KR101856272B1

KR101856272B1 - 4-hppd 억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 높은 식물

Info

Publication number: KR101856272B1
Application number: KR1020137016549A
Authority: KR
Inventors: 히로시 가토; 히데오 마에다; 요시히로 수노하라; 이쿠오 안도; 마사히로 오시마; 모토시게 가와타; 히토시 요시다; 사키코 히로세; 마키코 가와기시; 요지로 다니구치; 가즈마세 무라타; 히로아키 마에다; 유지 야마다; 게이스케 세키노; 아키히코 야마자키
Original assignee: 가부시키가이샤 에스디에스 바이오텍크; 고쿠리츠겐큐가이하츠호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교기쥬츠 소고겐큐기코; 토야마켄
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2018-05-10
Also published as: US10544425B2; CN103403165A; CN103403165B; RU2013135291A; WO2012090950A1; JPWO2012090950A1; BR112013016859A2; US20150047066A1; JP5891178B2; KR20140008322A; RU2604793C2; AU2011350804B2; BR122019027736B1; CN105861524B; ZA201304730B; AU2011350804A1; CN105861524A; CA2823290C; CA2823290A1

Abstract

4-HPPD 억제제 감수성 벼로 4-HPPD 억제제 저항성 벼를 이용한 QTL해석 등에 의해 4-HPPD 억제제 저항성 유전자가 벼 제2염색체 단원에 좌승하는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자(HIS1유전자)임을 동정하였다. 또한 HIS1유전자와의 상동 유전자(HSL1유전자)가 벼 제6염색체에 좌승하고 있는 것으로 확인되었다. 그리고 이들 유전자를 이용해 효율적으로 4-HPPD억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 향상된 식물체를 육성하고 식물의 4-HPPD억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정할 수 있음을 발견하였다.

Description

4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 높은 식물{Plant having improved resistivity or sensitivity to 4-HPPD inhibitor}

본 발명은 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 식물에 부여하기 위한 약제, 4-HPPD 억제제에 대한 저항성이나 감수성이 높은 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물 세포, 그 세포로부터 재생된 식물체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물에 있어서 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법, 및 해당 판정을 이용한 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 높은 식물의 육종방법에 관한 것이다.

바이오 에탄올 연료의 수요 증가에 따라 해외에서 사료용 곡물의 수입 가격이 급등하면서 일본 국내 축산 경영을 압박하고 있다. 여기서, 사료의 국내 생산 및 자급율의 향상을 목적으로 하고 휴경논 등을 이용한 수도(水稻 : 논에 물을 대어 심는 벼) 이외의 전작 작물의 경작이 이루어지고 있다. 그러나, 배수 불량 등의 문제에서 이들 전작 작물 재배에 적합한 수전(水田: 물을 대어 벼를 재배하는 땅)에는 한계가 있었기 때문에 사료로서의 벼의 이용이나 높은 생산성을 갖춘 사료 벼 전용 품종(다수(多收) 품종)의 개발이 진행되고 있다. 이러한 다수 품종에서 그 특성인 다수성(多收性)이나 안정한 재배성을 발휘하며, 가축의 기호성이나 영양가를 향상시키기 위해서는 재배 수전의 잡초 방제가 중요한 재배 관리 기술이다(비 특허 문헌 1). 또한 다수 품종이나 벼가 아니라 안정적이고, 경제적인 작물의 생산에는 저비용으로 에너지 절약적이며, 간편한 잡초 방제가 요구되며, 거기에는 선택성이 높은 제초제의 개발·시용(施用: 물건 따위를 실제로 씀)이 효과적이기 때문에(비 특허 문헌 2), 시용 제초제에 대한 저항성 작물의 개발이나 재배가 필요하다.

한편, 재배 수전의 잡초 방제에서는 적은 약의 양으로 광범위한 잡초에 효과적이고, 인체 및 환경에도 영향이 적은 술포닐우레아(SU)계 제초제가 널리 보급되고 있다. 그러나 SU계 제초제에 대해 내성을 갖는 올챙이 고랭이 등의 잡초의 발생이 확인되었으며, 벼 등의 재배 관리의 문제가 되고 있다.

요즈음, 걸리는 문제의 해결책으로서 벤조 비시클론(BBC: Benzo bicyclon), 메소트리온(Mesotrione) 또는 테퓨리트리온(Tefurytrione) 등의 SU계 제초제 내성 식물에도 효과를 나타내는 제초제 성분이 개발되어 실용화되고 있다. BBC, 메소트리온, 테퓨리트리온은 모두 4-히드록시 페닐 피르브산 옥시게나아제(4-HPPD: 4-Hydroxy Phenyl Pyruvate Dioxygenase)의 기능을 억제하는 약재(4-HPPD 억제제)이며, 이 효소의 기능을 억제함으로써 카로티노이드(Carotenoid) 합성계를 간접적으로 억제하고, 엽록소의 붕괴를 야기함으로써 식물을 백화, 고사에 이르게 한다(도 1 참조). 이들 억제제에 대해서는 식용 쌀 품종에 대한 안전성은 충분히 확인되었기 때문에 벼 재배에서 급속히 보급되고 있다.

4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 확실하게 식별할 수 있는 방법이나, 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 높일 수 있는 방법이 개발되면 예를 들어 도 2에 나타낸 바와 같이 식용 쌀 품종, 사료용 쌀 품종의 윤작 체계에서 전년 작의 "저절로 땅에 떨어진 씨앗"의 발아 리스크(누생(漏生) 벼, 묘(苗)의 문제)의 제어에 4-HPPD 억제제를 활용하고 나아가서는 사료용 쌀 품종 등의 생산 확대가 기대될 수 있고, 이러한 방법을 이용함으로써 필요에 따라 벼 등의 작물 재배의 구분 관리 기술에도 활용할 수 있다. 게다가 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 식별하는 마커가 되는 유전자가 출현되면, 벼를 포함한 작물을 효율적으로 육종하는 것이 가능하게 된다.

이 때문에 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 식물에 부여하기 위한 기술이나, 식물의 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하기 위한 기술의 개발이 강력하게 요구되고 있다. 그러나 이들 목적을 효율적으로 달성할 수 있는 기술은 아직 개발되지 않았다.

비특허문헌 1: 세키노 케이스케(關野景介) 등의 「사료용 벼 19품종의 수도용 제초제 벤조비시클론 감수성」, 일본 작물 학회 기사, 2009년 3월 25일 227권, 부록, 120~121면. 비 특허 문헌 2: Terry R.Wright 등의 Proc Natl Acad Sci USA., 2010년 11월 23일 107권, 47호, 20240~20245면. 비 특허 문헌 3: 마루야마 키요아키(丸山淸明) 등의 「사료용 벼 등이 일부 제초제에 약한 것을 판명」,[online], 2010년 3월 26일 독립 행정 법인 농업·식품 산업 기술 종합 연구 기구 중앙 농업 종합 연구 센터, 프레스 릴리스[2010년 9월 29일 검색], 인터넷〈URL:http://narc.naro.affrc.go.jp/press/h22/0326/index.htm〉

본 발명은 상기 종래 기술이 갖는 과제를 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 효율적으로 식물에게 부여할 수 있는 기술을 제공하는 것, 그리고 식물에서의 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 효율적으로 판정할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해, 우선 식물의 4-HPPD 억제제에 대한 저항성에 관여하는 유전자의 동정을 시도하였다. 구체적으로 본 발명자들은 우선 4-HPPD 억제제 감수성 벼와 4-HPPD 억제제 저항성 벼를 이용한 양적 유전자좌(QTL) 해석을 실시했다. 그 결과, 4-HPPD 억제제 저항성 결정 유전자좌가 벼의 제2 염색체 단원에 좌승(坐乘)하는 것이 판명되었다. 이어서 본 발명자들은 QTL 해석으로 확인된 유전자좌에 있는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자에 레토로토랑스포종 Tos17이 삽입된 일본청 계통을 이용하여 표현형(4-HPPD 억제형 감수성)을 조사하였는데, Tos17 삽입 호모 개체가 4-HPPD 억제제에 감수성을 나타내는 것을 발견하였다. 발견된 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자를 시로이나즈나(A.thaliana)및 벼를 도입한 결과 이들의 형질 전환 식물이 4-HPPD 억제제에 대한 저항성을 나타내면서 이 유전자가 식물에 4-HPPD 억제제에 대한 저항성을 가져오는 원인 유전자(이하, 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor sensitive gene No.1(HIS1)라 칭함)임이 입증되었다. 또한 벼의 HIS1유전자와 높은 상동성을 가진 유전자는 보리, 사탕수수(sorghum), 옥수수 등에서도 존재하였다.

더욱이 본 발명자들은 PCR 해석에 의해 4－HPPD 억제제 감수성 벼와 4－HPPD 억제제 저항성 벼에 있어서의 HIS1 유전자의 구조의 비교를 실시하였다. 그 결과, 4－HPPD 억제제에 대해서 감수성을 나타내는 벼 품종에 대해서는, HIS1 유전자의 제4~5 엑손에 걸쳐 삽입이나 결여되어 없어짐이 생기고 있던 것으로부터, HIS1 유전자의 기능의 억제가 식물에 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 가져오는 것이라고 생각되었다.

또한, 벼에 있어서 HIS1 유전자와 가장 상동성이 높은 벼 유전자(HSL1 유전자)가 제6 염색체에 좌승하고 있는 것을 명확하게 밝혔다. 더욱이 이 HSL1 유전자를 벼에 도입하였는데 이 형질 전환 벼도 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 나타내는 것도 명확하게 밝혔다.

이러한 지식에 근거하여 본 발명자들은 HIS1 유전자 또는 그 상동 유전자를 이용하는 것에 의해 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 높일 수 있는 식물체를 육성하는 것이 가능하고, 또한 해당 유전자를 표적으로 하여 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 것이 가능한 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 보다 상세하게는 이하와 같다.

(1)　4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하고, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하기 위한 약제

(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA

(b) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열에 대해 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA

(c) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열로부터 되는 DNA와 가혹한 조건에서 교잡하는 DNA

(d) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 60%이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA.

(2)　4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포이며, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있었던 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포

(b) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열에 대해 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA

(3)　(2)에 기재한 형질 전환 식물세포로부터 재생된, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체.

(4)　(3)에 기재한 식물체의 자손 또는 클론인 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체.

(5)　(3) 또는(4)에 기재한 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체의 번식 재료.

(6)　4－HPPD 억제제에 대한 저항성이 높은 식물체의 제조 방법으로서,

(I) 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정과

(d) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 60%이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA

(II) 공정(I)에 대해 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정을 포함하는 방법.

(7)　4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하고, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하기 위한 약제

(a) (1)에 기재한 DNA의 전사 생산물과 상보적인 이중사슬 RNA를 코드하는 DNA

(b) (1)에 기재한 DNA의 전사 생산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA

(c) (1)에 기재한 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열(開裂)하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA.

(8)　4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포이며, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있었던 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포

(c) (1)에 기재한 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA.

(9)　(8)에 기재한 형질 전환 식물세포로부터 재생된 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체.

(10)　(9)에 기재한 식물체의 자손 또는 클론인 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체.

(11)　(9) 또는(10)에 기재한 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체의 번식 재료.

(12)　4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체의 제조 방법으로서,

(I) 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정과

(c) (1)에 기재한 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA

(13) 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법이며, 피실험식물에 있어서의 하기의 (a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열을 해석하는 것을 특징으로 하는 방법

(b) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열에 대해 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA

(14) 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법으로서, 피실험식물에 있어서의 하기의 (a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA의 발현 또는 증폭 생산물 혹은 발현 생산물의 분자량을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법

(d) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA.

(15)　4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물을 육종 하는 방법으로서,

(a) 4－HPPD 억제제에 대해 저항성의 식물 품종과 임의의 품종을 교배시키는 공정,

(b) 공정(a)에 있어서의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체에 있어서의, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 (13) 또는 (14)에 기재한 방법에 의해 판정하는 공정, 및

(c) 4－HPPD 억제제에 대해 저항성을 갖는 것으로 판정된 개체를 선발하는 공정을 포함하는 방법.

(16)　4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물을 육종하는 방법으로서,

(a) 4－HPPD 억제제에 대해 감수성의 식물 품종과 임의의 품종을 교배시키는 공정,

(b) 공정(a)에 있어서의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을, (13) 또는 (14)에 기재한 방법에 의해 판정하는 공정, 및

(c) 4－HPPD 억제제에 대해 감수성을 갖는 것으로 판정된 개체를 선발하는 공정을 포함하는 방법.

본 발명에서 동정된 유전자를 이용함으로써 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성이 향상된 식물을 효율적으로 육성하는 것이 가능하였다. 또, 본 발명에서 동정된 유전자를 표적으로 하여, 식물의 4-HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 효율적으로 판정하는 것이 가능하게 되었다.

