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática.

II. Términos y expresiones

A menos que se defina de otro modo, todos la expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto ordinario en la técnica a la que se refiere esta divulgación. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluyendo las definiciones. A menos que el contexto requiera lo contrario, los términos y las expresiones en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en esta memoria se incorporan por referencia en su totalidad a todos los efectos, como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente para ser incorporada por referencia, a menos que solo se indiquen secciones específicas de patentes o publicaciones de patentes a incorporar como referencia.

Con el fin de aclarar aún más esta divulgación, se proporcionan los siguientes términos, expresiones, abreviaturas y definiciones.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "comprende", la expresión "que comprende", el término "incluye", "incluyendo", "tiene", la expresión "que tiene", el término "contiene" o la expresión "que contiene", o cualquier otra variación de los mismos, pretenden ser no-exclusivos o abiertos. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un procedimiento, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no está necesariamente limitado solo a esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a una composición, mezcla, procedimiento, método, artículo o aparato de este tipo. Además, a menos que se indique expresamente lo contrario, "o" se refiere a un o inclusivo y no a un o exclusivo. Por ejemplo, una condición A o B es satisfecha por cualquiera de los siguientes: A es verdadero (o está presente) y B es falso (o no está presente), A es falso (o no está presente) y B es verdadero (o está presente), y tanto A como B son verdaderos (o están presentes).

También, los artículos indefinidos "un" y "una" que preceden a un elemento o componente de una realización de la divulgación pretenden no ser restrictivos con respecto al número de casos, es decir, apariciones del elemento o componente. Por lo tanto, se debe leer que "un" o "una" incluye uno/una o al menos uno/una, y la forma de la palabra singular del elemento o componente también incluye el plural, a menos que sea obvio que se pretende que el número sea singular.

El término "invención" o la expresión "presente invención" tal como se utiliza en esta memoria es un término/expresión no limitativo y no pretende referirse a una realización única de la invención particular, sino que abarca todas las realizaciones posibles como se describe en la solicitud.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "planta" incluye una planta completa y cualquier descendiente, célula, tejido o parte de una planta. La expresión "partes de una planta" incluye cual(es)quier(a) parte(s) de una planta, incluyendo, por ejemplo y sin limitación: semillas (incluyendo semillas maduras y semillas inmaduras); un esqueje de planta; una célula vegetal; un cultivo de células vegetales; un órgano de planta (p. ej., polen, embriones, flores, frutos, brotes, hojas, raíces, tallos y explantes). Un tejido vegetal u órgano vegetal puede ser una semilla, protoplasto, callo o cualquier otro grupo de células vegetales que esté organizado en una unidad estructural o funcional. Un cultivo de células o tejidos vegetales puede ser capaz de regenerar una planta que tenga las características fisiológicas y morfológicas de la planta de la que se obtuvo la célula o el tejido, y de regenerar una planta que tenga sustancialmente el mismo genotipo que la planta. Por el contrario, algunas células vegetales no pueden regenerarse para producir plantas. Las células regenerables en un cultivo de células o tejidos vegetales pueden ser embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, barbas, flores, granos, espigas, mazorcas, vainas o tallos.

Las partes de plantas incluyen partes cosechables y partes útiles para la propagación de plantas de la progenie. Las partes de plantas útiles para la propagación incluyen, por ejemplo y sin limitación: semilla; fruta; un esqueje; una plántula; un tubérculo; y un portainjerto. Una parte cosechable de una planta puede ser cualquier parte útil de una planta, incluyendo, por ejemplo y sin limitación: flor; polen; planta de semillero; tubérculo; hoja; tallo; fruto; semilla; y raíz.

Una célula vegetal es la unidad estructural y fisiológica de la planta, e incluye células protoplastos sin pared celular y células vegetales con pared celular. Una célula vegetal puede estar en forma de una sola célula aislada o de un agregado de células (p. ej., un callo quebradizo y una célula cultivada), y puede ser parte de una unidad organizada superior (p. ej., un tejido vegetal, un órgano vegetal y una planta). Por lo tanto, una célula vegetal puede ser un protoplasto, una célula productora de gametos o una célula o colección de células que pueden regenerarse en una planta completa. Como tal, una semilla, que comprende múltiples células vegetales y es capaz de regenerarse en una planta completa, se considera una “célula vegetal” en realizaciones de esta memoria.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aislado" se refiere a un componente biológico (que incluye un ácido nucleico o una proteína) que ha sido separado, producido aparte de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se produce de forma natural (es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, y proteínas).

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "purificado" en referencia a moléculas de ácido nucleico no requiere una pureza absoluta (tal como una preparación homogénea); en cambio, representa una indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en su entorno celular nativo (en comparación con el nivel natural, este nivel debe ser al menos 2-5 veces mayor, p. ej., en términos de concentración o niveles de expresión génica). Las moléculas de ADN reivindicadas se obtienen directamente del ADN total o del ARN total. Además, los clones de ADNc no se producen de forma natural, sino que se obtienen preferiblemente mediante la manipulación de una sustancia que se produce de forma natural, parcialmente purificada (ARN mensajero). La construcción de una colección de ADNc a partir de ARNm implica la creación de una colección. Clones de ADNc individuales se pueden producir a partir de la colección mediante la selección clonal de las células que portan la colección de ADNc. Por lo tanto, el procedimiento que incluye la construcción de una colección de ADNc a partir de ARNm y la selección de distintos clones de ADNc produce una purificación de aproximadamente 106 veces del mensaje nativo. Asimismo, una secuencia de ADN promotor o génico podría clonarse en un plásmido. Un clon de este tipo no se produce de forma natural, sino que se obtiene preferiblemente mediante la manipulación de una sustancia que se produce de forma natural, parcialmente purificada, tal como una colección de ADN genómico. Por lo tanto, en estas técnicas se favorece la purificación de al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud.

De manera similar, sintético representa una indicación de que se ha producido un cambio químico o funcional en la secuencia de ADN del componente. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han "sintetizado" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas generadas mediante amplificación por PCR o por métodos recombinantes, en los que un polinucleótido aislado se modifica adicionalmente mediante la incorporación dentro de un plásmido o vector. El término "sintético" también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante métodos de ADN recombinante en una célula huésped (p. ej., células vegetales), así como moléculas de ácido nucleico, proteínas y péptidos sintetizados químicamente.

En la ingeniería de un gen para su expresión en plantas, el sesgo de codones de la(s) planta(s) huésped(es) potencial(es) puede(n) determinarse, por ejemplo, mediante el uso de bases de datos de secuencias de ADN disponibles públicamente para encontrar información sobre la distribución de codones de los genomas de las plantas o las regiones codificantes de proteínas de diversos genes vegetales. Una vez que se ha diseñado una secuencia de ADN optimizada (p. ej., una planta optimizada) en papel o in silico, se pueden sintetizar moléculas de ADN reales en el laboratorio para que correspondan en secuencia precisamente a la secuencia diseñada. Moléculas de ácido nucleico sintéticas de este tipo pueden clonarse y manipularse de otro modo exactamente como si se derivaran de fuentes naturales o nativas.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "polinucleótido" y las expresiones "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan indistintamente y pueden abarcar un ácido nucleico singular; ácidos nucleicos plurales; un fragmento de ácido nucleico, variante o derivado del mismo; y construcción de ácido nucleico (p. ej., ARN mensajero (ARNm) y ADN plasmídico (ADNp)). Un polinucleótido o ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADNc de longitud completa, o un fragmento de la misma, incluyendo las secuencias 5' y/o 3' no traducidas y la(s) secuencia(s) codificante(s). Un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden incluir ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos no modificados o ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos modificados. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto por ADN de cadena sencilla y de doble cadena; ADN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y de doble cadena; ARN de cadena sencilla y de doble cadena; y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y de doble cadena. Moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN pueden ser de cadena sencilla, de doble cadena o una mezcla de regiones de cadena sencilla y de doble cadena. Los términos y las expresiones anteriores también incluyen formas modificadas química, enzimática y metabólicamente de un polinucleótido o ácido nucleico.

Se entiende que un ADN específico se refiere también a su complemento, cuya secuencia se determina de acuerdo con las reglas del apareamiento de bases de desoxirribonucleótidos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "gen" se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto funcional (ARN o polipéptido/proteína). Un gen puede incluir secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en 5') y/o siguen (secuencias no codificantes en 3') a la secuencia que codifica el producto funcional.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos específica. Una "secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de nucleótidos situada aguas arriba (p. ej., secuencias no codificantes en 5'), dentro o aguas abajo (p. ej., secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, que influye en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo y sin limitación: promotores; secuencias conductoras de la traducción; intrones; secuencias de reconocimiento de poliadenilación; sitios de procesamiento de ARN; sitios de unión de efectores; y estructuras de tallo-bucle.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "polipéptido" incluye un polipéptido singular, polipéptidos plurales y fragmentos de los mismos. Este término se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud o tamaño específico del producto. Por consiguiente, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, proteína, cadena de aminoácidos y cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y los términos y expresiones anteriores se utilizan de manera indistinta con "polipéptido" en esta memoria. Un polipéptido puede aislarse de una fuente biológica natural o puede producirse mediante tecnología recombinante, pero un polipéptido específico no se traduce necesariamente a partir de un ácido nucleico específico. Un polipéptido puede generarse de cualquier manera apropiada, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, mediante síntesis química.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "nativo" se refiere a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si están presentes. El término "endógeno" se refiere a la forma nativa del polinucleótido, gen o polipéptido en su ubicación natural en el organismo o en el genoma del organismo.

Por el contrario, el término "heterólogo" se refiere a un polinucleótido, gen o polipéptido que normalmente no se encuentra en su ubicación en el organismo de referencia (huésped). Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que normalmente se encuentra en el organismo de referencia en una ubicación genómica diferente. A modo de ejemplo adicional, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que normalmente no se encuentra en el organismo de referencia. Un organismo huésped que comprende un polinucleótido, gen o polipéptido heterólogo puede producirse introduciendo el polinucleótido, gen o polipéptido heterólogo en el organismo huésped. En ejemplos particulares, un polinucleótido heterólogo comprende una secuencia codificante nativa, o una porción de la misma, que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del polinucleótido nativo correspondiente. En ejemplos particulares, un gen heterólogo comprende una secuencia codificante nativa, o una porción de la misma, que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del gen nativo correspondiente. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una secuencia codificante nativa que es una parte de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no nativas que se reintroduce en el huésped nativo. En ejemplos particulares, un polipéptido heterólogo es un polipéptido nativo que se reintroduce en un organismo fuente en una forma que es diferente del polipéptido nativo correspondiente.

Un gen o polipéptido heterólogo puede ser un gen o polipéptido que comprende un polipéptido funcional o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido funcional que se condensa con otros genes o polipéptido para producir un polipéptido quimérico o de fusión, o un gen que codifica el mismo. Genes y proteínas de realizaciones particulares incluyen secuencias y porciones de longitud completa ejemplificadas específicamente, segmentos, fragmentos (incluyendo fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales en comparación con las moléculas de longitud completa), variantes, mutantes, quiméricos y fusiones de estas secuencias.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "modificación" puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia particular que da como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Una modificación también puede referirse a un cambio en un polipéptido de referencia que da como resultado una actividad reducida, sustancialmente eliminada o eliminada del polipéptido de referencia. Alternativamente, el término "modificación" puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia que da como resultado una actividad incrementada o mejorada de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia, así como un cambio en un polipéptido de referencia que da como resultado una actividad incrementada o mejorada del polinucleótido de referencia. Cambios como los anteriores se pueden realizar mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo y sin limitación: eliminar una porción de la molécula de referencia; mutar la molécula de referencia (p. ej., mediante mutagénesis espontánea, mediante mutagénesis aleatoria, mediante mutagénesis provocada por genes mutadores y mediante mutagénesis de transposones); sustituir una porción de la molécula de referencia; insertar un elemento en la molécula de referencia; regular a la baja la expresión de la molécula de referencia; alterar la ubicación celular de la molécula de referencia; alterar el estado de la molécula de referencia (p. ej., a través de la metilación de un polinucleótido de referencia y a través de la fosforilación o ubiquitinación de un polipéptido de referencia); eliminar un cofactor de la molécula de referencia; introducción de un ARN/ADN antisentido que fija como objetivo la molécula de referencia; introducción de un ARN/ADN de interferencia que fija como objetivo la molécula de referencia; modificación química de la molécula de referencia; modificación covalente de la molécula de referencia; irradiación de la molécula de referencia con radiación UV o rayos X; recombinación homóloga que altera la molécula de referencia; recombinación mitótica que altera la molécula de referencia; sustitución del promotor de la molécula de referencia; y/o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

Se puede encontrar orientación para determinar qué nucleótidos o residuos de aminoácidos pueden modificarse en un ejemplo específico comparando la secuencia del polinucleótido o polipéptido de referencia con la de los polinucleótidos o polipéptidos homólogos (p. ej., levadura o bacterias homólogas), y maximizando el número de modificaciones realizadas en regiones de alta homología (regiones conservadas) o secuencias consenso.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante de ácido nucleico o ARN funcional. En ejemplos, la secuencia codificante controlada se ubica en 3' con respecto a una secuencia de promotor. Un promotor puede derivar en su totalidad de un gen nativo, un promotor puede estar compuesto por diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o un promotor puede incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Ejemplos de todos los promotores anteriores son conocidos y se utilizan en la técnica para controlar la expresión de ácidos nucleicos heterólogos. A los promotores que dirigen la expresión de un gen en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de los casos se les alude comúnmente como "promotores constitutivos". Además, aunque los expertos en la técnica han intentado (en muchos casos sin éxito) delinear los límites exactos de las secuencias reguladoras, se ha llegado a comprender que los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora idéntica. La actividad promotora de un ácido nucleico particular puede ensayarse utilizando técnicas familiares para los expertos en la técnica.