도 1은　티로신 대사 경로 및 카로테노이드 생합성 경로와 4－HPPD 억제제의 개요와 관련을 나타낸 도면이다.
도 2는　식용미 품종, 사료용미 품종의 윤작 체계에 있어서, 전년작의 「자생종(self-sown seed)」의 발아 리스크의 제어에 관한 개요를 나타낸 도면이다.
도 3은 아그로박테리움(Agrobacterium) 법에 의한 애기장대(白犬薺 학명: Arabidopsis thaliana)의 형질 전환에 이용한 nos 프로모터(nos－P)로 드라이브 되는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자(NPTII), CaMV35S 프로모터(CaMV35S－P)로 드라이브 되는 하이그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자(hygR) 및 CaMV35S 프로모터로 드라이브 되는 AK065581(HIS1)의 각 발현 카셋트 및 경계 서열(RB：우측 경계 서열, LB：좌측 경계 서열)을 연결한 바이너리(binary) 벡터(pIG121 － Hm / HIS1)의 개요를 나타낸 도면이다.
도 4는 아그로박테리움법에 의한 애기장대 및 벼의 형질 전환에 이용한, CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 하이그로마이신 저항성 유전자(mHPT), CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 AK065581(HIS1)의 각 발현 카셋트 및 경계 서열(RB：우측 경계 서열, LB：좌측 경계 서열)을 연결한 바이너리 벡터(35 sHIS1　pZH2B)의 개요를 나타내는 도면이다.
도 5는 아그로박테리움법에 의한 토마토의 형질 전환에 이용한, nos 프로모터(NOSpro)로 드라이브 되는 카나마이신 저항성 유전자(NPT2), CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 AK065581(HIS1)의 각 발현 카셋트 및 경계 서열(RB：우측 경계 서열, LB：좌측 경계 서열)을 연결한 바이너리 벡터(35 sHIS1pZK3)의 개요를 나타내는 도면이다.
도 6은 아그로박테리움법에 의한 애기장대 및 벼의 형질 전환에 이용한, CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 하이그로마이신 저항성 유전자(mHPT), CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 AK241948(HSL1)의 각 발현 카셋트, 및 경계 서열(RB：우측 경계 서열, LB：좌측 경계 서열)을 연결한 바이너리 벡터(35 sHSL1　pZH2B)의 개요를 나타내는 도면이다.
도 7은 아그로박테리움법에 의한 토마토의 형질 전환에 이용한, nos 프로모터(NOSpro)로 드라이브 되는 카나마이신 저항성 유전자(NPT2), CaMV35S 프로모터(35 S　Pro)로 드라이브 되는 AK241948(HSL1)의 각 발현 카셋트, 및 경계 서열(RB：우측 경계 서열, LB：좌측 경계 서열)을 연결한 바이너리 벡터(35 sHSL1　pZK3)의 개요를 나타내는 그림이다.
도 8은 벼 염색체 상에 있는 QTL 해석에 의해 특정된 4－HPPD 억제제 저항성 유전자(AK065581)와 그 상동 유전자를 나타내는 도면이다.
도 9는 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 A. thaliana(에코 타입 Columbia)의 4－HPPD 억제제(벤조비시클론(BBC))에 대한 저항성을 나타내는 사진이다. 또한 도면 중 「Col」는, A. thaliana 야생형(에코 타입 Columbia)의 결과를 나타내고, 「＃1」및 「＃3」은, 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 애기장대 A. thaliana(에코 타입 Columbia)의 결과인 것을 나타낸다.
도 10은 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(4－HPPD 억제제 감수성 품종：관동 239호)의 4－HPPD 억제제(벤조비시클론)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다. 또한 도면 중 「관동 239호」는 관동 239호(야생형)의 결과인 것을 나타내고, 「BBC21－23B」및 「BBC21－23C」는 표적 유전자(AK065581)를 도입한 관동 239호(재조합 벼)의 결과인 것을 나타낸다.
도 11은 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(벤조비시클론)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다. 또한 도면 중, 「일본청」및 「관동 239호」는 각각 일본청(야생형)(4－HPPD 억제제 저항성 품종) 및 관동 239호(야생형)의 결과인 것을 나타내고, 「BBC21－1A, 2, 3, 3D, 3F, 3－3, 9, 15」는, 표적 유전자(AK065581)를 도입한 관동 239호(재조합 벼)의 결과인 것을 나타낸다(도 12~15에 대해도 같음). 또, 「적용일」및 「평가일」은, 각각 「4－HPPD 억제제를 첨가한 고형(한천) 배양지에 종을 뿌린 날」및 「해종으로부터 발육한 식물체의 생육 상황을 조사한 날」을 나타낸다(도 12 ~ 15 및 22에 대해도 같음).
도 12는 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(메소트리온)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다.
도 13은 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(테퓨리트리온)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다.
도 14는 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(템보트리온)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다.
도 15는 표적 유전자(AK065581)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(NTBC)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다.
도 16은 각 벼 품종에 있어서의 HIS1 유전자의 각 엑손 영역을 증폭한 PCR 패턴을 나타내는 전기 영동 사진이다. 또한 도면 중, 「1」은 일본청, 「2」는 코시히카리, 「3」은 카세라스, 「4」는 호쿠리쿠(Hokuriku) 193호, 「5」는 타카나리, 「6」은 모미로만의 결과인 것을 나타내고, 「M」는 사이즈 마커를 나타낸다. 또, 「엑손 1」은 서열 번호：3에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：4에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 1의 영역을 나타내고, 「엑슨 2」는 서열 번호：5에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호 6에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 2의 영역을 나타내며, 「엑손 3」은 서열 번호：7에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：8에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 3의 영역을 나타내고, 「엑손 4」는 서열 번호：9에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：10에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 4의 영역을 나타내며, 「엑손 5」는 서열 번호：11에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：12에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 5의 영역을 나타낸다. 또, 「엑손 4 전반」은 서열 번호：13에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：14에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 HIS1 유전자의 엑손 4 내부의 전반 영역을 나타낸다. 또한 도면 중, 화살표 머리모양은 각각 100 pb, 200 bp, 500 bp의 크기인 것을 나타낸다.
도 17은 일본청의 HIS1 유전자와 모미로만 및 타카나리의 대응 유전자와의 구조를 비교한 결과를 나타내는 개요도이다.
도 18은 일본청의 HIS1 유전자와 카세라스의 대응 유전자와의 구조를 비교한 결과를 나타내는 개요도이다.
도 19는 HIS1 유전자와 그 상동 유전자(HSL1 유전자), 각각이 코드하는 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 상동성을 나타내는 도면이다.
도 20은 HIS1 유전자가 좌승하는 유전자좌(제2 염색체)와 그 상동 유전자(HSL1 유전자：Os06g0176700/Os06g0178500)가 좌승하는 유전자좌(제6 염색체)와의 각 조직에 있어서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
도 21은 HIS1 유전자 및 그 상동 유전자는, 벼과(단자엽) 식물에 고유의 유전자군에 속하는 것을 나타내는 계통수이다. 덧붙여 도면 중의 「HSL」는, 「HIS1－LIKE」의 약칭이며, HIS1의 상동 유전자인 것을 나타낸다.
도 22는 HIS1 유전자와 높은 상동성을 가지는 유전자(HSL1；AK241948)를 도입한 재조합 벼(관동 239호)의 4－HPPD 억제제(벤조비시클론)에 대한 저항성을 나타내는 사진이다. 또한 도면 중, 「관동 239호」는, 관동 239호(야생형)의 결과인 것을 나타내며, 「23－1」, 「23－21」및 「23－25」는 상동 유전자(AK241948)를 도입한 관동 239호(재조합 벼)의 결과인 것을 나타낸다.

＜4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하기 위한 약제＞

본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하기 위한 약제는, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA(이하, 본 발명의 저항성 DNA라고 칭한다), 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 「4－HPPD 억제제」란, 4－HPPD(4－히드록시페닐피르빈산디옥시제나아제)의 기능을 억제하는 약제(4－HPPD 억제제)를 의미한다. 4－HPPD 억제제는 도 1에 나타낸 바와 같이 4－HPPD의 기능을 억제하는 것에 의해 카로테노이드 합성계를 간접적으로 억제하고, 엽록소의 붕괴를 일으켜 식물을 백화시켜 고사에 이르게 한다. 본 발명에 있어서의 「4－HPPD 억제제」로서는, 예를 들면, 벤조비시클론(BBC), 메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온, 2-(2－니트로-4－트리플로오로메틸벤조일)－시클로헥산-1,3-디온(2－(2－nitro－4－trifluoromethylbenzoyl) cyclohexane－1,3－dione；NTBC)라고 하는 트리 케톤계 4－HPPD 억제제, 피라졸레이트(Pyrazolate), 벤조페납(Benzofenap), 피라족시펜(Pyrazoxyfen) 이라고 하는 피라졸계 4－HPPD 억제제를 들 수 있다. 본 발명의 저항성 DNA를 이용하여 식물에 저항성을 부여하는 대상이 되는 4－HPPD 억제제로는 BBC, 메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온, NTBC라고 하는 트리 케톤계 4－HPPD 억제제가 바람직하고, BBC가 특히 바람직하다.

또한, 전술의 4－HPPD 억제제라고 하는 제초제는 그 성분이 화합물로서 극히 다양하지만, 작용 기작의 측면에서 하기와 같이 몇개의 그룹으로 분류할 수 있다( 「농약으로부터 아그로바이오레귤레이터(Agrobioregulators) 병해충 잡초 제어의 현상과 장래」일본, 시엠시 출판, 2010년 1월 참조).

(I) 아세틸 CoA 카르복실라제(ACCase) 억제형 제초제

지방질 합성의 최초의 단계에 관여하는 ACCase를 억제하는 이 제초제 그룹은 세포막 합성을 억제하여 식물을 생육 장해에 이르게 한다. 이 그룹에 속하는 제초제는 더욱이 (1) 4－아릴옥시페녹시프로피온산계, (2) 시클로헥산디온·옥심계, (3) 디온계로 분류된다.

(II) 아세트 유산 합성 효소(ALS) 억제형 제초제

ALS를 표적으로 하는 이 제초제의 그룹은 ALS 활성을 억제하여 분지 아미노산 생성을 억제하는 것으로 식물을 생육 장해에 이르게 한다. 이 그룹에 속하는 제초제는 추가로 (1) 술포닐우레아계, (2) 트리아졸리논계, (3) 트리아졸로피리미딘계, (4) 피리미디닐살리실산계, (5) 이미다졸리논계로 분류된다.

(III)　4－HPPD 대사 억제형 제초제

티로신 대사 경로의 4－HPPD 대사를 억제하는 이 제초제 그룹은 식물의 카로테노이드 합성계를 간접적으로 억제하여 식물을 백화·고사에 이르게 한다. 이 그룹에 속하는 제초제는 추가로 (1) 시클로헥산디온계, (2) 피라졸계, (3) 비시클로계, (4) 이소옥사졸계, (5) 트리 케톤계로 분류된다. 또, (1) 시클로헥산디온계로서는, 예를 들면 벤조일시클로헥산-1,3－디온 유도체를 들 수 있으며, (2) 피라졸계로는 예를 들면, 피라졸레이트, 벤조페납, 피라족시펜을 들 수 있고, (3) 비시클로계로서는 예를 들면, 3－치환 벤조일비시클로［4, 1, 0］헵탄-2,4－디온 유도체를 들 수 있고, (4) 이소옥사졸계로는, 예를 들면 이소옥사플루톨(Isoxaflutole)를 들 수 있으며, (5) 트리 케톤계로서는, 예를 들면, BBC, 메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온을 들 수 있다.

(IV) 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제(PPO) 억제제 제초제

이 그룹의 제초제는 엽록소 합성을 억제하여, 세포막 붕괴로부터 고사에 이르게 한다. 이 그룹에 속하는 제초제는 추가로 (1) 디페닐에테르계, (2) 디알릴계, (3) 피라졸계로 분류된다.

(V) 초 장쇠 지방산 신장 효소(VLCFAE) 억제형 제초제

이 그룹의 제초제는 식물 지질 생합성계 중 C20 이상의 초 장쇠 지방산 생합성계 효소를 억제하여 식물을 고사에 이르게 한다.

(VI) 피토엔 데사츄라제(PDS) 억제형 제초제

카로테노이드 생합성 경로의 PDS 효소를 억제하는 이 제초제 그룹은 식물의 엽록소 붕괴를 일으켜 식물을 백화·고사에 이르게 한다.

(VII)　PS　II 억제형 제초제

이 그룹의 억제제는 프라스트키논(PQ)에 결합하여 그 결과 PQ가 관련되는 광화학계　II(PS　II)로부터 광화학계　I(PS　I)에의 전자 전달이 억제되어 식물체내에서의 탄소 고정 기능이 불능하여 식물이 고사한다.

(VIII) 합성 옥신(Auxin)형 제초제

이 그룹의 억제제는 식물체내에 저농도로 존재하여 식물의 생장을 조절하는 천연 옥신과 같이 행동하여 식물의 분화·성장이 비정상이 되어 결과적으로 고사한다.

(IX)　EPSP 합성 효소(EPSPS) 억제형 제초제

이 그룹의 억제제는 시킴산(shikimic acid) 회로의 EPSPS와 결합하여 EPSP의 합성을 억제한다. 그 결과 트립토판(Trytophan), 페닐알라닌, 티록신(Tyrosine)이 생합성 되지 않고, 식물은 고사한다.

본 발명의 저항성 DNA의 예로서 일본청 유래의 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자와 추정되는 유전자(HIS1 유전자:Os02g0280700)의 염기 서열을 서열 번호：1에 상기 DNA가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호：2로 나타낸다.

또, 본 발명의 저항성 DNA의 다른 예로서 일본청 유래의 유전자(HIS1－LIKE(HSL) 1 유전자；Os06g0176700/Os06g0178500(AK241948)의 염기 서열을 서열 번호：16에 상기 DNA가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호：17로 나타낸다.

본 발명의 저항성 DNA의 하나의 태양은 서열 번호：2로 기재한 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA(전형적으로는, 서열 번호：1로 기재한 염기 서열의 코드영역을 포함한 DNA)이다.

또, 본 발명의 저항성 DNA의 다른 태양은 서열 번호：17로 기재한 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA(전형적으로는, 서열 번호：16으로 기재한 염기 서열의 코드 영역을 포함한 DNA)이다.

현재의 기술 수준에 대해서는 당업자라고 하면 이러한 DNA의 염기 서열 정보를 얻을 수 있는 경우 그 염기 서열에 대해서 여러 가지의 개조 및 변형을 실시하고, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 변이 유전자의 제조를 실시하는 것이 가능하다. 또, 자연계에 있어도 염기 서열이 변이하는 것은 일어날 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명의 저항성 DNA에는 상기 활성을 가지는 단백질을 코드하는 한 서열 번호：2 또는 17로 기재한 아미노산 서열에 대해 하나 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 코드하는 DNA도 포함된다. 여기서 「복수」란 HIS1 단백질 또는 HSL1 단백질의 아미노산 서열 전체에 대해서는 통상 50 아미노산 이내, 바람직하게는 30 아미노산 이내, 더욱 바람직하게는 10 아미노산 이내, 특히 바람직하게는 몇 개의 아미노산 이내(예를 들면, 5 아미노산 이내, 3 아미노산 이내, 2 아미노산 이내, 1 아미노산)이다.