La expresión "enlazado operativamente" se refiere a una asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo ácido nucleico, en el que la función de una de las secuencias de ácido nucleico se ve afectada por otra. Por ejemplo, un promotor se enlaza operativamente con una secuencia codificante cuando el promotor es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia codificante (p. ej., la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Una secuencia codificante puede estar enlazada operativamente a una secuencia reguladora en una orientación sentido o antisentido.

El término "expresión" o la expresión "que expresa", tal como se utiliza en esta memoria, puede referirse a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado de un ADN. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "sobre-expresión" se refiere a una expresión que es mayor que la expresión endógena del mismo gen o un gen relacionado. Por lo tanto, un gen heterólogo se "sobre-expresa" si su expresión es mayor que la de un gen endógeno comparable.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "transformación" o "transformar" se refiere a la transferencia e integración de un ácido nucleico o fragmento del mismo en un organismo huésped, dando como resultado una herencia genéticamente estable. A organismos huéspedes que contienen un ácido nucleico transformante se les alude como organismos "transgénicos", "recombinantes" o "transformados". Métodos de transformación conocidos incluyen, por ejemplo: transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes; transformación de fosfato de calcio; transformación de polibreno; fusión de protoplastos; electroporación; métodos ultrasónicos (p. ej., sonoporación); transformación de liposomas; microinyección; transformación con ADN desnudo; transformación con vectores de plásmidos; transformación con vectores virales; transformación biolística (bombardeo de micropartículas); transformación mediada por fibras de carburo de silicio; emisión de aerosoles; y transformación mediada por PEG.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "introducido" (en el contexto de la introducción de un ácido nucleico en una célula) incluye la transformación de una célula, así como el cruce de una planta que comprende el ácido nucleico con una segunda planta, de modo que la segunda planta contenga el ácido nucleico, como se puede realizar utilizando técnicas convencionales de fitomejoramiento. Técnicas de reproducción de este tipo son conocidas en la técnica. Para una discusión de las técnicas de fitomejoramiento, véase Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4a Edición, AVI Publication Co., Westport CT.

Pueden utilizarse métodos de retrocruzamiento para introducir un ácido nucleico en una planta. Esta técnica se ha utilizado durante décadas para introducir rasgos en las plantas. Puede encontrarse un ejemplo de una divulgación de retrocruzamiento (y otras metodologías de fitomejoramiento) en, por ejemplo, Poelman (1995), supra; y Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, Nueva York, NY. En un protocolo de retrocruzamiento ejemplar, una planta original de interés (el "parental recurrente") se cruza con una segunda planta (el "parental no recurrente") que porta el ácido nucleico que se ha de introducir. La progenie resultante de este cruce se vuelve a cruzar entonces con el progenitor recurrente, y el procedimiento se repite hasta que se obtenga una planta convertida, en donde esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del parental recurrente se recuperan en la planta convertida, además del ácido nucleico del parental no recurrente.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "isogénico" se refiere a dos plantas individuales (o partes de las mismas, p. ej., semillas, células) que tienen un genotipo sustancialmente idéntico (p. ej., no más de 1 gen es diferente entre los individuos).

"Unión" se refiere a una interacción no covalente específica para la secuencia entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos para la secuencia (p. ej., contactos con residuos fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción en su conjunto sea específica para la secuencia. Interacciones de este tipo se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10'6 M'1 o inferior. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión: la afinidad de unión incrementada se correlaciona con una Kd más baja.

Los términos "plásmido" y "vector", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a un elemento extracromosómico que puede portar uno o más genes que no forman parte del metabolismo central de la célula. Los plásmidos y los vectores son típicamente moléculas circulares de ADN de doble cadena. Sin embargo, los plásmidos y los vectores pueden ser ácidos nucleicos lineales o circulares, de ADN o ARN de cadena sencilla o de doble cadena, y pueden derivar de cualquier fuente, en la que un cierto número de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento de promotor y una secuencia de ADN codificante junto con cualquier secuencia no traducida en 3' apropiada en una célula. En ejemplos, los plásmidos y los vectores pueden comprender secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración del genoma y/o secuencias de fagos o nucleótidos.

Polipéptido y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria e incluyen una cadena molecular de dos o más aminoácidos enlazados a través de enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. Por lo tanto, "péptidos" y "oligopéptidos" se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones post-traduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Además, fragmentos de proteínas, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares se incluyen dentro del significado de polipéptido. Los términos también incluyen moléculas en las que se incluyen uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no canónicos o no naturales que se pueden sintetizar o expresar de forma recombinante utilizando técnicas conocidas de ingeniería de proteínas. Además, las proteínas de fusión de la invención se pueden derivatizar como se describe en esta memoria mediante técnicas de química orgánica bien conocidas.

La expresión "proteína de fusión" indica que la proteína incluye componentes polipeptídicos derivados de más de una proteína o polipéptido parental. Por lo general, una proteína de fusión se expresa a partir de un gen de fusión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia polipeptídica de una proteína se anexiona en marco y, opcionalmente, se separa mediante un enlazador de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia polipeptídica de una proteína diferente. A continuación, el gen de fusión puede expresarse mediante una célula huésped recombinante como una sola proteína.

III. Realizaciones de la Presente Invención

La invención está definida por el alcance de las reivindicaciones. En la medida en que la siguiente divulgación comprenda cualquier contenido que vaya más allá de la materia objeto reivindicada, dicha divulgación debe considerarse como ilustrativa, no como parte de la invención.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En aspectos de la realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 tienen actividad de esterilidad masculina citoplasmática.

En otra realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.

En otra realización, la presente divulgación se refiere a una célula que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1. En un aspecto, la célula que comprende los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 1 puede ser una célula vegetal. En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a una planta que comprende la célula vegetal que comprende el polipéptido aislado de s Eq ID NO: 1. En otra realización, la planta es una planta monocotiledónea. En realizaciones adicionales, la planta monocotiledónea es una planta de maíz. En otra realización, la planta de maíz tiene citoplasma de tipo CMS-S. Aspectos adicionales de la presente divulgación se refieren a la semilla obtenida de la planta que comprende la célula vegetal que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1.

En una realización adicional, la divulgación se refiere se refiere a una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido de SEQ ID NO: 1 es codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra realización, un polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, un polinucleótido consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, un polinucleótido consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional, el polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 está enlazado operativamente a un promotor, en donde el promotor es funcional en plantas. En aún otro aspecto, el promotor es un promotor de esterilidad masculina citoplasmática vegetal. En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que comprende el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que consiste en el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que consiste esencialmente en el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, la divulgación se refiere a un vector que comprende el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, la divulgación se refiere a un vector que consiste en el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, la divulgación se refiere a un vector que consiste esencialmente en el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Además, la presente divulgación se refiere a un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, que comprende las etapas de:

a) cruzar una planta parental femenina con una planta parental masculina, en donde la planta parental femenina es una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática homocigota para SEQ ID NO: 4, y en donde la planta parental masculina es una planta parental fértil;

b) cosechar una semilla de la progenie del cruce de la etapa (a), en donde la semilla de la progenie es homocigota para SEQ ID NO: 4;

c) plantar la semilla de la progenie; y,

d) hacer crecer la semilla de la progenie, en donde la semilla de la progenie produce la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, en donde la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie es homocigota para SEQ ID NO: 4.

En un aspecto adicional, el método se refiere a la producción de la progenie de plantas con esterilidad masculina citoplasmática, en donde las plantas parentales femeninas y masculinas son plantas monocotiledóneas. En otra realización, las plantas monocotiledóneas son plantas de maíz. En una realización adicional, la planta de maíz tiene un citoplasma de tipo CMS-S. En aún otra realización, la planta parental masculina es isogénica a la planta parental femenina. En una realización posterior, las plantas de maíz son homocigotas o heterocigotas para SEQ ID NO: 8. En otra realización, el método comprende, además, introducir un rasgo deseado en la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En una realización posterior, el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste en un rasgo de resistencia a insecticidas, rasgo de tolerancia a herbicidas, rasgo de resistencia a enfermedades, rasgo de aumento de rendimiento, rasgo de calidad nutricional, rasgo de aumento agronómico y combinaciones de los mismos.

En aún otro aspecto, la divulgación objeto se refiere a un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, comprendiendo el método, además, las etapas de:

e) cruzar la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie con otra planta que comprende un rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1;

f) seleccionar plantas de la progenie F1 que tengan el rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1 seleccionadas;

g) cruzar las plantas de la progenie F1 seleccionadas con la planta de la progenie con esterilidad masculina citoplasmática para producir plantas de la progenie retrocruzadas;

h) seleccionar plantas de la progenie retrocruzadas que tengan el rasgo deseado; e

i) repetir las etapas (g) y (h) tres o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas de la progenie del cuarto retrocruzamiento o superior que comprendan el rasgo deseado.

Aspectos adicionales de la presente divulgación se refieren a un método para restaurar la fertilidad a una progenie de una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método:

a) cruzar una planta parental femenina con una planta parental masculina, en donde la planta parental femenina es una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8, y en donde la planta parental con esterilidad masculina citoplasmática es una planta parental fértil;

b) cosechar una semilla de la progenie del cruce de la etapa (a), en donde la semilla de la progenie es homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8;

c) plantar la semilla de la progenie;

d) hacer crecer la semilla de la progenie, en donde la semilla de la progenie produce una planta fértil masculina citoplasmática de la progenie; y

e) restaurar la fertilidad a la progenie de la planta progenitora con esterilidad masculina citoplasmática, en donde la planta con fertilidad masculina citoplasmática de la progenie es homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8. En un aspecto adicional, el método se refiere a la producción de una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, en el que las plantas parentales femeninas y masculinas son plantas monocotiledóneas. En otra realización, las plantas monocotiledóneas son plantas de maíz. En aún otra realización, la planta de maíz tiene citoplasma de tipo CMS-S. En una realización adicional, la planta parental masculina es isogénica a la planta parental femenina. En una realización posterior, las plantas de maíz son homocigotas o heterocigotas para SEQ ID NO: 8. En otra realización, el método comprende, además, introducir un rasgo deseado en la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En otra realización, el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste en un rasgo de resistencia a insecticidas, rasgo de tolerancia a herbicidas, rasgo de resistencia a enfermedades, rasgo de aumento de rendimiento, rasgo de calidad nutricional, rasgo de aumento agronómico y combinaciones de los mismos.

En aún otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para producir una progenie de una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método, además, las etapas de:

f) cruzar la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie con otra planta que comprende un rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1;

g) seleccionar plantas de la progenie F1 que tengan el rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1 seleccionadas;

h) cruzar las plantas de la progenie F1 seleccionadas con la planta de la progenie con esterilidad masculina citoplasmática para producir plantas de la progenie retrocruzadas;

i) seleccionar plantas de la progenie retrocruzadas que tengan el rasgo deseado; y

j) repetir las etapas (g) y (h) tres o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas de la progenie del cuarto retrocruzamiento o superior que comprendan el rasgo deseado.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En aspectos de la realización, los polipéptidos aislados de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 tienen actividad restauradora de la esterilidad masculina citoplasmática.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización, la presente divulgación se refiere a un polipéptido aislado que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7.

En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5. En un aspecto, la célula que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 puede ser una célula vegetal. En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a una planta que comprende la célula vegetal que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5. En otra realización, la planta es una planta monocotiledónea. En realizaciones adicionales, la planta monocotiledónea es una planta de maíz. En otra realización, la planta de maíz tiene citoplasma de tipo CMS-S. Aspectos adicionales de la presente divulgación se refieren a una semilla obtenida de la planta que comprende la célula vegetal que comprende el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5.

En una realización adicional, la divulgación se refiere se refiere a una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico sintético comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico sintético consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico sintético consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico sintético comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico sintético consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico sintético consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización, un casete de expresión génica comprende la secuencia sintética de SEQ ID NO: 8. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 está enlazado operativamente a un promotor, en donde el promotor es funcional en plantas. En aún otro aspecto, el promotor es un promotor de esterilidad masculina citoplasmática vegetal. En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que comprende el casete de expresión génica que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización, la divulgación se refiere a una célula que comprende el casete de expresión génica que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8. En una realización adicional, la divulgación se refiere a una célula que consiste esencialmente en el casete de expresión génica que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 8. En una realización adicional, la divulgación se refiere a un casete de expresión génica que comprende el polinucleótido que comprende, además, la secuencia de SEQ ID NO: 8. En una realización posterior, la divulgación se refiere a un casete de expresión génica que consiste en el polinucleótido que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización, la divulgación se refiere a un casete de expresión génica que comprende el polinucleótido que consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 8.

Aspectos adicionales de la presente divulgación se refieren a un método para restaurar la fertilidad a una planta con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método:

a) transformar la planta con esterilidad masculina citoplasmática con la secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5;

b) integrar la secuencia de ácido nucleico sintético en el genoma de la planta con esterilidad masculina citoplasmática;

y

c) expresar la secuencia de ácido nucleico sintético, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico sintético restaura la fertilidad de la planta con esterilidad masculina citoplasmática.

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método para alterar la morfología de una planta con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método:

a) transformar la planta con esterilidad masculina citoplasmática con la secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5;

b) integrar la secuencia de ácido nucleico sintético en el genoma de la planta con esterilidad masculina citoplasmática; y

c) expresar la secuencia de ácido nucleico sintético, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico sintético altera la morfología de la planta con esterilidad masculina citoplasmática.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método las etapas de:

a) aislar una muestra de polinucleótido genómico de una planta, tejido vegetal, parte de planta o célula vegetal; b) añadir un conjunto de cebadores de oligonucleótidos a la muestra de polinucleótido genómico;

c) someter la muestra de polinucleótido genómico y el conjunto de cebadores de oligonucleótidos a un proceso de amplificación; y

d) detectar al menos un producto amplificado, en donde el producto amplificado indica la presencia del rasgo de esterilidad masculina citoplasmática en la planta.

Realizaciones adicionales se refieren a un método para detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, incluyen el conjunto de cebadores de oligonucleótidos que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30. En otra realización, el producto amplificado comprende la SEQ ID NO: 6. En una realización, el producto amplificado consiste en la SEQ ID NO: 6. En una realización adicional, el producto amplificado consiste esencialmente en SEQ ID NO: 6. Realizaciones adicionales incluyen la cuantificación del producto amplificado.

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método para detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método las etapas de:

a) realizar un primer proceso de amplificación utilizando una sonda de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático (SEQ ID NO: 30), un cebador de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático directo (SEQ ID NO: 28) y un cebador de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático inverso (SEQ ID NO: 29) en una muestra de polinucleótido genómico, en el que se libera un primer colorante fluorescente de la sonda de rasgo restaurador estéril masculina citoplasmática (SEQ ID NO: 30);

b) realizar un segundo proceso de amplificación utilizando una sonda de referencia (SEQ ID NO: 36), un cebador de referencia directo (SEQ ID NO: 34) y un cebador de referencia inverso (SEQ ID NO: 35) en una muestra de polinucleótido genómico, en el que se libera un segundo colorante fluorescente de la sonda de referencia (SEQ ID NO: 36);

c) cuantificar la intensidad relativa del primer colorante fluorescente con respecto al segundo colorante fluorescente para detectar el nivel de expresión del rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática.

Realizaciones adicionales se refieren al método de detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, incluyen en el que los procesos de amplificación primero y segundo se realizan en un solo tubo de ensayo de PCR utilizando sondas con diferentes colorantes fluorescentes.

En una realización adicional, el método para detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática comprende las etapas de:

d) cargar una solución de PCR en un solo tubo de ensayo de PCR, comprendiendo la solución de PCR una polimerasa con actividad de nucleasa de 5' a 3', desoxinucleótidos, los cebadores, las sondas, un tampón y la muestra de polinucleótido genómico;

e) amplificar la solución de PCR, en donde la solución de PCR se trata en condiciones de amplificación tales que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la polimerasa escinde las sondas, liberando con ello el colorante fluorescente que emite luz; y

f) medir la luz emitida por el colorante fluorescente, durante la amplificación.

Realizaciones adicionales se refieren al método de detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de esterilidad masculina citoplasmática, incluyen la sonda de rasgo restaurador de esterilidad masculina citoplasmática que comprende el primer colorante fluorescente y un primer colorante inhibidor. En una realización posterior, el primer colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente HEX, un colorante fluorescente VIC, un colorante fluorescente FAM, un colorante fluorescente JOE, un colorante fluorescente TET, un colorante fluorescente Cy 3, un colorante fluorescente Cy 3.5, un colorante fluorescente Cy 5, un colorante fluorescente Cy 5.5, un colorante fluorescente Cy 7 o un colorante fluorescente ROX. En una realización adicional, el primer colorante inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un colorante inhibidor Dabcyl, un colorante inhibidor Tamra, un colorante inhibidor Qxl, un colorante inhibidor Iowa Black FQ, un colorante inhibidor Iowa Black RQ, un colorante inhibidor IR Dye QC-1, un colorante inhibidor MGB o un colorante inhibidor Blackhole. En aún otra realización, la sonda de referencia comprende el segundo colorante fluorescente y un segundo colorante inhibidor. En una realización posterior, el segundo colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente HEX, un colorante fluorescente FAM, un colorante fluorescente VIC, un colorante fluorescente JOE, un colorante fluorescente TET, un colorante fluorescente Cy 3, un colorante fluorescente Cy 3.5, un colorante fluorescente Cy 5, un colorante fluorescente Cy 5.5, un colorante fluorescente Cy 7 o un colorante fluorescente ROX. En otra realización, el segundo colorante inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un colorante inhibidor Dabcyl, un colorante inhibidor Tamra, un colorante inhibidor Qxl, un colorante inhibidor Iowa Black FQ, un colorante inhibidor Iowa Black RQ, un colorante inhibidor IR Dye QC-1, un colorante inhibidor MGB o un colorante inhibidor Blackhole. En una realización adicional, la muestra de polinucleótido genómico comprende ADNc producido a partir de ARNm aislado de una planta, tejido vegetal, parte de planta o célula vegetal.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un casete donante de polinucleótidos que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 comprende, además, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En una realización posterior, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 y un polipéptido con un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 tienen actividad citoplasmática de esterilidad masculina.

Sistemas de esterilidad masculina citoplasmática se han utilizado para reproducir híbridos en un cierto número de especies de cultivos. El uso de un sistema de esterilidad de este tipo puede ser rentable y consciente de la mano de obra. En maíz o grano, por ejemplo, la costosa y laboriosa tarea de despanojar se evita cuando se utiliza la esterilidad masculina citoplasmática para evitar la auto-polinización. El uso del sistema de esterilidad masculina citoplasmática en un programa de mejoramiento también es ventajoso debido a su simplicidad y ahorro de costos.

La esterilidad masculina citoplasmática, un rasgo heredado de la madre, se utiliza más ampliamente en la industria de los híbridos para hacer que las propiedades masculinas de una planta no funcionen. Durante la fecundación, la parte femenina aporta un núcleo haploide y prácticamente todo el citoplasma del óvulo, mientras que la parte masculina haploide casi nada de citoplasma del polen. El resultado es que el citoplasma femenino que confiere la esterilidad masculina se transmite de generación a generación. La información transportada en el citoplasma que afecta al fenotipo, es decir, la presencia de anteras o la producción de polen, es aportada exclusivamente por la parte femenina. Este tipo de esterilidad afecta únicamente a la producción de polen; el conjunto de semillas es normal. Generalmente, toda la progenie de una planta estéril masculina es por sí misma estéril masculina. Sin embargo, en algunos casos se puede restaurar la fertilidad masculina. Pearson, O.H. (1981) Hort Sci. 16: 482-487. La fertilidad se puede restaurar por reversión citoplasmática a la fertilidad o por un gen restaurador nuclear capaz de anular los efectos del citoplasma. MacKenzie, S.A. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA J35: 2714-2717. Un citoplasma específico se puede transportar de generación a generación, con la condición de que la planta que posee el citoplasma sea el parental materno en cada cruzamiento.

Típicamente, tras la identificación de una fuente de esterilidad masculina citoplasmática, el rasgo " r f se transfiere a una línea "femenina" o "A" deseable. Se utiliza una línea de "mantenimiento" o "B" que carece tanto del rasgo de esterilidad como del factor de restauración para perpetuar y aumentar la línea femenina. Una línea "restauradora" o "Rf", que porta un factor de fertilidad del polen, se utiliza como parte masculina para polinizar la línea "A" con esterilidad masculina citoplasmática para crear una variedad híbrida. La planta con esterilidad masculina citoplasmática de la línea "A" se puede cruzar con una planta de una variedad diferente para producir una progenie híbrida. A este tipo de programa de mejoramiento se le alude a menudo como sistema restaurador de esterilidad masculina citoplasmática.

Se han secuenciado o clonado diversos alelos Rf, por ejemplo, Rf2 de maíz (Zea mays) (Cui, X., Wise, R.P. y Schnable, P.S. 1996. The Rf2 nuclear restorer gene of male-sterile T-cytoplasm maize. Science 272:1334-1336), Rf-PPR592 de Petunia (Petunia hybrida) (Bentolila, S., Alfonso, A.A. y Hanson, M.R. 2002. A pentatricopeptide repeat-containing gene restores fertility to male sterile plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :10887-10892), Rfo de rábano (Raphanus sativus) (Brown, G.G., Formanova, N., Jin, H., Wargachuk, R., Dendy, C., Patil, P., Laforest, M.., Zhang, J.F., Cheung, W.Y. y Landry, B.S. 2003. The radish Rf Restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats. Plant J. 35 :262-272 ; Desloire, S., Gherbi, H., Laloui, W., Marhadour, S., Clouet, V., Cattolico, L., Falentin, C., Giancola, S., Renard, M., Burdar, F., Small, I., Caboche, M. y Bendahmane, A. 2003. Identification of the fertility restorer locus, Rfo, in radish, as a member of the pentatricopeptide-repeat protein family. EMBO Rep. 4:1-7; Koizuka, N., Imai, R., Fujimoto, H., Hayakawa, T., Kimura, Y., Kohno-Murase, J., Sakai, T., Kawasaki, S., Imamura, J.

2003. genetic characterization of a pentatricopeptide repeat protein gene, orf 687, that restores fertility in the cytoplasmic male sterile Kosena radish. Plant J. 34:407-415), Rf1 y Rf2 de sorgo (Sorghum bicolor) (Klein, R.R., Klein, P.E., Mullet, J.E., Minx, P., Rooney, W.L. y Schertz, K.F. 2005. Fertility restorer locus Rf1 of sorghum (Sorghum bicolor L.) encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in the collinear region of rice chromosome 12. Theor. A..l. Genet. 111:994-1012), Rf1a y Rf1b de arroz (Oryza sativa) para CMS de tipo BT (Kazama, T. y Toriyama, K. 2003. A pentatricopeptide repeat-containing gene that promotes the processing of aberrant atp6 RNA of cytoplasmic male-sterile rice. FEBs Lett.

544:99-102; Akagi, H., Nakamura, A., Yokozeki-Misono, Y., Inagaki, A., Takahashi, H., Mori, K. y Fujimura, T. 2004. Position cloning of the rice Rf-1 gene, a restorer of BT-type cytoplasmic male sterility that encodes a mitochondria-targeting PPR protein. Theor. Appl. Genet. 108:1449-1457; Komori, T., Ohta, /s., Murai, N., Takakura, Y., Kuraya, Y., Suzuki, S., Hiei, Y., Imaseki, H. y Nitta, N. 2004. Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf-1 in rice (Oryza sativa L.). Plant J.

37:315-325; y Wang, Z., Zou, Y., Li, X., Zhang, Q., Chen, L., Wu, H., Su, D., Chen, Y., Guo, J., Luo, D., Long, Y., Zhong, Y. y Liu, Y.G. 2006b. Cytoplasmic male sterility of rice with Boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing. Plant Cell 18:676-687), Rf17 (RMS) de arroz (Oryza sativa) para CMS de tipo CW (Fujii S. y Toriyama K. 2009. Suppressed expression of RETROGRADE-REGULATED MALE St ERILITY restores pollen fertility in cytoplasmic male sterile rice plants. PNAS 106:9513-9518), Rf1 y Rf2 de flor-mono (Mimulus guttatus) (Barr, C. M. y Fishman L. 2010. The Nuclear component of a cytonuclear hybrid incompatibility in Mimulus maps to a cluster of pentatricopeptide repeat genes. Genetics 184:455-465), Rf2 para CMS de tipo Lead Rice de arroz (Oryza sativa) (Itabashi, E., Iwata, N., Fujii, S., Kazama, T. y Toriyama, K. 2011. The Fertility restorer gene, Rf2 for lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein. The plant Journal (2011) 65:359-367), Rf5 para CMS de tipo Hong-Lian de arroz (Oryza sativa) (Hu, J., Wang, K., Huang, W., Liu, G., Wang, J., Huang, Q., Ji, Y., Qin, X., Wan, L., Zhu, R., Li, S., Yang, D. y Zhu, Y. 2012. The Rice Pentatricopeptide Repeat Protein Rf5 Restores Fertility in Hong-Lian Cytoplasmic Male-Sterile Lines via a Complex with the Glycine-Rich Protein GRP162. The plant cell advance online publication 2012) y Rf4 para CMS de tipo C de maíz (Zea mays) (Pub. de Patente de EE.UU. N° 2012/0090047 A1).

En otras realizaciones, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 comprende, además, una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En una realización posterior, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 1 y un polipéptido con un 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 tienen actividad de esterilidad masculina citoplasmática.