또한, 현재의 기술 수준에 대해서 당업자라고 하면 특정의 저항성 DNA를 얻을 수 있는 경우 그 DNA의 염기 서열 정보를 이용하여 동종 혹은 다른 식물로부터 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 상동 유전자를 단리 하는 것이 가능하다. 이러한 상동 유전자를 취득하기 위한 식물로서는 단자엽 식물이 바람직하고, 벼과 식물이 특히 바람직하다. 벼과 식물로서는, 예를 들면, 벼(예를 들면, 4－HPPD 억제제 저항성 품종인, 일본청(Nipponbare), 코시히카리(Koshihikari), 키타아오바(kitaaoba), 아키히카리(Akihikari), 아키타코마치(Akitakomachi), 후쿠히비키(Fukuhibiki), 베코아오바(Bekoaoba), 베코고노미(Bekogonomi), 유메아오바(Yumeaoba), 호쿠리쿠(Hokuriku) 193호, 립스타(LeafStar), 타치수가타(Tachisugata), 쿠사노호시(Kusanohoshi), 호시아오바(Hoshiaoba), 니시아오바(Nishiaoba), 타치아오바(Tachiaoba), 마키미즈오(Makimizuho), 모그모그아오바(Mogmogaoba), 하마사리(Hamasari), 미나미유타카(Minamiyutaka)), 보리, 수수, 옥수수 등을 들 수 있다.

상동 유전자를 취득하기 위한 방법으로는 예를 들면, 교잡 기술(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98：503, 1975)나 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 기술(Saiki, R. K., et　al. Science, 230：1350－1354, 1985, Saiki, R. K. et　al. Science, 239：487－491, 1988)을 들 수 있다. 상동 유전자를 단리 하기 위해서는 통상 가혹한 조건하에서 교잡 반응을 실시한다. 가혹한 교잡의 조건으로는 6 M　요소, 0.4%　SDS, 0.5 × SSC의 조건 또는 이것과 동등의 가혹한 교잡 조건을 예시할 수 있다. 보다 가혹한 높은 조건, 예를 들면, 6 M　요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC의 조건을 이용하면 보다 상동성이 높은 유전자의 단리를 기대할 수가 있다. 본 발명의 저항성 DNA에는 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 한 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열로부터 되는 DNA와 가혹한 조건으로 교잡하는 DNA가 포함된다.

취득된 상동 유전자가 코드하는 단백질은 통상, 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 적어도 60%이상, 바람직하게는 80%이상(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상)의 서열 상동성이다. 서열 상동성은 BLASTX(아미노산 레벨)의 프로그램(Altschul　et　al. J. Mol. Biol., 215：403－410, 1990)을 이용하여 결정할 수가 있다. 해당 프로그램은 Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：2264－2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：5873－5877, 1993)에 근거하고 있다. BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는 파라미터(parameter)는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. 또한 Gapped　BLAST 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는 Altschul 등(Nucleic　Acids　Res. 25：3389－3402, 1997)에 기재된 바와 같이 실시할 수가 있다. BLAST와 Gapped　BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 패러미터를 이용한다. 이러한 해석 방법의 구체적인 수법은 공지되어 있다. 본 발명의 저항성 DNA에는 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 한, 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 60%이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA가 포함된다. 이러한 DNA로서는, 예를 들면, 보리 유래의 유전자(HｖHCP1(AF527606)), 옥수수 유래의 유전자(ZmHSL1(BT062842), ZmHSL2(NM_001153464)), 수수 유래의 유전자(SbHSL1(XM_002436546))를 들 수 있다(도 21 참조).

특정의 유전자가 코드하는 단백질이 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는지의 여부는 예를 들면, 후술의 실시예에 기재한 바와 같이, 해당 유전자를 식물에 도입하는 것에 의해, 작출(作出)한 식물에 상기 저항성이 부여되고 있는지의 여부를 검정하는 것에 의해 판정할 수가 있다(실시예 2 참조). 즉, 0. 03㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 애기장대(A. thaliana：에코 타입 Columbia)를 이용하는 경우에 대해서는 상기 유전자를 애기장대에 도입하는 것에 의해 작출하는 형질 전환체가 상기 BBC 농도의 존재 아래에서 백화하지 않고 생육할 수 있으면, 상기 유전자가 코드하는 단백질은 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지고 있다고 판정할 수 있다. 또한, 0.1㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 BBC 감수성 벼 품종 「관동 239호」를 이용하는 경우에 대해서는, 상기 유전자를 관동 239호에 도입하는 것으로써 작출한 형질 전환체가, 상기 BBC 농도의 존재 아래에서 백화하지 않고 생육할 수 있으면, 상기 유전자가 코드하는 단백질은 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지고 있다고 판정할 수 있다. 게다가 BBC 이외의 트리 케톤계 4－HPPD 억제제(메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온, NTBC 등 )를 이용하는 경우에 대해서는, 상기 유전자를 관동 239호에 도입하는 것에 의해 작출하는 형질 전환체가, 1㎛의 메소트리온, 2. 5㎛의 테퓨리트리온, 0. 5㎛의 템보트리온 또는 1㎛의 NTBC의 존재 하에 있어서 백화하지 않고 생육할 수 있으면, 상기 유전자가 코드하는 단백질은 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지고 있다고 판정할 수 있다.

본 발명의 저항성 DNA로서는 그 형태에 특히 제한은 없고 cDNA 외에 게놈 DNA 및 화학 합성 DNA가 포함된다. 이들 DNA의 조제는 당업자에게 있어 상투적인 수단을 이용하여 실시하는 것이 가능하다. 게놈 DNA는 예를 들면, 식물로부터 게놈 DNA를 추출하여 게놈 라이브러리(벡터로서는, 플라스미드(Plasmid), 파아지(Phage), 코스미드(Cosmid), BAC, PAC 등을 이용할 수 있다)를 작성하고, 이것을 전개하여 HIS1 유전자(예를 들면, 서열 번호：1에 기재한 DNA) 또는 HSL1 유전자(예를 들면, 서열 번호：16에 기재한 DNA)의 염기 서열을 기본으로 조제한 프로브를 이용해 콜로니 교잡(Colony hydridization) 혹은 플라크 교잡(Plaque hybridization)을 실시하는 것에 의해 조제하는 것이 가능하다. 또, HIS1 유전자 또는 HSL1 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하고 이것을 이용한 PCR를 실시하는 것에 의해 조제하는 일도 가능하다. 또한, cDNA는, 예를 들면, 식물로부터 추출한 mRNA를 기본으로 cDNA를 합성하고, 이것을 λZAP등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 작성하고, 이것을 전개하여 상기와 같이 콜로니 교잡 혹은 플라크 교잡을 실시하는 것에 의해 또 PCR를 실시하는 것에 의해 조제하는 것이 가능하다. 또, 시판의 DNA 합성기를 이용하면, 목적하는 DNA를 합성하는 것에 의해 조제하는 일도 가능하다.

＜4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하기 위한 약제＞

또한, 본 발명은, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하기 위한 약제를 제공한다. 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이 HIS1 유전자가 코드하는 단백질의 기능이 억제되는 것에 의해 4－HPPD 억제제에 대한 저항성이 억제된다. 따라서, 본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하기 위한 약제는 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA의 하나의 태양은 상기한 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 산물과 상보적인 dsRNA(이중사슬 RNA)를 코드하는 DNA이다. 표적 유전자 서열과 동일 혹은 유사한 서열을 가지는 dsRNA를 세포내에 도입하는 것에 의해 도입한 외래 유전자 및 표적내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 RNAi(RNA 간섭, RNA　interference)로 불리는 현상을 일으킬 수가 있다. 세포에 약 40 ~ 수백 염기 대 dsRNA가 도입되면, 헬리카세 도메인(Helicase domain)을 가지는 다이서(Dicer)로 불리는 RNaseIII모양의 뉴클리아제(Nuclease)가 ATP 존재하에서 dsRNA를 3’말단으로부터 약 21~23 염기 대 씩 잘라서 siRNA(short interference　RNA)가 생긴다. 이 siRNA에 특이적인 단백질이 결합하여 뉴클리아제 복합체(RISC：RNA－induced　silencing　complex)가 형성된다. 이 복합체는 siRNA와 같은 서열을 인식하여 결합하고 RNaseIII 모양의 효소 활성에 의해 siRNA의 중앙부에서 표적 유전자의 전사 산물(mRNA)을 절단한다. 또한, 이 경로와는 별도로 siRNA의 안티센스사슬(Antisense strand)이 mRNA에 결합하여 RNA 의존성 RNA 폴리메라아제(RsRP)의 프라이머로서 작용하여 dsRNA가 합성된다. 이 dsRNA가 다시 다이서의 기질이 되어 새로운 siRNA를 일으키는 작용을 증폭하는 경로도 생각되고 있다.

본 발명의 dsRNA를 코드 하는 DNA는 표적 유전자, 즉 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 산물(mRNA)의 몇 개의 영역에 대한 안티센스 RNA를 코드한 안티센스 DNA와 해당 mRNA의 몇 개의 영역의 센스 RNA를 코드한 센스 DNA를 포함하여 해당 안티센스 DNA 및 해당 센스 DNA보다 각각 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 발현시킬 수가 있다. 또, 이러한 안티센스 RNA 및 센스 RNA 보다 dsRNA를 작성할 수가 있다.

본 발명의 dsRNA의 발현 시스템을 벡터 등에 보관 유지시키는 경우의 구성으로는 동일한 벡터로부터 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 발현시키는 경우와 다른 벡터로부터 각각 안티센스 RNA와 센스 RNA를 발현시키는 경우가 있다. 동일한 벡터로부터 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 발현시키는 구성으로는 예를 들면, 안티센스 DNA 및 센스 DNA의 상류에 각각 polIII계와 같이 짧은 RNA를 발현 할 수 있는 프로모터를 연결시킨 안티센스 RNA 발현 카셋트와 센스 RNA 발현 카셋트를 각각 구축하여 이들 카셋트를 동 방향 또는 역방향으로 벡터에 삽입하는 구성이다.

또, 다른 사슬 상에서 대향하도록 안티센스 DNA와 센스 DNA를 역방향으로 배치한 발현 시스템을 구성할 수도 있다. 이 구성에서는 안티센스 RNA 코드 사슬과 센스 RNA 코드 사슬과 대비되는 하나의 2개 사슬 DNA(siRNA 코드 DNA)를 갖출 수 있어 그 양측으로 각각의 사슬로부터 안티센스 RNA와 센스 RNA를 발현할 수 있도록 프로모터를 대향하여 갖추고 있다. 이 경우에는, 센스 RNA와 안티센스 RNA의 하류에 여분의 서열이 부가되는 것을 피하기 위해서, 각각의 사슬(안티센스 RNA 코드 사슬, 센스 RNA 코드 사슬)의 3’말단에 터미네이터를 각각 갖추고 있는 것이 바람직하다. 이 터미네이터는, A(아데닌) 염기를 4개 이상 연속시킨 서열 등을 이용할 수가 있다. 또, 이 팔린드롬 스타일의 발현 시스템에서는 2개의 프로모터의 종류는 차이가 나는 것이 바람직하다.

또한, 다른 벡터로부터 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 발현시키는 구성으로는, 예를 들면, 안티센스 DNA 및 센스 DNA의 상류에 각각 polIII계와 같이 짧은 RNA를 발현할 수 있는 프로모터를 연결시킨 안티센스 RNA 발현 카셋트와 센스 RNA 발현 카셋트를 각각 구축하고, 이들 카셋트를 다른 벡터에 보관 유지시키는 구성이다.

본 발명에서 사용하는 dsRNA로는 siRNA가 바람직하다. 「siRNA」는 세포내에서 독성을 나타내지 않는 범위의 짧은 사슬로부터 되는 이중 사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 발현을 억제할 수가 있고 동시에 독성을 나타내지 않으면, 그 사슬 길이에 특히 제한은 없다. dsRNA의 사슬 길이는 예를 들면, 15 ~ 49 염기대이고, 바람직하게는 15 ~ 35 염기대이며, 더욱 바람직하게는 21~30 염기대이다.

본 발명의 dsRNA를 코드하는 DNA로는 표적 서열의 인버티드 리피트(Inverted repeat)의 사이에 적당한 서열(인트론 서열이 바람직함)을 삽입하고 머리핀 구조를 가지는 더블 스트랜드 RNA(self－complementary ‘hairpin’RNA(hpRNA))를 만드는 것 같은 콘스트럭트(Smith, N. A. , et　al. Nature, 407：319, 2000, Wesley, S. V. et　al. Plant　J. 27：581, 2001, Piccin, A. et　al. Nucleic　Acids　Res. 29：E55, 2001)을 이용할 수도 있다.

본 발명의 dsRNA를 코드 하는 DNA는 표적 유전자의 염기 서열과 완전하게 동일할 필요는 없지만 적어도 70%이상, 바람직하게는 80%이상, 더욱 바람직하게는 90%이상(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는다. 서열의 동일성은 상술한 수법(BLAST 프로그램)에 의해 결정할 수 있다.

dsRNA에 있어서의 RNA 끼리 서로 접합한 이중 사슬 RNA의 부분은 완전하게 서로 접합하고 있는 것에 한정하지 않고, 미스매치(Mismatch : 대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(Bulge: 한쪽 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의해 서로 접합하지 않는 부분이 포함되어 있어도 좋다. 본 발명에 대해서는, dsRNA에 있어서 RNA 끼리 서로 접합하는 이중 사슬 RNA 영역 중에 벌지 및 미스매치의 양쪽 모두가 포함되어 있어도 좋다.

4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드 하는 DNA의 다른 태양은 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA(안티센스 DNA)이다. 안티센스 DNA가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중 사슬 형성에 의한 전사 개시 억제, RNA 폴리메라아제에 의해 국부적으로 개상 루프 구조가 만들어진 부위와 하이브리드(hybrid) 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA와의 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 인트론과 액손과의 접합점에서의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소솜(splicesosome) 형성 부위와의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 캡핑 부위나 폴리(A) 부가 부위와의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 번역 개시 인자 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 번역 개시 억제, 개시 코돈(codon) 근방의 리보솜 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 번역 억제, mRNA의 번역 영역이나 폴리솜 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 펩티드 사슬의 신장 저지 및 핵산과 단백질과의 상호작용 부위와의 하이브리드 형성에 의한 유전자 발현 억제 등을 들 수 있다. 이것들은 전사, 스플라이싱 또는 번역의 과정을 억제하여 표적 유전자의 발현을 억제한다(히라지마(平島) 및 이노우에(井上) 「신생 화학 실험 강좌 2 핵산 IV유전자의 복제와 발현」, 일본 생화학회편, 토쿄 화학 동인, pp. 319－347, 1993). 본 발명에서 이용되는 안티센스 DNA는 상기의 어느 작용으로 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 한 가지 태양으로는 표적 유전자의 mRNA의 5＇선단 근방의 비번역 영역에 상보적인 안티센스 서열을 설계하면 유전자의 번역 억제에 효과적일 수 있다. 그러나, 코드 영역 또는 3＇측의 비번역 영역에 상보적인 서열도 사용할 수 있다. 이와 같이, 유전자의 번역 영역 뿐만 아니라 비번역 영역의 서열의 안티센스 서열을 포함한 DNA도 본 발명에서 이용되는 안티센스 DNA에 포함된다. 사용되는 안티센스 DNA는 적당한 프로모터의 하류에 연결되어 바람직하게는 3’측에 전사 종결 시그널을 포함한 서열이 연결된다.

안티센스 DNA는 본 발명의 저항성 DNA(예를 들면, 서열 번호：1에 기재한 염기 서열로부터 되는 DNA)의 서열 정보를 기본으로 포스포로티오에이트(Phosphorothioate)법(Stein, Nucleic　Acids　Res. , 16：3209－3221, 1988) 등에 의해 조제하는 것이 가능하다. 조제된 DNA는 후술 하는 공지의 방법으로 식물에 도입할 수 있다. 안티센스 DNA의 서열은 식물이 가지는 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 생산물과 상보적인 서열인 것이 바람직하지만 유전자의 발현을 유효하게 억제할 수 있는 한 완전하게 상보적이지 않아도 좋다. 전사된 RNA는 표적으로 하는 유전자의 전사 산물에 대해서 바람직하게는 90%이상(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%이상)의 상보성을 갖는다. 효과적으로 표적 유전자의 발현을 억제하려면 안티센스 DNA의 길이는 적어도 15 염기 이상이며, 바람직하게는 100 염기 이상이며, 더욱 바람직하게는 500 염기 이상이다. 통상, 이용되는 안티센스 DNA의 길이는 5 kb 보다 짧고, 바람직하게는 2.5 kb보다 짧다.

4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드 하는 DNA의 다른 태양은 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA이다. 리보자임에는 그룹 I 인트론형이나 RNaseP에 포함되는 M1RNA와 같이 400 뉴클레오티드 이상 크기의 것도 있지만, 해머 헤드형이나 머리핀형으로 불리는 40 뉴클레오티드 정도의 활성 도메인을 갖는 것도 있다(코이즈미 마코토(小泉誠)및 오오츠카 시게코(大塚榮子), 단백질 핵산 효소, 35：2191, 1990).

예를 들면, 해머 헤드형 리보자임의 자기 절단 도메인은 G13U14C15의 C15의 3＇측을 절단하지만, 활성에는 U14가 9위의 A와 염기대를 형성하는 것이 중요하여 15위의 염기는 C 외에 A 또는 U에서도 절단되는 것이 나타나고 있다(Koizumi　et. al., FEBS　Lett. 228：225, 1988). 리보자임의 기질 결합부를 표적 부위 근방의 RNA 서열과 상보적으로 되도록 설계하면, 표적 RNA중의 UC, UU 또는 UA라고 하는 서열을 인식하는 제한 효소적인 RNA 절단 리보자임을 작출하는 것이 가능하다(Koizumi　et. al. , FEBS　Lett. 239：285, 1988, 코이즈미 마코토 및 오오츠카 시게코, 단백질 핵산 효소, 35：2191, 1990, Koizumi　et. al. , Nucleic. Acids. Res. 17：7059, 1989).

또한, 머리핀형 리보자임도 본 발명의 목적을 위해서 유용하다. 머리핀형 리보자임은 예를 들면 담배 링스포트 바이러스(Tobacco ringspot virus)의 위성(satellite) RNA의 마이너스 사슬에서 발견되었다(Buzayan, Nature　323：349, 1986). 이 리보자임도 표적 특이적인 RNA 절단을 발생하도록 설계할 수 있는 것이 나타나 있다(Kikuchi　and　Sasaki, Nucleic　Acids　Res. 19：6751, 1992, 키쿠치 히로시(菊池洋), 화학과 생물　30：112, 1992). 표적을 절단할 수 있도록 설계된 리보자임은 식물세포 중에서 전사되도록 카울리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)의 35 S프로모터등의 프로모터 및 전사 종결 서열에 연결된다. 이러한 구성 단위를 텐덤(Tandem)에 병행하고, 표적 유전자내의 복수의 부위를 절단할 수 있도록 하여 보다 효과를 높일 수도 있다(Yuyama　et　al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 186：1271, 1992). 이러한 리보자임을 이용하여 표적이 되는 내인성의 본 발명의 저항성 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 절단하여 해당 DNA의 발현을 억제할 수가 있다.

＜본 발명에 의한 DNA가 삽입된 벡터＞

상기 본 발명의 DNA(본 발명의 저항성 DNA, 또는 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA)가 삽입되는 벡터로서는 식물세포내에서 삽입 유전자를 발현시키는 것이 가능한 것이면 특히 제한은 없다. 본 발명에 의한 벡터는, 본 발명의 DNA를 항상적 또는 유도적으로 발현시키기 위한 프로모터를 함유할 수 있다. 항상적으로 발현시키기 위한 프로모터로는 예를 들면, 카울리플라워 모자이크 바이러스의 35 S프로모터, 벼의 엑틴(actin) 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모타 등을 들 수 있다. 또한, 유도적으로 발현시키기 위한 프로모터로는, 예를 들면, 사상균·세균·바이러스의 감염이나 침입, 저온, 고온, 건조, 자외선의 조사, 특정의 화합물의 산포 등의 외부 요인에 의해 발현하는 것이 알려져 있는 프로모터 등을 들 수 있다. 이러한 프로모터로는, 예를 들면, 사상균·세균·바이러스의 감염이나 침입에 의해 발현하는 벼 치티나아제(Rice Chitinase) 유전자의 프로모터나 담배의 PR단백질 유전자의 프로모터, 저온에 의해 유도되는 벼의 lip19 유전자의 프로모터, 고온에 의해 유도되는 벼의 hsp80 유전자와 hsp72 유전자의 프로모터, 건조에 따라서 유도되는 애기장대의 rab16 유전자의 프로모터, 자외선의 조사에 의해 유도되는 파슬리(Parsley)의 칼콘(Chalcone) 합성 효소 유전자의 프로모터, 혐기적 조건에서 유도되는 옥수수의 알코올 디하이드로게나아제(Alcohol dehydrogenase) 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 벼 치티나아제 유전자의 프로모터와 담배의 PR단백질 유전자의 프로모터는 살리실산 등의 특정의 화합물에 의해 rab16은 식물호르몬의 아브시스산(Abscisic acid)의 산포에 의해도 유도된다.

본 발명의 약제는 본 발명의 DNA나 해당 DNA가 삽입된 벡터 자체이어도 좋고, 다른 성분이 혼합된 되고 있는 것이어도 괜찮다. 이와 같은 다른 성분으로는 특히 제한은 없고, 예를 들면, 멸균수, 생리 식염수, 식물유, 계면활성제, 지질, 용해 보조제, 완충제, 보존제 등이 있다. 또, 후술하는 아그로박테리움을 매개로 하는 방법에 의해 본 발명의 형질 전환 식물세포를 조제하는 경우에 대해서는, 상기 DNA가 도입된 아그로박테리움을 함유하는 것이어도 좋다.

＜본 발명의 형질 전환 식물세포＞

본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있었던 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포는 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하고 상기 본 발명의 저항성 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입되는 것에 의하여 형질 전환되는 식물세포이다.

또한, 본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있었던 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포는 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입되는 것에 의한 형질 전환되는 식물세포이다.

본 발명의 식물세포의 유래하는 식물로는 특히 제한은 없고, 예를 들면, 벼, 보리, 밀, 수수, 옥수수, 흰겨이삭(Creeping bentgrass) 등의 벼과 식물, 애기장대 등의 유채과 식물, 토마토 등의 가지과 식물, 콩, 알팔파(Alfalfa), 벌노랭이 등의 콩과식물, 목화 등의 아욱과 식물, 사탕무 등의 명아주과 식물을 들 수 있다.

이들 식물에서 특히 4－HPPD 억제제에 감수성의 품종이 본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높이는 적용 대상으로서 바람직하다. 4－HPPD 억제제에 감수성의 벼 품종으로서는, 예를 들면, 하바타키(Habataki), 타카나리(Takanari), 모미로만(Momiroman), 미즈호치카라(mizuhochikara), 루리아오바(Ruriaoba), 오도로키모티(Odorokimoti), 효고 우시와카마루, 카세라스, 관동 239호를 예로 들 수 있지만 이것들에 제한되는 것은 아니다.

또한, 이들 식물에서 특히, 4－HPPD 억제제에 저항성의 품종이 본 발명의 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높이는 적용 대상으로서 바람직하다. 4－HPPD 억제제에 저항성의 벼 품종으로서는, 예를 들면, 일본청, 코시히카리, 기타아오바, 아키히카리, 아키타코마치, 후쿠히비키, 베코아오바, 베코고노미, 유메아오바, 호쿠리쿠 193호, 립스타, 타치수가타, 쿠사노호시, 호시아오바, 니시아오바, 타치아오바, 마키미즈호, 모그모그아오바, 하마사리, 미나미유타카를 들 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식물세포에는 배양 세포 외 식물체 중의 세포도 포함된다. 더욱이 여러 가지의 형태의 식물세포, 예를 들면, 현탁배양 세포, 원형질체, 잎의 절편, 캘러스, 미숙 배아, 화분 등이 포함된다.

식물세포로 본 발명의 저항성 DNA가 삽입된 벡터를 도입하는 방법으로는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜법, 전기천공법(일렉트로포레이션), 아그로박테리움을 매개로 하는 방법, 파티클 건(Particle gun) 법 등 당업자에게 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수가 있다.

＜본 발명의 식물체, 및 그 번식 재료, 및 상기 식물체의 제조 방법＞

　본 발명은, 상기 형질 전환 식물세포로부터 재생된 식물체(이하, 형질 전환 식물체라고도 칭한다)를 제공한다. 형질 전환 식물세포로부터의 식물체의 재생은, 식물세포의 종류에 응해 당업자에게 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.

예를 들면, 벼에 대해 형질 전환 식물체를 만드는 수법으로는, 폴리에틸렌 글리콜에 의해 원형질체에 유전자를 도입하고 식물체를 재생시키는 방법(Datta, S. K. In　Gene　Transfer　To　Plants(Potrykus　I　and　Spangenberg　Eds. ) pp66－74, 1995), 전기 펄스에 의해 원형질체에 유전자 도입하고 식물체를 재생시키는 방법(Toki　et　al. Plant　Physiol. 100, 1503－1507, 1992), 파티클 건법에 의해 세포에 유전자를 직접 도입하고 식물체를 재생시키는 방법(Christou　et　al. Bio/technology, 9：957－962, 1991) 및 아그로박테리움을 통해서 유전자를 도입하고 식물체를 재생시키는 방법(Hiei　et　al. Plant　J. 6：271－282, 1994) 등 몇 개의 기술이 이미 확립되어 있고 본원 발명의 기술 분야에 서 광범위하게 이용되고 있다.

또한, 보리에 대한 형질 전환 식물체를 만드는 수법으로는 Tingay 등(Tingay　S. et　al. Plant　J. 11：1369－1376, 1997), Murray등(Murray　F　et　al. Plant　Cell　Report　22：397－402, 2004) 및 Traｖalla 등(Traｖalla　S　et　al. Plant　Cell　Report　23：780－789, 2005)에 기재된 방법을 들 수가 있다.

또한 수수 식물체를 재생시키는 방법으로는, 예를 들면, 아그로박테리움법이나 파티클 건법에 의해 미숙 배아나 캘러스에 유전자를 도입하여 식물체를 재생시키는 방법, 초음파에 의해 유전자를 도입한 화분을 이용하여 수분(受粉)하는 방법이 적합하게 이용되고 있다(J. A. Able　et　al., In　Vitro　Cell. Deｖ. Biol. 37：341~348, 2001, A. M. Casas　et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA　90：11212~11216, 1993, V. Girijashankar　et　al., Plant　Cell　Rep　24：513~522, 2005, J. M. JEOUNG　et　al., Hereditas　137：20~28, 2002, V　Girijashankar　et　al. , Plant　Cell　Rep　24(9)：513~522, 2005, Zuo-yu　Zhao　et　al.,　Plant　Molecular　Biology　44：789~798, 2000, S. Gurel　et　al. , Plant　Cell　Rep　28(3)：429~444, 2009, ZY　Zhao, Methods　Mol　Biol,　343：233~244, 2006, AK　Shrawat　and　H　Lorz, Plant　Biotechnol　J, 4(6)：575~603, 2006, D　Syamala　and　P　Deｖi　Indian　J　Exp　Biol, 41(12)：1482－1486, 2003, Z　Gao　et　al. , Plant　Biotechnol　J, 3(6)：591~599, 2005).

더욱이 애기장대가 있다면 Akama 등(Akama　et　al. Plant　Cell　Reports　12：7－11, 1992) 방법을 들 수 있으며 본 발명에 있어서는 이러한 방법을 매우 적합하게 이용할 수가 있다.

일단, 게놈 내에 본 발명의 DNA가 도입된 식물체를 얻을 수 있으면, 해당 식물체로부터 유성 생식 또는 무성 생식에 의해 자손을 얻는 것이 가능하다. 또, 해당 식물체나 그 자손 혹은 클론으로부터 번식 재료(예를 들면, 종자, 과실, 절수(切穗)(절단된 이삭), 주(株)(초목의 뿌리), 캘러스, 원형질체 등)를 얻고, 그들을 기본으로 해당 식물체를 양산하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명에서는 본 발명의 DNA가 도입된 식물세포, 해당 세포를 포함한 식물체, 해당 식물체의 자손 및 클론 및 해당 식물체, 그 자손 및 클론의 번식 재료가 포함된다.

또한, 본 발명은 (I) 상기 본 발명의 저항성 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정 및 (II) 공정(I)에 대해 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체의 제조 방법도 제공하는 것이다.