La expresión "porcentaje de identidad" (o "% de identidad"), como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, según se determina por la coincidencia entre cadenas de secuencias de este tipo. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero no limitados a los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Eds.) Humania: Nj (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

Técnicas para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos son conocidas en la técnica. Típicamente, técnicas de este tipo incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para un gen y/o determinar la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Las secuencias genómicas también pueden determinarse y compararse de esta manera. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótidos o aminoácidos) determinando su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas, dividido por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100. Véase Russell, R. y Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds," J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994), en la p. 337, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Además, métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los alineamientos de secuencias y los cálculos de porcentaje de identidad se pueden realizar, por ejemplo, utilizando el programa AlignX de la suite Vector NTI® (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el programa MegAlign™ de la suite informática bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza utilizando el "Método de alineamiento Clustal" que abarca varias variedades del algoritmo, incluyendo el "Método de alineamiento Clustal V" correspondiente al método de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ de la suite informática bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE BRECHA = 10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO = 10. Los parámetros predeterminados para los alineamientos por pares y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas utilizando el método Clustal son KTUP^l E = 1, PENALIZACIÓN DE BRECHA = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE = 2 , PENALIZACIÓN DE BRECHA = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias utilizando el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa. Además, el "Método de alineamiento Clustal W" está disponible y corresponde al método de alineamiento denominado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ v6.1 de la suite informática bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parámetros predeterminados para el alineamiento múltiple (PENALIZACIÓN DE BRECHA = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE BRECHA = 0,2, Retardo de Secuencias Divergentes (%) = 30, Peso de Transición de ADN = 0,5, Matriz de Peso de Proteína = Serie Gonnet, Matriz de Peso de ADN = IUB). Después del alineamiento de las secuencias utilizando el programa Clustal W, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa.

El experto en la técnica entiende bien que muchos niveles de identidad de secuencia son útiles para identificar polipéptidos, de otras especies, en los que polipéptidos de este tipo tienen la misma función o actividad o una similar. Ejemplos útiles de identidades porcentuales incluyen, pero no se limitan a: 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o cualquier porcentaje entero de 55 % a 100 % puede ser útil para describir realizaciones de la presente divulgación, tales como 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Fragmentos de ácido nucleico adecuados no solo tienen las homologías anteriores, sino que típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferiblemente al menos 100 aminoácidos, más preferiblemente al menos 150 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 200 aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos menos 250 aminoácidos.

La expresión "software de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que sea útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software de análisis de secuencias" puede estar disponible comercialmente o desarrollarse de forma independiente. El software típico de análisis de secuencias incluirá, pero no se limita a: 1.) la suite GCG de programas (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: Nueva York, NY). Dentro del contexto de esta solicitud, se entenderá que cuando se utiliza software de análisis de secuencias para el análisis, los resultados del análisis se basarán en los "valores predeterminados" del programa al que se hace referencia, a menos que se especifique lo contrario. Tal como se utiliza en esta memoria, "valores predeterminados" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el software cuando se inicializa por primera vez.

Cuando se hace referencia a las técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida puede utilizarse como una sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, colecciones genómicas o de ADNc) de una organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADN plasmídico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, fragmentos de ADN amplificados por PCR, oligonucleótidos u otros polinucleótidos, y pueden estar marcados con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Por lo tanto, por ejemplo, pueden fabricarse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en las secuencias de ADN de realizaciones de la divulgación. Métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de colecciones genómicas y de ADNc son generalmente conocidos en la técnica y se describen (Sambrook et al., 1989).

Las sondas de ácido nucleico y cebadores de las realizaciones de la presente divulgación se hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. Puede utilizarse cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de hibridarse específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en determinadas circunstancias. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente entre sí, si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de doble cadena anti-paralela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si las dos moléculas de ácido nucleico exhiben una complementariedad completa. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada uno de los nucleótidos de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Moléculas que exhiben complementariedad completa se hibridarán generalmente entre sí con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer asociadas entre sí en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Condiciones convencionales de alta rigurosidad se describen por Sambrook et al., 1989.

Se dice que dos moléculas exhiben "complementariedad mínima" si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer asociadas entre sí en condiciones al menos convencionales de "baja rigurosidad". Condiciones convencionales de baja rigurosidad se describen por Sambrook et al., 1989. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, solo necesita exhibir la complementariedad mínima de secuencia para ser capaz de formar una estructura estable de doble cadena. bajo las concentraciones particulares de disolvente y sal empleadas.

Factores que afectan a la rigurosidad de la hibridación son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a temperatura, pH, fuerza iónica y concentración de disolventes orgánicos, tales como, por ejemplo, formamida y dimetilsulfóxido. Como es conocido por los expertos en la técnica, la rigurosidad de la hibridación aumenta con temperaturas más altas, fuerza iónica más baja y concentraciones de disolvente más bajas.

La expresión "condición rigurosa" o "condiciones de rigurosidad" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana (es decir, a una secuencia de ácido nucleico particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico comentado en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55. Véase también, Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,5 M de iones de Na+, típicamente a una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na+ (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (p. ej., más de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1,0 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 % a 37 °C y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55 °C. Condiciones de rigurosidad moderada ilustrativas incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45 %, NaCl 1,0 M, SDS al 0,1 % a 37 °C y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55 a 60 °C. Condiciones ejemplares de alta rigurosidad incluyen la hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1,0 M, SDS al 0,1 % a 37 °C y un lavado en 0,1X SSC a 60 a 65 °C.

La especificidad es típicamente una función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación Tm = 81,5 °C+16,6 (logM)+0,41(% GC)-0,61(% form.)-500/L, en que M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases (Meinkoth y Wahl, 1984). La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desajuste; por lo tanto, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para las secuencias de la identidad deseada para hibridar. Por ejemplo, si se buscan secuencias con un 90 % de identidad, la Tm puede disminuirse 10 °C. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C por debajo del punto de fusión térmica (Tm); condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo del punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11 a 20 °C por debajo del punto de fusión térmica (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, el experto ordinario comprenderá que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado deseado de desajuste da como resultado una Tm inferior a 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder utilizar una temperatura más alta. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra (1997) en Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 2-40, Tercera Edic. (1997) y Sambrook et al. (1989).

En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona una célula que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. El término "célula", tal como se hace referencia en esta memoria, abarca un organismo vivo capaz de autorreplicarse, y puede ser una célula eucariota o procariota. En algunas realizaciones, la célula es una célula vegetal. En algunas realizaciones, la célula vegetal puede ser, pero no se limita a cualquier planta superior, incluyendo plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, y plantas consumibles, incluyendo plantas de cultivo y plantas utilizadas por sus aceites. Por lo tanto, cualquier especie vegetal o célula vegetal puede seleccionarse como se describe más adelante.

En algunas realizaciones, las células vegetales de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, cualquier planta superior, incluyendo las plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, y particularmente las plantas consumibles, incluyendo las plantas de cultivo. Plantas de este tipo pueden incluir, pero no se limitans, por ejemplo, a: alfalfa, soja, algodón, colza (también descrita como canola), linaza, maíz, arroz, Brachiaria, trigo, cártamo, sorgo, remolacha azucarera, girasoles, tabaco y césped. Por lo tanto, se puede seleccionar cualquier especie vegetal o célula vegetal. En realizaciones, las células vegetales utilizadas en esta memoria y las plantas cultivadas o derivadas de las mismas incluyen, pero no se limitan a células que se pueden obtener de colza (Brassica napus); mostaza india (Brassica júncea); mostaza etiópe (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repollo (Brassica oleracea); soja (Glycine max); lino/linaza (Linum usitatissimum); maíz (también descrito como grano) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girasol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; nuez de Brasil (Betholettia excelsa); ricino (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuete (Arachis hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); palma de aceite (Elaeis guineeis); olivo (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); calabaza (Cucurbita maxima); cebada (Hordeum vulgare); caña de azúcar (Saccharum officinarum); arroz (Oryza sativa); trigo (Triticum spp. Incluyendo Triticum durum y Triticum aestivum); y lenteja de agua (Lemnaceae sp.). En algunas realizaciones, los antecedentes genéticos dentro de una especie vegetal pueden variar.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona una semilla que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En realizaciones posteriores, se proporciona una semilla de maíz. Una semilla de maíz puede describirse o denominarse grano y se compone de cuatro partes estructurales: (1) el pericarpio, que es una cubierta exterior protectora (también conocida como salvado o cáscara); (2) el germen (también conocido como embrión); (3) el endospermo; y (4) la tapa de la punta, que es el punto de unión a la mazorca. Otro aspecto de la presente divulgación es una o más partes de la semilla de maíz, tales como el pericarpio de la semilla de maíz o el germen y/o el endospermo de la semilla de maíz que quedan después de retirar el pericarpio y los restos adheridos de la cubierta de la semilla.

La presente divulgación también se refiere a una o más partes de una planta de maíz de una línea de maíz rf3 o Rf3. Las partes de la planta de maíz incluyen células vegetales, protoplastos de plantas, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas de maíz, a Dn de plantas, callos de plantas, grupos de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, flores, semillas, granos, espigas, mazorcas, hojas, cáscaras, tallos, raíces, ápices de raíces, raíces ramificadas, ramas de panojas laterales, anteras, panojas, glumas, barbas, tallos y similares.

En realizaciones posteriores, la presente divulgación se refiere a una célula que comprende SEQ ID NO: 5. En otras realizaciones, la célula es una célula vegetal. Realizaciones adicionales incluyen una planta que comprende la célula vegetal. En algunas realizaciones, la planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea. En otras realizaciones, la planta monocotiledónea es una planta de maíz. Realizaciones adicionales incluyen una planta de maíz con citoplasma de tipo CMS-S. Realizaciones adicionales incluyen una parte de una planta, un tejido vegetal o una semilla de planta.

IV. Secuencias de Polinucleótidos que Codifican la Proteína Aislada

La presente divulgación proporciona, además, una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En una realización, la secuencia de ácido nucleico sintético que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1 es codificada por SEQ ID NO: 2. En realizaciones adicionales, la secuencia de ácido nucleico sintético que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 3 es codificada por SEQ ID NO: 4. En realizaciones posteriores, se proporciona una secuencia con una identidad de secuencia de 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 % o 99 % de SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2. En una realización, las secuencias de polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2 pueden incluir un casete de expresión génica, un vector, un plásmido, un cromosoma artificial bacteriano, un fragmento de ADN, un oligonucleótido, un cebador o una sonda.

En realizaciones adicionales, la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2 está enlazada operativamente a un promotor, en donde el promotor es funcional en plantas. En un aspecto de la realización, el promotor es un promotor de esterilidad masculina citoplasmática vegetal.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2 está enlazada operativamente a un promotor. El promotor utilizado para dirigir la expresión de un péptido que codifica un ácido nucleico depende de la aplicación particular. Por ejemplo, puede emplearse un cierto número de promotores que dirigen la expresión de un gen en una planta. Promotores de este tipo se pueden seleccionar de promotores constitutivos, regulados químicamente, inducibles, específicos para tejidos y preferidos por semillas.

La gama de promotores compatibles con plantas disponibles incluye promotores específicos para tejidos e inducibles. Un elemento regulador inducible es aquel que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que luego se convierte directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico, tal como una proteína, un metabolito, un regulador del crecimiento, un herbicida o un compuesto fenólico, o un estrés fisiológico impuesto directamente por el calor, el frío, la sal o elementos tóxicos, o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente de enfermedad tal como un virus. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que luego se convierte directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico, tal como una proteína, un metabolito, un regulador del crecimiento, un herbicida o un compuesto fenólico, o un estrés fisiológico impuesto directamente por el calor, el frío, la sal o elementos tóxicos, o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente de enfermedad tal como un virus. Una célula vegetal que contiene un elemento regulador inducible puede exponerse a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta, tal como mediante pulverización, riego, calentamiento o métodos similares. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico sintético que está operativamente enlazada a un promotor puede comprender, además, una secuencia codificante para un péptido de tránsito. Ejemplos de péptidos de tránsito son conocidos en la técnica e incluyen péptidos de tránsito que fijan como objetivo mitocondrias o cloroplastos.

Realizaciones posteriores de la presente divulgación se refieren a una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2. Realizaciones adicionales de la presente divulgación se refieren a una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 4. Realizaciones adicionales de la presente divulgación se refieren a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 2. Realizaciones adicionales de la presente divulgación se refieren a una célula que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona una célula que comprende cualquier realización previa de dicho vector.

En otras realizaciones, el vector comprende un plásmido. Un plásmido o vector puede describirse o denominarse como vectores procarióticos, vectores lanzadera, vectores de insectos o vectores eucarióticos. Típicamente, los plásmidos son elementos extracromosómicos, a menudo ADN circular, que se componen de un origen de replicación y un gen marcador seleccionable. A veces, puede ser preferible tener un plásmido que sea funcional en E. coli (p. ej., análisis de secuencias de ADN, construcción de insertos, obtención de cantidades de ácidos nucleicos). El plásmido particular se puede seleccionar con respecto al uso previsto (p. ej., expresión en plantas, animales, bacterias, hongos y protozoos). Los plásmidos de expresión estándares en bacterias, plantas y animales se conocen en la técnica y se describen en detalle, por ejemplo, en la Publicación de Patente de EE.Uu .20050064474A1 y las Publicaciones de Patente Internacional WO 05/084190, WO05/014791 y WO03/080809. Ejemplos de un plásmido incluyen un plásmido pUC19. pUC19 es un pequeño círculo de ADN de doble cadena. El plásmido contiene un origen de replicación de alto número de copias que es capaz de replicación bacteriana y contiene un sitio de clonación múltiple. Véase Yanisch-Perron, C., Vieira, J. y Messing, J. (1985). Gene. 33, 103-119. Otros plásmidos son conocidos y se utilizan comúnmente en la técnica. Por ejemplo, pUC18, pBR322, pBR325, pBR328, pACYC184, pAT153, pUC118 y pUC119 son plásmidos comúnmente conocidos en la técnica.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En una realización adicional, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 comprende, además, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En una realización posterior, el polipéptido aislado de SEQ ID NO: 5 y un polipéptido con un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7 tienen actividad citoplasmática de esterilidad masculina.

La presente divulgación proporciona, además, una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. En una realización, la secuencia de ácido nucleico sintético que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 5 es codificada por SEQ ID NO: 6. En realizaciones adicionales, la secuencia de ácido nucleico sintético que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 7 es codificada por SEQ ID NO: 8. En realizaciones posteriores, se proporciona una secuencia con una identidad de secuencia de 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 % o 99 % de SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones, un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8. En una realización, las secuencias de polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8 pueden incluir un casete de expresión génica, un vector, un plásmido, un cromosoma artificial bacteriano, un fragmento de ADN, un oligonucleótido, un cebador o una sonda.

En otras realizaciones, la presente divulgación se refiere se refiere a una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5. En realizaciones adicionales, la secuencia de ácido nucleico sintético tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8. En realizaciones adicionales, se proporciona un casete de expresión génica que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8. Realizaciones adicionales incluyen el casete de expresión génica que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8 enlazada operativamente a un promotor, en donde el promotor es funcional en plantas. En realizaciones adicionales, el promotor es un promotor de esterilidad masculina citoplasmática. Realizaciones adicionales incluyen una célula que comprende el casete de expresión génica que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8. Realizaciones adicionales de la presente divulgación se refieren a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona una célula que comprende dicho vector.

V. Introgresión de Alelos RF3 en Plantas de la Progenie

Una realización de la presente divulgación proporciona un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, comprendiendo el método las etapas de:

a) cruzar una planta parental femenina con una planta parental masculina, en donde la planta parental femenina es una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática homocigota para SEQ ID NO: 4, y en donde la planta parental masculina es una planta parental fértil;

b) cosechar una semilla de la progenie del cruce de (a), en donde la semilla de la progenie es homocigota para SEQ ID NO: 4;

c) plantar la semilla de la progenie; y,

d) hacer crecer la semilla de la progenie, en donde la semilla de la progenie produce la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, en donde la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie es homocigota para SEQ ID NO: 4.

En realizaciones adicionales, la presente divulgación se refiere a plantas parentales femeninas y masculinas que son plantas monocotiledóneas. En otras realizaciones, las plantas monocotiledóneas son plantas de maíz. En realizaciones adicionales, la planta parental masculina es isogénica a la planta parental femenina. En un aspecto de la realización, la planta parental masculina es homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8.

En aún otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos para producir plantas de la progenie, procedimientos que generalmente comprenden cruzar una primera planta de maíz parental con una segunda planta de maíz parental, en donde al menos una de la primera planta de maíz parental o la segunda planta de maíz parental es una planta con esterilidad masculina citoplasmática que tiene citoplasma de tipo CMS-S. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la planta masculina estéril citoplasmática es femenina y en otras realizaciones la planta restauradora masculina citoplasmática es masculina. Estos procedimientos pueden ejemplificarse adicionalmente como procedimientos para producir semillas o plantas de la progenie, en los que una primera planta de maíz se cruza con una segunda planta de maíz.

Cada vez que la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática se cruzan con otra endogamia de maíz diferente, se produce una progenie o una planta híbrida de maíz de primera generación (F1). Como tal, se puede producir una progenie o una planta de maíz híbrida F1 cruzando la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática con cualquier segunda planta de maíz endogámica. Por lo tanto, cualquier progenie o planta de maíz híbrida F¹ o semilla de maíz que se produzca con la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática como un parental es una realización de la presente divulgación.

Cuando la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática se cruza con otra planta endogámica para producir una progenie o un híbrido, el parental original puede servir como la planta materna o paterna con básicamente las mismas características en los híbridos. Ocasionalmente, las características heredadas por vía materna pueden expresarse de manera diferente dependiendo de la decisión de qué parental utilizar como parte femenina. Sin embargo, a menudo se prefiere una de las plantas parentales como planta materna debido al rendimiento incrementado de semillas y las características de producción preferidas, tales como el tamaño y la calidad óptimos de las semillas o la facilidad para eliminar la panoja. Algunas plantas producen vainas de espigas más apretadas, conduciendo a más pérdidas, por ejemplo, debido a la pudrición, o la vaina de la espiga puede estar tan apretada que la barba no puede salir por completo de la punta, lo que impide la polinización completa, dando como resultado un menor rendimiento de semillas. Puede haber retrasos en la formación de las barbas que afecten negativamente a la sincronización del ciclo reproductivo de un par de parentales endogámicos. Las características de la cubierta de la semilla pueden ser preferibles en una planta, lo que puede afectar la vida útil del producto de semilla híbrida. El polen puede desprenderse mejor de una planta, lo que convierte a esa planta en el parental masculino preferido.

En realizaciones de la presente divulgación, la primera etapa de "cruzar' la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática comprende plantar, preferiblemente en la proximidad de la polinización, semillas de una primera planta de maíz endogámica y una segunda planta de maíz endogámica distinta.

Una etapa adicional comprende cultivar o hacer crecer las semillas de la planta masculina estéril citoplasmática o la planta restauradora masculina citoplasmática que porta flores. Si las plantas parentales difieren en el momento de la madurez sexual, se pueden emplear técnicas para obtener una muesca adecuada, es decir, para asegurar la disponibilidad de polen de la planta de maíz parental designada masculina durante el tiempo en que las barbas de la planta de maíz parental designada femenina son receptivas al polen. Métodos que se pueden emplear para obtener la muesca deseada incluyen retrasar la floración de la planta de maduración más rápida, tal como, pero no limitado a retrasar la siembra de la semilla de maduración más rápida, cortar o quemar las hojas superiores de la planta de maduración más rápida (sin matar la planta) o acelerar la floración de la planta de maduración más lenta tal como cubriendo la planta de maduración más lenta con una película diseñada para acelerar la germinación y el crecimiento o cortando la punta de un brote de espiga joven para exponer la barba.

En una realización, la planta estéril masculina o la planta restauradora masculina citoplasmática se tratan con uno o más productos químicos agrícolas según lo considere apropiado el cultivador.

Una etapa adicional comprende recolectar las semillas, cerca de o en la madurez, de la espiga de la planta que recibió el polen. En una realización particular, la semilla se recolecta de la planta parental femenina y, cuando se desee, la semilla recolectada se puede cultivar para producir una progenie o una planta de maíz híbrida de primera generación (Fi).

Todavía otra etapa comprende secar y acondicionar las semillas, incluyendo el tratamiento, el calibrado (o la clasificación) de las semillas y el envasado para la venta a los cultivadores para la producción de grano o forraje. Al igual que con las semillas endogámicas, puede ser deseable tratar las semillas híbridas con composiciones que hagan que las semillas y las plántulas que crecen a partir de ellas sean más resistentes cuando se exponen a condiciones adversas. Debe mencionarse que la progenie resultante o la semilla híbrida puede venderse a los cultivadores para la producción de grano y forraje y no para la reproducción o producción de semilla.

Aún más, la presente divulgación proporciona una planta de maíz de la progenie producida cultivando las semillas recolectadas producidas en la planta con esterilidad masculina citoplasmática o restauradora, así como el grano producido por la planta de maíz de la progenie.

En una realización posterior, la divulgación se refiere a introducir un rasgo deseado en la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En un aspecto de la realización, el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste en un rasgo de resistencia a insecticidas, rasgo de tolerancia a herbicidas, rasgo de resistencia a enfermedades, rasgo de aumento de rendimiento, rasgo de calidad nutricional, rasgo de aumento agronómico y combinaciones de los mismos. Otros ejemplos de un rasgo deseado incluyen el metabolismo de ácidos grasos modificado, por ejemplo, mediante la transformación de una planta con un gen antisentido de estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624 (1992). Disminución del contenido de fitato: (i) la introducción de un gen codificador de fitasa potenciaría la descomposición del fitato, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase, Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993), para una divulgación de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger. (ii) Podría introducirse un gen que reduzca el contenido de fitato. En el maíz, esto podría lograrse, por ejemplo, clonando y luego reintroduciendo el ADN asociado con el alelo único que es el responsable de los mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico. Véase Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990). (iii) Composición de hidratos de carbono modificada realizada, por ejemplo, transformando plantas con un gen que codifica una enzima que altera el patrón de ramificación del almidón. Véase Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (secuencia de nucleótidos del gen de la fructosiltransferasa de Streptococcus mutans), Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) (secuencia de nucleótidos del gen levansacarasa de Bacillus subtillus), Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992) (producción de plantas transgénicas que expresan a-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993) (secuencias de nucleótidos de genes de invertasa de tomate), Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) (mutagénesis dirigida al sitio del gen de la a-amilasa de cebada) y Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (enzima ramificadora de almidón de endospermo de maíz II). Ejemplos adicionales de características potencialmente deseadas incluyen mayor rendimiento, mejores tallos, mejores raíces, tiempo reducido para la madurez del cultivo, mejor calidad agronómica, mayor valor nutricional, mayor capacidad de extracción o fermentación del almidón, resistencia y/o tolerancia a insecticidas, herbicidas, plagas, calor y sequía, y enfermedad, y uniformidad en los tiempos de germinación, establecimiento de rodales, tasa de crecimiento, madurez y tamaño del grano.

En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un método para producir una planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie, comprendiendo el método, además, las etapas de:

e) cruzar la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie con otra planta que comprende un rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1;

f) seleccionar plantas de la progenie F1 que tengan el rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1 seleccionadas;

g) cruzar las plantas de la progenie F1 seleccionadas con la planta de la progenie con esterilidad masculina citoplasmática para producir plantas de la progenie retrocruzadas;

h) seleccionar plantas de la progenie retrocruzadas que tengan el rasgo deseado; e

i) repetir las etapas (g) y (h) tres o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas de la progenie del cuarto retrocruzamiento o superior que comprendan el rasgo deseado.

Se pueden utilizar diversos esquemas de reproducción para producir plantas de la progenie. En un método, al que generalmente se alude como método de pedigrí, el parental puede cruzarse con otra planta diferente tal como una segunda planta de maíz progenitora endogámica, que exhibe una o más características deseables seleccionadas o imparte características deseables seleccionadas a una combinación híbrida. Si las dos plantas de maíz parentales originales no proporcionan todas las características deseadas, entonces se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. Las plantas de la progenie, es decir, líneas endogámicas homocigotas de reproducción pura, también se pueden utilizar como materiales de partida para la reproducción o poblaciones fuente a partir de las cuales desarrollar plantas de la progenie.

A partir de entonces, la semilla resultante se recolecta y las plantas resultantes de la progenie superior se seleccionan y se autofecundan o aparean entre hermanos en generaciones sucesivas tal como durante aproximadamente 5 a aproximadamente 7 o más generaciones, hasta que se produce una generación que ya no se segrega sustancialmente por todos los factores por los cuales los parentales endogámicos difieren, proporcionando con ello una gran cantidad de líneas endogámicas distintas y puras.

En otra realización para generar plantas de la progenie, a la que generalmente se alude como retrocruzamiento, se pueden introducir uno o más rasgos deseados en el parental con esterilidad masculina citoplasmática o en el parental fértil restaurado al cruzar las plantas parentales con otra planta de maíz (a la que se alude como donante o parental no recurrente) que porta el o los genes que codifican el o los rasgos particulares de interés para producir plantas de la progenie F¹. Tanto los alelos dominantes como los recesivos pueden transferirse mediante retrocruzamiento. La planta donante también puede ser endogámica, pero en el sentido más amplio puede ser un miembro de cualquier variedad vegetal o población fértil cruzada con el parental recurrente. A continuación, se seleccionan las plantas de la progenie F¹ que tienen el rasgo deseado. Luego, las plantas de la progenie seleccionadas se cruzan con el parental con esterilidad masculina citoplasmática o con el parental fértil restaurado para producir plantas de la progenie de retrocruzamiento. A continuación, se seleccionan las plantas de la progenie de retrocruzamiento que comprenden el rasgo deseado y las características fisiológicas y morfológicas del parental con esterilidad masculina citoplasmática o del parental fértil restaurado. Este ciclo se repite durante aproximadamente uno a aproximadamente ocho ciclos, preferiblemente durante aproximadamente 3 o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas de la progenie de retrocruzamiento superior que comprenden el rasgo deseado y todas las características fisiológicas y morfológicas del parental con esterilidad masculina citoplasmática o parental fértil restaurado cuando se cultiva en las mismas condiciones ambientales. Rasgo(s) deseado(s) ejemplar(es) incluye(n) resistencia a insectos, calidad nutricional mejorada, almidón ceroso, resistencia a herbicidas, estabilidad del rendimiento, mejora del rendimiento y resistencia a enfermedades bacterianas, fúngicas y virales. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica del fitomejoramiento apreciaría que un obtentor utilice diversos métodos para ayudar a determinar qué plantas deben seleccionarse de las poblaciones segregantes y, en última instancia, qué líneas endogámicas se utilizarán para desarrollar híbridos para la comercialización. Además del conocimiento del germoplasma y otras habilidades que utiliza el obtentor, una parte del proceso de selección depende del diseño experimental junto con el uso del análisis estadístico. El diseño experimental y el análisis estadístico se utilizan para ayudar a determinar qué plantas, qué familia de plantas y, finalmente, qué líneas endogámicas y combinaciones de híbridos son significativamente mejores o diferentes para uno o más rasgos de interés. Métodos de diseño experimental se utilizan para evaluar el error de modo que las diferencias entre dos líneas endogámicas o dos líneas híbridas puedan determinarse con mayor precisión. El análisis estadístico incluye el cálculo de los valores medios, la determinación de la significancia estadística de las fuentes de variación y el cálculo de los componentes de varianza apropiados. Habitualmente se utiliza un nivel de significancia del cinco o del uno por ciento para determinar si una diferencia que ocurre para un rasgo dado es real o se debe al entorno o a un error experimental. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica del fitomejoramiento sabría cómo evaluar los rasgos de dos variedades vegetales para determinar si no hay una diferencia significativa entre los dos rasgos expresados por esas variedades. Por ejemplo, véase Fehr, Walt, Principles of Cultivar Development, p. 261-286 (1987) que se incorpora en esta memoria como referencia. Los valores medios de los rasgos se pueden utilizar para determinar si las diferencias de los rasgos son significativas y, preferiblemente, las características se miden en plantas cultivadas en las mismas condiciones ambientales.