더욱이 본 발명은 (I) 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정 및 (II) 공정(I)에 대해 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체의 제조 방법도 제공하는 것이다.

＜식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법＞

본 발명의, 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법은 피실험식물에 있어서 본 발명의 저항성 DNA 혹은 대응하는 감수성 DNA(이하, 본 발명의 검출 대상 DNA라고 칭함) 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열을 해석하는 것을 특징으로 한다. 덧붙여 「감수성 DNA」란 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA이다.

본 발명의 검출 대상 DNA는 전형적으로는 아래와 같이(a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA이다.

(c) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열로부터 되는 DNA와 가혹한 조건으로 교잡하는 DNA

덧붙여 (a)로부터 (d)에 있어서의 DNA의 의미는 원칙으로 상기한 바와 같지만, 본 발명의 검출 대상 DNA에 대해서는, 특히 내인성의 DNA를 의미하고, 또한, 저항성 DNA 및 감수성 DNA의 쌍방이 포함되는 의미이다.

후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이 4－HPPD 억제제 저항성 품종인 일본청에 있어서의 HIS1 유전자와 비교해서 4－HPPD 억제제 감수성 품종인 모미로만, 타카나리, 카세라스에 있어서의 대응 유전자의 서열에 대해서는 염기의 삽입이나 결실이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 검출 대상 DNA의 염기 서열을 해석하는 것에 의해 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정할 수가 있다.

또한, 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성은 열성 유전하는 것으로부터 본 발명의 검출 대상 DNA의 발현량 및 그 발현량을 제어하는 영역(인핸서, 프로모터, 사이렌서, 인스 레이터)의 염기 서열을 해석하는 것에 의해 식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정할 수도 있다.

본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열의 해석에 있어서는 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역을 PCR에 의해 증폭한 증폭 생산물을 이용할 수가 있다. 상기 PCR를 실시하는 경우에 있어서 이용되는 프라이머는 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역을 특이적으로 증폭할 수 한 제한은 없고, 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 서열 정보(예를 들면, 서열 번호：1)에 기초해서 적당히 설계할 수가 있다. 적합한 프라이머로는 서열 번호：13로 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머 및 서열 번호：14로 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 들 수 있다. 이들 프라이머를 적당 조합하여 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 특정의 염기 서열을 증폭할 수가 있다.

또한, 피실험식물의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성의 판정에 대해서는, 예를 들면, 「대조의 염기 서열」이라고 비교하는 공정을 포함할 수가 있다. 피실험식물에 있어서의 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열과 비교하는 「대조의 염기 서열」은 벼 이면, 전형적으로는, 4－HPPD 억제제 저항성 품종(예를 들면, 일본청, 코시히카리, 기타아오바, 아키히카리, 아키타코마치, 후쿠히비키, 베코아오바, 유메아오바, 호쿠리쿠 193호, 립스타, 타치수카타, 쿠사노호시, 호시아오바, 니시아오바, 타치아오바, 마키미즈호, 모그모그아오바, 하마사리, 미나미유타카) 또는 4－HPPD 억제제 감수성 품종(예를 들면, 하바타키, 타카나리, 모미로만, 미즈호치카라, 루리아오바, 오도로키모티, 효고우시와카마루, 카세라스, 관동 239호)에 있어서 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열이다.

또한, 본 발명의 감수성 DNA의 예로서 타카나리 또는 모미로만 유래의 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자(변이 HIS1 유전자)의 염기 서열을 서열 번호：15로 나타낸다.

결정한 피실험식물에 있어서 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열과 4－HPPD 억제제 저항성 품종에 있어서 그러한 염기 서열(예를 들면, 서열 번호：1, 서열 번호：16) 또는 4－HPPD 억제제 감수성 품종에 있어서의 그러한 염기 서열(예를 들면, 서열 번호：15)을 비교하는 것에 의해 피실험식물이 4－HPPD 억제제에 대해서 저항성을 갖는가 감수성을 갖는가를 평가할 수 있다. 예를 들면, 4－HPPD 억제제 저항성 품종에서 염기 서열(예를 들면, 서열 번호：1)과 비교하여 염기 서열에 대해 크게 다른 점이 있는 경우(특히, 새로운 종지 코돈의 출현이나 프레임 쉬프트에 의해 코드하는 단백질의 분자량이나 아미노산 서열에 큰 변화가 생기는 경우) 피실험식물은 4－HPPD 억제제에 대해서 감수성을 가지고 있는 개연성이 높은 것으로 판정된다.

또한, 본 발명의 판정 방법에서 피실험식물로부터의 DNA의 조제는 통상적인 방법, 예를 들면, CTAB법을 이용하여 실시할 수가 있다. DNA를 조제하기 위한 식물로는 성장한 식물체 뿐만 아니라, 종자나 어린 식물체를 이용할 수도 있다. 또, 염기 서열의 결정은, 통상적인 방법, 예를 들면, 디데옥시(Dedeoxy)법이나 막삼-길버트(Maxam-Gilbert)법 등에 의해 행할 수가 있다. 염기 서열의 결정에 대해서는 시판하는 시퀀스 키트 및 시퀀서를 이용할 수가 있다.

피실험식물에 있어서 본 발명의 검출 대상 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열이 대조의 염기 서열과 다른지 아닌지는 상기한 직접적인 염기 서열의 결정 이외에 여러 가지의 방법에 의해 간접적으로 해석할 수가 있다. 이러한 방법으로서는, 예를 들면, PCR－SSCP(Single－Strand　Conformation　Polymorphism, 한 개 사슬 고차 구조 다형) 법, 제한 효소 단편 장다형(Restriction　Fragment　Length　Polymorphism/RFLP)를 이용한 RFLP법이나 PCR－RFLP법, 변성제 농도 구배 겔 전기 영동법(Denaturant　Gradient　Gel　Electrophoresis：DGGE), 아렐 특이적 올리고 뉴클레오티드(Allele　Specific　Oligonucleotide/ASO) 교잡(Hybridization)법, 리보누크레아제 A 미스매치(Ribonuclease A mismatch) 절단법을 들 수 있다.

본 발명의 식물에 있어서 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 다른 방법은 피실험식물에서 상기(a)~(d)로부터 되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA의 발현 또는 증폭 생산물 혹은 발현 생산물의 분자량을 검출하는 것을 특징으로 한다.

후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 4－HPPD 억제제 저항성 품종인 일본청, 코시히카리, 호쿠리쿠 193호에 있어서 HIS1 유전자의 제4 엑손 전반 영역은 4－HPPD 억제제 감수성 품종인 모미로만이나 타카나리에 있어서의 그것들보다 길다. 따라서, 본 발명의 검출 대상 DNA의 증폭 생산물 또는 발현 생산물의 분자량을 검출하는 것에 의해 식물에 있어서 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정할 수가 있다.

또한, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성은 열성 유전하는 것으로부터 본 발명의 검출 대상 DNA의 발현을 검출하는 것에 의해 식물에 있어서 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정할 수가 있다.

여기서 「DNA의 발현의 검출」은 전사 레벨에 있어서 검출 및 번역 레벨에 서의 검출의 쌍방을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 「발현의 검출」은 발현의 유무의 검출 뿐만 아니라 발현의 정도의 검출을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 검출 대상 DNA(예를 들면, 게놈 DNA)의 증폭은 PCR(Polymerase　chain　reaction) 법에 의해 실시할 수가 있다.

본 발명에 따른 DNA의 전사 레벨에 있어서의 검출은, 통상적인 방법, 예를 들면, RT－PCR(Reｖerse　Transcribed－Polymerase　Chain　Reaction) 법이나 노잔브롯팅(Northern Blotting)법에 의해 실시할 수가 있다. 상기 PCR를 실시하는 경우에 이용되는 프라이머는 본 발명의 검출 대상 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 한 제한은 없고, 이미 결정된 본 발명의 저항성 DNA 혹은 감수성 DNA의 서열 정보(예를 들면, 서열 번호：1, 서열 번호：16, 서열 번호：15)에 근거해 적당하게 설계할 수가 있다. 매우 적합한 프라이머로서는 서열 번호：3~14의 어느 쪽에 기재한 염기 서열로부터 되는 프라이머를 들 수 있다. 또한, 이들 프라이머를 적당 조합하여 본 발명의 검출 대상 DNA의 특정의 염기 서열을 증폭할 수가 있다.

한편, 번역 레벨에 있어서의 검출은, 통상적인 방법, 예를 들면, 웨스턴브롯팅(Westhern Blotting)법에 의해 실시할 수가 있다. 웨스턴브롯팅에 이용하는 항체는 폴리클로날 항체에서도 단일 클론 항체이어도 좋고, 이들 항체의 조제 방법은, 당업자에게 주지되어 있다.

또한, 본 발명의 검출 대상 DNA의 발현은 본 발명의 검출 대상 DNA의 발현 제어 영역의 하류에 리포터 유전자를 발현 가능하게 연결한 벡터를 구축해, 해당 벡터를 식물세포에 도입해, 리포터 활성을 검출하는 것으로써, 판정할 수도 있다.

유전자 발현의 검출의 결과, 피실험식물에 대해, 본 발명의 검출 대상 DNA의 발현량이 4－HPPD 억제제 저항성 품종(예를 들면, 벼에 대해서는 일본청, 코시히카리, 기타아오바, 아키히카리, 아키타코마치, 후쿠히비키, 베코아오바, 베코고노미, 유메아오바, 호쿠리쿠 193호, 립스타, 타치수카타, 쿠사노호시, 호시아오바, 니시아오바, 타치아오바, 마키미즈호, 모그모그아오바, 하마사리, 미나미유타카)의 발현량보다 유의하게 낮으면(예를 들어, 본 발명의 검출 대상 DNA가 실질적으로 발현하지 않으면), 또한, 본 발명의 검출 대상 DNA의 증폭 생산물 또는 발현 생산물의 분자량이 4－HPPD 억제제 저항성 품종(예를 들면, 일본청, 코시히카리, 기타아오바, 아키히카리, 아키타코마치, 후쿠히비키, 베코아오바, 베코고노미, 유메아오바, 호쿠리쿠 193호, 립스타, 타치수카타, 쿠사노호시, 호시아오바, 니시아오바, 타치아오바, 마키미즈호, 모그모그아오바, 하마사리, 미나미유타카)에 있어서의 분자량과 유의하게 다르면 피실험식물은 4－HPPD 억제제에 대해서 감수성을 가지고 있는 개연성이 높은 것으로 판정된다. 실제 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 4－HPPD 억제제 저항성 품종(일본청, 코시히카리, 호쿠리쿠 193호)의 저항성 DNA와 비교해서 4－HPPD 억제제 감수성 품종(모미로만, 타카나리)에 있어서의 감수성 DNA의 분자량은 유의하게 작다.

＜본 발명의 식물을 육종하는 방법＞

본 발명은, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물을 육종하는 방법을 제공한다. 이러한 육종 방법은 (a) 4－HPPD 억제제에 대한 저항성의 식물 품종과 임의의 식물 품종을 교배시키는 공정, (b) 교배에 의해 얻어진 개체에 있어서 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 상기 본 발명의 판정 방법에 의해 판정하는 공정 및 (c) 4－HPPD 억제제에 대해 저항성을 가진 것으로 판정된 품종을 선발하는 공정을 포함한다.

또한, 본 발명은, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물을 육종하는 방법을 제공한다. 이러한 육종 방법은 (a) 4－HPPD 억제제에 대한 감수성의 식물 품종과 임의의 식물 품종을 교배시키는 공정, (b) 교배에 의해 얻을 수 있는 개체에 있어서, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 상기 본 발명의 판정 방법에 의해 판정하는 공정 및 (c) 4－HPPD 억제제에 대해 감수성을 가진다고 판정된 품종을 선발하는 공정을 포함한다.

4－HPPD 억제제에 대한 저항성의 식물 품종과 교배시키는 「임의의 식물 품종」으로는, 예를 들면, 4－HPPD 억제제 감수성 품종, 4－HPPD 억제제 저항성 품종과 4－HPPD 억제제 감수성 품종과의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체를 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성의 식물 품종과 교배시키는 「임의의 식물 품종」으로서는, 예를 들면, 4－HPPD 억제제 저항성 품종, 4－HPPD 억제제 저항성 품종과 4－HPPD 억제제 감수성 품종과의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체를 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 4－HPPD 억제제에 대한 감수성은 열성 유전하는 것으로부터 교배에 의해 얻을 수 있는 개체가 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 나타내기 때문에 4－HPPD 억제제에 대한 감수성형의 HIS1 유전자를 호모로 보유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 육종 방법을 이용하면 4－HPPD 억제제 저항성 또는 감수성의 품종을 종자나 유식물의 단계에서 선발하는 것이 가능하게 되며 해당 형질을 가지는 품종의 육성을 단기간으로 실시하는 것이 가능해진다.

실시예

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, 이하의 실시예는 이하에서와 같이 실험, 해석을 수행하였다.

[QTL해석]

고시히카리/하바타키 염색체 절편 치환 계통 및 타치수가타//타치수가타/모미로만의 BC1F4을 시험하였다. 즉, 저항성 품종 고시히카리를 유전적 배경으로 하고, 그 염색체 절편의 일부를 인도형 감수성 품종 하바타키의 염색체로 대체한 고시히카리/하바타키 염색체 절편 치환 계통 군(KHSL)을 해석하였다. 또한 KHSL은 32계통으로 구성하고 하바타키 전 12염색체의 모두에 대해 해석이 가능하였다(KHSL에 대해서는 무라타 카즈마사 등 "고시히카리를 유전적 배경으로 한 인도형 품종 하바타키의 염색체 절편 치환 계통 군의 육성과 평가", 육종학연구, 2009년 3월 27일 제11권, 별1호, 66쪽 참조). 또 감수성 품종 모미로만에 저항성 품종의 것을 1회 역으로 교잡하여 얻어진 BC1F4계통 군 94계통도 SSR마커 80종을 이용하여 해석하였다(이용한 SSR표식에 대해서는 "Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice(Oryza sativa L.)", DNA Res, 2002년 9권, 6호, 199~207쪽, http://www.gramene.org/참조).