Este método da como resultado la generación de plantas endogámicas de la progenie con sustancialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del parental recurrente y el(los) rasgo(s) particular(es) transferido(s) de interés. Debido a que plantas endogámicas de la progenie de este tipo son heterocigóticas para los loci que controlan el rasgo o los rasgos transferidos de interés, la última generación de retrocruzamiento se autofecundaría posteriormente para proporcionar una progenie de mejoramiento pura para el rasgo o los rasgos transferidos.

El retrocruzamiento puede acelerarse mediante el uso de marcadores genéticos, tales como los marcadores SSR, RFLP, SNP o AFLP para identificar plantas con el mayor complemento genético del parental recurrente.

La selección directa se puede aplicar cuando un solo locus actúa como un rasgo dominante tal como el rasgo de resistencia a los herbicidas. Para este proceso de selección, la progenie del cruce inicial se rocía con el herbicida antes del retrocruzamiento. El rociado elimina cualquier planta que no tenga la característica de resistencia a herbicidas deseada, y solo aquellas plantas que tengan el gen de resistencia a herbicidas se utilizan en el retrocruzamiento posterior. En el caso de que la característica que se transfiere sea un alelo recesivo, puede ser necesario introducir un test de la progenie para determinar si la característica deseada se ha transferido con éxito. El proceso de selección, ya sea directo o indirecto, se repite luego para todas las generaciones de retrocruzamiento adicionales.

Los expertos ordinarios en la técnica deberían apreciar que el retrocruzamiento se puede combinar con el mejoramiento genealógico, ya que en los casos en los que el parental con esterilidad masculina citoplasmática o el parental fértil restaurado se cruza con otra planta de maíz, la progenie resultante se vuelve a cruzar con el parental con esterilidad masculina citoplasmática o parental fértil restaurado y, posteriormente, la progenie resultante de este retrocruzamiento único se cruza posteriormente para desarrollar nuevas líneas endogámicas. Esta combinación de retrocruzamiento y mejoramiento genealógico es útil cuando se desea recuperar menos de todas las características del parental con esterilidad masculina citoplasmática o del parental fértil restaurado que las que se obtendrían mediante un retrocruzamiento convencional.

En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un método para restaurar la fertilidad a una progenie de una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método:

a) cruzar una planta parental femenina con una planta parental masculina, en donde la planta parental femenina es una planta parental con esterilidad masculina citoplasmática homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8, y en donde la planta parental masculina es una planta parental fértil;

b) cosechar una semilla de la progenie del cruce de (a), en donde la semilla de la progenie es homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8;

c) plantar la semilla de la progenie;

d) hacer crecer la semilla de la progenie, en donde la semilla de la progenie produce una planta fértil masculina citoplasmática de la progenie; y

e) restaurar la fertilidad a la progenie de la planta parental con esterilidad masculina citoplasmática, en donde la planta con fertilidad masculina citoplasmática de la progenie es homocigota o heterocigota para SEQ ID N0: 8.

Realizaciones adicionales del método incluyen

f) cruzar la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie con otra planta que comprende un rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1;

g) seleccionar plantas de la progenie F1 que tengan el rasgo deseado para producir plantas de la progenie F1 seleccionadas;

h) cruzar las plantas de la progenie F1 seleccionadas con la planta de la progenie con esterilidad masculina citoplasmática para producir plantas de la progenie retrocruzadas;

i) seleccionar plantas de la progenie retrocruzadas que tengan el rasgo deseado; y

j) repetir las etapas (h) e (i) tres o más veces en sucesión para producir plantas seleccionadas de la progenie del cuarto retrocruzamiento o superior que comprendan el rasgo deseado.

En realizaciones adicionales, la presente divulgación se refiere a plantas parentales femeninas y masculinas que son plantas monocotiledóneas. En otras realizaciones, las plantas monocotiledóneas son plantas de maíz. En realizaciones adicionales, la planta parental masculina es isogénica a la planta parental femenina. En un aspecto de la realización, la planta parental masculina es homocigota o heterocigota para SEQ ID NO: 8. En una realización posterior, la divulgación se refiere a introducir un rasgo deseado en la planta con esterilidad masculina citoplasmática de la progenie. En un aspecto de la realización, el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste en un rasgo de resistencia a insecticidas, rasgo de tolerancia a herbicidas, rasgo de resistencia a enfermedades, rasgo de aumento de rendimiento, rasgo de calidad nutricional, rasgo de aumento agronómico y combinaciones de los mismos.

VI. Ensayos para la Detección de los Alelos Rf3 y rf3

Pueden emplearse diversos ensayos para detectar los polinucleótidos que codifican los alelos Rf3 y rf3 que se describen en determinadas realizaciones de la divulgación. Las siguientes técnicas son útiles en una diversidad de situaciones y, en una realización, son útiles para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico y/o el polipéptido que codifica un alelo Rf3 o rf3 en una célula vegetal. Por ejemplo, la presencia de la molécula se puede determinar de diversas formas, incluyendo el uso de un cebador o una sonda de la secuencia, un ensayo ELISA para detectar la proteína codificada, una transferencia Western para detectar la proteína o una transferencia Northern o Southern para detectar ARN o ADN. Pueden emplearse ensayos enzimáticos para detectar los polinucleótidos que codifican el alelo Rf3 y rf3. Además, se puede generar un anticuerpo que puede detectar la presencia de la proteína Rf3 o rf3 utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. También pueden utilizarse técnicas adicionales, tales como hibridación in situ, tinción enzimática e inmunotinción, para detectar la presencia o expresión de los polinucleótidos que codifican los alelos Rf3 y rf3 en órganos y tejidos vegetales específicos. Los polinucleótidos que codifican los alelos Rf3 y rf3 pueden expresarse selectivamente en algunos tejidos de la planta o en algunas fases de desarrollo, o los polinucleótidos que codifican los alelos Rf3 y rf3 pueden expresarse sustancialmente en todos los tejidos de la planta, sustancialmente a lo largo de todo su ciclo de vida. Sin embargo, también es aplicable cualquier modo de expresión combinatoria.

En una realización, la divulgación se refiere al método de detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática a través de una reacción de amplificación en la que se genera un producto amplificado o amplicón. La detección de la ausencia del amplicón es una indicación de si la planta contiene un alelo Rf3 o rf3 de secuencia génica, respectivamente.

Pueden emplearse diversos ensayos en relación con la reacción de amplificación y se consideran realizaciones de la divulgación. Las siguientes técnicas son útiles en una diversidad de situaciones y, en una realización, son útiles para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico y/o el polipéptido codificado en una célula vegetal. Por ejemplo, la presencia de la molécula se puede determinar de diversas formas, incluyendo el uso de un cebador o una sonda de la secuencia. Los alelos Rf3 o rf3 pueden expresarse selectivamente en algunos tejidos de la planta o en algunas fases de desarrollo, o los alelos Rf3 o rf3 pueden expresarse sustancialmente en todos los tejidos de la planta, sustancialmente a lo largo de todo el ciclo de vida de la planta. Sin embargo, también es aplicable cualquier modo de expresión combinatoria.

La amplificación de una secuencia de ácido nucleico se puede llevar a cabo por cualquier medio adecuado. Véase, en general, Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Ejemplos de técnicas de amplificación adecuadas incluyen, pero no se limitan a reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena (véase generalmente G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)), amplificación basada en la transcripción (véase, D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), replicación de secuencia autosostenida (o "3SR") (véase, J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), el sistema de replicasa Qp (véase, P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (o "NASBA", por sus siglas en inglés) (véase, R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), la reacción en cadena de reparación (o "RCR", por sus siglas en inglés) (véase, R. Lewis, supra) y amplificación de ADN boomerang (o "BDA", por sus siglas en inglés) (véase, R. Lewis, supra). Generalmente se prefiere la reacción en cadena de la polimerasa.

La "amplificación" es un caso especial de replicación de ácidos nucleicos que implica especificidad para el molde. Debe contrastarse con la replicación del molde no específica (es decir, la replicación que depende del molde, pero no depende de un molde específico). La especificidad para el molde se distingue aquí de la fidelidad de la replicación (es decir, la síntesis de la secuencia de polinucleótidos adecuada) y la especificidad para los nucleótidos (ribo o desoxirribo). La especificidad del molde se describe frecuentemente en términos de especificidad de "diana". Las secuencias diana son "dianas" en el sentido de que se busca separarlos de otros ácidos nucleicos. Las técnicas de amplificación se diseñaron principalmente para esta clasificación.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "reacción en cadena de la polimerasa" y "PCR" se refiere generalmente al método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación (Pat. de EE.UU. N°s 4.683.195; 4.683.202; y 4.965.188; incorporadas en esta memoria como referencia). Este proceso de amplificación de la secuencia diana comprende la introducción de un exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclación térmica en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia diana de doble cadena. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se reasocian luego con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después de la reasociación, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, reasociación del cebador y extensión con polimerasa se pueden repetir muchas veces (es decir, la desnaturalización, la reasociación y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del procedimiento, al método se le alude como "reacción en cadena de la polimerasa" (en lo sucesivo, "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificados por PCR".

El término "pluralidad" se utiliza en esta memoria para referirse a dos o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco o más, incluyendo diez, veinte, cincuenta o más polinucleótidos, sondas de ácido nucleico y similares.

La expresión "transcriptasa inversa" o "RT-PCR" (por sus siglas en inglés) se refiere a un tipo de PCR en el que el material de partida es ARNm. El ARNm inicial se convierte enzimáticamente en ADN complementario o "ADNc" utilizando una enzima transcriptasa inversa. El ADNc se utiliza luego como un "molde" para una reacción "PCR".

En una realización, se cuantifica la reacción de amplificación. En otras realizaciones, la reacción de amplificación se cuantifica utilizando un perfil de firma, en el que el perfil de firma se selecciona del grupo que consiste en una temperatura de fusión o un perfil de firma de fluorescencia. En realizaciones adicionales, la reacción de amplificación se cuantifica mediante el método Delta Delta ct.

Los polinucleótidos que codifican los genes Rf3 y rf3, o segmentos de los mismos, pueden utilizarse como cebadores para la amplificación por PCR. Al realizar la amplificación por PCR, se puede tolerar cierto grado de desajuste entre el cebador y el molde. Por lo tanto, las mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente las adiciones de nucleótidos al extremo 5') de los cebadores ejemplificados caen dentro del alcance de la presente divulgación. Se pueden producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador dado mediante métodos conocidos por un experto ordinario en la materia.

Otro ejemplo de método de detección es la técnica de pirosecuenciación descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que se solapa al ADN genómico adyacente y se inserta en la unión del ADN. El oligonucleótido se hibrida con el producto PCR de cadena sencilla de la región de interés y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Los DNTPs se añaden individualmente y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia del inserto del transgén/secuencia flanqueante debido a una amplificación, hibridación y extensión de base única o múltiple con éxito (esta técnica se utiliza para la secuenciación inicial, no para la detección de un gen específico cuando se conoce).

Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencias. En síntesis, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que se solapa a la unión de ADN genómico y de inserción flanqueante. La estructura única de la sonda FRET resulta en que contenga una estructura secundaria que mantiene los restos fluorescentes y de extinción muy próximos. La sonda FRET y los cebadores de PCR se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Después de una amplificación por PCR con éxito, la hibridación de la(s) sonda(s) FREt con la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de extinción. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto genómico/transgénico flanqueante debido a una amplificación e hibridación realizadas con éxito.

El ensayo de sonda de hidrólisis, también conocido como Taqman® (Life Technologies, Foster City, Calif.), es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. En síntesis, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET con un oligo dentro del transgén y otro en la secuencia genómica flanqueante para la detección específica de eventos. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la escisión y la liberación del resto fluorescente lejos del resto de extinción en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto flanqueante/transgénico debido a una amplificación e hibridación realizadas con éxito.

El ELISA o inmunoensayo ligado a enzimas se conoce desde 1971. En general, los antígenos solubilizados en un tampón se recubren sobre una superficie de plástico. Cuando se añade suero, los anticuerpos pueden adherirse al antígeno en la fase sólida. La presencia o ausencia de estos anticuerpos puede demostrarse cuando se conjugan con una enzima. La adición del sustrato apropiado detectará la cantidad de conjugado unido que se puede cuantificar. Un ensayo ELISA común es el que utiliza anticuerpos policlonales anti-(proteína) biotinilados y un conjugado de fosfatasa alcalina. Por ejemplo, un ELISA utilizado para la determinación cuantitativa de los niveles de lacasa puede ser un ensayo sándwich de anticuerpos, que utiliza anticuerpos policlonales de conejo obtenidos comercialmente. El anticuerpo se conjuga con fosfatasas alcalinas para su detección. En otro ejemplo, un ensayo ELISA para detectar tripsina o tripsinógeno utiliza anticuerpos policlonales anti-tripsina o anti-tripsinógeno biotinilados y un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.

Los ensayos KASPar® son un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. En síntesis, la muestra de ADN genómico que comprende el locus genómico fijado como objetivo se detecta utilizando un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocido como sistema de ensayo KASPar®. El ensayo KASPar® utilizado en la práctica de la presente divulgación puede utilizar una mezcla de ensayo KASPar® PCR que contiene múltiples cebadores. Los cebadores utilizados en la mezcla de ensayo de PCR pueden comprender al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso. El cebador directo contiene una secuencia correspondiente a una región específica de la secuencia polinucleotídica de ADN, y el cebador inverso contiene una secuencia correspondiente a una región específica de una segunda secuencia polinucleotídica de ADN. Además, los cebadores utilizados en la mezcla de ensayo de PCR pueden comprender al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso. Por ejemplo, la mezcla de ensayo KASPar® PCR puede utilizar dos cebadores directos correspondientes a dos alelos diferentes y un cebador inverso. Uno de los cebadores directos contiene una secuencia correspondiente a una región específica de la secuencia genómica endógena. El segundo cebador directo contiene una secuencia correspondiente a una región específica del polinucleótido de ADN donante. El cebador inverso contiene una secuencia correspondiente a una región específica de la secuencia genómica. Un ensayo KASPar® de este tipo para la detección de una reacción de amplificación es una realización de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la señal fluorescente o el colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente HEX, un colorante fluorescente FAM, un colorante fluorescente JOE, un colorante fluorescente TET, un colorante fluorescente Cy 3, un colorante fluorescente Cy 3.5, un colorante fluorescente Cy 5, un colorante fluorescente Cy 5.5, un colorante fluorescente Cy 7 y un colorante fluorescente ROX.

En otras realizaciones, el colorante inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un colorante inhibidor Dabcyl, un colorante inhibidor Tamra, un colorante inhibidor Qxl, un colorante inhibidor Iowa Black FQ, un colorante inhibidor Iowa Black RQ, un colorante inhibidor IR Dye QC-1, un colorante inhibidor MGB o un colorante inhibidor Blackhole.

En otras realizaciones, la reacción de amplificación se lleva a cabo utilizando segundos colorantes de ADN fluorescentes adecuados que son capaces de teñir el ADN celular en un intervalo de concentraciones detectable por citometría de flujo y tienen un espectro de emisión fluorescente que es detectable por un termociclador en tiempo real. Los expertos ordinarios en la técnica deberían apreciar que se conocen otros colorantes de ácido nucleico y que se identifican continuamente. Se puede emplear cualquier colorante de ácido nucleico adecuado con espectros de excitación y emisión adecuados, tales como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® y TOTO®, en una realización, un segundo colorante de ADN fluorescente es SYTO13® utilizado a menos de 10 μM, menos de 4 μM o menos de 2,7 μM.

En diversas realizaciones, se realizan otros métodos de detección conocidos para detectar los alelos Rf3 o rf3.

El análisis de Southern es un método de detección de uso común, en el que el ADN se corta con endonucleasas de restricción y se fracciona en un gel de agarosa para separar el ADN por peso molecular y luego se transfiere a membranas de nailon. Luego se hibrida con el fragmento de la sonda que se marcó radiactivamente con 32P (u otros marcadores de sonda) y se lavó en una solución de SDS.

El análisis Northern implementa un protocolo similar, en el que el ARN se corta con endonucleasas de restricción y se fracciona en un gel de agarosa para separar el ARN por peso molecular y luego se transfiere a membranas de nailon. Luego se hibrida con el fragmento de la sonda que se marcó radiactivamente con 32P (u otros marcadores de sonda) y se lavó en una solución de SDS. El análisis del ARN (p. ej., ARNm) aislado de los tejidos de interés puede indicar niveles de expresión relativos. Típicamente, si el ARNm está presente o la cantidad de ARNm ha aumentado, se puede asumir que se está expresando el transgén correspondiente. El análisis Northern, u otros protocolos analíticos de ARNm, se pueden utilizar para determinar los niveles de expresión de un transgén introducido o un gen nativo.

En el análisis Western, en lugar de aislar el ADN/ARN, la proteína de interés se extrae y se coloca en un gel de acrilamida. Luego, la proteína se transfiere a una membrana y se pone en contacto con una sustancia marcadora. Véase, p. ej., Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997); Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications" Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "T ransfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proc Natl Acad Sci USA 76(7): 3116-3120.

Realizaciones de la presente divulgación se ejemplifican adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos Ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración. A partir de las realizaciones anteriores y los siguientes Ejemplos, un experto en la materia puede determinar las características esenciales de esta divulgación y puede realizar diversos cambios y modificaciones de las realizaciones de la divulgación para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de las realizaciones de la divulgación, además de las mostradas y descritas en esta memoria, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Lo siguiente se proporciona a modo de ilustración.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Desarrollo de una Población de Retrocruzamiento 1 para el Mapeo y la Resolución Precisa de los Alelos Rf3

Se produjo una población de retrocruzamiento 1 (BC1) y se utilizó a través del análisis del mapa de enlace con marcadores moleculares desarrollados para mapear la secuencia codificante de Rf3. La población de mapeo se creó cruzando una línea estéril masculina citoplasmática de maíz, Zea mays c.v. 4XP811 (Patente de EE.UU. N° 7.135.629; que contenía alelos rf3 recesivos homocigóticos) con una línea restauradora de maíz Zea mays c.v. MBB56 (que contenía al menos un alelo Rf3 dominante), y luego retrocruzando la progenie con la línea estéril masculina citoplasmática de maíz, Zea mays c.v. 4XP811. La población resultante de la progenie de maíz contenía 275 individuos con diversos grados de cigosidad para los alelos Rf3 (dominante) y rf3 (recesivo).

Las plantas de maíz resultantes se clasificaron fenotípicamente de acuerdo con dos métodos. El primer método implicó la observación del desprendimiento de polen de las plantas de maíz en el campo. Se observaron plantas fértiles para el crecimiento y desarrollo de anteras que estaban físicamente expuestas antes del desarrollo de la barba y el inicio del desprendimiento de polen. Se observaron plantas estériles masculinas citoplasmáticas para el retraso en el crecimiento y desarrollo de las anteras. A la mitad del desarrollo de las barbas (p. ej., alrededor de 7 días después de que las barbas comienzan a desarrollarse) las anteras no estaban expuestas físicamente.

El segundo método implicó la determinación de la vitalidad del grano de polen mediante el uso de tinción con KI-I² al 1 %. Cuando el polen de las plantas fértiles se tiñó con una tinción de KI-I², el polen absorbió la tinción de KI-I² , dando con ello como resultado un polen teñido uniformemente. Es bien sabido que el polen de las plantas fértiles está lleno de almidón al que se adhiere la tinción de KI-I². Cuando se tiñó el polen de plantas con esterilidad masculina citoplasmática, el polen no absorbió la tinción con KI-I² , dando como resultado polen sin teñir. El polen de las plantas con esterilidad masculina citoplasmática contiene polen colapsado que contiene bajos niveles de almidón, y la tinción de KI-I² no puede unirse a las cantidades mínimas de almidón presentes en el polen. La Tabla 1 proporciona la información de segregación detallada de la población de mapeo BC1.

Tabla 1: Datos de fenotipo de la población de mapeo BC1.

Los datos resultantes indicaron que la segregación de fertilidad de la población BC1 se ajustaba a una relación teórica 1: 1 de plantas fértiles: plantas estériles utilizando el modelo de segregación de un gen (X2 = 1,39 [a (0,05) = 3,84]). Los datos sugirieron, además, que el germoplasma de la línea MBB56 portaba un gen restaurador, Rf3, y el germoplasma de 4XP811 era homocigoto para el gen rf3.

Ejemplo 2: Mapeo del Genoma Asistido por Marcadores de RF3

Las poblaciones de BC1 se detectaron con marcadores moleculares para identificar el locus correspondiente al alelo RF3 a alta resolución. Se seleccionó un panel de 482 marcadores SNP (distribuidos uniformemente por todo el genoma) para genotipar la población de mapeo BC1. A partir de este ensayo, se utilizaron 437 marcadores SNP (incluyendo cuatro marcadores basados en PCR de PPR2, 432 marcadores basados en SNP de todo el genoma y un marcador basado en el fenotipo estéril-fértil de la población de mapeo BC1) para crear un enlace genético con el software JoinMap 4.0™ (Van Ooijen JW: JoinMap 4. Software para el cálculo de mapas de enlace genético en poblaciones experimentales Kyazma BV. Países Bajos: Wageningen; 2006). Utilizando el mapa de enlace genético, los datos fenotípicos y los datos genotípicos, se realizó un análisis de QTL de genoma completo utilizando el software Map QTL 6.0™ (Van Ooijen JW: MapQTL 6. Wageningen, Países Bajos: Software para el mapeo de loci de rasgos cuantitativos en poblaciones experimentales de especies diploides Kyazma BV; 2009). Los resultados demostraron que todos los marcadores específicos para el gen PPR2 se co-segregaron con el locus RF3. Se determinó que la ubicación genómica del locus RF3 se encontraba en el cromosoma 2 en un intervalo genómico de 1,3 Mb del genoma del maíz (véase la Figura 1).

Ejemplo 3: Secuenciación del Genoma Completo para Identificar la Secuencia del Gen RF3

Para identificar adicionalmente la secuencia del gen restaurador Rf3 específico y la secuencia del gen de la modificación rf3 que da como resultado la esterilidad masculina citoplasmática, se utilizó la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés) para investigar adicionalmente el locus Rf3. Las secuencias genómicas de dos líneas CMS-S de maíz y dos líneas restauradoras de maíz se determinaron utilizando la secuenciación NGS. Las dos líneas CMS-S (4XP811 y 7SH382ms) y las dos líneas restauradoras (LH60 y MBB56) se utilizaron para el análisis de secuenciación del genoma completo.

Se identificaron un total de 10 genes PPR (anotados secuencialmente como PPR 1-10) en el cromosoma 2 dentro de un intervalo genómico de 1,3 Mb después de comparar las regiones genómicas secuenciadas con la secuencia anotada del genoma de referencia de Zea mays c.v. B73 (disponible en www.maizegdb.org). No existía una secuencia codificante de longitud completa que se corresponda con PPR2 en el genoma anotado de Zea mays c.v. B73 y no podía predecirse como un gen funcional de longitud completa. Como resultado, la secuencia completa del gen de p PR2 se obtuvo a partir de una comparación de la secuencia con el genoma de referencia de Zea mays c.v. Mo17 (disponible en www.maizegdb.org). Las secuencias resultantes para los 10 genes PPR (PPR2 tenía dos secuencias, la primera secuencia de la línea Zea mays c.v. B73 y la segunda secuencia de la línea Zea mays c.v. Mo17) se ensamblaron para obtener información de la secuencia de referencia basada en datos de secuenciación del genoma completo de las dos líneas CMS-S y dos líneas de restaurador.

A continuación, las secuencias se alinearon entre las líneas CMS-S, las líneas de restaurador y las secuencias genómicas de referencia para todos los genes PPR. La predicción de la secuencia codificante (p. ej., ADNc en donde se eliminaron las secuencias de intrones) de las secuencias genómicas de PPR se completó utilizando el software Softberry™ (Softberry Inc., Mount Kisco, NY), y se obtuvieron y alinearon las secuencias de ADNc predichas y de proteínas correspondientes. Las variaciones de la secuencia genómica se identificaron a partir de las secuencias genómicas alineadas de los genes PPR y se anotaron. Cuando las secuencias de ADNc y proteínas se alinearon entre líneas CMS-S y de restaurador con secuencias de referencia, se observó que la mayoría de las variaciones dentro de las secuencias de PPR2 resultaron en mutaciones silenciosas (véanse la Figura 2 y la Figura 3). Se identificaron variaciones en las secuencias de PPR2 que resultaron en modificaciones de residuos de aminoácidos y se desarrollaron ensayos de RT-PCR para detectar y amplificar estas modificaciones (p. ej., mutaciones).