＜Tos17 삽입 계통을 이용한 연쇄 해석＞

벼에 대해 발견된 레트로트랜스포손(Retrotransposon)인 Tos17는 조직배양에 의해 활성화되어 게놈내에 스스로의 카피를 전이시킨다. 전이선이 유전자의 내부에서 있는 경우 그 유전자는 파괴되어 돌연변이를 일으키는 것이 알려져 있다(Hirochika등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996년, 93권, 7783~7788 페이지 참조). 본 실시예에 대해서는 이 현상을 이용하여 조직배양에 의해 작출한 변이를 축적한 벼의 집단(돌연변이체 패널, 데이타베이스명：Tos17 돌연변이체 패널 데이타베이스(http：／／tos. nias. affrc. go. jp/~miyao/pub/tos17/))를 이용했다. Tos17 돌연변이체 패널 데이타베이스로부터, QTL 해석으로 특정된 유전자좌에 있는 BBC 감수성과의 관여가 강하게 의심되는 철·아스코르빈산 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자의 전사 부위에 Tos17가 삽입된 2 계통을 선출하였다. 그리고, 이들 2 계통의 각 15 개체를 재배하여 얻어진 자식종자를 이용하여 표현형(BBC 감수성)과 유전자형(Tos17의 삽입)에 대해 조사하였다.

＜유전자 클론의 취득＞

QTL 해석으로 특정된 유전자좌에 있는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 mRNA(AK065581)를 벼 유전자 은행으로부터 입수하였다.

＜벡터 구축 및 형질 전환＞

nos 프로모터로 드라이브 되는 카나마이신 저항성 유전자(NPT2) 또는 CaMV35S 프로모터로 드라이브 되는 하이그로마이신 저항성 유전자(mHPT)와 CaMV35S 프로모터로 드라이브 되는 AK065581(HIS1 유전자) 또는 AK241948(HSL1 유전자)의 각 발현 카셋트를 연결한 바이너리 벡터를 구축하고(도 3~7 참조), 아그로법의 형질 전환으로 시험하였다.

A. thaliana의 형질 전환은, 에코 타입 「Columbia」를 이용하여 Floral　dip법으로 수행하였다(Weigel　and　Glazebrook,　Arabidopsis,　a　laboratory　manual,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press　(2002)　p131－132　참조). 즉 먼저, 항생 물질을 포함한 액체 배양지(LB 또는 YEB)에 있어 아그로박테리움을 진탕 배양하고, 대략 16시간 후에 배양액 중 2 ml를 항생 물질을 포함한 액체 배지(LB 또는 YEB)에 첨가하고 추가로 진탕 배양을 하였다. 그리고, 그 대략 16시간 후, 배양액을 4℃, 8000 rpm에서 10분간 원심 처리를 하고, 상등액을 제거하여 얻어진 침전물을 5% 스크로스를 포함한 액 500 ml에 현탁시켰다. 그리고, 형질 전환의 직전에 형질 전환용 시약　silwet(등록상표：SILWET　L－77, 제품 번호：BMS－SL7755, 바이오메디칼사이언스 사제)를 최종 농도 0.025%가 되도록 첨가하였다. 그 다음에, 얻어진 아그로박테리움 현탁액에 이미 개화, 수분한 꽃눈을 제거한 아라비드프시스(Arabidopsis)를 30~120초간 담그었다. 그 후, 대략 16시간 방치한 후 식물체를 생육시켜 종자를 얻었다.

벼의 형질 전환은 BBC 감수성 벼 품종 관동 239호를 이용하여 「Taniguchi등, Plant　Cell　Rep. , 2010년, 29권, 11호, 1287~1295 페이지」에 기재한 방법의 일부를 개변하여 수행하였다. 즉 먼저, 멸균한 완숙 종자를 N6D 배지에 평탄하게 배치하고 30℃으로 7일간 배양하고, 아그로박테리움을 감염시켜, 아세트실리콘(AS)을 포함한 N6배지(2 N6－AS배양지) 암흑 조건하에서 3일간, 25℃ 공배양을 하였다. 그 후, 감염된 조직은 카르베니실린(Carbenicillin)을 포함하는 N6D 배지에서 4~6주간(낮이 긴 18시간), 40 mg/L　하이그로마이신(Hyg) 존재하에서 배양하고, Hyg 내성 캘러스를 재분화시켰다.

토마토의 형질 전환은 품종 「마이크로 톰(Micro-Tom)」을 시험하고 도 5 및 7에 나타낸 벡터(35 SHIS1　pZK3, 35 SHSL1　pZK3)를 이용하여 아그로박테리움법으로 실시하였다. 또한, 원품종 마이크로 톰은 25℃의 인큐베이터에서 0. 3㎛의 벤조비시클론(BBC)를 포함한 한천 배지에서 종자를 발아시키면 약 2주일 후에 잎 부분의 백화를 명료하게 확인할 수 있었다.

상기 토마토의 형질 전환의 결과 HIS1 유전자 또는 HSL1 유전자가 도입된 복수의 재분화 식물체를 얻을 수 있었다. 또한, 재분화한 식물체는 PCR에 의해 도입 유전자를 확인하였다.

＜재조합체의 BBC 저항성 검정＞

작출한 A. thaliana 재조합체(T2세대) 및 벼 재조합체(T0세대)의 BBC 저항성 검정에는 주식회사 에스·데·에스바이오텍크 보유의 BBC 원체를 후술하는 농도에서 이용하였다.

＜재조합체의 트리케톤계 4－HPPD 저해제에 대한 저항성의 검정＞

작출한 벼 재조합체(T1 및 T2세대)의 새 케톤계 4－HPPD 저해제, 즉 메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온 및 NTBC 저항성 검정에는 시판의 각 시약을 후술하는 농도로 이용하였다.

＜PCR＞

HIS1(AK065581)의 5개의 각 엑손 영역 내를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 설계하여 PCR로 시험하였다. 또한 PCR는 표 1에 나타내는 염기 배열로부터 되는 프라이머를 이용하여 94℃　30초, 55℃　30초, 72℃　30초의 35 사이클로 수행하였다. 또, 주형 DNA로는 BBC 감수성 벼 품종(모미로만, 타카나리, 카세라스) 및 BBC 저항성 벼 품종(일본청, 코시히카리, 호쿠리쿠 193호)의 잎으로부터 CTAB법을 이용하여 추출한 게놈 DNA를 이용했다.

(실시예 1) 4-HPPD 억제제 저항성 유전자좌의 특정

자포니카(Japonica) 형 벼 중에서, 4－HPPD 저해제의 일종인 BBC에 대한 감수성을 가지는 품종은 알려지지 않았다. 한편, 자포니카형과 인디카(Indyca)형의 교잡에 의해 육성된 벼 품종에는 BBC 감수성이 출현하는 일이 있다.

여기서, BBC 저항성 벼 품종 「코시히카리」라고 감수성 벼 품종 「하바타키」를 이용한 코시히카리/하바타키 염색체 단편 치환 계통(KHSL)의 QTL 해석을 앞에서와 같이 수행하였다. 그 결과, 제2 염색체 단완 영역이 하바타키형으로 치환된 KHSL(KHSL04)만이 감수성을 나타낸 것으로부터 BBC 저항성을 결정하는 유전자좌는 코시히카리의 제2 염색체 단완상에 있는 것이 밝혀졌다(표 2 참조). 또한 표 2에는 KHSL의 QTL 해석의 결과의 일부를 나타낸 것이다. 또한, 표 2중 「A」는 마커가 코시히카리 유래인 것을 나타내고, 「B」는 마커가 하바타키 유래인 것을 나타낸다.

또한 BBC저항성 벼 품종 "타치수가타"와 감수성 벼 품종 "모미로만"을 이용한 타치수가타//타치수가타/모미로만의 BC1F4의 QTL해석을 상기와 같이 수행하였다. 그 결과 상기처럼 BBC 내성을 결정하는 유전자좌는 타치수가타의 제2염색체 단완상에 있다는 것이 명확하며, 다른 벼 품종을 시험한 QTL해석으로 특정한 유전자좌는 동일 영역이며, 벼 품종 "일본청" 데이터베이스 정보에 따르면 11종의 후보 유전자가 존재하는 것이 확인되었다(표 3참조).

또한, 11종의 후보 유전자의 염기 서열 및 추정 아미노산 서열은 모두 BBC에서 영향을 받는 치로신 대사 경로 및 카로테노이드 생합성 경로(도 1 참조)의 효소 및 그 유전자와 상동성이 없는 것도 밝혀졌다.

또한 벼 품종 「일본청」데이타베이스 정보에 의하면 BBC로 활성 저해를 받는 HPPD 효소를 코드하는 기존 유전자와 가장 상동성이 높은 벼 유전자는 제2 염색체 단완상에 있지만 QTL 해석으로 특정된 유전자좌와는 달랐다(도 8 참조).

더욱이, BBC 저항성에 관여하는 유전자가 좌승하는 영역을 좁히기 때문에, KHSL04와 코시히카리를 교잡한 F2집단, 및 모미로만으로 한 것을 1회 역교배 하여 얻어진 BC1F4 계통군으로부터 제2 염색체 단완에 관한 해석 집단을 작출하고, 2 집단을 이용하여 다시 해석을 시도한 결과, BBC 저항성에 관여하는 유전자는 SSR 마커 RM12980와 RM12983와의 사이에 존재하는 것이 분명해졌다. 그리고, 좁힌 영역에 존재하는 유전자를 RAP－DB으로 검색한 결과 글리옥살라제 유사 단백질(741 bp)을 제외하고 10개의 후보 유전자의 존재가 확인되었다.

(실시예 2)　4－HPPD 저해제 저항성 유전자의 분류

상술한 바와 같이, QTL 해석에 의해 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 결정하는 유전자가 벼 제 2 염색체단완상에 있는 것이 시사되었다. 거기서 해당 유전자좌에 있는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자에 주목하고, Tos17 삽입 계통을 시험하여 표현형(BBC 고감수성)과 유전자형과의 연쇄 관계를 분명히 하는 것과 동시에 BBC 감수성의 A. thaliana 및 벼에 해당 유전자를 도입한 재조합체를 작출하여 BBC 저항성 부여 효과를 조사하였다.

즉, QTL 해석으로 특정된 BBC 저항성 결정 유전자좌에는 BBC로 활성 저해되는 HPPD 효소와 같이 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소로 추정되는 유전자(이하, 「표적 유전자」라고도 칭함)가 있다(표 4 참조).

Tos17 삽입 계통의 원품종 「일본청」은 BBC 저항성 품종이지만 표적 유전자의 전사 부위에 Tos17가 삽입된 계통에서는 BBC 감수성 개체가 출현한다. 합계 30 개체를 시험한 연쇄 해석에 의해 표현형(BBC 감수성)과 유전자형(Tos17 삽입 호모형)에 대해 조사한 결과, Tos17 삽입 호모 6 개체의 후대는 모두 BBC 감수성을 나타냈다. 또, Tos17 삽입 이질 18 개체의 후대부터는, 모두 BBC 감수성의 개체를 분리하였다. 이 결과로부터, 철·아스코르빈산 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자가 BBC 저항성에 깊게 관여하는 것이 시사되었다.

여기서, 표적 유전자가 BBC 저항성 유전자인 것을 실증하기 위하여 0.03㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 A. thaliana(에코 타입 Columbia)에 표적 유전자를 도입한 재조합체(T2세대)를 제작하여 상기 BBC 농도의 존재하에서 이 재조합체의 생육 상황을 조사하였다. 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다.

또한, 0.1㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 BBC 감수성 벼 품종 「관동 239호」에 표적 유전자를 도입한 재조합체(T0세대)를 제작하여 300 ga. i. /ha의 BBC로 처리한 배토에서 이 재조합체의 생육 상황을 조사하였다. 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다.

또한, 0.1㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 BBC 감수성 벼 품종 「관동 239호」에 표적 유전자를 도입한 재조합체를 제작하고, T1종자 또는 T2종자를 얻었다. 이들을 2㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에 파종하여 재조합체의 생육 상황을 조사하였다. 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 또한, 상기 종자를 1㎛의 메소트리온, 2.5㎛의 테퓨리트리온, 0.5㎛의 템보트리온 또는 1㎛의 NTBC를 포함한 한천 배지에 파종하여 재조합체의 생육 상황을 조사하였다. 얻어진 결과를 도12~15에 나내었다.

도 9에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 표적 유전자를 도입한 상기 A. thaliana 재조합체는 0.03㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하지 않고 생육하였다. 또한 도 10에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이 표적 유전자를 도입한 상기 벼 재조합체는 300 ga. i. /ha의 BBC로 처리한 배토로 백화하지 않고 생육하였다. 게다가 도 11에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이 표적 유전자를 도입한 상기 벼 재조합체는 2㎛의 BBC로 처리한 한천 배지에서 백화하지 않고 생육하였다. 덧붙여 이 농도는 BBC 저항성 품종인 일본청을 백화시키는 고농도이다.

또한, 도 12~15에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이 표적 유전자를 도입한 상기 벼 재조합체는 BBC 이외의 트리케톤계 4－HPPD 저해제(메소트리온, 테퓨리트리온, 템보트리온 또는 NTBC)를 포함한 배지에서도 백화하지 않고 생육하였다. 즉, 표적 유전자를 도입한 벼 재조합체는, 1㎛의 메소트리온, 2.5㎛의 테퓨리트리온, 0.5㎛의 템보트리온 또는 1㎛의 NTBC로 처리한 한천 배지에서 백화하지 않고 생육하였다.

이러한 결과로부터, 표적 유전자는 4－HPPD 저해제 저항성 유전자(HIS1 유전자), 즉 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA인 것이 실증되었다.

(실시예 3)　HIS1 유전자의 염기 배열 해석에 의한 4－HPPD 저해제에 대한 저항성 또는 감수성의 판정

일본형 벼 제 2 염색체인 HIS1 유전자는 특정되었지만, HIS1 유전자를 증폭하는 PCR를 실시하면, BBC 감수성 벼 품종에 대해도 증폭 생산물은 얻을 수 있다. 또한 BBC 감수성 벼 품종 중에서 카세라스는 BBC 처리 조건에 따라서는 감수성·저항성의 판정이 곤란한 경우가 있다. 여기서, HIS1 유전자의 특정 영역을 증폭하는 PCR에 의해 HIS1 유전자의 염기 배열과 BBC 감수성의 정도와의 관련 유무를 판정할 수 있는지를 조사하였다.