Los resultados del mapeo de enlace genético y NGS indicaron que el alelo Rf3 y el subsiguiente fenotipo CMS fueron el resultado de un solo gen ubicado en el cromosoma 2. Como la mayoría de los genes Rf clonados, lo más probable es que Rf3 sea un gen PPR. Se identificó que el gen restaurador Rf3-PPR de Zea mays c.v. LH60 (SEQ ID NO: 8) estaba presente en fenotipos de plantas fértiles restauradoras y codifica una proteína de 814 aminoácidos (SEQ ID NO: 7). Además, se identificó que un fragmento de polinucleótido parcial del gen restaurador Rf3-PPR de Zea mays c.v. MBB56 (SEQ ID NO: 12) estaba presente en fenotipos de plantas fértiles restauradoras y codifica el fragmento de proteína de aminoácido (SEQ ID NO: 11). Se encontró que un motivo de aminoácido, SEQ ID NO: 5 (IVLFSS), que es codificado por SEQ ID NO: 6 (5'-ATTGTTTTATTCAGT-3'), era común para ambos genes Rf3-PPR de tipo salvaje de Zea mays c.v. LH60 y Zea mays c.v. MBB56.

Se identificó que el gen rf3-PPR citoplasmático estéril masculino mutado de Zea mays c.v. 4XP811 (SEQ ID NO: 4) estaba presente en fenotipos de plantas citoplasmáticas masculinas estériles y codifica una proteína de 814 aminoácidos (SEQ ID NO: 3). Además, se identificó que un gen rf3-PPR citoplasmático masculino estéril de Zea mays c.v. 7SH382ms (SEQ ID NO: 10) estaba presente en fenotipos de plantas citoplasmáticas masculinas estériles y codifica una proteína de 814 aminoácidos (SEQ ID NO: 9). Se encontró que un motivo de aminoácido, SEQ ID NO: 1 (IVFFSS), que es codificado por SEQ ID NO: 2 (5'-ATTGTTTTCTTCAGT-3'), era común para ambos genes Rf3-PPR de Zea mays c.v. 4XP811 y Zea mays c.v. 7SH382ms.

Ejemplo 4: Análisis de la Expresión de RF3-PPR2 por PCR en Tiempo Real

Para validar si la expresión de la proteína Rf3-PPR2 se correlacionaba con la restauración de la fertilidad del maíz S-CMS, se realizó un ensayo de PCR en tiempo real (RT-PCR) para determinar cuantitativamente el patrón de expresión del gen Rf3-PPR2 en plantas fértiles y el gen rf3-PPR2 en plantas CMS. Se diseñaron varios pares de cebadores y sondas específicos, basándose en porciones de las secuencias de polinucleótidos que contenían aminoácidos con variaciones en el gen codificante de la proteína Rf3-PPR2 (Tabla 2). El ARN total se extrajo de las diversas líneas de plantas. Estas muestras se extrajeron de dos líneas; 4XP811 (estéril citoplasmático masculino) y LH60 (líneas restauradoras), individuos F3 derivados de una espiga F2 que se segrega para la región de 1,3 Mb del cromosoma 2 de brazo largo y tres líneas comerciales de maíz. Se completaron los ensayos Taqman® para cuantificar la expresión del gen Rf3-PPR2. Los niveles de expresión se cuantificaron por comparación con un gen de control interno de maíz, EF a l. (Czechowski T, et al., Plant Physiol., Sep; 139(1 ):5-17, 2005).

Tabla 2: Cebadores y sondas utilizados para RT-PCR de las plantas de maíz RF3.

Las plantas a analizar mediante el ensayo Taqman® se cultivaron en un invernadero. Se recogieron tejidos de hojas de plantas de 7 semanas (justo antes de la panojado) y de 10 semanas (después de la polinización). También se recolectaron tejidos de panoja con anteras/pólenes en desarrollo y pólenes desprendidos (en plantas fértiles). El ARN total se extrajo utilizando el RNeasy Plant Mini Kit™ de Qiagen y el ADNc se sintetizó utilizando el QuantiTect Reverse Transcription Kit™ de Qiagen (Qiagen, Carlsbad, CA). Para la RT-PCR, se utilizó como control interno la expresión del factor de elongación a-1 (EF a l) del maíz. Applied Biosystems (Foster City, CA) sintetizó cebadores para Rf3-PPR2 y EF a l y sondas marcadas dualmente con colorantes FAM o VIC y el colorante inhibidor Minor Groove Binding Non Fluorescence Quencher ™ I (MGBNFQ). Se utilizó la mezcla madre de genotipado Taqman® (Applied Biosystems, Foster City, CA) para preparar reacciones de PCR de 10 μl y la PCR se realizó en un termociclador LightCycler 480™ de Roche (Roche, Indianapolis, IN). El programa de PCR se inició con 10 minutos de activación de la enzima Taq a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos y 58 °C durante 38 segundos. Las señales de fluorescencia se registraron al final de cada uno de los ciclos. Los niveles de expresión relativos de Rf3-PPR2 a EF a l se calcularon utilizando el método Delta Delta CT.

Se diseñaron siete ensayos Taqman® basados en modificaciones que dieron como resultado cambios de aminoácidos dentro del gen Rf3-PPR2 (véase la Tabla 2). Sorprendentemente, solo el ensayo CMS-S9 amplificó un amplicón que se correspondía con la presencia de la secuencia del gen Rf3 o rf3 en las líneas restauradoras fértiles y las líneas estériles masculinas citoplasmáticas, respectivamente. Este ensayo fue capaz de identificar una modificación de un solo par de bases (p. ej., mutación) que resultó en el fenotipo de esterilidad masculina citoplasmática rf3. Como tal, esta modificación de un solo par de bases podría utilizarse para discernir entre las plantas con esterilidad masculina citoplasmática rf3 y las plantas fértiles restauradas Rf3. A pesar de las numerosas mutaciones de aminoácidos presentes en las líneas rf3, solo las plantas que contenían el motivo SEQ ID NO: 1 dieron como resultado la observación de plantas con esterilidad masculina citoplasmática rf3.

Los resultados de la RT-PCR cuantitativa demostraron que las plantas que contenían el motivo SEQ ID NO: 5 expresaron en Rf3 el parental restaurador LH60 y las plantas F3 que eran homocigotas o heterocigotas para el alelo restaurador en todas las fases de crecimiento testadas. Sin embargo, Rf3 no se expresó en los parentales CMS-S, F3s homocigotos para el alelo rf3 y las líneas comerciales de maíz. En particular, los niveles de expresión de Rf3 se distinguieron entre individuos F3 homocigotos Rf3 (Rf3/Rf3) y heterocigotos (Rf3/rf3), lo que podría explicar por qué las plantas homocigotas (Rf3/Rf3) desprenden polen fértil lleno de almidón al 100 %, mientras que las plantas heterocigotas (Rf3/rf3) desprenden aproximadamente un 50 % de polen fértil lleno de almidón. Finalmente, el gen Rf3-PPR2, que restaura el citoplasma CMS tipo S, se expresa tanto en el tejido de la panoja que contiene polen inmaduro como en el tejido de la hoja.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 92,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, que comprende SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido tiene actividad de esterilidad masculina citoplasmática.

2. Una célula transgénica que expresa el polipéptido de la reivindicación 1 como un polipéptido heterólogo, en donde opcionalmente la célula es una célula vegetal.

3. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal de la reivindicación 2, en donde opcionalmente la planta es una planta monocotiledónea, en donde opcionalmente la planta monocotiledónea es una planta de maíz.

4. Una semilla de la planta de la reivindicación 3, en donde la semilla comprende el polipéptido de la reivindicación 1 como un polipéptido heterólogo.

5. Una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica el polipéptido de la reivindicación 1, en donde opcionalmente la secuencia de ácido nucleico sintético comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de SEQ ID NO: 4.

6. Un polinucleótido o un casete de expresión génica que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de la reivindicación 5, en donde opcionalmente el polinucleótido o la secuencia de ácido nucleico sintético está enlazado operativamente a un promotor, en donde el promotor es funcional en plantas, en donde opcionalmente el promotor es un promotor de la esterilidad masculina citoplasmática vegetal.

7. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico sintético de la reivindicación 5.

8. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un método para restaurar la fertilidad de una planta con esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método las etapas de;

a) transformar la planta con esterilidad masculina citoplasmática en la que la esterilidad masculina se obtiene a partir de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 92,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, que comprende SEQ ID NO: 1, con una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con ^s E^q ID NO: 7, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

b) integrar la secuencia de ácido nucleico sintético en el genoma de la planta con esterilidad masculina citoplasmática; y c) expresar la secuencia de ácido nucleico sintético, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico sintético restaura la fertilidad de la planta con esterilidad masculina citoplasmática.

10. Un método para detectar una planta que comprende un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método las etapas de:

a) aislar una muestra de polinucleótido genómico de una planta, tejido vegetal, parte de planta o célula vegetal;

b) añadir un conjunto de cebadores de oligonucleótidos a la muestra de polinucleótido genómico;

c) someter la muestra de polinucleótido genómico y el conjunto de cebadores de oligonucleótidos a un proceso de amplificación; y

d) detectar al menos un producto amplificado, en donde el producto amplificado indica la presencia del rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática en la planta, en donde el conjunto de cebadores de oligonucleótidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, en donde el método incluye opcionalmente uno de los siguientes:

i) el producto amplificado comprende SEQ ID NO: 6,

ii) se cuantifica el producto amplificado,

iii) la muestra de polinucleótido genómico comprende ADNc producido a partir de ARNm aislado de una planta, tejido vegetal, parte de planta o célula vegetal.

11. Un método para detectar un nivel de expresión de un rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, comprendiendo el método las etapas de:

a) realizar un primer proceso de amplificación utilizando una sonda de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático (SEQ ID NO: 30), un cebador de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático directo (SEQ ID NO: 28) y un cebador de rasgo restaurador estéril masculino citoplasmático inverso (SEQ ID NO: 29) en una muestra de polinucleótido genómico, en el que se libera un primer colorante fluorescente de la sonda de rasgo restaurador estéril masculina citoplasmática (SEQ ID NO: 30);

b) realizar un segundo proceso de amplificación utilizando una sonda de referencia (SEQ ID NO: 36), un cebador de referencia directo (SEQ Id NO: 34) y un cebador de referencia inverso (SEQ ID NO: 35) en una muestra de polinucleótido genómico, en el que se libera un segundo colorante fluorescente de la sonda de referencia (SEQ ID NO: 36);

c) cuantificar la intensidad relativa del primer colorante fluorescente con respecto al segundo colorante fluorescente para detectar el nivel de expresión del rasgo restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática,

en donde el método incluye opcionalmente uno de los siguientes:

i) los procesos de amplificación primero y segundo se realizan en un solo tubo de ensayo de PCR utilizando sondas con diferentes colorantes fluorescentes,

ii) el método comprende además las etapas de:

d) cargar una solución de PCR en un solo tubo de ensayo de PCR, comprendiendo la solución de PCR una polimerasa con actividad de nucleasa de 5' a 3', desoxinucleótidos, los cebadores, las sondas, un tampón y la muestra de polinucleótido genómico;

e) amplificar la solución de PCR, en donde la solución de PCR se trata en condiciones de amplificación tales que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la polimerasa escinde las sondas, liberando con ello el colorante fluorescente que emite luz; y

f) medir la luz emitida por el colorante fluorescente, durante la amplificación,

iii) la sonda de rasgo de esterilidad masculina citoplasmática comprende el primer colorante fluorescente y un primer colorante inhibidor,

en donde el método incluye opcionalmente uno de los siguientes:

a) el primer colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente HEX, un colorante fluorescente VIC, un colorante fluorescente FAM, un colorante fluorescente JOE, un colorante fluorescente TET, un colorante fluorescente Cy 3, un colorante fluorescente Cy 3.5, un colorante fluorescente Cy 5, un colorante fluorescente Cy 5.5, un colorante fluorescente Cy 7 o un colorante fluorescente ROX,

b) el primer colorante inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un colorante inhibidor Dabcyl, un colorante inhibidor Tamra, un colorante inhibidor Qxl, un colorante inhibidor Iowa Black FQ, un colorante inhibidor Iowa Black RQ, un colorante inhibidor IR Dye QC-1, un colorante inhibidor MGB o un colorante inhibidor Blackhole,

iv) la sonda de referencia comprende el segundo colorante fluorescente y un segundo colorante inhibidor, en donde el método incluye opcionalmente uno de los siguientes:

c) el segundo colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente HEX, un colorante fluorescente FAM, un colorante fluorescente VIC, un colorante fluorescente JOE, un colorante fluorescente TET, un colorante fluorescente Cy 3, un colorante fluorescente Cy 3.5, un colorante fluorescente Cy 5, un colorante fluorescente Cy 5.5, un colorante fluorescente Cy 7 o un colorante fluorescente ROX,

d) el segundo colorante inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un colorante inhibidor Dabcyl, un colorante inhibidor Tamra, un colorante inhibidor Qxl, un colorante inhibidor Iowa Black FQ, un colorante inhibidor Iowa Black RQ, un colorante inhibidor IR Dye QC-1, un colorante inhibidor MGB o un colorante inhibidor Blackhole,

v) la muestra de polinucleótido genómico comprende ADNc producido a partir de ARNm aislado de una planta, tejido vegetal, parte de planta o célula vegetal.