또한 도면에는 나타나 있지 않지만, 모미로만, 타카나리, 카세라스는 모두 BBC 감수성 품종이지만, 그 정도가 다르며 카세라스의 BBC 감수성과 비교해서 모미로만 및 타카나리는 보다 강한 BBC 감수성을 나타내는 것은 확인되었다.

여기서 먼저, HIS1 유전자의 5개의 각 엑손 영역내를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 BBC 감수성 품종(모미로만, 타카나리, 카세라스)과 BBC 저항성 품종(일본청, 코시히카리, 호쿠리쿠 193호)을 해석하였다. 얻어진 결과는 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 결과로부터 분명한 것 바와 같이 HIS1 유전자의 제4 엑손의 전반 부분을 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR에서 해석한 결과, BBC강감수성 품종의 모미로만 및 타카나리에서는 BBC 저항성 품종과 비교해서 PCR 산물의 분자량이 작은 것으로 밝혀졌다.

게다가 BBC 감수성 품종 모미로만 및 타카나리와 BBC 저항성 품종 일본청을 게놈 DNA의 배열에 대해 비교하였다. 얻어진 결과는 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이 상술한 PCR의 해석 결과와 합치하며, 모미로만 및 타카나리에 대해서는 HIS1 유전자의 제4 엑손의 전반 부분에 서 28 bp가 결실되는 것을 알았다. 게다가 HIS1 유전자의 제4 엑손과 제5 엑손과의 사이의 인트론에 대해서도 19 bp 및 16 bp의 결실부위가 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 HIS1 유전자의 제5 엑손에 있어서는, 1 bp(아데닌)의 결실과 5 bp의 삽입이 있는 것도 확인되었다.

또한 BBC 감수성 품종 카세라스와 BBC 저항성 품종 일본청을 게놈 DNA의 배열에 대해 비교하였다. 얻어진 결과는 도 18에 나타내었다.

도 18에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이, 상술한 PCR의 해석 결과와 합치하며, 카세라스에 대해서는 HIS1 유전자의 제4 엑손의 전반 부분에서 결실되는 것이 확인되었다. 그러나, HIS1 유전자의 제4 엑손과 제5 엑손과의 사이의 인트론에 대해서는 TA의 삽입과 16 b.p.의 결실부위가 있는 것으로 확인되었다. 또한 HIS1 유전자의 제5 엑손에 있어서는 아데닌의 결실, 5 bp의 삽입 및 시트신의 삽입이 있는 것이 확인되었다.

따라서, 이러한 결과로부터 HIS1 유전자의 제4 엑손으로부터 제5 엑손에 걸친 염기의 결실 및/또는 삽입에 의해 HIS1 유전자가 코드하는 단백질을 갖는 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성이 억제되고 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 모미로만 및 타카나리와 카세라스와의 4－HPPD 저해제에 대한 감수성의 상위는 HIS1 유전자의 제4 엑손의 전반 부분에 있서의 결실의 유무 등에 기인하는 것이라고 생각된다.

(실시예 4)　HIS1 유전자와 상동성을 가지는 유전자의 해석

다음에, HIS1 유전자와 상동성을 가지는 유전자를 데이타베이스에서 탐색하였다. 즉, NCBI　Blast를 이용하여 HIS－1 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을 쿼리(Query)로 하여 tBLASTN 검색(디폴트 설정)을 실시하였다. 또한 서치 대상 데이터는 nr/nt(non－redundant　nucleotide　collection)이다.

그 결과, HIS1 유전자와 가장 상동성이 높은 벼 유전자(HSL1 유전자)는 제6 염색체에 좌승하여 추정 아미노산 서열의 상동성은 약 86% 정도로 높은 것으로 확인되었다(도 19 참조). 또한, 제6 염색체상의 상동 유전자는 근방에서 다중 유전자군(클러스터)을 형성하고 있는 것도 밝혀졌다.

그렇지만, 이러한 제6 염색체상의 상동 유전자가 코드하는 단백질은 HIS1 유전자로 변이가 생기고 있는 감수성 품종에 대해도 발현하고 있다고 추정된다.

이 점에 관해서는, 도 20에 나타낸 바와 같이 HIS1 유전자는 주로 잎으로 발현하고 있지만, 제6 염색체상의 상동 유전자는 주로 뿌리나 곡물 등이 익어가고 있음 중의 종자로 발현하고 있는 것으로부터, 제6 염색체상의 상동 유전자가 코드하는 단백질은, 잠재적으로 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지고 있지만, 잎에서의 발현량이 낮기 때문에 그 효과가 나타나지 않는다고 할 가능성이 있다고 생각된다.

또한 도 20은, RiceXPro(벼 유전자 발현 데이타베이스/http：／／ricexpro. dna.affrc.go.jp/)를 이용하여 HIS1(Os02g0280700)와 제6 염색체상의 상동 유전자(Os06g0176700/Os06g0178500)의 조직·생육 시기별의 발현 패턴을 해석한 결과에 근거한다(Sato등, Nucleic　Acids　Res. 2010년 11월 2일［Epub　ahead　of　print］참조).

또한 , HIS1 유전자의 상동 유전자는 단자엽 식물에만 산재하고, 쌍자엽 식물에 대해서는 확인되지 않는 것이 밝혀졌다(도 21 참조). 게다가 HIS1 유전자와 상동성이 약간 낮은 유전자군은 에틸렌 합성계 ACC 오키시다제 유전자군을 비롯한식물 전반에 분포하고 있지만, 기능적으로는 다르다고 생각된다. 또한 도 21은 tBLASTN 해석에 의해 HIS1와 상동성을 가지는 단백질의 아미노산 서열을 추출하여 얻어진 서열을 기초로 ClustalW 소프트웨어를 이용하여 계통수 해석을 실시하고, TreeView 소프트웨어에 의해 묘사한 것이다.

(실시예 5)　HSL1 유전자의 해석

HIS1 유전자와 가장 상동성이 높고 제6 염색체에 좌승하는 벼 유전자(HSL1 유전자)에 대해서도 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA인지를 조사하였다.

즉, 0.1㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하는 BBC 감수성 벼 품종 「관동 239호」에 표적 유전자를 도입한 재조합체를 제작하고 T1종자 또는 T2종자를 얻었다. 이들을 0. 12㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에 파종하여 재조합체의 생육 상황을 조사하였다. 얻어진 결과를 도 22에 나타내었다.

도 22에 나타낸 결과로부터 분명한 바와 같이 상동 유전자를 도입한 벼 재조합체는 0.12㎛의 BBC를 포함한 한천 배지에서 백화하지 않고 생육하였다. 이 농도는 BBC 저항성 품종 「일본청」이 백화하지 않는 농도이다. 이 결과로부터 내성의 정도는 낮기는 하지만 HSL1 유전자는 HIS1 유전자와 같게 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 DNA인 것이 실증되었다.

본 발명의 4－HPPD 저해제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물을 이용하여 재배를 실시하면, 재배논이나 재배밭의 잡초 방제를 효율적으로 실시할 수가 있다. 또한, 본 발명의 식물에 있어서 4－HPPD 저해제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법은, 예를 들면, 윤작 체계에 있어서의 전년작에 저절로 땅에 떨어진 종자의 발아 리스크의 경감에 이용할 수가 있다. 이와 같이, 본 발명은, 유용 식물의 수확량의 안정이나 증대에 크게 공헌할 수 있는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> INCORPORATED ADMINISTRATIVE AGENCY NATIONAL AGRICULTURE AND FOOD RESEARCH ORGANIZATION TOYAMA PREFECTURE SDS BIOTECH K.K. <120> PLANT HAVING INCREASED RESISTANCE OR SENSITIVITY TO 4-HPPD INHIBITOR <130> IBPF11-547WO <150> JP2010/293451 <151> 2010-12-28 <160> 17 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1729 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 ggctagctcc ccaagtcgaa acgtcgtcgc ccctcatcat ctcctcctcg ttgtcgcacc 60 cccaaccgca cgctgccgcc gctcgcttcc tcctctcctc gtctcactcc agaaagccaa 120 gctgcaaagc actatggcac atcccatagc aatggcagca tggacacaca gccatcggag 180 ccgaccgtgg taaaagcttt catcgcggtg cctgatatat cgacgccgac atcgagcacg 240 ccccaactcc atatgtattt gcaggctata gatgagctga aagatctcct ttcttttcaa 300 gcaagaacaa agttaagcaa gggaagatcc aagaacaaga acaccaatgg ctgacgagtc 360 atggagggcg ccggcgatag tgcaagagct ggcggcagcc ggcgtcgagg agccgccgag 420 ccgatacctg ctacgggaga aagaccgttc tgacgtcaag ctggtcgccg ccgagctgcc 480 ggagcccctc cccgtcgttg atctcagccg gctagatggt gccgaggagg ccaccaagct 540 cagggtggct ctgcagaatt ggggcttctt cctgcttacc aaccatggag tagaagcctc 600 tctgatggac agcgtgatga acttgtcgag agagtttttc aaccaaccaa tcgaacggaa 660 gcaaaaattc agcaacttga tcgatggcaa gaacttccag attcaagggt atggaactga 720 ccgggtggtt acccaagatc agatcctgga ctggtctgat cggttgcatc tcagagttga 780 acccaaggag gagcaagatc ttgccttctg gcctgaccat cctgaatctt tcagggatgt 840 tctgaacaag tatgcatcag gaaccaaaag aattagagac gatatcattc aggctatggc 900 caagcttctt gagcttgatg aggattactt cttggaccga ctcaacgaag ctcctgcatt 960 tgcaagattc aactactacc ctccctgtcc aaggcctgac cttgtgttcg gcatcaggcc 1020 tcactccgac ggcaccctct tgacgattct tctcgtcgac aaagatgtca gtggcctgca 1080 agttcagagg gatggcaagt ggtccaacgt tgaggcaact cctcacacat tgctgatcaa 1140 cttaggtgac accatggagg taatgtgcaa tggcatcttc aggagcccgg tgcacagggt 1200 ggtgacaaac gccgagaagg agaggatctc cctggccatg ttatacagcg tgaacgatga 1260 gaaagacatt gagccggcgg ctggtttgct ggatgagaat cggcctgcaa gatacaggaa 1320 agtgagcgtc gaagagttca gggccgggat ctttggaaaa ttctctcgag gagagaggta 1380 catcgactcc ctgaggatct gatctcgaag agagcatgat tgttgcaagc tcagcagctt 1440 tcagtagcaa gtatttcctt gggaaaacaa acatttttcc ccccttaagg gaattgctga 1500 aaacatgtcg caagttctcg taaagaaaaa cttttaaatt taactatggt ataattgtaa 1560 tataattaca tatgtaataa cccctccgtt tcatattata agactttcta gcattgtcca 1620 catttatata gatgtgggca atgccataaa gtcttacaat atgaaaacgg aggaagtctt 1680 gtaactacgg tactgcattc ttttcaaatt acaaattact tgtcatccg 1729 <210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Asp Glu Ser Trp Arg Ala Pro Ala Ile Val Gln Glu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Glu Glu Pro Pro Ser Arg Tyr Leu Leu Arg Glu Lys 20 25 30 Asp Arg Ser Asp Val Lys Leu Val Ala Ala Glu Leu Pro Glu Pro Leu 35 40 45 Pro Val Val Asp Leu Ser Arg Leu Asp Gly Ala Glu Glu Ala Thr Lys 50 55 60 Leu Arg Val Ala Leu Gln Asn Trp Gly Phe Phe Leu Leu Thr Asn His 65 70 75 80 Gly Val Glu Ala Ser Leu Met Asp Ser Val Met Asn Leu Ser Arg Glu 85 90 95 Phe Phe Asn Gln Pro Ile Glu Arg Lys Gln Lys Phe Ser Asn Leu Ile 100 105 110 Asp Gly Lys Asn Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gly Thr Asp Arg Val Val 115 120 125 Thr Gln Asp Gln Ile Leu Asp Trp Ser Asp Arg Leu His Leu Arg Val 130 135 140 Glu Pro Lys Glu Glu Gln Asp Leu Ala Phe Trp Pro Asp His Pro Glu 145 150 155 160 Ser Phe Arg Asp Val Leu Asn Lys Tyr Ala Ser Gly Thr Lys Arg Ile 165 170 175 Arg Asp Asp Ile Ile Gln Ala Met Ala Lys Leu Leu Glu Leu Asp Glu 180 185 190 Asp Tyr Phe Leu Asp Arg Leu Asn Glu Ala Pro Ala Phe Ala Arg Phe 195 200 205 Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Val Phe Gly Ile Arg 210 215 220 Pro His Ser Asp Gly Thr Leu Leu Thr Ile Leu Leu Val Asp Lys Asp 225 230 235 240 Val Ser Gly Leu Gln Val Gln Arg Asp Gly Lys Trp Ser Asn Val Glu 245 250 255 Ala Thr Pro His Thr Leu Leu Ile Asn Leu Gly Asp Thr Met Glu Val 260 265 270 Met Cys Asn Gly Ile Phe Arg Ser Pro Val His Arg Val Val Thr Asn 275 280 285 Ala Glu Lys Glu Arg Ile Ser Leu Ala Met Leu Tyr Ser Val Asn Asp 290 295 300 Glu Lys Asp Ile Glu Pro Ala Ala Gly Leu Leu Asp Glu Asn Arg Pro 305 310 315 320 Ala Arg Tyr Arg Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Arg Ala Gly Ile Phe 325 330 335 Gly Lys Phe Ser Arg Gly Glu Arg Tyr Ile Asp Ser Leu Arg Ile 340 345 350 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 3 ctagctcccc aagtcgaaac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 4 atggggtgaa ctcacatgg 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 5 gcaggctata gatgagctga aa 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 6 caggaagaag ccccaattct 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 7 cttaccaacc atggagtaga agc 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 8 tgaaagattc aggatggtca g 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer 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attattgatt cctcaatttt ctgtagtttt ttctatgcgt 1080 gctaactcag caagctcttt tatgggccta attgctcaaa gacagattct tttttactct 1140 agattgaatt aaattatgta cataacaagt tgaaatcaga tgtgcatatt taatggctca 1200 gttctgccga ccaataataa cataatattt aaacatttag ttcggatcat aggttcgtct 1260 cgatatctaa ttctagttga ctgactatca atttatgtat ttttgaaaaa aaaaatcaaa 1320 tttaaagtat aatccaatta taatatatta tggcccatat atacacaagg ctcttatacg 1380 ggcatcacaa agtcgcgcaa cgcgcggcta ggtggctagt tatactagtt gaaatatcta 1440 ggagataaga gaaggcaagc aatggaattt gtttttccca ttcaggcatt cagccccgtt 1500 tggaactcaa ttccacaatg ttactagctc acttccacaa tgtcaaactg cttgaaatac 1560 cagtcccttt cttctgccca atgccacaat gttaaatagt ttgaatacct ttagtttaat 1620 ttcaaaaaag gaatttgaag attccctttc ttgtgctcaa ttccacgatg tcaaacagtt 1680 tgaataccta tccctttctt cagctcaatc tgaatctttt tatcttatct ataacgagtc 1740 attttttttc accatgtata tcgtacatca tttcttctac tgttgaatag tagctgagaa 1800 gcagtgtcca ttctcattat gcctgaattt tcaatccatt ttcatccaag tatccaattc 1860 aagatgtatt tgcaggctat agatgagctg aaagatctcc tttcttttca agcaagaaca 1920 aagttaagca agggaagatc caagaacaag aacaccaatg gctgacgagt catggagggc 1980 gccggcgata gtgcaagagc tggcggcagc cggcgtcgag gagccgccga gccgatacct 2040 gctacgggag aaagaccgtt ctgacgtcaa gctggtcgcc gccgagctgc cggagcccct 2100 ccccgtcgtt gatctcagcc ggctagatgg tgccgaggag gccaccaagc tcagggtggc 2160 tctgcagaat tggggcttct tcctggtcag cttctaacaa gtgattctac tttgcttcat 2220 aaaaaagact tgctcatttg tattcatttc tccaatttgt gtggttgtgt gtgatccagc 2280 ttaccaacca tggagtagaa gcctctctga tggacagcgt gatgaacttg tcgagagagt 2340 ttttcaacca accaatcgaa cggaagcaaa aattcagcaa cttgatcgat ggcaagaact 2400 tccagattca agggtatgga actgaccggg tggttaccca agatcagatc ctggactggt 2460 ctgatcggtt gcatctcaga gttgaaccca aggaggagca agatcttgcc ttctggcctg 2520 accatcctga atctttcagg tcacctactc acctcacatt gatcgatgtt ttactttcca 2580 gtttccacac gtctgaattt gtttctcttt tgttttttcc ttttttgcaa aagatagtgt 2640 ttcttactgt tcatatatta cttacaaagt aacaaggatt gttgtctgaa ttcagaaagt 2700 acaacttgac gatgtatcaa gaaatggttt tgctgagcta tttgagagcc ttttcttctg 2760 cagggatgtt ctgaacaagt atgcatcatt caggctatgg ccaagcttct tgagcttgat 2820 gaggattact tcttggaccg actcaacgaa gctcctgcat ttgcaagatt caactactac 2880 cctccctgtc caaggcctga ccttgtgttc ggcatcaggc ctcactccga cggcaccctc 2940 ttgacgattc ttctcgtcga caaagatgtc agtggcctgc aagttcagag ggatggcaag 3000 tggtccaacg ttgaggcaac tcctcacaca ttgctgatca acttaggtga caccatggag 3060 gtaattgcct tattggcatc caacatccaa aatacttact ctctgaatct gcagacatcc 3120 agtacttcct ccgtttcata ttataagact ttctagcatt gcccacattc atatatatgt 3180 taatgaatct agacataata tatatataaa tgttgttaat gaatctagac acatatacat 3240 atatatgaat gtgggcaatg ctagaaagtc ttatgacctg aaacgaaggt agtatatctg 3300 atgataaatc cagggtttct gaatgctgat gcatatttgg atgcaacatt tctgtgcagg 3360 taatgtgcaa tggcatcttc aggagcccgg tgcacagggt ggtgacaaac gccgagaagg 3420 agaggatctc cctggccatg ttatacagcg tgaacgatga gaaagacatt gagccggcgg 3480 ctggtttgct ggatgagaat cggcctgcaa gatacaggaa agtgagcgtc gaagagttca 3540 gggccgggat ctttggaaaa 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Glu Leu Pro Glu Pro Ile Pro Val Val 35 40 45 50 gat ctc agc cgg cta gcc ggc gcc gac gag gct gcc aag ctc agg gcg 249 Asp Leu Ser Arg Leu Ala Gly Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Arg Ala 55 60 65 gct ctg cag aat tgg ggc ttc ttc ctg ctt acc aac cat gga gta gaa 297 Ala Leu Gln Asn Trp Gly Phe Phe Leu Leu Thr Asn His Gly Val Glu 70 75 80 acc tct ctg atg gat gat gtg ttg aac ttg gca aga gag ttc ttc aac 345 Thr Ser Leu Met Asp Asp Val Leu Asn Leu Ala Arg Glu Phe Phe Asn 85 90 95 caa ccg atc gaa cgg aag cga aaa ttc agc aac ttg atc gac ggc aag 393 Gln Pro Ile Glu Arg Lys Arg Lys Phe Ser Asn Leu Ile Asp Gly Lys 100 105 110 aac ttc cag gtg gaa ggg tat gga act gac cgg gtg gta acc caa gat 441 Asn Phe Gln Val Glu Gly Tyr Gly Thr Asp Arg Val Val Thr Gln Asp 115 120 125 130 cag atc ctg gac tgg tct gat cgg ctg ttt ctc aga gtt gaa ccc aag 489 Gln Ile Leu Asp Trp Ser Asp Arg Leu Phe Leu Arg Val Glu Pro Lys 135 140 145 gag gag cga aat ctt gcc ttc tgg cct gac cat cct gaa tct ttc agg 537 Glu Glu Arg Asn Leu Ala Phe Trp Pro Asp His Pro Glu Ser Phe Arg 150 155 160 gat gtt ctg aac gag tac gca tca aga acc aaa aga ata aga gac gat 585 Asp Val Leu Asn Glu Tyr Ala Ser Arg Thr Lys Arg Ile Arg Asp Asp 165 170 175 atc gtt cag gct atg tcc aag ctt ctt ggg ctt gat gag gat tac ttc 633 Ile Val Gln Ala Met Ser Lys Leu Leu Gly Leu Asp Glu Asp Tyr Phe 180 185 190 ttc gac cga ctc aac aaa gct cct gca ctt gca aga ttc aac tac tac 681 Phe Asp Arg Leu Asn Lys Ala Pro Ala Leu Ala Arg Phe Asn Tyr Tyr 195 200 205 210 cct ccc tgt cca agg cct gac ctt gtg ttc ggc gtc agg cct cac tcc 729 Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Val Phe Gly Val Arg Pro His Ser 215 220 225 gac ggc tcc ctc ttt acg att ctt ctc gtc gac gaa gat gtc ggt ggc 777 Asp Gly Ser Leu Phe Thr Ile Leu Leu Val Asp Glu Asp Val Gly Gly 230 235 240 ctg caa att cag agg gat ggc aag tgg tac aat gtt cag gtc act ccc 825 Leu Gln Ile Gln Arg Asp Gly Lys Trp Tyr Asn Val Gln Val Thr Pro 245 250 255 aac aca ttg ctg atc aac tta ggt gac acc atg gag gta ttg tgc aat 873 Asn Thr Leu 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tgtaattatt gtataattgt aatgtaatta cactattaac tacattggat 1354 atgttttttt tcctactttt atcgatatag ccatattagt 1394 <210> 17 <211> 350 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 17 Met Ala Asp Glu Ser Trp Arg Thr Pro Ala Ile Val Gln Glu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Glu Glu Pro Pro Ser Arg Tyr Val Leu Gly Glu Lys 20 25 30 Asp Arg Ser Asp Glu Leu Val Ala Ala Glu Leu Pro Glu Pro Ile Pro 35 40 45 Val Val Asp Leu Ser Arg Leu Ala Gly Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu 50 55 60 Arg Ala Ala Leu Gln Asn Trp Gly Phe Phe Leu Leu Thr Asn His Gly 65 70 75 80 Val Glu Thr Ser Leu Met Asp Asp Val Leu Asn Leu Ala Arg Glu Phe 85 90 95 Phe Asn Gln Pro Ile Glu Arg Lys Arg Lys Phe Ser Asn Leu Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Asn Phe Gln Val Glu Gly Tyr Gly Thr Asp Arg Val Val Thr 115 120 125 Gln Asp Gln Ile Leu Asp Trp Ser Asp Arg Leu Phe Leu Arg Val Glu 130 135 140 Pro Lys Glu Glu Arg Asn Leu Ala Phe Trp Pro Asp His Pro Glu Ser 145 150 155 160 Phe Arg Asp Val Leu Asn Glu Tyr Ala Ser Arg Thr Lys Arg Ile Arg 165 170 175 Asp Asp Ile Val Gln Ala Met Ser Lys Leu Leu Gly Leu Asp Glu Asp 180 185 190 Tyr Phe Phe Asp Arg Leu Asn Lys Ala Pro Ala Leu Ala Arg Phe Asn 195 200 205 Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Val Phe Gly Val Arg Pro 210 215 220 His Ser Asp Gly Ser Leu Phe Thr Ile Leu Leu Val Asp Glu Asp Val 225 230 235 240 Gly Gly Leu Gln Ile Gln Arg Asp Gly Lys Trp Tyr Asn Val Gln Val 245 250 255 Thr Pro Asn Thr Leu Leu Ile Asn Leu Gly Asp Thr Met Glu Val Leu 260 265 270 Cys Asn Gly Ile Phe Arg Ser Pro Val His Arg Val Val Thr Asn Ala 275 280 285 Glu Arg Glu Arg Ile Ser Leu Ala Met Phe Tyr Ser Val Asn Asp Glu 290 295 300 Lys Asp Ile Gly Pro Ala Ala Gly Leu Leu Asp Glu Asn Arg Pro Ala 305 310 315 320 Arg Tyr Arg Lys Val Ser Val Gly Glu Phe Arg Ala Gly Ile Ile Gly 325 330 335 Lys Phe Ser Arg Arg Glu Arg Tyr Ile Asp Ser Leu Lys Ile 340 345 350

Claims

4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하고, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하기 위한 약제:
(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열을 포함하는 DNA와 교잡하는 DNA, 및
(c) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA,
여기서 상기 DNA는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자이다.
4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포이며, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포:
(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열을 포함하는 DNA와 교잡하는 DNA, 및
(c) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA,
여기서 상기 DNA는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자이다.
제2항에 따른 형질 전환 식물세포로부터 재생된 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체.
제3항에 따른 식물체의 자손 또는 클론인 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체.
제3항 또는 제4항에 따른 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물체의 번식 재료.
4－HPPD 억제제에 대한 저항성이 높은 식물체의 제조 방법으로서,
(I) 4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 단백질을 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정과;
(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열을 포함하는 DNA와 교잡하는 DNA, 및
(c) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA,
여기서 상기 DNA는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자이며,
(II) 공정(I)에서 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정을 포함하는 방법.
4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 포함하고, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하기 위한 약제
(a) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 이중사슬 RNA를 코드하는 DNA
(b) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA
(c) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA.
4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포이며, 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있었던 식물체를 재생할 수 있는 형질 전환 식물세포
(a) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 이중사슬 RNA를 코드하는 DNA
(b) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA
(c) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA.
제8항에 따른 형질 전환 식물세포로부터 재생된 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체.
제9항에 따른 식물체의 자손 또는 클론인 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체.
제9항 또는 제10항에 따른 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체의 번식 재료.
4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물체의 제조 방법으로서,
(I) 4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 식물에 부여하는 활성을 가지는 RNA를 코드하는 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA, 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터를 식물세포에 도입하는 공정과
(a) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 이중사슬 RNA를 코드하는 DNA
(b) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물과 상보적인 안티센스 RNA를 코드하는 DNA
(c) 제1항에 따른 DNA의 전사 생산물을 특이적으로 개열하는 리보자임 활성을 가지는 RNA를 코드하는 DNA
(II) 공정(I)에 대해 상기 DNA 또는 해당 DNA가 삽입된 벡터가 도입된 형질 전환 식물세포로부터 식물체를 재생하는 공정을 포함하는 방법.
식물에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법으로서, 피실험식물에 있어서의 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA 또는 그 발현 제어 영역의 염기 서열을 해석하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열을 포함하는 DNA와 교잡하는 DNA, 및
(c) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA,
여기서 상기 DNA는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자이다.
식물에 있어서 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 판정하는 방법으로서, 피실험식물에 있어서의 하기의 (a)~(c)로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 DNA의 발현 또는 증폭 생산물 혹은 발현 생산물의 분자량을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA,
(b) 서열 번호：1 또는 16에 기재한 염기 서열을 포함하는 DNA와 교잡하는 DNA, 및
(c) 서열 번호：2 또는 17에 기재한 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA,
여기서 상기 DNA는 철·아스코르빈산 의존성 산화 환원 효소 유전자로 추정되는 유전자이다.
4－HPPD 억제제에 대한 저항성을 높일 수 있는 식물을 육종하는 방법으로서,
(a) 4－HPPD 억제제에 대해 저항성의 식물 품종과 임의의 품종을 교배시키는 공정,
(b) 공정(a)에 있어서의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체에 있어서의, 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을 제13항 또는 제14항에 따른 방법에 의해 판정하는 공정, 및
(c) 4－HPPD 억제제에 대해 저항성을 갖는 것으로 판정된 개체를 선발하는 공정을 포함하는 방법.
4－HPPD 억제제에 대한 감수성을 높일 수 있는 식물을 육종하는 방법으로서,
(a) 4－HPPD 억제제에 대해 감수성의 식물 품종과 임의의 품종을 교배시키는 공정,
(b) 공정(a)에 있어서의 교배에 의해 얻을 수 있는 개체에 있어서의 4－HPPD 억제제에 대한 저항성 또는 감수성을, 제13항 또는 제14항에 따른 방법에 의해 판정하는 공정, 및
(c) 4－HPPD 억제제에 대해 감수성을 갖는 것으로 판정된 개체를 선발하는 공정을 포함하는 방법.